sandra mayumi nishi fdfd

SANDRA MAYUMI NISHI

Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na

expresso de genes associados resposta

imune em tecidos de sunos

So Paulo 2004

SANDRA MAYUMI NISHI

Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de

genes associados resposta imune em tecidos de sunos

Tese apresentada ao Programa de Ps-graduao em Epidemiologia Experimental e Aplicada s Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo para a obteno do ttulo de Doutor em Medicina Veterinria

Departamento:

Medicina Veterinria Preventiva e Sade Animal

rea de Concentrao

Epidemiologia Experimental e Aplicada s Zoonoses

Orientadora:

Profa. Dra. Solange Maria Gennari

So Paulo 2004

Autorizo a reproduo parcial ou total desta obra, para fins acadmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAO-NA-PUBLICAO(Biblioteca da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo)

T. 1433 Nishi, Sandra MayumiFMVZ Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de genes

associados resposta imune em tecidos de sunos / Sandra Mayumi Nishi. So Paulo : S. M. Nishi, 2004.

149 f. : il.

Tese (doutorado) - Universidade de So Paulo. Faculdade de MedicinaVeterinria e Zootecnia. Departamento de Medicina Veterinria Preventivae Sade Animal, 2004.

Programa de Ps-graduao: Epidemiologia Experimental e Aplicadas Zoonoses.

rea de concentrao: Epidemiologia Experimental e Aplicada sZoonoses.

Orientador: Profa. Dra. Solange Maria Gennari.

1. Sunos. 2. Toxoplasma gondii. 3. Imunologia. 4. Expressognica. 5. Real-Time RT-PCR. I. Ttulo.

FOLHA DE AVALIAO

Nome da autora: NISHI, Sandra Mayumi

Ttulo: Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de genes associados resposta imune em tecidos de sunos

Tese apresentada ao Programa de Ps-graduao em Epidemiologia Experimental e Aplicada s Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Doutor em Medicina Veterinria

So Paulo, 30 de novembro de 2004

Banca Examinadora

Prof. Dr. ________________________________ Instituio: ________________________

Assinatura: ______________________________ Julgamento: _______________________









Dedico esta tese aos meus queridos familiares,

minha av Toshiko Sakajiri ( in memorian),

Aos meus pais, Izabel e Tadahisa,

Aos meus irmos Augusto e Srgio, minha cunhada Rivnia e a minha sobrinha Talita,

Aos meus tios Joo (in memorian) e Akiko, Aos meus primos-irmos Priscila e Daniel,

Aos tios Edu, Akemi e Raquelzinha,

Pela pacincia aos meus caprichos... Pela confiana, mesmo sem entender o que fao, Pelo respeito s minhas decises, Pelo carinho em todos os momentos e sem restries.

AGRADECIMENTOS

Os experimentos apresentados nesta tese fazem parte de um projeto

envolvendo equipes de pesquisadores do Animal and Natural Resources Institute

(ANRI) e Beltsville Human Nutrition Research Center (BHNRC) do Departamento de

Agricultura dos Estados Unidos da Amrica (USDA). Esta tese representa, desta

forma, somente uma pequena parte dos experimentos realizados e um reflexo do

esforo e do empenho de vrios profissionais.

uma tarefa difcil listar nomes e expressar em palavras minha gratido

a todos aqueles que de alguma forma participaram na execuo do experimento

e tambm queles que indiretamente contriburam para que esta tese pudesse ser

realizada. Com certeza haver aqueles que no foram aqui citados, mas no deixo

de estender meus sinceros agradecimentos a todas as pessoas responsveis para a

minha formao pessoal e profissional.

Agradeo Solange Maria Gennari, minha orientadora no curso de

Mestrado, por lanar a oportunidade de dar continuidade a minha formao

acadmica. Minha gratido por sempre abrir portas para novos horizontes, pela

confiana e pela terna amizade.

Joan K. Lunney, pesquisadora-chefe do antigo IDRL, atualmente

pesquisadora do Animal Parasitic Diseases Laboratory do ARS, USDA. Joan foi, sem

dvida, a grande incentivadora para a consolidao deste trabalho. Minha

gratido pela receptividade, abrindo as portas do IDRL e introduo ao mundo

da imunologia. Agradeo por todo apoio profissional e pessoal, pela confiana e

pelo carinho nos momentos mais difceis.

