1

Rezumatul tezei de doctorat

„IMPLICAȚIILE POLIMORFISMELOR GENELOR MDR1, CYP 2C9 ȘI CYP 2C19 ÎN

EPILEPSIA REFRACTARĂ”

Doctorand: Octavia Sabin

Conducător: Prof. Dr. Anca-Dana Buzoianu

Cuvinte cheie: epilepsie refractară, proteina de eflux, enzime de metabolizare, polimorfism

genetic, MDR1, CYP2C9, CYP2C19

CUPRINS

INTRODUCERE 13

STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII

1. Epilepsia – definiție, clasificare 17

2. Farmacogenetica epilepsiei 19

2.1. Ipoteze privind cauzele epilepsiei refractare 20

2.2. Variabilitatea sistemului CYP 450 21

2.3 Glicoproteina P 28

CONTRIBUŢIA PERSONALĂ

1. Ipoteza de lucru/obiective generale 39

2. Metodologie generală 39

3. Studiul 1 Evaluarea frecvenței polimorfismelor genelor

CYP2C9, CYP2C19 și MDR1 la epileptici 47

4. Studiul 2 Corelarea concentrațiilor de valproat cu

polimorfismele CYP2C9, CYP2C19 și MDR1 69

5. Studiul 3 Studiul polimorfismelor genei MDR1 în epilepsia

refractară 101

6. Concluzii generale (sinteză) 119

7. Originalitatea şi contribuţiile inovative ale tezei 121

REFERINŢE 123

2

STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII

Farmacogenomica cercetează modul în care variaţiile genomului uman influenţează

răspunsul la medicamente şi permite adaptarea medicaţiei la constelaţia genetică individuală a

pacientului sub forma tratamentelor individualizate, croite pe bolnav, cu eficacitate şi siguranţă

crescute. Primii pași au fost făcuți prin studierea unor mutații specifice în anumite tipuri de

cancer, ceea ce a permis utilizarea unor medicamente anticanceroase specifice. Astfel, analiza

genotipică înaintea administrării medicamentelor este absolut necesară în anumite situații

particulare, dar pare să fie o abordare clinică promiţătoare și în tratamentul altor maladii, în

vederea reducerii efectelor adverse ale medicamentelor şi creşterea eficacităţii acestora.

Epilepsia reprezintă un grup de boli neurologice cronice caracterizate prin manifestări

paroxistice recurente prezente la peste 50 de milioane de persoane în lume (incidenţă de 0.5-1%),

caracterizate prin episoade recurente critice convulsive sau non-convulsive, provocate de

descărcări focale sau generalizate cerebrale. Acestea pot fi controlate medicamentos la peste

două treimi din pacienți, dar rămâne un număr foarte mare de persoane la care crizele epileptice

sunt dificil de controlat, în ciuda unui tratament antiepileptic bine condus și adecvat. Formele

refractare la tratament sunt asociate cu un risc crescut de mortalitate şi consecinţe psihosociale

debilitante.

Una din cele mai la îndemână ipoteze este modificarea farmacocineticii medicamentelor

antiepileptice, de exemplu variabilitatea afinității enzimelor de metabolizare. Mutaţiile în genele

CYP pot produce abolirea, reducerea, alterarea sau creşterea activităţii enzimatice, respectiv mai

multe exprimări fenotipice ale indivizilor: metabolizatori lenţi, intermediari, rapizi şi

metabolizatori ultrarapizi. Prin obținerea unor concentrații plasmatice subterapeutice, răspunsul

terapeutic poate să fie nesatisfăcător.

Pentru pacienții la care se ating concentrații plasmatice corespunzătoare, au fost emise mai

multe ipoteze privind etiologia multirezistenţei la tratamentul antiepileptic. Principalele două

concepte care încearcă să explice această multirezistență sunt 1) ipoteza modificării țintei de

acțiune și 2) ipoteza modificării funcției proteinelor de eflux. Prima ipoteză se bazează pe studii

care au arătat că unele modificări structurale sau anomalii la nivelul reţelei neuronale şi în

funcţionarea unor neurotransmiţători care apar la pacienții epileptici, pot fi cauze de rezistenţă

la tratamentul farmacologic antiepileptic, adică boala este caracterizată de modificarea țintei de

acțiune. A doua ipoteză a pornit de la observația că unul din principalele obstacole în tratarea

bolilor cerebrale, inclusiv epilepsia, este slaba penetrare prin bariera fiziologică ce separă țesutul

cerebral de sânge, bariera hemato-encefalică (BHE). Pe lângă joncțiunile intercelulare foarte

strânse, la nivelul BHE există o densitate crescută a transportorilor ABC care conferă rezistență

multiplă medicamentoasă. Pornind de la această idee și de la observaţia că pacienţii cu epilepsie

refractară la tratament sunt nonresponsivi la mai multe antiepileptice, care acţionează prin

diferite mecanisme moleculare de acţiune clinice, s-a sugerat intervenţia unui mecanism

nespecific care limitează eficacitatea antiepilepticelor, prin supraexprimărea transportorilor de

eflux la nivelul BHE. Prototipul acestor transportori este glicoproteina P (P-gp).

Enzimele citocromului P450 prezente în ficat şi tractul gastro-intestinal au o istorie

îndelungată de studii farmacogenetice, care au dovedit o relevanţă clinică a polimorfismelor, în

special a CYP2C9, CYP2C19 şi CYP2D6. CYP2C9 este implicată în metabolismul a mai mult

3

de 100 de medicamente, incluzând anticoagulantele orale cumarinice, sulfonilureele, inhibitorii

de angiotensină şi o parte din antiinflamatoarele nonsteroidiene. Studiile în vitro au arătat că

CYP2C9*3 este asociat cu scăderea cleareance-ului intrinsec al medicamentelor într-o mai mare

măsură decât CYP2C9*2. Cel puţin una din variantele CYP2C9*2 sau*3 sunt întâlnite la

aproximativ 20% şi respectiv 12 % din populaţia caucaziană, aproximativ 2,5 % sunt homozigoţi

pentru aceste alele sau heterozigoţi tip *2/*3 . Rămân două treimi din populaţia caucaziană cu

tipul sălbatic, cu activitate enzimatică normală. Pentru CYP2C19, homozigoţii pentru alelele de

tip sălbatic la nivelul exonului 5 şi 4 (1*/1*) au fost clasificaţi ca metabolizatori rapizi

homozigoţi (homMR), mutaţiile de tip *1/*2, *1/*3 ca metabolizatori rapizi heterozigoţi

