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1
Cinetica enzimatica
Prof. Giorgio Sartor
Copyright © 2001-2019 by Giorgio Sartor.
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v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 2 -
Spontaneità
• Una qualunque reazione chimica avviene
spontaneamente se e solo se la variazione di energia libera (∆G) è negativa:
∆GT,p < 0
∆GT = ∆H – T∆S
• A T e p costanti
1
2
2
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Spontaneità
• Quindi, data una qualunque reazione chimica
A → B
• Essa avviene spontaneamente se le energie libere molari
GB < GA
• Più in generale qualunque trasformazione avviene se e solo se:
Gfinale < Giniziale
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Spontaneità ed equilibrio
• QuandoGB = GA
• Quindi ∆G = 0
• La reazione è all’equilibrio
BA
3
4
3
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Spontaneità e realtà
• Questo non significa che una reazione chimica (un processo) esoergonica (∆G < 0) avvenga con velocità apprezzabile.
∆G°’ = -7.3 kcal·mole-1 (-30.6 kJ·mole-1) a pH 7
NO
N
N
OHOHN
NH2OP
O
O
O
P
O
OO
P
O
OO
NO
N
N
OHOHN
NH2OP
O
O
OP
O
OO
HO
H
OP
O
OO
..
+
ATP + H2O
ADP + Pi
↓
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Energia di attivazione
• In soluzione l’ATP è stabile perché esiste l’energia di attivazione.
5
6
4
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Catalisi
• In assenza di catalizzatore:
A + B → C + D
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Catalisi
Coordinate di reazione
Energ
ia lib
era
∆G
∆G*
A + B
C + D
∆G* = Energia di attivazione
7
8
5
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Catalisi
• In presenza di catalizzatore:
A + K → AKAK + B → ABK
ABK → C + D + K
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Catalisi
∆G*c
Coordinate di reazione
Energ
ia lib
era
∆G
∆G*c = Energia di attivazione in presenza di catalizzatore
A + B + K
C + D + K
AK + B
9
10
6
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Controllo termodinamica e controllo cinetico di una reazione
• Ogni reazione può avvenire se e solo se è termodinamicamente favorita (∆G < 0),
• Avviene se e solo se vi è abbastanza energia per superare l’energia di attivazione:
H202 → H2O + ½ O2
• Catalizzatore :– Nessuno ∆H* = 18 kcal·mole-1
– Platino ∆H* = 11.7 kcal·mole-1
– Catalasi ∆H* = 5.5 kcal·mole-1
(∆H* = energia di attivazione)
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In una reazione chimica
A → Bv = k · [A]
[A]
Vel
ocità
di re
azio
ne
11
12
7
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Una reazione enzimatica
ES EP
E + S ES E + Pk1
k-1
k2
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In una reazione enzimaticaE + S ES E + P
[S]
Vel
oci
tà d
i re
azio
ne
v = k' [Eo][S]
v = k'' [Eo]
Bassa concentrazionedi substrato
[S]>[E]
Alta concentrazionedi substrato[S]>>[E]
13
14
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Enzimi
• Gli enzimi sono sistemi catalitici, in genere…
… proteine
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Enzimi
• Gli enzimi sono sistemi catalitici, in genere…
… proteine
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16
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Specificità degli enzimi
• Specificità – Stereochimica – Assoluta– Di gruppo– Di legame
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Specificità degli enzimi
• Specificità stereochimica
HOH
OH2
34
56
7
89
10
1112
13
14 15
16
17
1 2
34
56
7
89
10
1112
13
1415
16
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1
steroide 11-β-monossigenasi
11-β-idrossi steroide
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18
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Specificità degli enzimi
• Specificità assoluta
CH2OPO3H-
OHH
OHH
HOH
HOH
CH2OH
CH2OPO3H-
OHH
OHH
HOH
O
CH2OH
mannitolo-1-fosfato deidrogenasi
fruttoso-6-fosfatomannitolo-1-fosfato
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Specificità degli enzimi
• Specificità di gruppo– Proteasi
…-Leu-Arg-Gly-Phe-…
Taglia qui
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Centro catalitico
Asp102
His57
Ser195
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Meccanismo delle proteasi a serina
21
22
12
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Meccanismo delle proteasi a serina
**
O
O *
*
N
N
H
*O
*
H
N
*
H*
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
E
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Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
N
H
R
*
H
R
H
N*
O
*O
*
**
O
O *
*
N
N
H
H
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
ES
23
24
13
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Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
N
H
R
*
H
**
O
O *
*
N
N+
H
H*
O
*
R
H
N*
O
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
Intermedio tetraedrico
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Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
N
H
R
*
H
**
O
O *
*
N
N+
H
H*
O
*
R
H
N*
O
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
25
26
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Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
N
H
R
*
H
**
O
O *
*
N
N
H
H*
O
*
R
H
N*
O
HO
H
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
Acilenzima
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 28 -
Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
N
H
R
*
H
H
*O
*
R
H
N*
O
**
O
O *
*
N
N
H
HO
H
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
27
28
15
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Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
*O
*
R
H
N*
O
**
O
O *
*
N
N
H
H
OH
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
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Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
**
O
O *
*
N
N+
H
H
OH
*O
*
R
H
N*
O
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
Intermedio tetraedrico
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30
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Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
**
O
O *
*
N
N+
H
H
OH
*O
*
R
H
N*
O
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 32 -
Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
*O
*
**
O
O *
*
N
N
H
HO
H
R
H
N*
O
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
31
32
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v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 33 -
Meccanismo delle proteasi a serina
**
O
O *
*
N
N
H
*O
*
H
N
*
H*
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 34 -
Meccanismo delle proteasi a serina
33
34
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v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 35 -
Proteasi a serina (1HAX)
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Proteasi a serina (1HAX)
Ser195Gly193
His57
35
36
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Specificità degli enzimi
• Specificità di legame– Esterasi
Estere → Acido + Alcool
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Classificazione degli enzimi
• Singolo enzima– Ureasi
• Complesso enzimatico– Complesso piruvato deidrogenasi
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Classificazione gerarchica degli enzimi
• Ogni enzima viene classificato a secondo della reazione che catalizza.