Harry Dawson, pesquisador do Nutrient Requirement & Function

Laboratory (NRFL), BHNRC, USDA, a mente idealizadora deste experimento.

Agradeo pelas inmeras sugestes, pela bem-humorada pacincia e pela

dedicao, sempre disposto a dividir o vasto e invejvel conhecimento no campo

da biologia molecular, da bioinformtica e da imunologia.

Terezinha Padilha, pelo incentivo e pela constante dedicao

formao de pesquisadores e o intercmbio entre as instituies. Minha especial

gratido, estendida tambm a David Bounds, pelo carinhoso apoio e pela ajuda

em todos os momentos que precisei.

Ao Joseph Urban Jr, pesquisador chefe do Nutrient Requirement &

Function Laboratory pelo planejamento, pela pacincia e pelo apoio indispensvel

para a execuo dos experimentos.

Ao JP Dubey, pesquisador do APDL, pelas palavras de apoio, pela

contribuio e pelas sugestes crticas para a conduo dos experimentos.

Ao Federico Zuckermann, do Departamento de Patobiologia da

Universidade de Illinois, pela pacincia e pelo suporte necessrio para a

concretizao do intercmbio.

Ethiopia Beshah pela amizade e pelo carinho. Obrigada por dividir os

conhecimentos tcnicos, pelas advertncias e pela viso criteriosa que foi

importante para a manuteno da boa qualidade dos resultados.

Gloria Solano-Aguilar, pesquisadora do NRFL, pela inspirao e

sugestes na realizao do experimento.

Ao Atabak Royaee, ps-doc do antigo IDRL, atualmente ps-doutorando

da Universidade de Massashussets, pelas sugestes teis para a anlise dos

resultados e pelo companheirismo.

Agradecimentos especiais a Daniel Kuhar e a Yi Chong, pela ajuda no

processamento das amostras, pela dedicao e pela amizade, imprescindveis

para a concluso dos experimentos e a manuteno de um alegre ambiente de

trabalho.

Aos colegas de laboratrio Alexander Rustico Domingo, Tonya Ledbetter,

Jenny Kessler, Jeremy Samon, Pat Boyd e Chika Obele pelo agradvel convvio e

pela ajuda, mesmo que involuntria, na manuteno da rotina laboratorial.

Ao Samuel Shen e ao Oliver Kwok por toda ateno dispensada e pelo

fornecimento dos isolados de Toxoplasma gondii, pela realizao das provas de

aglutinao modificada e auxlio na digesto das amostras para a prova de PCR.

Ao William Hare, mdico veterinrio responsvel pelo Servio Veterinrio

do ANRI-USDA, pela realizao das provas de avaliao heptica e do

hemograma.

Pat Allen e ao Eli Miramontes por permitir a utilizao do laboratrio e

auxlio na realizao das deteminaes de xido ntrico.

Ao Sreekumar Chirukandoth pelo auxlio nos exames histopatolgicos.

Dolores Hill por permitir a utilizao do laboratrio para a realizao

das provas de ELISA.

Alm do corpo cientfico agradeo s secretrias Ruth Flester e Judy Sirk

pela carinhosa dedicao e pela constante ateno aos procedimentos

burocrticos.

Aos queridos colegas Ricardo Arajo, Karen Tunin, Danielle Seipel da

Silva, Hilda F. J. Pena, Rodrigo Martins Soares, Joo L. Garcia, Manoella Vianna,

Jorge T. de Souza e Flora Piasentin pelo apoio, pela amizade e pelo

companheirismo durante o perodo nos EUA.

A todos os colegas cientistas e funcionrios do ANRI e do NRFL, USDA

pelo agradvel convvio dirio.

Meus agradecimentos ao prof. Silvio A. Vasconcellos pela ateno e

pela dedicao na conduo do curso de ps-graduao

Maria Cristina Paick, Ana Virgnia P. de Almeida Prado, Danival Lopes

Moreira e Tnia Delonero por toda a ateno dispensada e pelo empenho no bom

funcionamento do Departamento.

s secretrias Sandra, Cludia e Dayse do Servio de Ps-graduao e

bibliotecria Elza M. Faquim da Biblioteca Virginie Buff DApice da FMVZ-USP pela

simptica pacincia e pela ajuda nos procedimentos burocrticos.