(hetMR), iar restul combinaţiilor *2/*2, *2/*3, *3/*3 sunt metabolizatori lenţi (ML). Varianta

CYP2C19*2 este relativ comună la populaţia caucaziană, de aproximativ 15% spre deosebire de

varianta CYP2C19*3 prezentă în proporţie de 0,04%. Aceasta din urmă este mult mai frecventă

in populaţiile asiatice si la afro-americani (0,4% şi 5 %)

Fenitoina, un antiepileptic utilizat la scara largă, este un exemplu de medicament la care

apar diferenţe interindividuale de farmacocinetică, atribuite in mare măsură unor factori genetici

cum ar fi polimorfismul CYP2C9. Fenitoina este metabolizată în mare măsură de enzima

CYP2C9 şi o parte şi de enzima CYP2C19 rezultând metabolitul 5-(parahidroxifenil)-

fenilhidantoin. Reducerea semnificativă a cleareance-ului fenitoinei (până la 40% in cazul

mutaţiilor genei CYP2C9 faţă de varianta sălbatică) a fost observată şi in vivo la pacienţi aflaţi

sub tratament antiepileptic , demonstrându-se că mutația CYP2C9 (în special alela *3) este

asociată cu risc crescut de apariție a toxicității neurologice induse de fenitoină . În cazul

mefenitoinei, defectele de metabolizare pot fi atribuite la mai mult de 10 alele ale genei care

exprimă CYP2C19.

În cazul diazepamului şi a fenitoinei, primul metabolizat de CYP2C19, al doilea fiind

substrat al CYP2C9, s-a observat o diferenţă de maxim 2 ori a cleareance-ul hepatic sau a ariei

de sub curbă (AUC) a concentraţiei plasmatice în funcţie de timp între metabolizatorii lenţi şi

metabolizatorii rapizi. În cazuri rare, acidul valproic poate fi metabolizat într-un produs

hepatotoxic, acid 4-ene-valproic. Datele existente nu lămuresc deocamdată dacă variantele

genetice ale enzimei implicate CYP2C9 sunt responsabile pentru această problemă. În acelaşi

mod, metabolitul activ al carbamazepinei, carbamazepin-10,11-epoxide, este transformat de

epoxid hidroxilaza microzomială, o enzima care este de asemenea înalt polimorfică, dar

farmacocinetica şi consecinţele clinice vor trebui evaluate . Clobazamul este o benzodiazepină

utilizată în tratamentul epilepsiei refractare, la care principalele căi de metabolizare sunt

demetilarea de către CYP3A4 şi CYP2C19, precum şi hidroxilarea metabolitului activ N-

desmetilclobazam de către CZP2C19. CYP 2C19 este implicat în metabolismul hexobarbitalului,

mefobarbitalului şi a fenobarbitalului în variate grade, însă această cale este responsabilă doar de

o mică parte a biotransformării şi eliminării fenobarbitalului. Mefobarbitalul urmează o cale de

metabolizare stericoselectivă. R-mefobarbitalul este metabolizat prin CYP2C19, iar un studiu

japonez a demonstrat o creştere de 92 de ori a ariei de sub curbă a concentraţiei în funcţie de

timp la metabolizatorii lenți faţă de metabolizatorii rapizi, timpul de înjumătăţire fiind de

4

asemenea prelungit. Această diferenţă enormă poate constitui un motiv suficient care să justifice

genotiparea pe scară largă a pacienţilor epileptici, mai ales a celor cu forme multirezistente.

Glicoproteina P (P-gp) acţionează ca şi o pompă membranară activă prin hidroliza ATP-

ului, dirijând fluxul substanţelor substrat specifice împotriva unui gradient de concentraţie.

Localizările P-gp sugerează rolul deţinut de aceste proteine, acela de detoxifiere şi protecţie a

organismului faţă de metaboliţii şi xenobioticele toxice, prin excreţia acestora în bilă, urină, în

lumenul intestinal şi prin prevenirea acumulării lor în creier, testicule şi în organismul fătului. P-

gp este codificată de o mică familie de gene, ce reuneşte la om 2 gene denumite MDR1

(ABCB1) şi MDR2 (ABCB4). Aceste gene sunt situate una lângă cealaltă pe cromozomul 7

(7q21) . Gena MDR1 codifică transportorul specific pentru medicamente responsabil de

fenotipul polirezistenţei medicamentoase și gena MDR2 codifică un transportor pentru

fosfatidilcolină la nivelul canaliculilor biliari.

Epilepsia refractară la tratament se asociază cu o supraexprimare a proteinelor

transportoare la nivel cerebral, fapt dovedit prin mai multe studii in vivo şi in vitro. Patologia

lobului temporal a fost cel mai studiat focar epileptogen din punctul de vedere al reglării

transportului medicamentelor la nivel cerebral. Tishel şi colab. au evidenţiat o creştere de 10 ori

a ARNm MDR1 în ţesutul cerebral extirpat, la 11 din 19 pacienţi la care s-a practicat lobectomie

temporală, comparativ cu ţesut cerebral normal. Dombrovski şi colaboratorii au decelat o

supraexprimare a MDR1, MRP2 şi MRP5 în celulele endoteliale izolate din vasele temporale ale

unor probe de țesut prelevate de la 5 pacienţi cu epilepsie refractară, tratată prin lobectomie

temporală.

O problemă importantă este mecanismul prin care se ajunge la această supraexprimare a

transportorilor de eflux la nivel cerebral. Supraexprimarea transportorilor în creierul pacienţilor

cu epilepsie poate fi constitutivă, dobândită sau mixtă, prin asocierea acestora. Supraexprimarea

constitutivă poate apărea ca şi rezultat al unei predispoziţii genetice sau poate şi intrinsecă

dezvoltării unei patologii specifice. Forma dobândită poate apărea în contextul unor crize

epileptice frecvente sau poate fi indusă de antiepilepticele utilizate în scopul prevenirii crizelor.

