sắc ký điều chế và ứng dụng

8/11/2019 Sắc ký điều chế và ứng dụng

http://slidepdf.com/reader/full/sac-ky-dieu-che-va-ung-dung 1/47

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh

Trƣờng Đại Học Bách Khoa

Khoa Kỹ Thuật Hóa Học

Môn học: CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

Đề tài số 1: SẮC KÝ ĐIỀU CHẾ VÀ ỨNG DỤNG

GV: TS. Huỳnh Khánh Duy

HVTH:

Nguyễn Quốc Tuấn 13050203

TP. HỒ CHÍ MINH, 1 /2014

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHONWWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM



Sắc ký điều chế và ứng dụng

Trang 2

MỤC LỤC

MỤC LỤC ...................................................................................................................................... 2

PHẦN 1 ........................................................................................................................................... 5

SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾ ................................................................................................. 5

1.1. Nguyên tắc – yêu cầu. .......................................................................................................... 5

1.2. Ưu, nhược điểm và ứng dụng của PTLC. ............................................................................ 5

1.2.1. Ưu điểm. ....................................................................................................................... 5

1.2.2. Nhược điểm. .................................................................................................................. 6

1.2.3. Ứng dụng. ..................................................................................................................... 6

1.3. Pha tĩnh. ............................................................................................................................... 6

1.3.1. Silica gel........................................................................................................................ 6

1.3.2. Nhôm oxit. .................................................................................................................... 7

1.3.3. Cellulose. ...................................................................................................................... 7

1.3.4. Silica gel ghép. .............................................................................................................. 7

1.3.5. Các pha tĩnh khác. ......................................................................................................... 7

1.4. Dung môi. ............................................................................................................................ 8

1.5. Chuẩn bị mẫu sắc ký. ........................................................................................................... 8

1.6. Cách phát hiện trong sắc ký lớp mỏng điều chế. ............................................................... 10

1.6.1. Soi UV. ....................................................................................................................... 10

1.6.2. Phun thuốc thử lên phần không bị che. ....................................................................... 10

1.6.3. Sử dụng hơi iod. .......................................................................................................... 10

PHẦN 2 ......................................................................................................................................... 11

SẮC KÝ CỘT ĐIỀU CHẾ ........................................................................................................... 11

2.1. Các cách tiến hành phân tích sắc ký. ................................................................................. 11

2.1.1. Phương pháp tiền lưu. ................................................................................................. 11

2.1.2. Phương pháp rửa giải. ................................................................................................. 12

2.1.3. Phương pháp rửa đẩy. ................................................................................................. 12

2.2. Cột sắc ký. .......................................................................................................................... 13

2.2.1. Cột phân tích. .............................................................................................................. 13

2.2.2. Chất nhồi cột. .............................................................................................................. 13

2.2.3. Cột chế hóa. ................................................................................................................ 13

2.3. Pha tĩnh. ............................................................................................................................. 13

2.3.1. Silicagel (hay kieselgel của acid silicic) pha thuận. ................................................... 13

2.3.2. Nhôm oxit. .................................................................................................................. 14






Trang 3

2.3.3. Kieselguhr. .................................................................................................................. 15

2.3.4. Polyamide. .................................................................................................................. 15

2.3.5. Silicagel pha đảo. ........................................................................................................ 15

2.3.6. Pha tĩnh cho sắc ký rây phân tử. ................................................................................. 16

2.3.7.Cellulose. ..................................................................................................................... 16

2.4. Kỹ thuật nhồi cột sắc kí. .................................................................................................... 17

2.4.1. Dụng cụ. ...................................................................................................................... 17

2.4.2. Thực hiện. ................................................................................................................... 18

2.5. Pha động............................................................................................................................. 19

2.5.1. Lựa chọn dung môi. .................................................................................................... 19

2.5.2. Dung môi cho sắc ký pha thuận. ................................................................................. 21

2.5.3. Dung môi cho sắc ký pha đảo. .................................................................................... 22

2.5.4.Dung môi cho sắc ký gel. ............................................................................................. 22

2.6. Cách phát hiện trong sắc ký cột điều chế. .......................................................................... 23

2.6.1. UV detector. ................................................................................................................ 23

2.6.2. Refractive detector (RI). ............................................................................................. 23

2.7. Định tính một cột sắc ký. ................................................................................................... 23

2.7.1. Sắc ký đồ. .................................................................................................................... 23

2.7.2. Số đĩa lý thuyết. .......................................................................................................... 25

2.7.3. Chiều cao tương ứng với một đĩa lý thuyết. ............................................................... 25

2.7.4. Chiều cao đĩa lý thuyết đã làm giảm. .......................................................................... 25

2.7.5. Độ phân giải. ............................................................................................................... 26

2.7.6. Thể tích chết. ............................................................................................................... 26

2.8. Phân lập kết quả sắc ký. ..................................................................................................... 27

2.9. Sắc ký cột nhanh (FC – Flash Chromatography). .............................................................. 28

2.9.1. Nguyên tắc. ................................................................................................................. 28

2.9.2. Lựa chọn pha tĩnh phù hợp. ........................................................................................ 28

2.9.3. Khảo sát hệ thống sắc ký trước bằng sắc ký lớp mỏng. .............................................. 29

2.9.4. Từ TLC đến FC. .......................................................................................................... 31

2.9.5. Nạp mẫu lên cột. ......................................................................................................... 31

2.9.6. Rửa giải theo gradient. ................................................................................................ 32

PHẦN 3 ......................................................................................................................................... 34

HPLC ĐIỀU CHẾ ......................................................................................................................... 34

3.1. Nguyên tắc - yêu cầu.......................................................................................................... 34






Trang 4

3.2. Ưu- nhược điểm, khả năng và mức độ ứng dụng. ............................................................. 35

3.3. Pha tĩnh, cách chuẩn bị cột. ............................................................................................... 36

3.3.1. Normal-phase silica gels. ............................................................................................ 37

3.3.2. Reversed-phase silica gels. ......................................................................................... 37

3.4. Cách nhồi cột. .................................................................................................................... 38

3.4.1. Cột kiểu 4.3. ................................................................................................................ 39

3.4.2. Cột kiểu hình 4.4. ........................................................................................................ 39

3.4.3. Chuẩn bị mẫu- Đưa mẫu lên cột. ................................................................................ 39

3.4.4. Với pha đảo (Reverse Phase HPLC Basics for LC/MS). ............................................ 40

3.5. Lựa chọn dung môi- Thay đổi dung môi. .......................................................................... 41

3.6. Phương pha p pha t hiê n va thu nhâ n kết qua sắc ky . .......................................................... 42

3.7. Các ứng dụng cụ thể. ......................................................................................................... 44

PHẦN 4 ......................................................................................................................................... 45

MPLC ĐIỀU CHẾ ........................................................................................................................ 45

4.1. Tổng quan. ......................................................................................................................... 45

4.2. So sánh ưu nhược điểm giữa MPLC và HPLC. ................................................................ 45

4.2.1. Chuyển đổi dung môi. ................................................................................................. 45

4.2.2. Cột nạp mẫu rắn. ......................................................................................................... 45

4.3. Ứng dụng. .......................................................................................................................... 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................ 47






Trang 5

PHẦN 1

SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾ

1.1. Nguyên tắc – yêu cầu.

Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography – PTLC) là một

phương pháp sắc ký được sử dụng để tách một lượng nhỏ đơn chất (10 – 1000 mg) từ

một hỗn hợp đơn giản (chỉ gồm vài cấu tử). Trong PTLC, một dung dịch mẫu thử được

chấm trên một lớp chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxyd) có độ dày từ 0,5 – 2,0

mm tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh. Một

dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử

của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rfkhác nhau. Sau khi khai triển, ta có thể thu được những cấu tử đặc trưng bằng cách cạo

vùng chất hấp phụ chứa vết ra khỏi bản và phản hấp phụ chất ra khỏi giá hấp phụ bằng

một dung môi thích hợp. Hợp chất thu được từ bản mỏng có thể được tinh khiết hóa tiếp

tục bằng sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC) hay các phương pháp sắc

ký khác hoặc hợp chất này đã đạt độ tinh khiết để tiến hành định tính, xác định cấu trúc

bằng các phương pháp phân tích cơ bản hay bằng phép đo quang phổ, nghiên cứu hoạt

tính sinh học, nghiên cứu tổng hợp hóa học, sử dụng như chất chuẩn đối chiếu.

1.2. Ƣu, nhƣợc điểm và ứng dụng của PTLC.

1.2.1. Ƣu điểm.

Phương pháp tiến hành của PTLC nhìn chung tương tự như TLC chỉ khác ở việc

sử dụng những bản mỏng dày hơn so với TLC: PTLC 0,5 – 2 mm, có thể dày đến 10 mm

tùy yêu cầu sử dụng; TLC 0,2 – 0,25 mm.

So với sắc ký cột:

-

Nhanh và thuận tiện hơn so với sắc ký cột cổ điển.