Muito obrigada,

Sandra Nishi

Agradecimentos adicionais

Ao National Pork Producers (EUA) e ao USDA pela concesso da bolsa

durante todo o perodo de execuo dos trabalhos nos EUA e do suporte financeiro

para a realizao dos experimentos.

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES)

pela concesso da bolsa durante o perodo final de elaborao da tese.

Pr-reitoria de Ps-graduao da Universidade de So Paulo pela

concesso de uma das passagens.

RESUMO

NISHI, S. M. Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de genes associados resposta imune em tecidos de sunos. [Effect of Toxoplasma gondii infection on immune related tissue gene expression in pigs]. 2004. 149f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinria) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2004.

A toxoplasmose uma zoonose de ampla distribuio mundial afetando homens e diversas

espcies animais. Levantamentos sorolgicos indicam elevados ndices de infeco, porm

relatos de doena severa rara. A infeco pelo T. gondii induz uma intensa resposta imune

mediada pelo interferon-J (IFN-J) que rapidamente controla a multiplicao parasitria. Com

o objetivo de explorar a resistncia da espcie suna toxoplasmose como modelo de estudo

para a compreenso dos mecanismos de defesa a infeco, foram realizadas infeces orais

com 4,5 x 105 oocistos (cepa VEG) e colheitas de amostras de linfonodo hepato-esplnico

(LN HS), mesentrico (LN M) e leo-clico (LN IC), fgado, sangue, leo, jejuno, bao e timo

aos 2, 4, 7 e 14 dias ps-infeco (DPI). Analisou-se a expresso de 69 genes ligados a

resposta de defesa s infeces pela Real-Time RT-PCR*. LN M, LN HS e fgado foram as

amostras que apresentaram a maior quantidade de genes e maior intensidade de ativao

enquanto que clulas mononucleares de sangue perifrico (CMSP) e timo apresentaram

reduzida resposta infeco. A expresso e a produo de IFNG foram mais altas nas

amostras de LN M e LN HS comparadas s amostras de LN traqueo-bronquial e CMSP,

indicando diferentes nveis de resposta local. Intensa induo de resposta inata e inflamatria

foi observada em vrios tecidos, envolvendo os genes IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1,

MYD88, TLR2, TLR4; estimulao de resposta Th1, mediada por IFNG incluiu os genes

IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanceada pela expresso de

citocinas regulatrias IL10, TGFB1 e TGFB3. Uma proeminente induo de ARG1, INDO

and SLC11A1 indica ativao de mecanismos de proteo do hospedeiro envolvendo

metabolismo de aminocidos (arginina, triptofano) e ferro. A presena de parasitas foi

detectada no LN M aos 2DPI pela Real-Time PCR e pela imunohistoqumica. Aumento do

nmero de parasitas no 4DPI foi seguida de intensa resposta inflamatria, edema e necrose

tecidual no 7DPI principalmente no fgado e no LN M. Elevados nveis de AST srico no

7DPI confirmam a leso de hepatcitos. A diminuio da inflamao e da quantidade de

parasitas no 14DPI sugerem controle da proliferao parasitria. Elevados nveis de

haptoglobina e xido ntrico sricos detectados aos 4DPI (D=0,05) indicam respectivamente a

ativao de protenas de fase aguda e de macrfagos. A anlise de citometria de fluxo mostra

elevao da porcentagem de clulas CD2/CD16 DP sugerindo envolvimento de clulas NK e

no foram observadas alteraes na porcentagem de clulas CD4+/CD8+, CD3+/CD25+. A

estimulao na expresso gnica, a produo de IFN-J, as determinaes sricas e leses

histolgicas apresentam padro similar, com incio de resposta no 2DPI, elevao no 4DPI e

7DPI e diminuio no 14DPI. A anlise da expresso de mRNA nos tecidos revelou alguns

dos mecanismos de defesa do hospedeiro ativados durante a infeco pelo T. gondii.

Observou-se uma equilibrada ativao de citocinas pr- e anti-inflamatrias envolvendo uma

intrincada rede de mecanismos co-estimulatrios e regulatrios coordenando a resposta do

tipo Th1. *Siglas dos genes segundo o Human Gene Nomenclature Committee (HGNC).

Palavras-chave: Sunos. Toxoplasma gondii. Imunologia. Expresso gnica. Real-Time RT-

PCR

ABSTRACT

NISHI, S. M. Effect of Toxoplasma gondii infection on immune related tissue gene expression in pigs. [Efeito da infeco pelo Toxoplasma gondii na expresso de genes associados resposta imune em tecidos de sunos]. 2004. 149f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinria) Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2004.