Până în prezent majoritatea studiilor au demonstrat implicarea ambelor mecanisme.

Testarea ipotezei genetice a rezistenţei medicamentoase a fost realizată într-un studiu

amplu de către Siddiqui. S-a realizat genotiparea a 315 pacienţi de rasă caucaziană diagnosticaţi

cu epilepsie cronică (200 de pacienţi cu epilepsie rezistentă la tratament şi 115 responsivi) şi 200

de pacienţi fără epilepsie. Pacienţii cu formă refractară de boală au prezentat în procent mai mare

genotipul 3435 CC decât genotipul 3435TT, comparativ cu pacienţii responsivi sau cu lotul

control . Asocierea răspunsului la terapia farmacologică şi genotipul C3435T observată în aceste

studii nu a fost confirmată în altele care au inclus pacienţi cu caracteristici etnice similare. O

meta-analiză a 11 studii (3371 de pacienți din care 1646 de pacienți cu epilepsie refractară și

1725 pacienți de control) care au urmărit influența mutației C3435T asupra epilepsiei refractare,

a demonstrat că nu există diferențe în privința frecventei mutațiilor la populația refractară la

tratament și populația care răspunde la tratament. Studiile privind disponibilitatea

medicamentelor asociate cu polimorfisme prezintă în cele mai multe cazuri date discordante

5

explicabile de heterogenitatea haplotipurilor în diferitele populaţii şi numărul relativ redus de

probe analizate, precum și datorită studierii unui număr mic de mutații (în special a

polimorfismului C3435T). Studierea mai multor gene candidate și analiza multivariabilă a

rezultatelor este direcția de urmat.

CONTRIBUŢIA PERSONALĂ

În această teză am evaluat influența polimorfismelor genelor care codifică proteina de

eflux P-gp (MDR1 sau ABCB1) precum și a unor enzime de metabolizare (CYP2C9 și

CYP2C19) asupra frecvenței epilepsiei idiopatice sau secundare, asupra concentrațiilor

plasmatice ale medicamentelor antiepileptice și asupra răspunsului la tratamentul antiepileptic

farmacologic.

Studiul 1 - Evaluarea frecvenței polimorfismelor genelor CYP2C9, CYP2C19 și MDR1 la

epileptici

Obiectivul principal al acestui studiu au fost evaluarea frecvențelor de apariție ale

polimorfismelor ABCB1 (MDR1) C3435T, G2677T/A și a T129C precum și a CYP2C9 și

CYP2C19 la pacienți cu epilepsie și compararea datelor obținute cu frecvențele acestor variante

la populația de control. Secundar, am comparat frecvențelor de apariție ale genotipurilor MDR1,

CYP2C19 și CYP2C9 în populația din România cu frecvențele întâlnite în alte populații

caucaziene și asiatice.

Studiul a evaluat 101 de pacienți diagnosticați cu epilepsie idiopatică sau secundară

conform criteriilor stabilite ILAE la acea dată. Am folosit ca și grup de control 126 de voluntari

sănătoși pentru MDR1 G2677T/A și T-129C, petru restul date publicate anterior de la voluntari

sănătoși din aceeași regiune geografică ca și lotul cu epilepsie.

S-au studiat patru polimorfisme ale genei MDR1 pentru proteina de eflux P-gp (C3435T,

T129C, G2677A și G2677T), 2 polimorfisme pentru CYP2C9 și respectiv 2 polimorfisme ale

CYP2C19.

Frecvențele de apariție ale mutațiilor CYP2C9 respectiv CYP2C9*2 (C416T) și

CYP2C9*3 (A1061C)9, nu au fost semnificativ diferite în lotul pacienților epileptici față de

populația control. Frecvența de apariție a variantelor CYP2C19 studiate respectiv CYP2C19*1,

CYP2C19*2 și CYP2C19*3 nu au fost semnificativ diferite în lotul pacienților epileptici față de

populația control.

Au fost determinate pentru prima oară pe o populație din România, frecvențele

polimorfismelor pentru mutațiile MDR1 G2677T/A și T-129C. Genotipurile MDR1 G2677T/A a

avut o frecvență de apariție de 37% pentru varianta sălbatică GG, 45% pentru heterozigoții GT,

15% pentru homozigoții mutanți TT, 2% pentru heterozigoți GA și respectiv 1% pentru TA.

Genotipurile T-129C al genei MDR1 a avut o frecvență de apariție de 95% pentru forma

homozigotă sălbatică TT și de 5% pentru heterozigot TC. Nu au fost depistate forme homozigote

mutante CC.

6

Comparând frecvențele MDR1 G2677T/A obținute în acest studiu pe lotul de subiecți

sănătoși cu alte rezultate obținute atât pe populație europeană cât și asiatică, nu au fost remarcate

diferențe semnificative statistic între populația din România și celelalte populații europene, dar

au fost observate diferențe semnificative comparativ cu populația asiatică. Aceste date corespund

observațiilor anterioare privind frecvența MDR1 G2677T/A. În privința studiului efectuat pe

mutația T-129C , a fost observată o frecvență mai mare a genotipurilor heterozigote în populația

asiatică. Nu au fost remarcate diferențe semnificativ statistic comparativ cu populații europene

evaluate în alte studii. Comparând frecvențele genotipurilor 2677 din studiul nostru s-a observat

o frecvență mai scăzută a variantei sălbatice GG la pacienții epileptici față de control, dar fără a

avea semnificație statistică. Compararea frecvențelor alelelor MDR1 G2677T la pacienții cu

epilepsie idiopatică, respectiv epilepsie secundară cu lotul de control nu a demonstrat o diferență

semnificativă statistic pentru niciunul dintre grupuri, cu excepția alelei A, mai frecventă la lotul

cu epilepsie idiopatică.

Comparând frecvența formei heterozigote TC a T-129C în funcție de tipul de epilepsie

remarcăm o diferență între frecvența mai mare a genotipului la cei epilepsie secundară, față de

cei cu epilepsie idiopatică. Având în vedere că această diferență nu este semnificativă, prin

compararea lotului cu epilepsie secundară cu lotul de control, acest rezultat poate fi datorat

probabil erorilor date de faptul că lotul studiat este mic și frecvența apariției mutației este de

asemenea redusă.