• Viene classificato con un numero:
• EC X.Y.Z.T• X = classe• Y = sottoclasse• Z = sotto-sottoclasse• T = numero dell’enzima nella sotto-
sottoclasse– http://www.enzyme-database.org/class.php– http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes/– http://www.brenda-enzymes.org/– http://www.genome.jp/kegg-bin/get_htext?ko01000.keg
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Classificazione gerarchica degli enzimi
• Classi:– 1. Ossidoreduttasi
• Catalizzano una reazione redox.
– 2. Transferasi• Catalizzano il trasferimento di un gruppo da una
molecola ad un’altra: X-Y + Z → X-Z + Y le chinasi trasferiscono un gruppo fosfato.
– 3. Idrolasi• Catalizzano la scissione idrolitica di legami C=O, C-N,
C-C, P-O-P,…
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Classificazione gerarchica degli enzimi
• Classi:– 4. Liasi
• Catalizzano scissioni di legami con meccanismi diversi dalle Ossidoreduttasi e dalle Idrolasi.
– 5. Isomerasi• Catalizzano modificazioni geometriche.
– 6. Ligasi (Sintetasi)• Catalizzano l’unione di due molecole accoppiata al
consumo di ATP o di un altro nucleotide trifosfato.
– 7. Translocasi• Catalizzano la translocazione (passaggio attraverso
membrane) di ioni o molecole.
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Classificazione gerarchica degli enzimi
• Per esempio:
Alcool + NAD+ → Aldeide o chetone + NADH
• Nome comune: alcool deidrogenasi• Nome sistematico: alcool:NAD+ ossidoreduttasi• EC 1.1.1.1
La classe - Ossidoreduttasi
La sottoclasse – Agiscono sul gruppo di donatori CH-OH
La sotto-sottoclasse – con NAD+ o NADP+ come accettori
Numero dell’enzima nella sotto-sottoclasse
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43
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Isoenzimi
• Questa classificazione NON riguarda gli enzimi in quanto proteine ma in quanto CATALIZZATORI
• La classificazione riguarda quindi gli enziomi che catalizzano una reazione.