Toxoplasmosis is a widespread zoonosis affecting humans and large range of animal species

worldwide. Serological surveillance indicates high infection rates, but rarely is associated to

severe disease. T. gondii (Tg) infection induces a strong IFN-J dominated immune response

that rapidly controls parasite replication. Pig resistance to toxoplasmosis was explored as an

experimental model to evaluate host defense mechanisms. Pigs were fed 4.5 x 105 oocysts

(VEG strain) and hepato-splenic (HS LN), mesenteric (MLN) and ileal lymph nodes (I LN),

liver, blood, ileum, jejunum, spleen and thymus samples were collected at 2, 4, 7 and 14 days

after infection (DAI). Gene expression analysis for a panel of 69 immune related genes were

performed by Real-Time RT-PCR*. Most intense response were detected in MLN, HS LN

and liver samples, whereas low changes were observed in periferic blood monocytes (PBMC)

and thymus. IFNG mRNA expression and protein production were higher in MLN and HSLN

cells than in tracheo-bronchial LN and PBMC, suggesting different levels of local response.

Intense innate and inflammatory induction were observed in most of the tissues involving

IL1B, IL6, IFNA1, TNF, ORM1, MYD88, TLR2, TLR4; stimulation of IFNG dominated Th1

response included IRF1, IL23A, IL18, STAT1, SOCS1, SOCS3, ICSBP1, TBX21; balanced

by expression of regulatory cytokines IL10, TGFB1 and TGFB3. Prominent ARG1, INDO

and SLC11A1 upregulation indicate activation of host amino acid (arginine and tryptophan)

and iron protective mechanisms. Tg parasites were detected by Real-Time PCR and

immunohistochemistry in MLN as early as 2DAI. Increase of parasite burden at 4DPI was

followed by an intense inflammatory response, edema and tissue necrosis in liver and LNM at

7DPI. Increased serum AST levels at 7DPI confirmed liver damage. Reduced parasite

numbers and inflammatory response suggest control of parasite replication at 14 DPI. High

serum haptoglobin and nitric oxide at 4DAI (D=0.05) indicate acute phase protein and

macrophage activation, respectively. Flow citometry analysis showed increased percentage of

CD2/CD16 DP suggesting involvement of NK cells, whereas no changes were observed at

CD4+/CD8+, CD3+/CD25+ cells. Gene expression stimulation, IFN-J production, serum

determinations and histological lesions showed similar pattern, of induction at 2DPI,

increasing at 4DPI and 7DPI and decreasing at 14DPI. Tissue mRNA expression analysis

revealed some of the host defense mechanisms activated during T. gondii infection. A balance

of pro- and anti-inflammatory cytokine activation, involving an intricated co-stimulatory and

regulatory mechanisms that coordinates Th1 response was observed.*Gene names according

to Human Gene Nomenclature Committee (HGNC).

Keywords: Pig. Toxoplasma gondii. Immunology. Gene expression. Real-Time RT-PCR

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1 - Organograma de colheita e exame das amostras dos sunos experimentais Beltsville 2003 ............................................... 50

Figura 3.2 - Visualizao grfica da amplificao pela Real-Time PCR. O ABI7700 detecta a emisso de fluorescncia - 'Rn (nas ordenadas) ao longo dos 40 ciclos trmicos da reao (na abscissa). Os resultados so expressos em valores de Ct que indica o nmero de ciclos necessrios para que o sinal fluorescente atinja o limiar de deteco - Beltsville 2003 ....... 63

Figura 4.1.1 - Efeito da infeco pelo T. gondii na expresso gnica no linfonodo mesentrico (LN M), no linfonodo hepato-esplnico (LN HS), nas clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP), no fgado, no bao e no timo de sunos mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento ou diminuio da expresso de mRNA nos grupos infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville 2003 ....................................................... 91

Figura 4.1.2 - Efeito da infeco pelo T. gondii na expresso gnica no linfonodo leo-clico (LN IC), no jejuno (JEJ) e no leo de sunos mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento ou diminuio da expresso de mRNA nos grupos infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville 2003 ................ 92