Studiul 2 - Corelarea concentrațiilor de valproat cu polimorfismele CYP2C9, CYP2C19 și

MDR1

Acest studiu evaluează variațiile concentrațiilor plasmatice ale unui medicament

antiepileptic, acidul valproic, în funcție de polimorfismele genelor pentru enzimele microzomale

CYP2C9, CYP2C19 și pentru proteina transportoare P-gp (MDR1) pentru a putea face o

eventuală corelație între concentrațiile plasmatice și anumite mutații genetice. Secundar se

determină corelația dintre răspunsul la tratament și concentrațiile plasmatice ale acidului

valproic.

Studiul a evaluat 74 de pacienți epileptici aflați sub tratament cu acid valproic

(medicament antiepileptic unic sau asociat cu alte medicamente antiepileptice), pacienți aflați la

steady-state (doză constată de aprox o lună) Acestor pacienți li s-au determinat concentrațiile

serice ale valproatului și polimorfismele genetice ale CYP2C9, CYP2C19 și MDR1.

Din cei 74 de pacienți evaluați în studiu, 43 (58,1%) au fost femei și 31 (41,9%) bărbați.

Împărțirea în funcție de tipul de epilepsie a arătat o frecvență de 62,2% (46 de cazuri) de

epilepsie idiopatică și 37,8% (28 de cazuri) de epilepsie secundară. Tipul de epilepsie nu se

corelează cu vârsta, indicele de masă corporală, suprafața corporală, sau cu sexul pacienților.

S-au observat diferențe semnificative statistic ale dozelor utilizate, ale dozei pe suprafaţa

corporală (D/SC), precum și a raportului dintre dozele utilizate și concentrația plasmatica a

valproatului (D/C) între pacienții cu monoterapie și cei cu politerapie antiepileptică, în sensul

utilizării unor doze mai mari la pacienții cu politerapie.

O cincime din pacienții studiați au avut concentrații plasmatice ale valproatului sub limita

inferioară terapeutică de 50 mg/l, dar un singur pacient non-responder (3,5% din totalul de non-

7

responderi) a avut valori foarte reduse ale concentrației plasmatice a valproatului (2,06 mg/l). La

ceilalți 5 pacienți non-responderi cu concentrația plasmatică sub 50 mg/l, concentrațiile

plasmatice s-au situat în jurul valorii de 40 mg/l. Cu toate acestea jumătate din pacienți au fost

încadrați ca non-responder. Putem, deci, presupune că mecanismele care determină rezistența la

acești pacienți sunt mult mai complexe decât simpla neatingere a concentrațiilor considerate

terapeutice. De fapt doar un număr de 3 pacienți non-responder au concentrații supraterapeutice.

Dar având în vedere că, statistic, nu avem diferențe semnificative între mediile concentrațiilor

plasmatice la responder și non responder(p=0,36), putem presupune că, în cazul loturilor studiate

de noi, mecanismul de apariție a rezistenței nu depinde în mare măsură de concentrațiile

plasmatice ale valproatului. Dozele de valproat utilizate la non-responderi sunt semnificativ mai

mari față de responder (p<0,001). Raportul doza utilizată pe concentrație este de asemenea

modificat semnificativ la pacienții non-responderi (p=0,001)

Concentrațiile plasmatice ale valproatului nu diferă semnificativ între loturile de pacienti

cu politerapie și cu monoterapie (p=0,939) precum și nici între cei cu epilepsie idiopatică și cei

cu epilepsie secundară (p=0,581)

Prezenta alelei C pentru 129 reduce semnificativ statistic concentrațiile plasmatice ale

valproatului până la valori subterapeutice, însă alte mutații observate pentru MDR1 C3435T,

G2677T, CYP2C19 nu influențează semnificativ concentrațiile plasmatice ale acidului valproic

și a raportului doză pe concentrație. În schimb, genotipul CYP2C9*2/*3 crește concentrația

valproatului până la valori supraterapeutice (dar fără semnificație statistic)

Studiul 3 - Studiul polimorfismelor genei MDR1 în epilepsia refractară

Ultimul studiu al tezei cercetează influența polimorfismelor MDR1 C3435T, G2677T/A și

T-129C ale genei transportorului membranar P-gp, asupra răspunsului la terapia antiepileptică.

Adiacent s-a efectuat analiza în lotul studiat a unor parametrii asociați , ca durata medie a bolii,

tipul de epilepsie.

În studiu au fost incluși 70 de pacienți diagnosticaţi cu epilepsie, aflați pe un regim stabil

de tratament antiepileptic de minim o lună. Pacienții au fost urmăriți timp de un an, cu minim

patru vizite la medic. La sfârșitul acestei perioade s-a stabilit dacă pacienții răspund sau nu la

tratament. Responderii sunt pacienții fără nici o criză epileptică timp de un an sub tratament

antiepileptic. Au fost excluși din studiu pacienții cu răspuns terapeutic nedefinit (potrivit

criteriilor ILAE), adică pacienții la care răspunsul la terapia adecvată nu poate fi definit nici ca

refractar (responder), nici cu răspuns pozitiv la tratament, non-responder (de exemplu pacienții

care post intervenție au încetat să mai aibă crize, dar nu este încă satisfăcut criteriul de timp sau

pacienții care mai au crize , dar s-a încercat numai o schemă de tratament). Pentru comparare, s-a

utilizat un lot martor de voluntari sănătoși.