- Dễ tìm được dung môi thích hợp để tách các chất.

-

Vùng chứa chất tụ thành lớp mỏng dễ phát hiện, dễ cô lập .

- Tỉ lệ giữa silicagel và chất tách cao nên tách tốt hơn.






Trang 6

- Rẻ, đơn giản hơn so với HPLC. Thiết bị, thao tác đơn giản dễ nắm bắt và áp dụng.

Sử dụng một lượng nhỏ dung môi → có thể triển khai nhiều lần để thu được kết quả

phân tách tốt hơn, dễ dàng tách các vùng chứa chất hấp phụ ra khỏi bản mỏng, có thể

triển khai đồng thời các chất chuẩn đối chiếu trong cùng một điều kiện xác định giúp tạothuận lợi cho việc xác định hợp chất mong muốn.

1.2.2. Nhƣợc điểm.

Các hợp chất kém bền chấm trên bề mặt bản mỏng có thể bị phân hủy khi tiếp xúc

với không khí và ánh sáng.

Sự hiện diện đồng thời của tạp chất khi phản hấp phụ chất mong muốn ra khỏi giá

hấp phụ.

1.2.3. Ứng dụng. Dùng để tách các chất với hàm lượng nhỏ (10 – 1000 mg) trong trường hợp không

thể tách bằng các phương pháp khác.

Có thể phân lập được các đơn chất tinh khiết với khối lượng đủ từ các polymer tổng

hợp, các sản phẩm tự nhiên từ nuôi cấy mô hay từ dược liệu, các sản phẩm chuyển hóa từ

dịch sinh học, phân biệt cấu hình hoá học của các sản phẩm thiên nhiên hay tổng hợp.để

khảo sát điểm chảy, phổ UV, IR, khảo sát cấu trúc và làm chất chuẩn.

1.3. Pha tĩnh.

Pha tĩnh hay sử dụng trong PTLC là các chất hấp phụ, các chất hấp phụ này phần

lớn có trộn thêm chất kết dính như CaSO4 5 – 15 %, tinh bột 2 – 5 %, dextran, nhưng

cũng có trường hợp không dùng chất kết dính.

1.3.1. Silica gel.

Là một chất phân cực, hoạt động chủ yếu theo cơ chế hấp phụ, trung tâm hấp phụ

là các nhóm – OH silanol → hấp phụ các chất có tính kiềm (alkaloid base...) hơn là các

chất có tính acid (polyphenol...).

Mật độ nhóm silanol càng cao (VD: hạt càng mịn), khả năng hấp phụ của silica gel

sẽ càng lớn.






Trang 8

1.4. Dung môi.

Chọn dung môi:

Có độ tinh khiết cao, tránh chứa các vết kim loại.

Dung môi không quá dễ bay hơi.

Thay đổi dung môi:

Khả năng tách riêng các hợp chất bằng PTLC tùy thuộc tỉ lệ phân phối của các

hợp chất này giữa chất hấp phụ và dung môi ly giải

Thường ly giải với hỗn hợp dung môi nhưng tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có

nhiều hơn 2 cấu tử (vì hỗn hợp phức tạp dễ dẫn đến việc thay đổi pha khi thay đổi nhiệt

độ)

Để thay đổi khả năng tách có thể thay đổi dung môi hoặc thành phần dung môi

1.5. Chuẩn bị mẫu sắc ký.

Chuẩn bị lớp mỏng chế hóa:

Các bản mỏng chế hóa có thể tự làm trong phòng thí nghiệm (bản mỏng tự tráng)

hoặc sử dụng những bản mỏng tráng sẵn.

Độ dày của bản mỏng PTLC thường sử dụng là 0,5 – 2,0 mm, kích thước bản

mỏng thường là 5 × 20, 10 × 20, 20 × 20, 20 × 40 hay có thể đến 20 × 100 cm tùy yêu

cầu sử dụng.

Dùng các chất hấp phụ tạo hỗn dịch bền trong nước (có thể thêm một lượng nhỏ

chất trơ như thạch cao để kết dính nếu cần) rồi tráng lên tấm kính phẳng thành các bản có

độ dày 0,5 – 2,0 mm (có thể dày đến 10 mm) tùy yêu cầu sử dụng.

Để khô bản ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày, sau đó sấy sơ bộ 600C trong 2h rồi

mới sấy hoạt hóa ở 1200C trong 2h.

Chuẩn bị mẫu thử (dịch chấm):

Mẫu thử (đã được sơ bộ loại tạp) được cô ở áp suất giảm đến khô, sau đó hòa vào

trong một lượng vừa đủ dung môi (phải hòa tan tốt mẫu thử và dễ bay hơi) rồi chấm lên

bản mỏng.






Trang 9

Chấm mẫu thử:

Đánh dấu đường xuất phát cách mép dưới 1 – 2 cm.

Dùng ống mao quản hay micropipette chấm dung dịch mẫu thử lên bản mỏng

thành băng liên tục, băng có thể dày từ 1 – 2 mm, cách mép bản 1,5 – 2 cm.Khi chấm không được làm thủng lớp mỏng, vết chấm phải gọn (nên chấm dưới

một nguồn nhiệt), chứa lượng chất thử khoảng 1 – 10 µg.

Khai triển sắc ký:

Đặt bản mỏng đã chấm vào bình, đậy nắp bình. Sau khi dung môi chạy đến cách

đầu trên của bản khoảng 1 – 2 cm thì lấy ra, đánh dấu mức dung môi trên kính, để khô.

Lƣu ý:

-

Cấu tử nghiên cứu phải dễ phát hiện (tốt nhất là phát hiện được bằng đèn UV)

- Những điều kiện để phân tách thành công trên bản mỏng chế hóa:

-

Bản mỏng phải đồng nhất.

- Lượng mẫu chấm trên bản mỏng phù hợp.

Lượng chất hấp phụ trên bản mỏng thay đổi tùy theo từng trường hợp, đối với silica

gel cần 20 – 25 g/ bản mỏng kích thước 20 × 20 cm, dày 1mm, những bản mỏng dày có

thể bị nứt trong quá trình sấy do đó phải giảm lượng nước trong hỗn dịch hay hỗn hợp bột nhão của chất hấp phụ, tăng lượng chất kết dính (thạch cao CaSO4), tăng thời gian

sấy hoặc có thể sấy bằng tia hồng ngoại.

Vết chấm phải thẳng, hẹp và phải cách 2 mép hai bên của bản mỏng ít nhất 1 – 3 cm

để tránh hiệu ứng viền thường làm dung môi chuyển động nhanh hơn hoặc chậm hơn

bình thường ở hai mép của bản mỏng hơn là ở trung tâm của bản mỏng.

Mẫu thử được hòa tan trong một dung môi không phân cực, dễ bay hơi ở một nồng độ

mà tất cả các cấu tử của mẫu thử được hấp phụ không chỉ trên bề mặt mà phải xuyên suốt

chiều dày của bản mỏng. Có thể chấm bằng tay bằng cách sử dụng micropipette hay

syringe và thước kẻ hoặc có thể sử dụng những dụng cụ được thương mại hóa phục vụ

cho việc chấm mẫu.






Trang 10

1.6. Cách phát hiện trong sắc ký lớp mỏng điều chế.

1.6.1. Soi UV.

Ƣu điểm:

Nhanh, tiện lợi

Không bị hao hụt mẫu như phun xịt bản.

Nhƣợc điểm:

Mắt nhìn thấy vị trí biểu kiến khác vị trí thực của vết → đánh dấu trật vết và

không thu được chất khi cạo rồi ly giải.

Phun xịt bản với thuốc thử đặc trưng.

Tiến hành: Dùng tấm kiếng hoặc tấm nilon che 1 phần bản.

1.6.2. Phun thuốc thử lên phần không bị che.

Dựa vào những vết hiện trên bản, dùng spatule cạo phần silicagel để thu hợp chất.

Ƣu điểm:

Biết chính xác vị trí vết.

Nhƣợc điểm: Thuốc thử tạo phức với hợp chất không thể sử dụng để cạo bản, cô lập hợp chất.

1.6.3. Sử dụng hơi iod.

Tiến hành:

-

Đặt bản trong buồng hơi iod.

- Khi thấy vết lấy bản ra khỏi buồng.

-

Đánh dấu vị trí vết.- Phơi bản ngoài quạt gió để bay hơi iod.

-

Cạo bản để thu chất.






Trang 11

PHẦN 2

SẮC KÝ CỘT ĐIỀU CHẾ

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và

tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự

lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển

động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký.

2.1. Các cách tiến hành phân tích sắc ký.

Tuỳ thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc ký cũng như các thao tác tiến hành sắc

ký, người ta chia cách tiến hành sắc ký thành ba loại: 2.1.1. Phƣơng pháp tiền lƣu.

Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất. người ta cho hỗn hợp, ví dụ, hai chất A

và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ. Người ta xác định nồng độ

các cấu tử trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ

cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột. đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ hay đường

cong thoát (có tác giả gọi là đường cong xuất). Do các cấu tử bị hấp phụ lên cột, nên

trước hết từ cột chỉ chảy ra dung môi. Sau đó trong dung dịch thoát sẽ có cấu tử bị hấp

phụ yến hơn trên cột, ví dụ cấu tử A, sau đó đến phần dung dịch chứa hỗn hợp A+B,

đường cong thoát theo phương pháp tiền lưu cho trên hình dưới. Trong phương pháp tiền

lưu, ta chỉ thu được dung dịch thoát có cấu tử A tinh khiết ở lúc đầu, sau đó là hỗn hợp

A+B. Phương pháp tiền lưu không cho phép tách hoàn toàn các cấu tử ra khỏi nhau nên

thực tế ít được dùng vào mục đích phân tích các chất.






Trang 12

2.1.2. Phƣơng pháp rửa giải.

Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp

các cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B)

chạy qua cột. Các cấu tử A, B chứa trong Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột.Sau đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột. Lúc đó

các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới.

Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên chuyển động xuống phía dưới nhanh hơn B.

Nếu cột đủ dài và chế độ chảy của dung dịch rửa thích hợp thì sau một thời gian cho chảy

dung dịch rửa, các cấu tử tách ra thành từng vùng. Các vùng này sẽ tuần tự thoát ra khỏi

cột, mỗi vùng lại được cách nhau bằng một phần dung môi. Hình bên dưới biểu diễn

đường cong thoát của quá trình rửa giải. Trong phương pháp rửa giải, người ta cũng hay

dùng những dung dịch chứa một cấu tử có ái lực với cột nhưng phải nhỏ hơn ái lực của

các cấu tử cần tách với cột.

2.1.3. Phƣơng pháp rửa đẩy.

Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung

dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách. Các cấu tử cần tách

sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát rakhỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau

đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh dần. Khác với phương pháp rửa giải,

nồng độ các cấu tử không giảm qua quá trình sắc ký. Một nhược điểm quan trọng của

phương pháp rửa đẩy là rất khó phân biệt các phần riêng của các cấu tử trong dung dịch






Trang 13

thoát vì ở đây giữa các phần dung dịch thoát chứa các cấu tử không tách nhau bằng các

thể tích dung dịch rửa.

2.2. Cột sắc ký.

Cột sắc ký làm bằng thép không rỉ , thủy tinh đặc biệt hoặc chất dẻo.

2.2.1. Cột phân tích.

Dài: 10-30cm.

Đường kính trong: 4-10mm.

Cỡ hạt pha tĩnh: 5-10µm.

N=40.000-60.000 đĩa /met.

Cột nhỏ (microcolumn): 3-7.5cm, 1-2mm, 3-5µm, N=100.000 đĩa/mét.

2.2.2. Chất nhồi cột.

Silica (silic dioxyd) kết tụ thành silicagel.

Silicagel bao lớp mỏng hữu cơ liên kết ( hóa học hoặc vật lý) với bề mặt.

Nhôm oxyd, polymer, nhựa trao đổi ion.

2.2.3. Cột chế hóa.

Dài 25-100cm.

Đường kính trong 6-50mm, tránh được hiệu ứng thành của cột.

Tốc độ dòng lớn hơn cột phân tích.

Sử dụng trong dược liệu để sơ bộ tách các nhóm hợp chất.

2.3. Pha tĩnh.

2.3.1. Silicagel (hay kieselgel của acid silicic) pha thuận.

- Chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi hiện nay. Là một chất phân cực, thườngđược dùng làm pha tĩnh để phân tách các chất. phù hợp với hầu hết các pha động. nó có

thể chạy với những lượng mẫu rất nhỏ như trong sắc ký lớp mỏng.






Trang 14

- Ngày nay, Silicagel có kích thước các lỗ là 40,60 và 100Å (Si-40, Si-60, Si-100)

được dùng tron sắc ký điều chế . Si-60 thường được sử dụng nhất. Trong một vài trường

hợp, kích thước hạt quá nhỏ làm giảm hiệu quả của sự chiết tách.

- Silicagel có diện tích bề mặt từ 0.4-0.6g/cm3

, và nhiều nhất là 2.2g/cm3

.Có nhiều kích cỡ silicagel khác nhau phụ thuộc vào nhà sản xuất. Đối với sắc ký chế hóa

sử dụng cho những lượng mẫu trong phòng thí nghiệm thường sử dụng loại có kích thước

15-25µm,25-40µmhay 40-63µm.

- Tính hấp phụ của silicagel do các nhóm OH trên bề mặt quyết định. Nhóm OH

là các trung tâm hấp phụ.

- Để Silicagel hấp phụ được tốt thì cần hoạt hóa trước khi sử dụng: Sắt kim loại

được loại bỏ bằng cách đun sôi với HCl đặc, dùng nước rửa sạch ion clorid và lắng gan

loại các hạt nhỏ lơ lửng, sau đó sấy 120 oC trong 48 giờ.( đối với các bảng tráng sẵn thì

không cần hoạt hóa) . Không sấy quá lâu tránh làm mất nhóm silanol→bất hoạt.

- Tùy chất cần phân tích mà hoạt hóa silicagel khác nhau. Ví dụ : khi chạy tịnh dầu

thì sấy silicagel cần lâu càng tốt. còn đối với các chất phân cực mạnh thì sấy hoạt hóa ít

đi, them một ít nước để giảm hoạt tăng Rf.

- Tuỳ theo việc chọn các dung môi thích hợp cá thể dùng silicagel để tách các hợp

chất base(alkaloid) hay các hợp chất ưa dầu. Phân tách các chất có độ phân cực gần với

nó. Silicagel là sự lựa chọn tốt nhất làm pha tĩnh khi phân tách cá chất có khối lượng

phân tử nhỏ(<2000Da)

- Khả năng tách của silicagel tốt hơn khi tẩm nó bằng dung dịch bạc nitrat10-12%,

dung dịch acid boric , ammoniac, dung dịch đệm phosphate..

2.3.2. Nhôm oxit.

- Ít được sử dụng hơn silicagel. Thường được dùng trong sắc ký hấp phụ

- Là chất hấp phụ phân cực.

- Trong sắc ký có 3 dạng nhôm oxit: nhôm trung tính, acid, base.Tùy vào chất cần

tách mà lựa chọn loại oxit nhôm sử dụng cho phù hợp(chiết các acid amin có tính base

cần dùng oxit nhôm base, khi cần tách các chất trung tính thì dùng oxit nhôm trung bình).






Trang 15

- Để tách tốt hơn người ta xử lý nhôm với các dung dịch acid hoặc base.

Hoạt tính của nhôm oxit tùy thuộc lượng nước nó chứa, hoạt tính sẽ giảm đi khi lượng

nước gia tăng. Trước khi dùng cần hoạt hóa ở 120 oC trong 1 giờ.Bậc hoạt tính của nhôm

được chia làm 5 bậc: Bậc hoạt

tính

I II III IV V

% nước 0 3 6 10 15

- Diện tích bề mặt của oxit nhôm khoảng 0.9g/cm3 đến khoảng 4.0g/cm3.

- Oxit nhôm phân tách tốt các chất phân cực yếu đến trung bình, thường dùng để

phân tách các hợp chất thơm( có ái lực mạnh với OH phenol) và các hợp chất đồng phân

của nó. Oxit nhôm còn được dùng để tách các chất : hydrocacbon, alkaloid, chất màu

thực phẩm, lipid.

2.3.3. Kieselguhr.

- Ở dạng bột , chứa khoảng 70-95% SiO2 phần còn lại là các oxyd kim loại.

- Là một chất phân cực yếu, dùng để tách các chất phân cực như đường, các

triglyceric, các acid béo bậc cao, cetoacid, lacton. Nhưng thường được dùng chủ yếu làm

giá mang cho pha tĩnh trong sắc ký phân bố.

2.3.4. Polyamide.

- Ít được dùng làm chất hấp phụ , chủ yếu được dùng để tách các chất có chứa

nhóm chức phenol( flavon) , đường.

2.3.5. Silicagel pha đảo.

- Có nhiều loại mẫu kị nước như các peptid, thì sắc ký pha đảo thường là phương

pháp được lựa chọn sử dụng cột silicagel C-18.

- Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh có bản chất khác với pha động(pha tĩnh không

phân cực , phân động phân cực).






Trang 16

- Đây là silicagel có gắn một chuỗi carbon dài thường là 18C(c-18) hay 8C(C-8)

:Si-O-Si- nối Carbon.

- Các hợp chất được rửa giải ra khỏi theo thứ tự: hợp chất chứa nhóm _COOH→

alcol/phenol →amin→ eter/aldehyd→ cetone→hợp chất halogen→alkan.- Mặc dù sắc ký pha đảo có mắc tiền hơn sắc ký pha thuận nhưng nó có nhiều ưu

điểm hơn như:

Không cần phải hoạt hóa trước khi dùng.