Figura 4.2.1 - Efeito da infeco pelo T. gondii na expresso de genes no linfonodo mesentrico (LN M), no linfonodo hepato-esplnico (LN HS), no fgado, no leo e no jejuno de sunos mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento ou diminuio da expresso de mRNA nos grupos infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville 2003 ....................................................... 108

LISTA DE QUADROS

Quadro 3.1 - Genes avaliados pela Real-Time RT-PCR nos sunos infectados por T. gondii. Funo primria, siglas dos genes, nomes e nomes alternativos, nmero de acesso no Genbank das seqncias utilizadas para o desenho dos primers e sondas e nmero do experimento (EXP) em que foi testado Beltsville - 2003 ............................................................................................. 58

Quadro 4.1.1 - Deteco de T. gondii em tecidos de sunos nos diferentes dias ps-infeco (DPI) pelas tcnicas de PCR e imunohistoqumica (IHQ) - Beltsville 2003 ............................................................ 69

LISTA DE GRFICOS

Grfico 4.1.1 - Nveis de aspartato aminotransferase (AST) srico em sunos dos grupos controle e infectados pelo T. gondii - Beltsville 2003 ............................................................................................. 71

Grfico 4.1.2 - Nveis de IFN-J srico em sunos dos grupos controle e infectados pelo T. gondii medido pelo mtodo de ELISA - Beltsville 2003 ........................................................................ 72

Grfico 4.1.3 - Produo de IFN-J por clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP), do linfonodo mesentrico (LN M), do linfonodo hepato-esplnico (LN HS) e do linfonodo traqueo-bronquial (LN TB) de sunos dos grupos controle e infectados pelo T. gondii durante cultivo em ConA por 24 horas medida pelo mtodo de ELISA - Beltsville 2003 ................................. 73

Grfico 4.1.4 - Nveis de xido ntrico (NO) no soro de sunos dos grupos controle e infectados pelo T. gondii medido pelo mtodo de Griess - Beltsville 2003 ............................................................. 74

Grfico 4.1.5 - Nveis de haptoglobina em sunos dos grupos controle e infectados pelo T. gondii medido por mtodo colorimtrico - Beltsville 2003 .......................................................................... 75

Grfico 4.2.1 - Variao dos nveis de aspartato aminotransferase (AST) srico em sunos dos grupos Controle e infectados pelo T. gondii Beltsville 2003 ......................................................................... 97

Grfico 4.2.2 - Produo de IFN-J por clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP), clulas do linfonodo mesentrico (LN M) e do linfonodo hepato-esplnico (LN HS) de sunos dos grupos controle e infectados pelo T. gondii durante cultivo em ConA por 24 horas medida pelo mtodo de ELISA - Beltsville 2003 . 99

Grfico 4.2.3 - Nveis de haptoglobina em sunos dos grupos controle e infectados pelo T. gondii medido por mtodo colorimtrico. Letras distintas entre grupos experimentais indicam diferena estatstica significante (D=0,05) - Beltsville 2003 .................... 100

LISTA DE TABELAS

Tabela 4.1.1 - Mdia e desvio-padro (DP) dos valores de aspartato aminotransferase (AST), alanino aminotransferase (ALT), gamaglutamil transferase (GGT), bilirrubinas totais (TBILI), bilirrubina direta (DBILI), protenas totais (PT), globulinas (GLOB), albumina (ALB) e proporo albumina/globulina (A/G) das amostras de soro de sunos infectados com T. gondii econtroles no infectados. Diferena estatstica (Estat.) segundo teste de Tukey-Kramer (D=0,05) - Beltsville 2003 ................. 71

Tabela 4.1.2 - Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas do linfonodo mesentrico em sunos aps a infeco por T. gondii.Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos experimentais - Beltsville 2003 ................................................ 77

Tabela 4.1.3 - Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas do linfonodo hepato-esplnico em sunos aps a infeco por T.gondii. Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos experimentais - Beltsville 2003 ................................................ 78

Tabela 4.1.4 - Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas do linfonodo traqueo-bronquial de sunos aps a infeco por T.gondii. Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos experimentais - Beltsville 2003 ................................................ 79

Tabela 4.1.5 - Variao da expresso de antgenos de superfcie em clulas mononucleares do sangue perifrico de sunos aps a infeco por T. gondii. Mdia das porcentagens relativas, respectivos desvio padro (DP) e diferena estatstica (Estat.) entre os grupos experimentais - Beltsville 2003 .................................... 80