În acest studiu s-au urmărit trei polimorfisme ale MDR1, respectiv C3435T, G2677T/A și

T-129C, dar nu s-a reușit demonstrarea unei asocieri între prezența anumitor polimorfisme și

epilepsia refractară la tratament în loturile studiate . Genotipurile C3435T al genei MDR1 au

avut o frecvență de apariție la cazurile de pacienți epileptici de 20% pentru homozigot sălbatic

CC, de 54,3% pentru hetrozigoții CT și 25,7% pentru homozigoții mutanții CC. Genotipurile

MDR1 G2677T/A a avut o frecvență de apariție de 32,9% pentru varianta sălbatică GG, 47,1%

pentru heterozigot GT, 14,3% pentru homozigot mutant TT, 1,4% pentru heterozigot GA și

8

respectiv 4,3% pentru TA . Genotipurile T-129C al genei MDR1 a avut o frecvență de apariție de

92,9% pentru forma homozigotă sălbatică TT și de 7,1% pentru heterozigot TC. Nu au fost

depistate forme homozigote mutante CC. Prezența polimorfismelor C3435T, G2677T/A și T-

129C ale genotipului MDR1 (ABCB1) la pacienții epileptici din loturile studiate nu a fost

asociată cu răspunsul la tratamentul cu medicamente antiepileptice, având frecvențe de apariție

care nu diferă semnificativ la pacienții responderi și la cei nonresponderi.

52,86% din de pacienții epileptici incluși în studiu nu au avut un răspuns adecvat la

tratamentul antiepileptic. Frecvența pacienților non-responderi este mai crescută decât în studiile

care arată o frecvență de aproximativ 30-35% a epilepticilor care nu răspund la tratament.

Aceasta se datorează probabil unei adresabilității mai mari a acestor pacienți la un centru

regional cum este Clinica de Neurologie a Spitalului Județean Cluj.

A fost observată și o medie a duratei bolii semnificativ crescută pentru pacienții non-

responderi (p=0,0032) care poate fi explicată de asemenea printr-o adresabilitate mai mare către

Clinica de Neurologie a pacienților care au probleme în a controla prin medicație crizele

epileptice. Exisă o diferență semnificativă statistic și între durata boli în cazul epilepsiei

idiopatice față de epilepsia secundară, în sensul creșterii duratei bolii pentru epilepsia idiopatică

(p=0,042). Având în vedere că nu există diferențe semnificative între mediile vârstei celor două

categorii de pacienți, probabil această diferență este dată de debutul epilepsiei idiopatice la o

vârstă mai mică în raport cu epilepsia secundară.

Concluzii generale

1. Mutațiile MDR1 G2677T/A și T-129C, au fost determinate pentru prima oară pe o

populație din România,

2. Frecvențele polimorfismelor CYP2C9, CYP2C19 și MDR1 detectate nu sunt diferite față

de ale studii efectuate pe alte populații caucaziene europene, dar semnificativ diferite față

de frecvențele din populații asiatice.

3. Alela A pentru MDR1 G2677T/A, mai frecventă în populația cu epilepsie idiopatică, în

rest nu sunt diferențe ale frecvențelor mutațiilor CYP 2C9, CYP2C19, MDR1 studiate în

populația epileptică generală față de populația control.

4. Pentru genotipul MDR1 -129 TC s-au observat frecvențe mai crescute la pacienții cu

epilepsie secundară comparativ cu cei cu epilepsie idiopatică.

5. O cincime din populația studiată a avut valori ale concentrațiilor valproatului sub valorile

minime terapeutice (<50 mg/l)

6. Prezenta alelei C pentru 129 reduce semnificativ statistic concentrațiile plasmatice ale

valproatului până la valori subterapeutice.

7. Genotipul CYP2C9*2/*3 crește concentrația valproatului până la valori supraterapeutice

(dar fără semnificație statistic)

8. Nu au fost evidențiate asocieri între polimorfismele C3435T, G2677G/A și T-129C ale

MDR1 (ABCB1) și răspunsul la tratamentul cu medicamente antiepileptice

9

Summary of the PhD thesis

“IMPLICATIONS OF MDR1, CYP 2C9 AND CYP 2C19 GENE POLYMORPHISMS IN

REFRACTORY EPILEPSY”

PhD candidate: Octavia Sabin

Scientific Coordinator: Prof. Dr. Anca-Dana Buzoianu

Keywords: refractory epilepsy, efflux protein, drug-metabolizing enzymes, genetic

polymorphism, MDR1, CYP2C9, CYP2C19

TABLE OF CONTENTS

INTRODUCTION 13

CURRENT KNOWLEDGE

1. Epilepsy – definition, classification 17

2. Epilepsy pharmacogenetics 19

2.1. Hypotheses on the causes of refractory epilepsy 20

2.2. Variability of CYP 450 system 21

2.3. P Glycoprotein 28

PERSONAL CONTRIBUTION

1. Research hypothesis/general objectives 39

2. General methodology 39

3. Study 1 Evaluation of CYP2C9, CYP2C19 and MDR1

polymorphism frequency in epilepsy populations 47

4. Study 2 Correlation between valproic acid concentrations

and CYP2C9, CYP2C19 and MDR1 polymorphisms 69

5. Study 3 Study of MDR1 polymorphism in refractory epilepsy 101

6. General conclusions (summary) 119

7. Original and innovative contributions of the thesis 121

REFERENCES 123

10

CURRENT KNOWLEDGE

Pharmacogenomics analyses how human genome variations influence an individual’s

response to drugs. It allows adaptation of medication to the individual’s specific genetic markup

by means of individualized treatment options, optimized for each patient, highly effective and

secure. The first steps were taken with the analysis of specific mutations in certain types of

cancer, which made possible the use of specific cancer drugs. In particular cases, genotype

analysis is an absolutely necessary step before prescribing drug therapy. However, it seems to be

a promising clinical approach in the treatment of other diseases as well, to minimize drug side

effects and increase drug efficiency.

Epilepsy is a group of long-term neurological disorders characterized by repeated

epileptic seizures. More than 50 million people in the world have epilepsy (incidence of 0.5-1%),

characterized by recurrent episodes of critical or non-critical seizures, determined by focal or

generalized nerve cell activity in the brain. Seizures are controllable with medication in over

two-thirds of the patients, but there is still a large number of people in which epileptic crises are

difficult to control, in spite of well-managed and adequate antiepileptic therapy. Refractory

forms of epilepsy are associated with high mortality and debilitating psycho-social

consequences.

One of the most common hypotheses is the modification of antiepileptic drug

pharmacokinetics, for instance the variability of drug-metabolizing enzyme affinity. Mutations in

CYP genes can eliminate, reduce, alter or increase enzyme activity, respectively more individual

phenotype expressions: slow, intermediate, rapid and ultra-rapid metabolizers. By obtaining

lower than therapy-level plasma concentrations, the therapeutic response can be unsatisfactory.