• Proteine diverse (con diversa struttura primaria) che catalizzano la stessa reazione, sono
ISOENZIMI
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 48 -
Isoenzimi
• Sono le forme multiple dovute a differenze, determinate geneticamente, di struttura primaria
• Sono anche isoenzimi quelle proteine che svolgono la stessa funzione ma sono geneticamente indipendenti, per esempio:
• EC 1.1.1.37 malato deidrogenasi– Citosolica (codificata dal DNA nucleare)– Mitocondriale (codificata dal DNA mitocondriale)
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48
25
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Cenni di cinetica chimica
• All’equilibriov1 = v-1
Velocità diretta v1 = - = k1[A]d[A]
dt
Velocità inversa v-1 = - = k-1[B]d[B]
dt
BAk1
k-1
k1
k-1[A]eq
[B]eq= = Keq
k1[A]eq = k-1[B]eq
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Cenni di cinetica chimica• Ordine di reazione
– I ordine
v1 = k1[A]
– II ordine
v1 = k1[A]2
oppurev1 = k1[A][B]
• I ordine rispetto ad A• I ordine rispetto a B• II ordine globale
– Ordine 0
v1 = k1
• indipendente dalla concentrazione dei reagenti
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Dipendenza dalla temperatura
• La velocità di una reazione dipende dalla temperatura attraverso la costante di velocità k
• All’equilibrio
Eatt1
RT-
∆Eatt
RT-Eatt-1
RT-
v = k[A]
k = A e
Keq = = = Z ek1
k-1
A1 e-
Eatt1
RT
A-1 eZ = A1/A-1
∆Eatt = Eatt1 - Eatt-1
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Dipendenza dalla temperaturaKeq = Z e-
∆Eatt
RT
Keq = e- ∆HRT
lnKeq = - ∆HRT
= Z e- ∆GRT = Z e- ∆H - T∆S
RT = Z e- ∆H ∆SRT
- R
Coordinate di reazione
Ener
gia
Eatt 1-Eatt -1 = ∆Eatt
∆Eatt ≅ ∆Η
Eatt 1
Reagenti
Prodotti
Eatt -1
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Dipendenza dalla temperatura
1/T (K)
ln K
eq
ln Keq = -∆H/R 1/T
pendenza = -∆H/R
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 54 -
Dipendenza dalla temperatura
• All’equilibrio
∆G = ∆G°+ RT ln[Prodotti]
[Reagenti]
= Keq; ∆G = 0[Prodotti]
[Reagenti]
0 = ∆G°+ RT ln Keq
∆G° = - RT ln Keq
∆G° = ∆H° - T∆S°
53
54
28
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 55 -
Reazione enzimatica
ES EP
E + S ES E + Pk1
k-1
k2
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 56 -
Enzima e substrato
• In una reazione tra enzima (E) e substrato (S), possiamo distinguere tre fasi:
1. Legame tra E e S per formare il complesso ES
E + S → ES [S]>>[E]Stato prestazionario
2. Stato stazionario
3. Scompare il substrato, [ES] diminuisce, v diminuisce
= 0;d[ES]
dt
55
56
29
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 57 -
Enzima e substrato
∆[ES]/∆t ≈ 0
Conce
ntr
azio
ne
Tempo
[E]
[ES]
[P][S]
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 58 -
1a faseStato
Pre-stazionario2a fase
Stato stazionario
Enzima e substrato3a faseFine
d[P]/dt ≠ cost.
∆[ES]/∆t ≈ 0
Conce
ntr
azio
ne
Tempo
[E]
[ES]
[P][S]
µs → ms s → m → h
57
58
30
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 59 -
1a faseStato
Pre-stazionario2a fase
Stato stazionario
Enzima e substrato3a faseFine
d[P]/dt ≠ cost.
∆[ES]/∆t ≈ 0
Conce
ntr
azio
ne
Tempo
[E]
[ES]
[P][S]
µs → ms s → m → h
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 60 -
1a faseStato
Pre-stazionario2a fase
Stato stazionario
Enzima e substrato3a faseFine
d[P]/dt ≠ cost.Conce
ntr
azio
ne
Tempo
d[E]/dt =0
d[ES]/dt = 0
d[P]/dt =cost
d[S]/dt =cost
µs → ms s → m → h
59
60
31
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 61 -
Enzima e substrato
t (s)
c/c0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
[ES]
[E]
[S]
[P]
0=dt
d[ES]
0k-2
=
Dipendenza delle concentrazioni (normalizzate) di S, P, E ed ES dal tempo.
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 62 -
Enzima e substrato• In una reazione enzimatica
l’ordine di reazione è variabile
[S]
Vel
oci
tà d
i re
azio
ne
v = k[E][S]Ordine 1 v = k[E]
Pseudo ordine 0
61
62
32
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 63 -
Enzima e substrato• In una reazione enzimatica
l’ordine di reazione è variabile
[S] [S]
Ordine 1 Ordine 0
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 64 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• In una reazione enzimatica [S]>>[E]:
• Per l’equilibrio veloce (1)
E + S ES (veloce) (1)k1
k-1
ES E + P (lento) (2)k2
vdiretta = k2[ES]
[ES] = [E][S]k1
k-1
K = =k1
k-1
[ES]
[E][S]
INDETERMINABILE
INDETERMINABILE
63
64
33
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 65 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• Per l’equilibrio veloce (1)
[Etot] misurabile[Etot] = [E] + [ES]
[ES] = [E][S]k1
k-1
K = =k1
k-1
[ES]
[E][S]INDETERMINABILE
[ES] = ([Etot]-[ES]) [S]k1
k-1
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 66 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• Da cui
[ES] =
k1
k-1
[Etot][S]
+ [S]
k1
k-1 = Kd
E + S ES
k1
k-1
= Kd = KM
[E][S]
[ES]
Costante di dissociazionedel complesso ES
Costante di Michaelis e Menten
65
66
34
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 67 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• La concentrazione del complesso ES
• Poiché:vdiretta = k2[ES]
[ES] = [Etot][S]
KM + [S]
vdiretta = k2[Etot][S]
KM + [S]
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 68 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
• Quando tutto Etot diventa ES allora la velocità sarà massima.