Hệ được thiết thiết lập cân bằng nhanh chóng.

Dung dịch thân nước có thể đi qua .

Tách tốt đối với các chất phân cực.

- Thường được áp dụng trong HPLC.

2.3.6. Pha tĩnh cho sắc ký rây phân tử.

- Rây phân tử thường dùng các chất như :dextran, agarose hay polyacrylamide(

Sephadex, Sepharose, Fraktogel, Bio-gel…).

- Có các loại gel như gel cứng và gel bán cứng. Các gel cứng được cấu tạo từ các

hợp chất vinyl và divinyl styren polymer. Còn các gel cúng thì được cấu tạo bởi các hạt

thủy tinh xốp và silicagel xốp. Tùy vào tính chất của từng loại gel ma chia ra hai loại là

gel thân nước (hydrophilic gel) và gel thân dầu (lipophilic gel).

- Các Shephadex thông dụng:

Sephadex G(20.50.75).

Sephadex LH-20.

2.3.7.Cellulose.

- Là chất cao phân tử thiên nhiên có công thức [C6H7O2(OH)3]3, dạng bột mịn ,dùng không cần chất kết dính.

- Tách các hợp chất thân nước.

- Tăng hoạt tính của cellulose xử lý với hỗn hợp methanol, acid formic và nước

hoặc bằng isopropanol, acid acetic và nước.






Trang 17

Nhược điểm của cellulose không thể phát hiện vết sắc ký bằng các thuốc thử mạnh

như NaOH, H2SO4.

2.4. Kỹ thuật nhồi cột sắc kí .

2.4.1. Dụng cụ.

- Cột sắc kí (giống giống như cái buret, gồm 1 ống thủy tinh và 1 cái khóa, nhưng

không cần vạch chia độ).

- Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel, có 2 loại là

silicagel pha thuận và silicagel pha đảo, silicagel pha thuận thường dùng hơn, gồm Si có

đính các nhóm OH, silicagel pha đảo gồm Si có đính các dây alkan R, ngoài ra còn dùng

alumin) Chất nhồi cột quyết định quá trình sắc kí.

- Nếu dùng pha thuận, silicagel có gắn nhóm OH thì nó sẽ giữ chặt các chất phân

cực, các chất không phân cực sẽ liên kết với silicagel yếu hơn nên sẽ ra trước, các chất

phân cực hơn sẽ ra sau. Ngoài ra tùy thuộc vào lượng mẫu có mà sẽ dùng lượng silicagel

bao nhiêu, từ đó sẽ chọn kích cỡ cột sắc kí. Dùng lượng silicagel gấp 20, 30 hay 50 lần

lượng mẫu. Chú ý lượng silicagel phải đổ đến khoảng gấp 10 lần đường kính cột thì quá

trình tách sẽ diễn ra tốt. Dung môi: thông thường chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi

cột.- Nếu dùng silicagel pha thường (phân cực) thì chọn dung môi đi từ không phân

cực đến phân cực (ví dụ từ chloroform đếm methanol), thông thường dùng hỗn hợp dung

môi. Chú ý dung môi chạy sắc kí cột phải phân cực hơn một chút so với dung môi chạy

bản mỏng vì hạt silicagel dùng cho cột sắc kí sẽ to hơn hạt trên bản mỏng nên khả năng

tách sẽ kém hơn một chút.(sắc kí cột là phương pháp để tách chất sau khi đã có tất cả

thông tin trên bản mỏng, TLC, thin layer chromatography, là biện pháp đầu tiên dùng để

"dò tìm" thông tin về hỗn hợp của mình cũng như biện pháp tách chất cần lấy).






Trang 18

2.4.2. Thực hiện.

Bƣớc 1: nhồi cột.

Sau khi đã chọn cột, làm khô và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi

thì hòa tan silicagel vào dung môi đó trong một erlen. Lấy một miếng nhỏ bông gòn nhồidưới đáy cột để chặn silicagel lại, nếu cột quá dài thì dùng 1 dây kẽm thọt bông gòn

xuống, chú ý dùng ít bông gòn. Với những cột có sẵn miếng xốp hay lọc thủy tinh để

chặn silicagel rồi thì không cần làm việc này, tuy nhiên miếng xốp có nhược điểm là sau

khi chạy cột xong ta phải rửa lại nhiều lần cho sạch, rất mất thời gian so với việc nhồi

bông gòn, khi chạy cột xong chỉ cần vứt bông gòn.

Sau khi nhồi chặt bông gòn thì tiến hành khuấy silicagel trong dung môi (không

phân cực) đã pha sẵn rồi rót nhẹ nhàng vào cột. Trong lúc rót thì nên mở khóa để

silicagel lắng đều, nhớ để 1 erlen bên dưới để thu hồi dung môi, tiếp tục làm như vậy đến

khi cho hết lượng silicagel vào, tiến hành rót thêm dung môi (từ erlen bên dưới) để ổn

định hệ, chế đi chế lại nhiều lần đến khi hệ ổn định, cột không bị nứt hay gãy thì xem như

việc nhồi cột đã hoàn thành. Khóa cột lại.

Bƣớc 2:

Nạp mẫu chất vào. Có 2 loại nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt. Nạp mẫu

ướt là hỗn hợp chất phân tích cũng tan trong dung môi chạy cột nên chỉ cần cho mẫu vào.

Còn nếu mẫu không tan trong dung môi chạy cột thì phải hòa tan mẫu vào dung môi gián

tiếp trong 1 erlen. Sau đó dùng lượng ít silicagel cho vào erlen để hấp thu mẫu, sau đó

cho hết vào bình cô quay để cô quay đuổi dung môi đi thu được silicagel khô có chứa

mẫu. Lúc này nạp hết silicagel đó vào cột và cho dung môi chạy cột vào: gọi là nạp mẫu

khô. Khi cô quay thì nhớ lót miếng bông gòn ở miệng bình cô quay để tránh silicagel bay

lên. Cô quay là chưng cất trong áp suất kém (chân không).Bƣớc 3:

Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để

ổn định hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực của hệ, chú ý






Trang 19

không được thay đổi đột ngột cũng như chuyển từ không phân cực sang phân cực rồi lại

quay lại không phân cực, làm như vậy sẽ gãy cột và phải nhồi lại từ đầu.

Bƣớc 4:

Mở khóa, lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra có kém theochất đã tách được bằng ống nghiệm nhỏ, mỗi lần hứng khoảng 1/3ống nghiệm. Sau đó

đem chấm bản các ống nghiệm, những ống có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1

chất. Tiếp tục như vậy thì cuối cùng ta sẽ tách được các chất mong muốn.

2.5. Pha động.

Pha động là một thông số dễ điều chỉnh nhất khi tối ưu hóa hệ thống sắc ký. Trong

khảo sát pha động, vấn đề đặt ra là làm sao để tìm dung môi hoặc hỗn hợp dung môi phù

hợp nhất trong thời gian ngắn nhất có thể và sử dụng ít nhất vật liệu.

2.5.1. Lựa chọn dung môi.

Dung môi lựa chọn không được ảnh hưởng tới kết quả của phương pháp phát hiện.

Thường dùng hỗn hợp dung môi nên cần phải chú ý đến khả năng trộn thành hỗn hợp của

các dung môi:

Điểm sôi của các dung môi cũng là một yếu tốt rất quan trọng. Nhiệt độ sôi thấp sẽ

dễ dàng và tiết kiệm cho việc thu hồi. Tuy nhiên dung môi sử dụng không nên có điểm

sôi quá thấp (Ts > 400C) nhằm tránh sự bay hơi trong quá trình phân lập.






Trang 20

Dung môi với độ nhớt thấp cũng được ưu tiên vì giúp giảm áp lực phải đặt lên cột.

Tính bền vững và tính trơ phải được quan tâm để tránh hư mẫu.

Độc tính thấp, khả năng cháy nổ và giá cả cũng cần quan tâm.

Độ mạnh của dung môi

Snyder dựa trên giá trị thực nghiệm đưa ra bảng giá trị độ mạnh của dung môi:

Độ phân cực của dung môi

Độ phân cực của dung môi có thể lựa chọn dựa trên tam giác chọn lọc được xây

dựng bởi Snyder:






Trang 21

Độ tinh khiết của pha động:

Không có hoạt chất nào 100% tinh khiết. Độ tinh khiết càng cao, giá càng cao.

Cần phù hợp yếu tố chi phí với độ tinh khiết nhằm đưa các ảnh hưởng của nó về giới hạn

phù hợp.

2.5.2. Dung môi cho sắc ký pha thuận.






Trang 22

2.5.3. Dung môi cho sắc ký pha đảo.

2.5.4.Dung môi cho sắc ký gel.