In patients with adequate plasma concentrations, several hypotheses have been issued

concerning the etiology of multidrug resistance to antiepileptic therapy. The main two concepts

attempting to explain this multidrug resistance are 1) modification of action target and 2)

modification of efflux protein function. The first hypothesis is based on studies showing that

certain structural modifications or anomalies in the neuronal network and in the activity of

certain neurotransmitters occurring in epileptic patients can be caused by resistance to

antiepileptic drug therapy, i.e. the disorder is characterized by the modification of the action

target. The second hypothesis resulted from the observation that one of the main obstacles in

treating neurological disorders, including epilepsy, is the weak penetration through the

physiological barrier separating the brain tissue from the blood, i.e. the blood-brain barrier

(BBB). In addition to the very tight intercellular junctions, there is a high density of ABC

transporters at BBB, which determines multiple drug resistance. Starting from this idea and from

the observation that refractory epilepsy patients are non-responsive to several antiepileptic drugs

with different clinical mechanisms of action, a non-specific mechanism was suggested, which

limits antiepileptic drug efficiency by over-expressing efflux transporters at BBB. The prototype

of these transporters is the P glycoprotein (P-gp).

The cytochrome P450 enzymes in the liver and gastrointestinal tract have a long history of

pharmacogenetic studies, which demonstrated a clinical relevance of polymorphisms, and

especially CYP2C9, CYP2C19, and CYP2D6 polymorphisms. CYP2C9 is involved in the

metabolism of more than 100 drugs, including coumarin oral anticoagulants, sulphonylureas,

11

angiotensin inhibitors and some nonsteroidal anti-inflammatory drugs. In-vitro studies have

shown that CYP2C9*3 is associated with higher decrease in intrinsic clearance as compared to

CYP2C9*2. At least one of the CYP2C9*2 or *3 variants is present in approximately 20%,

respectively 12% of the Caucasian population, approximately 2.5 % are homozygous for these

alleles or heterozygous type *2/*3. The remaining two-thirds of the Caucasian population show

normal enzyme activity. For CYP2C19, homozygous for the wild type alleles in exons 5 and 4

(1*/1*) were classified as homozygous rapid metabolizers (homRM), mutations of type *1/*2,

*1/*3 as heterozygous rapid metabolizers (hetRM), and the remaining combinations *2/*2,

*2/*3, *3/*3 are slow metabolizers (SM). The CYP2C19*2 variant is relatively common in the

Caucasian population, with approximately 15% versus the CYP2C19*3 variant, with 0.04%. The

latter is significantly more frequent in Asian and Afro-American populations (0.4% and 5%)

Phenytoin, a widely-used antiepileptic drug, is an example of inter-individual

pharmacokinetic variation, largely due to genetic factors, such as CYP2C9 polymorphism.

Phenytoin is primarily metabolized by the CYP2C9 enzyme and partially by the CYP2C19

enzyme, to 5-(parahydroxyphenyl)-phenylhydantoin. Significant reduction in phenytoin

clearance (up to 40% for the CYP2C9 mutations as opposed to the wild variant) was also

observed in vivo, in patients receiving antiepileptic therapy, which proves that the CYP2C9

mutation (especially allele *3) is associated with an increased risk of phenytoin toxicity. In

mephenytoin, the metabolism defects can be attributed to more than 10 alleles of the CYPC19

gene.

In diazepam and phenytoin, the first metabolized by CYP2C19 and the second being a

CYP2C9 substrate, a maximum two-fold difference was observed in liver clearance or area under

the curve (AUC) of plasmatic concentration, depending on the time between slow and rapid

metabolizers. In rare instances, valproic acid can be metabolized in a hepatotoxic product, 4-ene-

valproic acid. The existing data is currently inconclusive if this issue is caused by genetic

variants of the CYP2C9 enzyme. Similarly, the active metabolite of carbamazepine,

carbamazepin-10,11-epoxyde, is transformed by microsomal epoxide hydroxylase, an enzyme

which is highly polymorphic, but the pharmacokinetics and the clinical consequences are still to

be evaluated. Clobazam is a benzodiazepine used in refractory epilepsy therapy. Its major

metabolizing pathway involves CYP3A4 and CYP2C19 demethylation, as well as hydroxilation

of N-desmetylclobazam active metabolite by CYP2C19. CYP2C19 is involved in the metabolism

of hexobarbital, mefobarbital and phenobarbital to different degrees, but this pathway is only

partially responsible for phenobarbital biotransformation and elimination. Mefobarbital follows a

stereoselective metabolizing pathway. R-mefobarbital is metabolized by CYP2C19. A Japanese

study demonstrated a 92-fold increase in the time-dependent area under the curve of the

concentration at slow metabolizers versus rapid metabolizers, and half time also extended. This

enormous difference can constitute in itself a justification for large-scale genotyping of epileptic

patients, especially those with multi-resistant forms of epilepsy.

P-glycoprotein (P-gp) acts as an active membrane pump by ATP hydrolysis, by guiding the

flow of specific substrate substances against a concentration gradient. P-gp locations indicate the

12

role of these proteins in cleaning and protecting the body from toxic metabolites and xenobiotics,

by eliminating these substances in the bile, urine, intestinal lumen and preventing their

accumulation in the brain, testicles and fetus. P-gp is coded by a small family of genes, which in

humans comprise 2 genes called MDR1 (ABCB1) and MDR2 (ABCB4). These genes are located

next to each other on chromosome 7 (7q21). MDR1 gene mediates the specific drug transfer

involved in the phenotype of multidrug resistance and MDR2 gene mediates a

phosphatidylcholine transfer in biliary vesicles.

Refractory epilepsy is associated with an overexpression of drug transport proteins in the

brain, which has been demonstrated by several in vivo and in vitro studies. The pathology of the

temporal lobe was the most frequently studied cause of epilepsy involved in the regulation of

drug transport in the brain. Thisel et al. indicated a 10-fold ARNm MDR1 increase in extirpated

brain tissue in 11 out of 19 patients subject to temporal lobectomy as compared to normal brain

tissue. Dombrovski et al. determined an overexpression of MDR1, MRP2 and MRP5 in

endothelial cells isolated from temporal lobe blood vessels of 5 patients with refractory epilepsy,

treated by temporal lobectomy.