Vmax = k2[Etot]
• Quando il substrato satura l’enzima allora la velocità sarà massima
v = Vmax[S]
KM + [S]
67
68
35
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 69 -
Equazione di Michaelis e Menten
v = Vmax[S]
KM + [S]
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 70 -
Michaelis e Menten
Leonor Michaelis (1875-1949) Maud Menten (1879-1960)
69
70
36
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 71 -
Efficienza catalitica o numero di turnover
• k2 è detta anche kcat e si ottiene:
• k2 è detto anche numero di turnover (Moli di substrato consumate per secondo per moli di enzima) si esprime in s-1.
~1 s-1 < k2 < 106 s-1
kcat = Vmax
[Etot]
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 72 -
Trattamento secondo Michaelis e Menten
Bassa concentrazione (relativamente) di substrato:
[S]<<KM (Ordine 1)
[S]
Vel
oci
tà d
i re
azio
ne
Alta concentrazione di substrato: [S]>>KM (Ordine 0)
v = Vmax[S]
KM + [S]
v = = Vmax Vmax[S]
KM + [S]
TRASCURABILE
TRASCURABILE
71
72
37
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 73 -
Trattamento secondo Briggs-Haldane
• Da un punto di vista formale il trattamento è lo stesso di M.M., cambia il significato cinetico di KM
• Allo stato stazionario:
E + Pk2
E + S ESk1
k-1 k-2
d[ES]
dt= 0 = k1[E][S] - (k-1[ES] + k2[ES])
[ES] = k1[E][S]
(k-1 + k2)
formazione di ES scomparsa di ES
v = Vmax[S]
KM + [S]KM =
k1
k-1 + k2
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 74 -
Briggs e Haldane
GE Briggs (1893-1985) JBS Haldane (1892-1964)
73
74
38
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 75 -
Significato di KM
• KM descrive l’interazione substrato-enzima a livello del sito di legame.
• KM è una concentrazione:
• È la concentrazione di substrato al quale la velocità della reazione è metà della Vmax
KM = Kd = = ; moli l-1[E][S]
[ES] k1
k-1
v = = ; Vmax
2
Vmax[S]
KM + [S]= ;
12
[S]
KM + [S]
KM = [S]
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 76 -
Significato di Vmax
E + Pk2
E + S ESk1
k-1 k-2
• Vmax è legata a k2
Vmax = k2[Etot]
• Dipende dalla concentrazione dell’enzima:– induzione genica, sintesi e degradazione delle
proteine.
75
76
39
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 77 -
Significato di k2
• k2 è una frequenza
Vmax/[Etot] = k2 (moli·l-1·s-1)/(moli·l-1)k2 = s-1
• Numero di eventi per unità di tempo (numero di turnover).
• Proprietà cinetica dell’enzima.
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 78 -
Significato di KM e Vmax
[S]
v
v = Vmax
Vmax
KM
2
Vmax[S]
KMv =
77
78
40
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 79 -
Enzima Sorgente Substrato Km (mM)n° di turnover
(1/s)
Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.4
ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014
Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.5
Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.5 1000000
Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale
Acido aspartico 0.9
Acido α-chetoglutarico 0.1
Acido ossalacetico 0.04
acido glutammico 4
Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA 0.014
Chimotripsina Pancreas bovino
N-benziltirosinamide 2.5
N-formiltirosinamide 12
N-acetiltirosinamide 32
gliciltirosinamide 122
Creatina fosfochinasi Muscolo di coniglio Creatina 19
Esochinasi Lievito Glucosio 0.15
Esochinasi Cervello Glucosio 0.008
Fosfatasi acida Prostata α-glicerofosfato 3
Fosfogliceraldeide deidrogenasi Muscolo di coniglio Gliceraldeide-3-fosfato 0.05
Glutamato deidrogenasi Fegato bovino
Acido glutammico 0.12
Acido α-chetoglutarico 2
Ione ammonio 57
NAD+ 0.025
NADH 0.018
Xantina ossidasi LatteXantina 0.03
Acetaldeide 1000
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 80 -
Enzima Sorgente Substrato Km (mM)n° di turnover
(1/s)
Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.4
ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014
Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.5
Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.5 1000000
Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale
Acido aspartico 0.9
Acido α-chetoglutarico 0.1
Acido ossalacetico 0.04
acido glutammico 4
Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA 0.014
Chimotripsina Pancreas bovino
N-benziltirosinamide 2.5
N-formiltirosinamide 12
N-acetiltirosinamide 32
gliciltirosinamide 122
Creatina fosfochinasi Muscolo di coniglio Creatina 19
Esochinasi Lievito Glucosio 0.15
Esochinasi Cervello Glucosio 0.008
Fosfatasi acida Prostata α-glicerofosfato 3
Fosfogliceraldeide deidrogenasi Muscolo di coniglio Gliceraldeide-3-fosfato 0.05
Glutamato deidrogenasi Fegato bovino
Acido glutammico 0.12
Acido α-chetoglutarico 2
Ione ammonio 57
NAD+ 0.025
NADH 0.018
Xantina ossidasi LatteXantina 0.03
Acetaldeide 1000
79
80
41
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 81 -