- Theo cơ chế rây phân tử, trao đổi ion, ái lực. Ngược lại với các loại sắc ký khác,

sắc ký gel không cho phép người dùng tác động lên tính tan do sự thay đổi pha

động. Pha động chỉ được chọn theo 3 tiêu chí:

-

Khả năng hòa tan tốt mẫu

- Độ nhớt thấp (= áp lực tác động lê gel thấp)

-

Không làm phá hủy pha tĩnh.

-

Tài liệu cung cấp từ nhà sản xuất gel cần phải được nghiên cứu kĩ lưỡng nhằm

tránh cho gel bị phá hủy do tương tác với dung môi không phù hợp.






Trang 23

2.6. Cách phát hiện trong sắc ký cột điều chế.

Phương phát ghi nhận sắc ký bằng detector UV thường được sử dụng nhất. Trong

khi việc phun thuốc thử giống để phát hiện là không khả thi thì sử dụng máy đo UV lại tỏ

rõ hiệu quả, sự chọn lọc và tính khả dụng.

2.6.1. UV detector.

Áp dụng được cho các hợp chất có nhân thơm, có nối đôi liên hợp, nhóm

carbonyl, có chứa iod, brom, sulfur,…

Nhìn chung UV detector có thể sử dụng được cho sắc ký gel mà không cần rửa

giải.

2.6.2. Refractive detector (RI).

Bộ phận phát hiện nhờ chỉ số khúc xạ. Bộ phận phát hiện này tuy có độ nhạy thấp

hơn so với bộ phát hiện UV nhưng nó có ứng dụng nhất định trong sắc ký điều chế. Với

độ nhạy thấp, khi lựa chọn dung môi sẽ dựa vào RI để lựa chọn được loại dung môi nào

chạy ra kết quả có nồng độ cao nhất.

2.7. Định tính một cột sắc ký.

Vì nhiều lý do, cần thiết phải có sự đánh giá những đặc thù nhất định của cột tự

làm.

Thông tin nào quan trọng nhất cho việc đánh giá một cột sắc ký chế hóa?

Thông tin về hiệu lực cột, thông tin này cho phép đưa ra kết luận về kết quả phân

lập của sắc ký.

2.7.1. Sắc ký đồ.

Nếu đầu ra của cột được ghi nhận bởi một bộ phận phát hiện thích hợp trong quá

trình phân lập sắc ký, và tín hiệu từ bộ phận phát hiện được ghi nhận dạng nồng độ theothời gian, sẽ ghi nhận được đường cong điển hình. Đường cong Gausian.

Toàn bộ các ghi nhận của các tín hiệu được gọi là sắc ký đồ. Dữ liệu sau đâu có

thể thu trực tiếp từ một sắc ký đồ:






Trang 24

-

to = thời gian chết của cột, thời gian cần thiết cho dung môi chảy qua hết cột với

tốc độ dòng xác định.-

tR = Thời gian lưu, thời gian từ khi triển khai mẫu đến pic cực đại.

-

W = Độ rộng cơ bản của pic.

- B0,5 = độ rộng pic tại ½ chiều cao.

Sẽ không thực sự hợp lý nếu đánh giá một cột dựa vào thời gian lưu hoặc độ rộng của

pic.

Những thông số này phụ thuộc vào quá nhiều yếu tố như tốc độ dòng, thành phần

dung môi, chiều dài cột… Tuy nhiên, việc đánh giá cột một cách thích hợp đối với sắc ký

điều chế là dựa vào SI (symmetry index - chỉ số đối xứng) và số đĩa lý thuyết hay chiều

cao đĩa lý thuyết.

SI mô tả sơ lược hình dáng của pic và do đó là một thông số có ích cho việc đánh giá

đặc tính chảy của cột. SI được định nghĩa:

SI = b/a

Sự bất đối xứng trở nên rõ ràng, tuy nhiên, một điều kiện tiên quyết cho loại thửnghiệm này phải sử dụng đối với chất có khả năng tách rửa tốt nhất.






Trang 25

Ví dụ của một pic tốt (trái) và một pic xấu (phải).

SI được đo không phải tại đường nền mà ở vị trí 5% hoặc 10% của chiều cao pic.

(trong ví dụ này là 5%)

2.7.2. Số đĩa lý thuyết.

Một thông số dùng để so sánh khác là số đĩa lý thuyết N của cột

Công thức tính N có được dựa trên giả định rằng pic có hình dạng đường cong

Gaussian. Để đơn giản tính toán, các pic được thừa nhận có hình dạng Gaussian.

Số N lớn tương ứng với cột tốt.

Khoảng cách lý thuyết cho một quá trình giải hấp phụ - hấp phụ là một đĩa lýthuyết do đó nó là thông số đại diện tốt nhất cho các thông số khác (kích thước pha hấp

phụ, tốc độ dòng, chiều dài cột,…).

2.7.3. Chiều cao tƣơng ứng với một đĩa lý thuyết.

Để có thể so sánh các cột có chiều dài khác nhau, cần thiết phải tính chiều cao của

đĩa lý thuyết H (H=L/N với L là chiều dài của cột)

2.7.4. Chiều cao đĩa lý thuyết đã làm giảm.

Nhằm so sánh các cột có kích cỡ khác nhau, thông số thích hợp nhất là chiều cao

đã làm giảm h.

h = H/d (d là đường kính của cột)






Trang 26

Trong một vài trường hợp, số đĩa lý thuyết phụ thuộc chặt chẽ và hoạt chất sử

dụng để kiểm tra. Thông tin chính xác về chất thử và điều kiện thử cần phải được cung

cấp.

2.7.5. Độ phân giải.

Độ phân giải mô tả mối liên hệ của 2 pic, đây là thông số đóng vai trò quan trọng

trong việc phân lập một hỗn hợp các chất.

R = 2(tR2 – tR1)/(w1 + w2) = 1,177(tR2 – tR1)/(b0,5(1) + b0,5(2))

2.7.6. Thể tích chết.

Thể tích chết V0 được định nghĩa là khoảng trống trong cột sắc ký.

V0 = tR . Fm (Fm là tốc độ phân phối hay lưu lượng dòng).

G. Helmchen và B.Glatz đã đề nghị một phương pháp khác để tính V 0. Cột được

làm đầy với một dung môi thứ nhất (tỉ trọng d1), đóng kín và cân (G1). Cột sau khi triển

khai được phục hồi lại bằng một dung môi thứ hai (d2), cũng đóng kín và cân (G2). V 0

được tính theo công thức:

V0 = (G2 – G1)/(d2 – d1)

Biết được V0 có thể tính toán được thời gian chết to.

to = V0 / Fm






Trang 27

2.8. Phân lập kết quả sắc ký.

Khi yếu tố phân giải giảm và các pic trở nên gần nhau hơn, việc phân lập trở nên

khó khăn.

Mặc dù không lý tưởng nhưng sự phân lập của các chất tinh khiết vẫn

có thể thực hiện được với độ phân

giải R = 0.6 nhưng việc này đòi hỏi

một điểm cắt trong các phân đoạn

thu được. Chỉ các phân đoạn rìa tùy

theo mỗi pic được thu thập và phần

còn lại nằm giữa chúng có thể đượcthu hồi và tái phân lập.

Trường hợp tiến hành sắc ký quá tải

có thể xảy ra hiện tượng kéo đuôi,

cần có sự điều chỉnh vị trí thu thập

để tránh lẫn phần kéo đuôi của pic

trước.






Trang 28

2.9. Sắc ký cột nhanh (FC – Flash Chromatography).

2.9.1. Nguyên tắc.

Sự phân lập sắc ký dựa trên một trạng thái cân bằng giữa các thành phần cần phân

lập, một tác nhân hấp phụ trong cột (pha tĩnh) và một dung môi chảy xuyên qua nó (pha

động).

Khi một thành phần phân tán vào pha tĩnh được định nghĩa là sự hấp phụ, sự tách

ra bởi pha động được định nghĩa là sự phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các

thành phần và pha tĩnh đồng nghĩa với sự lưu giữ của các chất này, được xem như chậm

trong sự rửa giải cột. Sự phân lập của một hỗn hợp ra các thành phần riêng biệt chỉ có thể

thực hiện khi mỗi thành phần này có đặc tính hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau.

2.9.2. Lựa chọn pha tĩnh phù hợp.

Có thể tiến hành sắc ký trên cả pha tĩnh phân cực và không phân cực, độ hấp phụ

tùy thuộc vào mỗi nhà sản xuất.

Sắc ký chuẩn yêu cầu sử dụng pha tĩnh phân cực như silica gel và dung môi không

phân cực. Các thành phần riêng lẻ bị lưu giữ là do tương tác giữa nhóm chức phân cực

của nó với chất hấp phụ. Các chất phân cực yếu được rửa giải ra trước, tiếp sau đó là các

chất phân cực mạnh hơn.