An important issue is the mechanism of this overexpression of efflux transporters in the

brain. Overexpression of transporters in the brain of epilepsy patients can be genetic, acquired or

a combination of the two. Genetic overexpression can occur as a result of genetic predisposition

or may be caused by specific pathology. The acquired form can manifest in the context of

frequent epileptic seizures or can be triggered by antiepileptic drugs taken as a seizure prevention

measure. Most of the studies performed until now have demonstrated that both mechanisms are

involved.

The genetic hypothesis of drug resistance was tested in a large study performed by

Siddiqui. The study involved genotyping of 315 Caucasian patients diagnosed with chronic

epilepsy (200 patients with drug resistant epilepsy and 115 drug-responsive patients) and 200

control subjects without epilepsy. As opposed to the patients with drug-responsive epilepsy or

with the control group, patients with drug-resistant epilepsy were more likely to have the CC

genotype at 3435 than the TT genotype. The association between drug therapy response and

C3435T genotype observed in these studies was not confirmed by other studies including

patients with similar ethnic characteristics. A meta-analysis of 11 studies (3371 patients of which

1646 patients with refractory epilepsy and 1725 control subjects) examining the influence of

C3435T mutation on refractory epilepsy demonstrated that there are no differences in mutation

frequencies between the drug-refractory population and the drug-responsive population. Most of

the studies concerning drug availability associated with polymorphisms contain discordant data

explained by the heterogeneity of haplotypes in different populations and a relatively low

number of analyzed samples, but also the small number of studied mutations (especially C3435T

polymorphism). The direction to follow in the future is to study several candidate genes and

perform a multivariable analysis of the results.

PERSONAL CONTRIBUTION

13

In this thesis we assessed the influence of gene polymorphisms mediating the efflux

protein P-gp (MDR1 or ABCB1), and of metabolizing enzymes (CYP2C9 and CYP2C19) on the

frequency of idiopathic or secondary epilepsy, on plasma concentrations of antiepileptic drugs

and on the antiepileptic drug response.

Study 1 - Evaluation of CYP2C9, CYP2C19 and MDR1 polymorphism frequency in

epilepsy populations

The main objective of this study was to evaluate the occurrence frequency of

polymorphisms ABCB1 (MDR1) C3435T, G2677T/A and of T129C, as well as CYP2C9 and

CYP2C19 in epileptic patients and to compare the resulting data with the frequency of these

variants in the control group. Secondarily, we compared the occurrence frequency of MDR1,

CYP2C19 and CYP2C9 genotypes in Romanian population with the frequencies in Caucasian

and Asian populations.

The study evaluated 101 patients diagnosed with idiopathic or secondary epilepsy

according to the established ILAE criteria to that date. We used a control group of 126 healthy

subjects for MDR1 G2677T/A and T-129C, for the remaining data previously published from

healthy subjects in the same geographic area as the epilepsy group.

Four polymorphisms of MDR1 gene were studied for the efflux protein P-gp (C3435T,

T129C, G2677A and G2677T), 2 polymorphisms for CYP2C9 and 2 polymorphisms for

CYP2C19.

The frequency of CYP2C9, respectively CYP2C9*2 (C416T) and CYP2C9*3 (A1061C)9

mutation were not significantly different in the epilepsy group versus the control group. The

frequency of CYP2C19 variants, respectively CYP2C19*1, CYP2C19*2 and CYP2C19*3 were

not significantly different in the epilepsy group versus the control group.

The frequencies of polymorphism frequencies for MDR1 G2677T/A and T-129C

mutations were determined for the first time in a Romanian population. The frequency of MDR1

G2677T/A genotypes was 37% for the wild type GG, 45% for heterozygous GT, 15% for the

mutant homozygous TT, 2% for heterozygous GA, and 1% for TA. The frequency of MDR1 T-

129C genotypes was of 95% for the homozygous wild type TT and 5% for the heterozygous TC.

No homozygous mutant CC variants were detected.

A comparison between the MDR1 G2677T/A frequencies obtained in this study in the

control group and other results obtained both in European and Asian populations revealed no

statistically significant differences between the Romanian population and other European

populations. However, significant differences were observed in comparison with the Asian

population. These conclusions are similar to previous observations concerning MDR1 G2677T/A

frequency. As concerns the study on T-129C mutation, a higher frequency of heterozygous

genotypes was observed in the Asian population. No statistically significant differences were

determined as compared to European populations evaluated in other studies. A comparison

between the 2677 genotypes in our study revealed a lower frequency of wild-type GG in

epileptic patients versus the control group, but with no statistical significance. A comparison

14

between MDR1 G2677T allele frequencies in patients with idiopathic respectively secondary

epilepsy and the control group revealed no statistically significant difference for none of the

groups, except for allele A, which is more frequent in the idiopathic epilepsy group.

A comparison between the frequency of the heterozygous variant TC a T-129C in various

epilepsy types reveals a higher frequency of the genotype in patients with secondary epilepsy

versus idiopathic epilepsy. Given that this difference is not significant when comparing the

secondary epilepsy group with the control group, the result is probably erroneous due to the

small size of the group and the low frequency of the mutation.

Study 2 - Correlation between valproic acid concentrations and CYP2C9, CYP2C19 and

MDR1 polymorphisms

This study examines the variations between plasma concentrations of valproic acid, an

antiepileptic drug, based on gene polymorphisms in microsomal enzymes CYP2C9, CYP2C19

and the transporter protein P-gp (MDR1) to make a correlation between plasma concentrations

and certain genetic mutations. Secondarily, the correlation between the treatment response and

the plasma concentrations of valproic acid is determined.

The study evaluated 74 epileptic patients receiving therapy with valproic acid (an unique

antiepileptic drug associated with other antiepileptic drugs), patients in steady state (constant

dose for approximately one month). These patients were tested for serum concentrations of

valproic acid and genetic polymorphisms of CYP2C9, CYP2C19 and MDR1.