Tabela 4.1.6 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo mesentrico dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii.Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 .................................................... 82

Tabela 4.1.7 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo hepato-esplnico dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii.Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 ..................................................... 83

Tabela 4.1.8 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de clulas mononucleares do sangue perifrico dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 ................ 84

Tabela 4.1.9 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de fgado dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 85

Tabela 4.1.10 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de bao dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 86

Tabela 4.1.11 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de timo dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 87

Tabela 4.1.12 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo leo-clico dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii.Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 ..................................................... 88

Tabela 4.1.13 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de jejuno dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 89

Tabela 4.1.14 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de leo dos sunos do EXP I. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 90

Tabela 4.1.15 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.gondii mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento (valores positivos) ou diminuio (valores negativos) da expresso de RNAm nos linfonodos mesentrico (LN M), hepato-esplnico (LN HS) e clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP) dos grupos infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville 2003 ......................................................................... 93

Tabela 4.1.16 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.gondii mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento (valores positivos) ou diminuio (valores negativos) da expresso de RNAm em amostras de fgado, bao e timo dos grupos infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville 2003 ............................................................................................ 94

Tabela 4.1.17 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.gondii mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento (valores positivos) ou diminuio (valores negativos) da expresso de RNAm no linfonodo leo-clico (LN IC), no jejuno e no leo dos grupos infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville 2003 ......................................................................... 95

Tabela 4.2.1 - Mdia e desvio-padro (DP) dos valores de aspartato aminotransferase (AST), alanino aminotransferase (ALT), gamaglutamil transferase (GGT), bilirrubinas totais (TBILI), bilirrubina direta (DBILI), fosfatase alcalina (ALP), protenas totais (PT), globulinas (GLOB), albumina (ALB) e proporo albumina/globulina (A/G) em amostras de soro de sunos infectados com T. gondii e controles no infectados. Diferena estatstica (Estat.) segundo teste de Tukey-Kramer (D=0,05) - Beltsville 2003 ......................................................................... 97

Tabela 4.2.2 - Mdia e desvio-padro (DP) da contagem do nmero total de leuccitos (Leu), nmero total (T) e relativo (%) de neutrfilos (Ne), linfcitos (Li), moncitos (Mo), Eosinfilos (Eo), basfilos (Ba), nmero total de eritrcitos (He), concentrao de hemoglobina (Hb), volume globular (Hct), volume corpuscular mdio (MCV), hemoglobina corpuscular mdia (MCH) e concentrao hemoglobnica corpuscular mdia (MCHC) em sunos infectados com T. gondii e controle no-infectado. Diferena entre os grupos experimentais (Estat.) segundo teste de Tukey-Kramer, D=0,05 - Beltsville 2003 ............................ 101

Tabela 4.2.3 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo mesentrico dos sunos do EXP II. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii.Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 ...................................................... 103

Tabela 4.2.4 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de linfonodo hepato-esplnico dos sunos do EXP II. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii.Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 ..................................................... 104

Tabela 4.2.5 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de fgado dos sunos do EXP II. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 105

Tabela 4.2.6 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de leo dos sunos do EXP II. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 106

Tabela 4.2.7 - Resultados da Real-Time RT-PCR em amostras de jejuno dos sunos do EXP II. Valores mdios de Ct e respectivos desvios padres (DP) nos grupos controle e infectados de acordo com o dia aps a infeco com T. gondii. Diferena estatstica (Estat.) segundo o teste de Tukey-Kramer (D = 0,05) - Beltsville 2003 107

Tabela 4.2.8 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.gondii, mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento (valores positivos) ou diminuio (valores negativos) da expresso de RNAm nos linfonodos mesentrico (LN M), hepato-esplnico (LN HS) e fgado dos grupos infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville 2003 ................................................ 109

Tabela 4.2.9 - Variao da expresso gnica em sunos aps infeco pelo T.gondii, mensurado pela Real-Time RT-PCR. Aumento (valores positivos) ou diminuio (valores negativos) da expresso de RNAm no leo e no jejuno dos grupos infectados em relao ao controle no-infectado Beltsville 2003 ................................. 110