Trong sắc ký pha đảo, pha tĩnh là chất không phân cực và sự rửa giải được thực

hiện bởi dung môi phân cực. Những pha tĩnh này được thiết kế bằng cách thay đổi silica






Trang 29

gel với nhóm không phân cực nhưng C-18 hoặc những gốc tương đồng. Vật liệu pha đảo

mắc hơn nhiều so với pha tĩnh chuẩn và đó là lý do chính khiến pha tĩnh chuẩn được sử

dụng chủ yếu trong sắc ký nhanh.

2.9.3. Khảo sát hệ thống sắc ký trƣớc bằng sắc ký lớp mỏng.

Như đã đề cập, đa phần sắc ký cột nhanh sử dụng pha tĩnh là

silica gel bình thường hoặc phân cực cao do đó việc tiến hành

khảo sát trước bằng TLC là hợp lý với một sự đầu tư nhỏ nhất

về thời gian và vật liệu, hứa hẹn tìm ra điều kiện sắc ký có khả

năng áp dụng cho cột sắc ký nhanh.

Xác định pha tĩnh

Tìm pha động với sự chọn lọc nhất

Xác định độ mạnh dung môi

Một cách lý tưởng, chất hấp phụ trên 2 loại sắc ký nên giống

nhau để khả năng áp dụng từ TLC cho FC là cao nhất.

Khảo sát pha tĩnh

Thực nghiệm với TLC có thể giúp đưa ra chọn lựa đúng đắn.

Nếu TLC với silica gel thường được sử dụng cho kết quả tốt thì

cũng có thể sử dụng cho FC. Nếu kết quả không đạt, khi đó mới nghĩ đến khả năng sử

dụng pha đảo.

Khảo sát dung môi

Một khi đã chọn được pha tĩnh với những đặc tính thích hợp, dung môi hoặc hỗn hợp

dung môi phân lập các chất thành phần sẽ được khảo sát.

Một cách tổng quát, mỗi dung môi đều có những đặc tính riêng, một số có xu hướng

giống nhau trong khi một số thì khác nhau rất nhiều. L.R.Snyder và J.J.Kirkland đã

nghiên cứu và so sánh các kết quả đặc tính của nhiều loại dung môi và các nhóm dung

môi có chung tác dụng thành các nhóm chọn lọc.






Trang 30

Nhóm chọn lọc cho

phép công việc tìm

kiếm được tập trung,

sẽ có ít điểm so sánhkhi mà dung môi

chung nhóm. Công

việc sẽ được tiến

hành theo hướng so

sánh giữa các nhóm

đặc tính.

Những dung môiquan trọng cho sắc

ký được trình bày

theo bảng sau chỉ

bao gồm các dung môi có thể dùng trong phân lập sử dụng bộ phận phát hiện UV (không

gây tín hiệu)

Dựa trên độ phân cực của các thành phần cần được phân lập, trong trường hợp độ

dung môi có độ mạnh quá lớn khiến không thể phân tách được, độ mạnh của dung môi có

thể được giảm xuống bằng cách hòa tan thêm hexane (độ mạnh 0.1), ngay lập tức có thể

phân lập tốt.






Trang 31

Giảm độ mạnh của dung môi (trái: dichloromethane, phải:

Hexane:dichloromethane 3:1).

Việc thêm hexane giúp giảm độ mạnh của dung môi nhưng không tác động lên

tính chọn lọc (khả năng phân giải).

Tùy theo thành phần được lựa chọn để chọn dung môi có sự chọn lọc thích hợp.

Bản VI có sự phân tách tốt nhưng nếu chỉ quan tâm tới việc phân lập thành phần đầu tiên,

dung môi chạy ở bản V sẽ được chọn. Lý tưởng = các thành phần khác càng tách xa chất cần tách càng tốt.

2.9.4. Từ TLC đến FC.

Do hiệu năng tách của TLC cao hơn so với FC nên cần phải có sự điều chỉnh khi áp dụng

từ TLC đến FC

Thể tích cột CV = 1/R f

R f nằm trong khoảng từ 0.15 – 0.4 sẽ tương ứng với thể tích cột 2.5 -6.6

2.9.5. Nạp mẫu lên cột.

Việc nạp mẫu đối với sắc ký cột bình thường là một công việc đơn giản trong phân

tích sắc ký, tuy nhiên trong sắc ký điều chế, cột thường được triển khai quá tải và việc

nạp mẫu là rất quan trọng.






Trang 32

Lúc trước, quy định chung cho sắc ký chế hóa là cột có thể nập mẫu ở nồng độ gần

1% tùy theo loại silica gel, ngày nay với việc sử dụng FC và tối ưu hóa pha động (R f 0.04

– 0.4, CV > 1), nồng độ mẫu nạp có thể tăng đến 10% và sự phân lập nhanh và hiệu quả

hơn rất nhiều. Khi đó thể tích mẫu sẽ nhỏ và được nạp thành băng có độ hẹp tối thiểu,hiệu năng tách sẽ cao.

2.9.6. R ửa giải theo gradient.

Khảo sát pha động và ghi nhận sự phân tách các peak theo mỗi pha.

Chia phân đoạn để thay đổi dung môi nhằm tách tốt hơn.

Ví dụ các kết quả:






Trang 33






Trang 34

PHẦN 3

HPLC ĐIỀU CHẾ

3.1. Nguyên tắc - yêu cầu.

Sư tách ca c chất băng phương pha p săc ky dựa trên trạng thái cân bằng giữa các

thành phần , một chất hấp phu trong cột (= pha t nh) và một dung môi chảy qua nó (pha

đô ng). Khi một tha nh phân liên kết vơ i pha t nh , hiê n tươ ng na y đươ c định nghĩa la sư

hấp phụ, khi tha nh phân na y bi ta ch ra nhơ pha đô ng , hiê n tươ ng na y được định nghĩa là

phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giư a ca c tha nh phân nghiên cư u vơ i pha t nh nghĩa

là sư lưu giữ các thành phần này trên cô t cao và do đo thành phần đó sẽ được rửa giải ra

khỏi cột trễ hơn thành phần khác . Việc tách riêng ca c chất tư mô t hỗn hợp thành chỉ cóthể tiến ha nh mô i chất co kha năng hấp phu va pha n hấp phu kha c nhau đối vơ i pha t nh

và pha động.

Sơ đô mô h nh să c ky lo ng chê ho a

Bình chứa dung môi Bơm dung môi

Bình chứa mẫu Bơm mâ u Valve bơm

Cô t săc ky chê ho a

Detector

Bô xư ly dư liu

Valve bơmphân đoan

Bình h ng ccphân đon






Trang 35

HPLC điều chế la mô t phương pha p hiê u qua va đang đươ c sư du ng rât phô biến

để tách các chất cần nghiên cứu ra khỏi 1 hô n hơ p hoă c đê tinh chế ca c chất .

Các yếu tố sau đây phải đƣợc chú ý đặc biệt:

- Linh hoạt trong việc chọn cột . Số lượng chất va các yêu cầu tách a nh hươ ng khácnhau đến ca c vấn đề cần giải quyết . Đơn giản và phu hơ p với kinh tế cu a mô t vân đề phân

tích cụ thể do đó có thể giải quyết được .

- Hiê u suất bơm cao hơn . Dung t ch cô t lơ n yêu câu thê t ch do ng lơ n hơn , do đo tốc

đô do ng cu ng cần pha i lơ n hơn.

- Áp suất lớn hơn . Khuynh hươ ng cu a sắc ky điều chế ro ra ng la hươ ng về chất hấ p

phụ dạng hạt mịn, điều này dẫn đến một kháng lực dòng đáng chú ý

3.2. Ƣu- nhƣợc điểm, khả năng và mức độ ứng dụng.

Kích thước tiểu phân càng nhỏ hiệu quả quá trình tách chiết càng cao. Tuy nhiên

kích thước tiểu phân càng nhỏ thì áp suất phản hồi trong cột nhồi càng cao, điều đó giới

hạn kích thước thực tế tiểu phân, tùy thuộc vào khả năng chịu áp của thiết bị. Nói chung,

đa số thiết bị chịu được áp suất phản hồi gây ra bởi tiểu phân kích thước 5µm ở tốc độ

dòng tối ưu.

Giá thành cao.Trong phân tách điều chế, pha tĩnh thường có thể hồi phục và tái sử dụng để tinh

chế cùng hoạt chất. Dung môi chạy sắc kí mới là phần tốn kém và khả năng tái sử dụng

dung môi đã dùng là quan trọng trong lựa chọn dung môi. Nếu trong quá trình chạy ta

dùng nhiều dung môi, ví dụ 1 dung môi để tiêm mẫu và 1 dung môi khác để rửa giải, thì

nên gom riêng các dung môi để tiện cho việc tái chế. 1 vài hỗn hợp dung môi hexane–

methyl-tert-butyl ether, hexane –ether, và hỗn hợp 3 thành phần không thể phục hồi như

dung môi tinh khiết.