The study comprised 74 patients, of which 43 (58.1%) women and 31 (41.9%) men. The

classification based on epilepsy type indicated a 62.2% frequency (46 cases) of idiopathic

epilepsy and 37.8% (28 cases) of secondary epilepsy. The type of epilepsy is not correlated with

age, body mass index, body surface area or gender.

Statistically significant differences in the doses, dose per body surface area (D/BSA) and

ratio of dose to valproic acid plasma concentration (D/C) were observed in the patients receiving

single-drug versus multidrug antiepileptic therapy, i.e. higher dosing was used in patients

receiving multidrug therapy.

A fifth of the patients in the study had valproic acid plasma concentrations lower than the

minimum therapy values of 50 mg/l, but only one non-responder (3.5% of the total number of

non-responders) had very low valproic acid plasma concentrations (2.06 mg/l). In the other 5

non-responding patients with plasma concentrations under 50 mg/l, plasma concentration values

were at approximately 40 mg/l. However, half of the patients were considered non-responders.

Therefore, we can assume that the mechanisms determining resistance in these patients are much

complicated than the failure to reach the concentrations considered to be at a therapeutic level.

Actually only a number of 3 non-responders have concentrations above the therapy level.

Considering that there are no statistically significant differences between the average plasma

concentrations in responders and non-responders (p=0.36), we can assume that in the groups in

our study the resistance mechanism is not significantly dependent on valproic acid plasma

concentrations. Valproic acid doses given to non-respondents are significantly higher than the

doses given to responders (p<0.001). The dose per concentration ratio is also significantly altered

in non-responders (p=0.001)

15

Valproic acid plasma concentrations are not significantly different in patient groups

receiving single-drug versus multidrug therapy (p=0.939), also between patients with idiopathic

versus secondary epilepsy (p=0.581)

The presence of allele C for 129 determines a statistically significant decrease in valproic

acid plasma concentrations to lower than therapy values, but other observed mutations for MDR1

C3435T, G2677T, CYP2C19 do not significantly influence the valproic acid plasma

concentrations or the dose per concentration ratio. However, the CYP2C9*2/*3 genotype

increases valproic acid concentrations to higher than therapy values (but not statistically

significant).

Study 3 - Study of MDR1 polymorphism in refractory epilepsy

The last study of the thesis examines the influence of MDR1 C3435T, G2677T/A and T-

129C polymorphisms, the gene of the P-gp membrane transporter, on the antiepileptic drug

response. Additionally, an analysis of associated parameters, such as average duration of the

disorder or the type of epilepsy was performed.

The study included 70 patients diagnosed with epilepsy on a stable drug regimen of at

least one month. The patients were monitored for a year, with minimum of four follow-up up

visits. At the end of this period, the patients were classified as responsive or non-responsive to

treatment. Responders are patients having no epilepsy seizures for a year of antiepileptic therapy.

The study did not include patients with undefined therapy response (according to ILAE criteria),

i.e. patients in which response to adequate therapy cannot be defined as refractory (responder),

with a positive response to therapy, non-responders (for instance patients who ceased to have

seizures after the intervention, but the time criterion is not fulfilled yet or patients who still have

seizures, but only one therapy plan was attempted). A control group of healthy subjects was used

for comparison.

The study monitored three MDR1 polymorphisms, C3435T, G2677T/A and T-129C, but

could not demonstrate an association between the presence of certain polymorphisms and drug

refractory epilepsy in the studied groups. The MDR1 C3435T genotype frequencies in epileptic

patients were of 20% for homozygous wild-type CC, 54.3% for heterozygous CT and 25.7% for

homozygous mutant CC. The frequency of MDR1 G2677T/A genotypes was of 32.9% for the

wild-type GG, 47.1% for heterozygous GT, 14.3% for the mutant homozygous TT, 1.4% for

heterozygous GA, and 4.3% for TA. The frequency of MDR1 T-129C genotypes was of 92.9%

for the homozygous wild-type TT and 7.1% for the heterozygous TC. No homozygous mutant

CC variants were detected. The presence of MDR1 (ABCB1) genotype C3435T, G2677T/A and

T-129C polymorphisms in epilepsy patients in the studied groups was not associated with the

antiepileptic drug therapy response, as the occurrence frequencies were not significantly different

in responder versus non-responder patients.

Of the patients included in the study, 52.86% did not have an adequate response to

antiepileptic drug therapy. The frequency of non-responder patients is higher than in studies

indicating an approximate 30-35% frequency of non-responsive epileptic patients. This is

probably due to easier access of these patients to a regional clinical center, the Neurology Clinic

of the Cluj County Hospital.

16

The average duration of the disease was significantly longer in non-responsive patients

(p=0.0032), a fact that can also be attributed to easier access to the Neurology Clinic of the

patients with difficulties controlling epileptic seizures with drug therapy. There is also a

statistically significant difference between the duration of the idiopathic versus secondary

epilepsy, with an increased duration in the case of idiopathic epilepsy (p=0.042). Given that there

are no significant differences between the average ages of the two patient categories, this

difference is probably determined by the earlier onset of idiopathic epilepsy versus secondary

epilepsy.

General conclusions

9. MDR1 G2677T/A and T-129C mutations were determined for the first time in a

Romanian population.

10. The frequencies of CYP2C9, CYP2C19 and MDR1 polymorphisms do not differ from

other studies on other European Caucasian populations, but differ significantly from

frequencies in Asian populations.

11. Allele A for MDR1 G2677T/A is more frequent in idiopathic epilepsy population, but this

is the only difference in frequencies of CYP 2C9, CYP2C19, MDR1 mutations studied in

the general epileptic population versus the control group.

12. For the MDR1 -129 TC genotype higher frequencies were determined in patients with

secondary epilepsy versus patients with idiopathic epilepsy.

13. A fifth of the population in the study had valproic acid concentrations below minimum

therapy values (<50 mg/l).

14. The presence of allele C for 129 determines a statistically significant reduction in plasma

concentrations of valproic acid to lower than normal therapy values.

15. The CYP2C9*2/*3 genotype increases valproic acid concentrations to higher than normal

therapy values (but not statistically significant).

16. No associations were determined between C3435T, G2677G/A and T-129C of MDR1

(ABCB1) polymorphisms and the response to antiepileptic drug therapy.