Enzima Sorgente Substrato Km (mM)n° di turnover
(1/s)
Acetil-CoA sintasi Cuore di bue Acetato 1.4
ATP-asi Muscolo di coniglio ATP 0.014
Alcool deidrogenasi Fegato di cavallo Etanolo 0.5
Anidrasi carbonica Eritrociti Anidride carbonica 7.5 1000000
Aspartato aminotransferasi Cuore di maiale
Acido aspartico 0.9
Acido α-chetoglutarico 0.1
Acido ossalacetico 0.04
acido glutammico 4
Butirril-CoA deidrogenasi Fegato di bue Butirril-CoA 0.014
Chimotripsina Pancreas bovino
N-benziltirosinamide 2.5
N-formiltirosinamide 12
N-acetiltirosinamide 32
gliciltirosinamide 122
Creatina fosfochinasi Muscolo di coniglio Creatina 19
Esochinasi Lievito Glucosio 0.15
Esochinasi Cervello Glucosio 0.008
Fosfatasi acida Prostata α-glicerofosfato 3
Fosfogliceraldeide deidrogenasi Muscolo di coniglio Gliceraldeide-3-fosfato 0.05
Glutamato deidrogenasi Fegato bovino
Acido glutammico 0.12
Acido α-chetoglutarico 2
Ione ammonio 57
NAD+ 0.025
NADH 0.018
Xantina ossidasi LatteXantina 0.03
Acetaldeide 1000
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 82 -
Linearizzazione dell’equazione di Michaelis e Menten
81
82
42
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 83 -
Lineweaver-Burk
• Inversione
v = Vmax[S]
KM + [S]
= = +Vmax[S]
KM + [S]1v
KM
Vmax [S]
1 1
Vmax
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 84 -
Lineweaver-Burk
= +1v
KM
Vmax [S]
1 1
Vmax
1/[S]
1/v
1/Vmax
-1/KM 0
Pendenza = KM/Vmax
83
84
43
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 85 -
Lineweaver e Burk
Hans Lineweaver (1907-2009) Dean Burk (1904-1988)
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 86 -
Eadie-Hofstee• Trasformazione
[S]
vKM v[S]+ = Vmax[S]
KM[S]KM
vKM + = Vmax
KM
v
v (KM + [S]) = Vmax[S]
vKM + v[S] = Vmax[S]
1KM[S]
v= -
Vmax
KM
v v
v/[s]Vmax/KM
Pendenza = - 1/KM
Vmax
85
86
44
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 87 -
Eadie-Hofstee (oppure)• Trasformazione
[S]
vKM v[S]+ = Vmax[S]
KM[S]KM
vKM + = Vmax
KM
v
v (KM + [S]) = Vmax[S]
vKM + v[S] = Vmax[S]
[S]v= -KM + Vmaxv
v
v/[s]
Vmax/KM
Pendenza = - KM
Vmax
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 88 -
Reazioni enzimatiche con più substrati
• Meccanismo sequenziale: i substrati si legano in modo sequenziale:
• Prima uno poi l’altro in ordine preciso:– Meccanismo sequenziale ordinato
• Senza un ordine preciso:– Meccanismo sequenziale casuale
• Meccanismo a ping-pong
87
88
45
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 89 -
Meccanismo sequenziale ordinato
A + B P + QE
E + A EA; EA + B EAB;
EAB EPQ; EPQ EQ + P;
EQ E + Q
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 90 -
Meccanismo sequenziale casuale
E + B EB EQ E + Q
E + A EA EP E + P
A + B P + QE
EAB EPQA
B Q
P
DNA POLIMERASI DIIDROFOLATO REDUTTASI
89
90
46
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 91 -
Meccanismo a ping-pong
A + B P + QE
E + A EA E'P E' + P
E' + B E'B EQ E + Q
E E'A E'P E' E'B EQ E
A P B Q
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 92 -
Centro catalitico
Asp102
His57
Ser195
91
92
47
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 93 -
Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
N
H
R
*
H
R
H
N*
O
*O
*
**
O
O *
*
N
N
H
H
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
E + A
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 94 -
Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
N
H
R
*
H
**
O
O *
*
N
N+
H
H*
O
*
R
H
N*
O
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
E’A
93
94
48
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 95 -
Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
N
H
R
*
H
**
O
O *
*
N
N+
H
H*
O
*
R
H
N*
O
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
E’A → E’P
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 96 -
Meccanismo delle proteasi a serina
N
*
H*
N
H
R
*
H
**
O
O *
*
N
N
H
H*
O
*
R
H
N*
O
HO
H
Asp102His57
Ser195
Gly193
SitoSpecifico
Acilenzima
E’P + B
95
96
49
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 97 -
Reazioni enzimatiche con più substrati
• Il trattamento è complesso, occorre fare lo studio cinetico tenendo fissa la concentrazione di uno dei substrati (B) variando l’altro (A), così, di grafici di Lineweaver-Burk si può avere una descrizione del meccanismo:
1/[A] 1/[A]
1/v 1/v
[B] [B]
Sequenziale casuale Ping-pong
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 98 -
Regolazione dell’attività enzimatica
• I fattori che regolano l’attività enzimatica sono:– Temperatura
• Enzimi solubili o di membrana
– pH– Effettori
• Inibitori (inattivatori)• Attivatori• Effetti allosterici
– Concentrazione di substrati e prodotti• Vie metaboliche
– Repressione o induzione genica
97
98
50
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 99 -
Temperatura
• La velocità delle reazioni chimiche dipende dalla temperatura.