Trong ky thuâ t HPLC điều chế, cần sư du ng cô t co k ch thươ c lơ n. Nêu ba n k nh cô t

tăng, trư phi sư du ng ky thuâ t nhôi đă c biê t , sư nhôi ha t trong cô t se trơ nên không hiê u

quả và sự nhồi hạt tự nó cũng không ổn định . Ngoài ra, để duy t rì tốc độ tối ưu cho pha

đô ng, lưu lươ ng pha đô ng cần pha i tăng lên va sư tiêu thu pha đô ng se rất tôn ke m .






Trang 37

tĩnh có dạng hình cầu chắc chắn (điều chế bằng cách phun dung dịch silicate trung tính

thành những giọt nhỏ trong 1 luồng khí nóng, hay phân tán dung dịch silica thành dạng

nhũ tương trong 1 dung môi hữu cơ thích hợp, tại đó những giọt gel hình cầu hình thành.

Tuy nhiên chi tiết việc sản xuất được giấu kín LC-A3) cũng được thúc đẩy bởi nhu cầutăng dần. Như đã nói trước, tiểu phân silica vô định hình thường dễ bị đứt gãy và tạo

thành bụi mịn.

Pha tĩnh bao phủ bởi các nhóm –OH thiết kế cho sắc kí loại cỡ như Zorbax GF 250

và PL-aquagel cũng tương tự pha thuận, thuận lợi của chúng ở chỗ tăng độ ổn định ở pH

cao. Lựa chọn pha tĩnh trong qua trình nâng cấp qui mô (từ sắc kí phân tích) 1 tiêu chuẩn

quan trọng khi phát triển phương pháp ban đầu là pha tĩnh sắc kí dùng trong qui trình

nâng cấp phải có bán sẵn ở cả dạng cột phân tích (250mm x 4mm) và dạng thô ở lượnglớn. Nói chung, vật liệu nhồi thường dùng cho cột điều chế có kích cỡ từ 10 -20 cm.

3.3.1. Normal-phase silica gels.

• Kromasil, 10 µm dp with 60 or 100 Å pore diameter

• Kromasil, 16 µm dp with 100 Å pore diameter

• Chiralcel AS, 20 µm dp

• Chiralcel OD, 20 µm dp

3.3.2. Reversed-phase silica gels.

• Kromasil C8

• YMC C18

• Hyperprep C8

Mặc dù hầu như 84% pha tĩnh dung trong HPLC điều chế là silica pha đảo. Tuy vậy, pha

thuận có những lợi điểm riêng: + Có thể chuyển đổi trực tiếp từ TLC pha thuận hoặc HPLC sang LC chế hóa.

+ Giá thành của vật liệu nhồi pha đảo cao và vài vật liệu nhồi không có dạng thô (để

nhồi thủ công).

+ Làm sạch silica pha thuận thì dễ hơn vì pha thuận bền vững hơn nhiều.






Trang 38

+ Loại bỏ dung môi thường dùng trong sắc kí pha thuận khỏi dịch sản phẩm cuồi dễ dàng

hơn loại bỏ nước khỏi 1 phân đoạn của sắc kí pha đảo, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp và

cho chất lượng sản phẩm cao hơn và ít tốn năng lượng hơn.

3.4. Cách nhồi cột.+ DAC (dynamic axial compression system- nén theo trục thẳng) phát minh bởi

Couillard:

+ radial compression system- phát triển bởi Waters, và thương mại hóa bởi Biotage:

Dùng cartridge bằng polymer dẻo nhồi với pha tĩnh. Cartridge được đặ t trong 1 xy-lanh

(cyclinder) và được áp cho 1 áp suất ngoài.

+ annular expansion:

Dùng 1 que có đầu hình nêm nén pha tĩnh trong cột (tạo ra cả sự nén trục và nén

kiểu tỏa tròn-radial)

Cách nhồi cột phụ thuộc vào thiết kế của cột. Kiểu cột ngắn với phần cột mở rộng

có thể tháo rời và đủ để chứa hỗn hợp chất nhồi; cột dài, đủ lớn để chứa hỗn hợp chất

nhồi pha tĩnh.






Trang 39

3.4.1. Cột kiểu 4.3.

Tính tổng thể tích của cột cộng với ống chứa(reservoir) để xác định thể tích hỗn

hợp nhồi A. Mật độ nhồi của pha tĩnh polymer thường là 0.3g/cm3, của pha tĩnh silica

thường là 0.6g/cm3. Thêm lượng thích hợp pha tĩnh vào 1 bình đựng và pha loãng vớidung môi đã chọn để được thể tích A. Khuấy trộn bằng tay hay máy, khi đạt được hỗn

hợp đồng nhất, ngừng khuấy và để hỗn hợp qua đêm để loại khí trong pha tĩnh.

Lắp cột, phần ống chứa; gắn bơm hút chân không và đồ hứng dung môi vào đáy

cột. Không hút chân không ở giai đoạn này. Phân tán lại hỗn hợp, sau đó đổ liên tục hỗn

hợp vào cột. Cần đổ nhanh để tránh hỗn hợp lắng trở lại; sự ngừng 1 vài giây cũng có thể

dẫn đến nứt cột làm giảm hiệu lực tách. Hút chân không, rút dung môi cho tới khi còn 1

lớp dung môi khoảng vài mm trên mặt cột. Tháo ống hút chân không và bít đáy cột (end

fitting) lại. Tháo ống chứa và gắn nắp trên (column top end-fitting). Gắn 1 đường dẫn

dung môi thải vào dưới cột (đáy cột vẫn được bịt kín). Nén cột cho tới khi áp suất nén tới

áp suất cho bởi nhà sản xuất (60-100 bar). Cột lúc này đã sẵn sàng cho nạp dung môi.

3.4.2. Cột kiểu hình 4.4.

Chuẩn bị hỗn hợp nhồi cột như trên. Bịt đáy cột và nạp cột nhu trên. Sau đó gắn

piston lên trên cột, bình chứa dung môi, nén, mở đáy cột cho dung môi đi ra. 3.4.3. Chuẩn bị mẫu- Đƣa mẫu lên cột.

Đưa mẫu vào : bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào rất cao.

Thời gian lưu của mẫu (retention time): Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào

đến khi đỉnh (peak) của hiển thị rõ nét. Khoảng thời gian này bị chi phối bởi các yếu tố :

+ Áp suất đầu vào.

+ Tính chất của pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt).

+ Thành phần dung môi.

+ Nhiệt độ cột.






Trang 40

overload trong sắc kí: khi lượng mẫu nạp quá lớn và điều đó làm giảm hiệu năng của cột,

có 2 loại: nạp vượt quá thể tích (volume overload) và nạp vượt quá khối/ nồng độ (mass

overload); có thể do mặc định hoặc có chủ ý trong sắc kí điều chế.

+ Volume overload dẫn tới mở rộng peak, nhưng sự mở rộng này đối xứng vì thế hìnhdạng peak ở trước và sau không bị méo/ biến dạng. Trong sắc kí chế hóa thể tích mẫu có

thể tăng cho tới khi 2 peak của 2 chất được rửa giải gần nhau nhất chạm nhau, và thể tích

mẫu lúc này là tối ưu. Trong sắc kí phân tích thì không chấp nhận chuyện này, không

dùng bất cứ cách nạp mẫu overload nào, ngoại trừ trong những trường hợp khả dĩ có thể

làm tăng khả năng phân tích chất dạng vết.

+ Mass overload thì chắc chắn làm cho peak bị biến dạng; mức nồng độ chất cần tách

trong pha tĩnh sẽ ở trong vùng không tuyến tính của đường đẳng nhiệt hấp phụ. Nếuđường đẳng nhiệt hấp phụ lõm về phía trục biểu thị nồng độ trong pha động thì ở nồng độ

cao của chất tan hệ số phân bố hiệu dụng sẽ thấp hơn. Vì vậy phần có nồng độ chất tan

cao hơn sẽ di chuyển trong cột nhanh hơn phần có nồng độ thấp, và peak sẽ bị méo với

phía trước nhọn và đuôi bị nghiêng/ thoải. Thời gian lưu nói chung sẽ giảm. Tuy nhiên

nếu đường đẳng nhiệt lõm về phía trục biểu diễn nồng độ trong pha tĩnh thì ở nồng độ

cao của chất tan, hệ số phân bố hiệu dụng sẽ lớn hơn. Và vì thế phần có nồng độ cao hơn

sẽ di chuyển chậm hơn phần có nồng độ thấp trong cột, peak sẽ bị méo với phía trước

nghiêng và đuôi nhọn; trong trường hợp này thời gian lưu nói chung sẽ giảm khi khối

mẫu tăng.

3.4.4. Với pha đảo (Reverse Phase HPLC Basics for LC/MS).

Mẫu không nên hòa tan trong 1 dung môi hữu cơ nếu không nó có thể không gắn

lên pha tĩnh được. Mẫu cũng không nên tan trong dung dịch chứa chất tẩy, một vài chất

tẩy có thể gắn lên cột pha đảo và làm thay đổi tính chất cột không thuận nghịch. Hơn nữachất tẩy được ion hóa ưu tiên khi bị tác động của dòng electron trong đầu dò khối phổ,

làm giảm khả năng phát hiện hay ức chế sự ion hóa chất phân tích.

Kiểm soát nhiệt độ:






Trang 41

Không 1 nghiên cứu nào về sắc kí gọi là hoàn chỉnh nếu thiếu phần nghiên cứu về

nhiệt độ. Nhiệt độ xung quanh ảnh hưởng thời gian lưu. Nhiệt độ chạy thường là 40°C.

Để ổn định nhiệt độ cho cột, ta có thể dùng jacket (áo giữ nhiệt), buồng ổn nhiệt,..

Có thể dùng nhiệt độ để tác động tới quá trình chiết tách. Nói chung nhiệt độ caohơn thì tốt hơn, peak sẽ nhọn hơn và rửa giải sớm hơn. Tuy vậy nhiệt độ cao làm giảm

tuổi thọ cột và nhiều cột không chịu được nhiệt độ quá 60°C.

3.5. Lựa chọn dung môi- Thay đổi dung môi.

Pha thuận thường được chạy với dung môi hữu cơ, thường là hexane, heptane,

cyclohexane hay halocarbon như DCM, Cloroform. Pha động rửa giải thường là 1 dung

môi thân nước, như nước, ester. Acid hữu cơ thường thêm vào để giảm thiểu hiệu ứng

trao đổi ion do những nhóm silanol.

Rửa giải đẳng dòng với hỗn hợp butanol, acid acetiic và nước là giao thức chuẩn

cho sự tách giải các acid amin và 1 hỗn hợp methanol, cloroform, nước hữu dụng cho

hợp chất hữu cơ nói chung. Peptide dễ dàng được tinh chế bằng rửa giải kiểu gradient

trên silica pha thuận, tăng dần từ acetonitrile tới pha động có nước. Kĩ thuật này đặc biệt

hiệu quả với những peptide rất phân cực khó phân lập trên sắc kí pha đảo.

Pha đảo hoạt động trong môi trường đệm thân nước, nơi hấp phụ kị nước giữa chất

phân tích và pha tĩnh bị xáo trộn bới sự tăng dần nồng độ 1 dung môi hữu cơ có thể hỏa

lẫn. Ứng dụng phổ biến của HPLC pha đảo là trong tinh chế peptides và protein, trong đó

chất phân tích thường được giả hấp bởi sự rửa giải gradient. Đệm chạy thân nước phổ

biến nhất thường là nước chứa hàm lượng thấp của axit trifluoroacetic (thường là 0,1% v

/ v) và các pha động rửa giải thường là acetonitrile- chất điều chỉnh độ phân cực- chứa

axít trifluoroacetic.

Các trifluoroacetic axit phục vụ hai mục đích: trước hết, nó tạo một cặp ion mạnhvới chất phân tích, như vậy chống lại việc trao đổi cation với bất kỳ nhóm silanol tự do

nào trên giá mang silica; và thứ nhì, với vai trò các cặp ion, nó làm giảm sự thay đôi cấu

trúc protein và peptide và do đó cải thiện hình dạng peak. Lợi điểm của axit

trifluoroacetic ở chỗ nó không hấp thu UV- kĩ thuật chính trong phát hiện peptide và






Trang 42

nhiều phân tử khác. Các đệm acid khác như phosphate, acetate and hydrochloride cũng

thường được dùng. Ethanol, methanol, tetrahydrofuran, pro-pionitrile và propan-2-ol

cũng thường được dùng với vai trò chất điều chỉnh độ phân cực, nhưng chúng không tốt

bằng acetonitrile. Silica pha đảo không ổn định trong môi trường kiềm do sự mất các gốc ankyl và sự

hòa tan của silica khi hoạt động lâu ở pH cao. Với pha tĩnh polymer lỗ lớn ổn định ở pH

cao (macroporous polymeric stationary phases) có thể mở rộng khoảng pH hoạt động của

pha đảo trong khoảng 1-14. Pha đảo polymer thường dùng nhất là loại polymer trùng hợp

từ styrene và divinyl benzene. Tính kị nước của pha tĩnh này là do mạch polymer dài và

vòng benzene, vì thế quá trình rửa giải dự đoán sẽ khác với pha tĩnh silica C18 chẳng

hạn. Thực tế, trên dữ liệu rửa giải nhiều chất, trình tự rửa giải và thời gian rửa giải quan sát được trên pha tĩnh polymer chất lượng cao thường tương tự kết quả thu được từ pha

tĩnh silica chất lượng cao.

3.6. Phƣơng pha p pha t hiê n va thu nhâ n kê t qua să c ky .






Trang 43

Một số bộ phận phát hiện:

-LC Detectors Based on Refractive Index Measurement

The Refractive Index Detector

The Angle of Deviation Method

The Fresnel Method

The Christiansen Effect Detector

The Interferometer Detector

The Thermal Lens Detector

The Dielectric Constant Detector

-The UV DetectorsThe UV Absorption Detectors

The Fixed Wavelength UV Detector

The Multi – Wavelength UV Detector

The Multi – Wavelength Dispersive UV Detector

The Diode Array Detector

The Fluorescence Detector

The Single Wavelength Excitation Fluorescence Detector

The Multi Wavelength Fluorescence Detector

-Transport Detectors

The Moving Wire Detector

The Chain Detector

The Modified Moving Wire Detector

The Disc Detector

-The Evaporative Light Scattering Detector

-L iquid L ight Scatteri ng Detectors

The Low Angle Laser Light Scattering Detector






Trang 44

The Multiple Angle Laser Light Scattering (MALLS) Detector

-The Electrical Conductivity Detector

-The Electrochemical Detector

Electrode Configurations

Electrode Construction

Basic Electrochemical Detector Electronics

The Multi – Electrode Array Detector

3.7. Các ứng dụng cụ thể.

Tinh chê taxol băng săc ky lo ng điều chế sư du ng trong công nghiê p : mô t phương

pháp đã được nghiên cứu phát triển để tinh chế taxol từ dịch ch iết cloroform thô cu

a cây

Taxus yunnanensis sư du ng sắc ky lo ng điều chế công nghiê p (IPLC) dư a trên pha t nh

polymer (D956 resin). Sư dung hê thông thiết bi đơn (single-system apparatus), khoảng 5

kg di ch chiết thô co thê đươ c ta i qua cô t đầu tiên , và cuối cùng , qua 3 lần cha y sắc ky ,

khoảng 50g taxol (99% tinh khiết) có thể thu được sau 155h, ko tôn bất ky dung môi hư u

cơ na o. Sư thu hồi taxol đa t trên 80%. Như a D956 đa cho thấy t nh chon lo c va kha năn g

tách taxol cao hơn so với silicagel và C materials . Vơ i hê thông na y , viê c a p dung chiêt

taxol trong công nghiê p co thê thư c hiê n đươ c . (Journal of Chromatography A, 813(1998) 201 – 204 Purification of taxol by industrial preparative liquid chromatography,

Xuefeng Yang*, Kailu Liu, Man Xie, Beijing Research Institute of Chemical Engineering

and Metallurgy, P.O. Box 234, Beijing 101149, China, 1998)

Ứng dụng sắc ký lỏng điều chế xác định polyphenol từ lá chè xanh thứ phẩm. TS.

Phùng Lan Hương.






Trang 46

Hợp chất đuợc tách tinh khiết cao

Lọc dung môi không cần lọc hay khử khí dung môi, giúp tiết kiệm thời gian cho

việc tinh khiết. Đặc biệt bóng khí không làm mất nguyên tố của hệ thống.

4.3. Ứng dụng.

Tinh khiết hợp chất chứa 5-5-benzyl-N-α-N-im-di-t-Boc-

L-His1 (hợp chất A), sử dụng cột C18, hệ dung môi 5-95% ACN:H2O, ở bước sóng

214nm.






TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Laboratory Chromatography Guide, Angelo Talamona, Büchi Labortechnik AG.

2.

Liquid Chromatography Column Theory, Raymond P. W. Scott, John Wiley &

Sons.

3.

Preparative Chromatography, Book 12 Chrom-Ed Book Series, Raymond P. W.

Scott.

4.

Encyclopedia of chromatography Third Edition, Jack Cazes.

5.

Preparative chromatography techniques Second edition “Applications in natural

product isolation”, K.Hostettmann, A. Marston, M.Hostettmann, Springer.6.

Journal of Chromatography library volume 3 – Liquid column chromatography a

survey of modern thechniques and applications, Z.Deyl, K.Macek and J.Janak,

p.163.

7.

A Practical Handbook of Preparative HPLC , Donald A. Wellings.

8.

The Role of the Column in Preparative HPLC , Ronald E. Majors, Agilent

Technologies, Wilmington, Delaware, USA.


sắc ký điều chế và ứng dụng

Documents