• La stabilità di una proteina dipende dalla temperatura.
Temperatura
Vel
ocità optimum
Aumento cinetico Denaturazione
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 100 -
Temperatura
• La temperatura influenza la fluidità di membrana
Ln v
Temperaturabassa
1/T 1/T
Ln v
Temperaturabassa
Temperaturaalta
Temperaturaalta
Temperaturadi transizione
della fase lipidica
Enzima solubile Enzima di membrana
99
100
51
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 101 -
pH
• La stabilità di una proteina dipende dal pH.• Alcuni processi coinvolgono valori estremi di pH
Vel
ocità
rela
tiva
pH
TripsinaPepsina Aceticolinesterasi
2 6 10
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 102 -
Effettori
• Attivatori• Inibitori
• La differenza non è netta, la stessa molecola può funzionare in entrambi i modi a seconda delle condizioni– Carica– Concentrazione– Enzima legato ad altre molecole – …
101
102
52
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 103 -
Inibitori
• Si definiscono inibitori quelle molecole che diminuiscono l’attività di un enzima, possono dare
• Inibizione reversibile – Modificano in modo reversibile (in genere attraverso un
legame non covalente) l’enzima
• Inibizione irreversibile– Modificano in modo irreversibile l’enzima
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 104 -
Inibitori reversibili
• A secondo delle loro caratteristiche si definiscono:
– Inibitori competitivi– Inibitori non competitivi– Inibitori acompetitivi
103
104
53
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 105 -
Inibitori competitivi
• Agiscono competendo con il substrato per lo stesso sito di legame, agiscono quindi sulla formazione del complesso ES.
• L’inibizione è rimossa aumentando la concentrazione di S
E + PS ES
I EI E + P
E +
KM
Ki
Ki =[EI]
[I][E]
KM =[ES]
[S][E]
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 106 -
Inibitori competitivi
• Senza inibitore
• Con inibitore
[S]
v
v = KM + [S]
Vmax [S]
[I]
Ki
v =
KM ( 1 + ) + [S]
Vmax [S]
105
106
54
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 107 -
Inibitori competitivi
• Senza inibitore
• Con inibitore
1/[S]
1/V
0-1/KM(app)
1/Vmax
= +1v
KM
Vmax [S]
1 1
Vmax
= ( 1 + ) +1v
KM
Vmax [S]
1 1
Vmax
[I]
Ki
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 108 -
Inibitori competitivi
• Sono molecole simili al substrato
• Occupano lo stesso sito di legame
IL LEGAMEDELL’INIBITOREPREVIENE ILLEGAME DELSUBSTRATO
SITO ATTIVODELL’INZIMA
SUBSTRATO
INIBITORE
PRODOTTI
SUBSTRATO EDINIBITORE SILEGANO ALLOSTESSO SITO
107
108
55
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 109 -
Biosintesi del colesterolo
• Viene sintetizzato nelle cellule epatiche a partire da acetil-CoA per formare 3-R-mevalonato.
CH3 S
O
CoA
CH3 S
O
CoA HS
CoA
SCoACH3
O O
SCoA
OH O
CH3
O
O
CH3 S
O
CoA HS
CoA
SCoA
OH OH
CH3
O
O
HOH
OH H
CH3
O
O
H
HS
CoA
NADPH + H+
NAPD+
Acetil-CoA (Cn) Acetoacetil-CoA
3-idrossi-3-metil
glutaril-CoA
HMG-CoA
3-R-mevalonato
Tiolasi HMG sintasi
HMG-CoA reduttasi I riduzione
Intermedio legato
all'enzima
NADPH + H+NAPD+
II riduzione
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 110 -
HMG reduttasi EC 1.1.1.34
• È una glicoproteina di membrana del reticolo endoplamatico,
• Il suo peso molecolare è di 97 kD,
• Il sito attivo è rivolto verso il citoplasma.
• È anch’essa regolata dal sistema protein chinasi. HMG
CoA
NADP
109
110
56
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 111 -
HMG reduttasi EC 1.1.1.34
• Viene inibita dalle statine, usate come farmaci per ridurre elevati livelli di colesterolo.
Mevastatina
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 112 -
Inibitori competitivi
111
112
57
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 113 -
Inibitori non competitivi
• Agiscono legandosi in un sito diverso dal sito di legame del substrato il quale può comunque legarsi.
• L’inibizione NON è rimossa aumentando la concentrazione di S
E + PE + S ES
+ I
EI + S
+ I
ESI
KM
KM
KiKi
Ki = = [EI]
[I][E]
KM =[ES]
[S][E]
[ESI]
[I][ES]
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 114 -
Inibitori non competitivi
• Senza inibitore
• Con inibitore
[I]
Ki
( 1 + )
v = KM + [S]
Vmax [S]
v = KM + [S]
Vmax[S] [S]
v
113
114
58
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 115 -
Inibitori non competitivi
• Senza inibitore
• Con inibitore
= +1v
KM
Vmax [S]
1 1
Vmax
= ( 1 + ) + ( 1 + ) 1v
KM
Vmax [S]
1 1
Vmax
[I]
Ki
[I]
Ki
1/[S]
1/V
1/Vmax
-1/KM 0
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 116 -
Inibitori non competitivi
• Sono molecole diverse dal substrato, si legano ad un proprio sito
• Ioni metallici (Cu++)• Complessanti (EDTA)• Modulatori
LA PRESENZADELL’INIBITORERIDUCE LA VELOCITÀ DI FORMAZIONE DEL PRODOTTO
SITO ATTIVODELL’INZIMA
SUBSTRATO
INIBITORE
IN ASSENZADI INBITORE SIFORMANOI PRODOTTI
SUBSTRATO EDINIBITORE SILEGANO A SITI DIVERSI
SITO INIBITORIO(REGOLATORIO)
115
116
59
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 117 -
Inibitori acompetitivi
• Agiscono legandosi e bloccando il complesso enzima-substrato.
E + PE + S ES
+ I
ESI
KM
Ki Ki =[ESI]
[I][ES]
KM =[ES]
[S][E]
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 118 -
Inibitori acompetitivi
• Senza inibitore
• Con inibitore
[I]
Ki
( 1 + )
[I]
Ki
( 1 + )
v = KM + [S]
Vmax [S]
v = KM
Vmax[S]
+ [S]
[S]
v
117
118
60
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 119 -
Inibitori acompetitivi
• Senza inibitore
• Con inibitore
= +1v
KM
Vmax [S]
1 1
Vmax
= + ( 1 + ) 1v
KM
Vmax [S]
1 1
Vmax
[I]
Ki
1/[S]
1/V
0-1/KM(app)
1/Vmax
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 120 -
Riassumendo…
• Inibizionecompetitiva
• Inibizione non competitiva
• Inibizioneacompetitiva
KM =[ES]
[S][E]
Ki =[EI]
[I][E]
Ki' =[ESI]
[I][ES]
E + PE + S ES
KM
+ I
EI + S
Ki
E + PE + S ES
+ I
ESI
KM
Ki'
+ I
EI + S
Ki
KM
E + PE + S ES
+ I
ESI
KM
Ki'
119
120
61
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 121 -
…riassumendo
Tipo di inibizione VMAXapp KM
app
Nessuna VMAX KM
Competitiva VMAX aKM
Non competitiva VMAX/a’ aKM /a’
Acompetitiva VMAX /a’ KM /a’
[I] a = (1 + )
Ki
[I] a' = (1 + )
Ki'
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 122 -
Inibitori irreversibiliInibitore Formula Origine Meccanismo
Ione cianuro CN- Mandorle amare
Complessa gli ioni metallici nelle
proteine
Diisopropil fluorofosfato
(DFP)Sintetico
Inibisce gli enzimi con serina nel sito
attivo
Sarin Sintetico Come il DFP
Fisostigmina Frutto del calabar Come il DFP
O PO
F
OCH3
CH3 CH3
CH3
O P
O
F
CH3
CH3
CH3
N
N
ONH
CH3
O
CH3
CH3
CH3
121
122
62
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 123 -
Inibitori irreversibili
Inibitore Formula Origine Meccanismo
Parathion SinteticoCome il DFP
(particolarmente attivo su acetilcolinesterasi di
insetti)
N-tosil-L-fenilalanina clorometil chetone(TPCK)
SinteticoReagisce con l’His-
57 della chimotripsina
Penicillina Penicillum Notatum
Inibisce gli enzimi della sintesi della parete batterica
O PS
O
O
C2H5
C2H5 NO2
NHS
O O
O
Cl
OR
NH
N
S CH3
CH3
CH3
O
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Attivatori
• Sono molecole che aumentano (o permettono) l’attività enzimatica– Protezione dell’enzima
• Glutatione• Ioni metallici
– Attivazione per azione sulle subunità
– Azione proteolitica su proenzimi
Enzima inattivo + cAMP → Subunità + Subunitàcatalitica regolatrice
123
124
63
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Attivatori• Azione proteolitica su proenzimi
Tripsinogeno
Tripsina
+
Proelastasi
Elastasi
+
Chimotripsinogeno
π-chimotripsina
α-chimotripsina
+
+
Procarbossipeptidasi
Carbossipeptidasi
+
Enteropeptidasi
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Effetti allosterici
• Un enzima allosterico è, in genere, un oligomero con subunità correlate.
• Gli effetti allosterici consistono nel legame di un effettore ad un sito diverso da quello del substrato con conseguente variazione delle proprietà cinetiche dell’enzima.
• L’effettore può essere lo stesso substrato (effettori omotropici) o diverso (effettori eterotropici).
Sitoattivo
Sito dell’effettore
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126
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Effetto allosterico
• Un enzima allosterico è un oligomero con subunità correlate la cui attività (Km) viene influenzate dal legame del substrato
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Effetti allosterici
• Il legame con l’effettore modifica (modula) le proprietà di legame del substrato.
• La velocità dipende da [S] come una sigmoide.
[S]
v
v = K + [S]n
Vmax [S]n
n = indice di cooperatività (costante di Hill)n = 1 nessuna cooperativitàn > 1 cooperatività positivan < 1 cooperatività negativa
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128
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Effetti allosterici
• Il legame con l’effettore modifica (modula) le proprietà di legame del substrato.
• La velocità dipende da [S] come una sigmoide.
[S]
v
v = K + [S]n
Vmax [S]n
n = indice di cooperatività
Emoglobina
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Vie metaboliche
• Una via metabolica è data da un insieme di reazioni catalizzate da enzimi che si susseguono l’una all’altra.
• Le vie metaboliche sono regolate:
A B C D E
A B C D E
A B C D E
H K X Y Z
P
Inibizione da prodotto
Attivazione da substrato
Attivazione compensatoria
129
130
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Vie metaboliche ramificate
Inibizione multivalente
Inibizione cooperativa
A B C D
E F G
K X Y
A B C D
E F G
K X Y
v.2.0 © gsartor 2001-2019 B06 - Cinetica enzimatica - 132 -
Vie metaboliche ramificate
Inibizione cumulativa
Inibizione di enzimi multipli
A B C D
E F G
Z X Y
H K I
A B C D
E F G
K X Y
131
132
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Catabolismo e anabolismo
A B
C
E F
X Y
ZT
S
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Regolazione genica• Un’altra via con la quale viene regolata l’attività di uno o più
enzimi è attraverso l’induzione o la repressione genica della sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica.
• Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi.
DEMOLIZIONE
ENZIMA
AMINOACIDI
RepressioneInduzione
DNA
mRNA SINTESI
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Regolazione genica• Un’altra via con la quale viene regolata l’attività di uno o più
enzimi è attraverso l’induzione o la repressione genica della sintesi proteica di quella proteina con attività enzimatica.
• Anche per gli enzimi esiste una sorta di omeostasi.
DEMOLIZIONE
ENZIMA
AMINOACIDI
RepressioneInduzione
DNA
mRNA SINTESI
Crediti e autorizzazioni all’utilizzo• Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica:
– CHAMPE Pamela , HARVEY Richard , FERRIER Denise R. LE BASI DELLA BIOCHIMICA [ISBN 978-8808-17030-9] – Zanichelli
– NELSON David L. , COX Michael M. I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER - Zanichelli – GARRETT Reginald H., GRISHAM Charles M. BIOCHIMICA con aspetti molecolari della Biologia
cellulare - Zanichelli– VOET Donald , VOET Judith G , PRATT Charlotte W FONDAMENTI DI BIOCHIMICA [ISBN 978-
8808-06879-8] - Zanichelli
• E dalla consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali:– Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes http://www.genome.ad.jp/kegg/– Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/– Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/– Rensselaer Polytechnic Institute:
http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb1/MB1index.html
• Il materiale è stato inoltre rivisto e corretto dalla Prof. Giancarla Orlandini dell’Università di Parma alla quale va il mio sentito ringraziamento.
Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da: http://www. gsartor.org/pro
• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna
Giorgio SartorUfficiale: [email protected]: [email protected]
Aggiornato il 06/03/2019 12:14:10
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