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS1

Ac Anticorpo

ALP Fosfatase alcalina

ALT Alanino aminotransferase

ANOVA Anlise de varincia

ANRI Animal and Natural Resources Institute

ARS Agricultural Research Service

AST Aspartato aminotransferase

BARC Beltsville Agricultural Research Center

BHQ Black Hole Quencher

CD Antgeno de superfcie

cDNA DNA complementar

CMSP Clulas mononucleares do sangue perifrico

ConA Concanavalin A, lectina da Conavalia ensiformis

CRP Protena C-Reativa

CSF Fator estimulador de colnia

DC Clula dendrtica

DNA cido desoxirribonuclico

DNase Desoxirribonuclease

DP Duplo positivos

DPI Dias ps-infeco

EDTA cido etileno diaminotetracetato sdico

ELISA Ensaio imunoenzimtico

FAM 6-carboxifluorescena

FCM Citometria de fluxo

FITC Isotiocianato de fluorescena

HBSS Hanks Balanced Salt Solution

HE Hematoxilina e eosina

HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid

1 Devido ao uso consagrado na literatura tcnica, algumas abreviaturas seguem as iniciais de sua grafia em ingls.

HGNC Human Gene Nomenclature Committee

HUGO Human Genome Organization

IDRL Immunology and Disease Resistance Laboratory

IFN Interferon

Ig Imunoglobulina

IHQ Imunohistoqumica

IL Interleucina

INDO Indoleamine 2,3-dioxygenase

iNOS NO sintase induzvel

ITS1 Internal Transcribed Spacer 1

LN Linfonodo

LN HS Linfonodo hepato-esplnico

LN IC Linfonodo leo-clico

LN M Linfonodo mesentrico

LN TB Linfonodo traqueo-bronquial

MAT Teste de aglutinao mofidicado

mRNA RNA mensageiro

NCBI National Center for Biotecnology Information

NK Clula Natural Killer

NO xido ntrico

NRFL Nutrient Requirements and Functions Laboratory

PBESL Parasite Biology, Epidemiology and Systematics Laboratory

PBS Soluo salina tamponada

PCR Reao em cadeia pela polimerase

PE Ficoeritrina

PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate

RNA cido ribonuclico

RNase Ribonuclease

ROX 6-carboxy-x-rhodamine

RT Transcrio reversa

SFB Soro fetal bovino

SLA Swine Leukocyte Antigen

STAg Antgeno solvel de T. gondii

T Linfcito T ou referente ao Linfcito T

TAMRA 5-(and 6)-carboxytetramethylrhodamine

Tc Linfcito T citotxico

TET Tetrachloro-6-carboxyfluorescein

TGF Fator transformador de crescimento

Th Linfcito T helper

TIGR The Institute for Genomic Research

TLR Receptor tipo Toll

TNF Fator de necrose tumoral

USDA The United States Department of Agriculture

LISTA DE SMBOLOS

D - alfa

E- beta

J - gama

G' - delta

P - micro

C - graus Celsius

SUMRIO

1 INTRODUO ........................................................................................ 30

2 REVISO DA LITERATURA .............................................................. 32

3 MATERIAL E MTODO ...................................................................... 45

3.1 LOCAL ..................................................................................................... 45

3.2 ANIMAIS .................................................................................................. 45

3.3 Toxoplasma gondii .................................................................................... 46

3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL .................................................... 46

3.5 SACRIFCIO DOS SUNOS E COLHEITA DAS AMOSTRAS ............ 49

3.6 ISOLAMENTO E PREPARO DAS CLULAS ...................................... 50

3.6.1 Separao de Clulas Mononucleares do Sangue Perifrico ............... 51

3.6.2 Separao de Clulas dos Linfonodos ................................................... 51

3.7 CULTURA IN VITRO ............................................................................... 52

3.8 ANLISE DE SUBPOPULAES DE CLULAS ............................... 53

3.9 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA A REAL-TIME RT-PCR ............ 53

3.9.1 Extrao de RNA ..................................................................................... 54

3.9.2 Quantificao de RNA por Espectrofotometria ................................... 54

3.9.3 Tratamento com DNase .......................................................................... 55

3.9.4 Determinao da Concentrao e da Qualidade do RNA .................... 55

3.9.5 Sntese de cDNA ...................................................................................... 56

3.10 REAL-TIME PCR ................................. 56

3.10.1 Genes ........................................................................................................ 57

3.10.2 Otimizao da Real-Time PCR .............................................................. 62

3.10.3 Condies da Reao e Anlise dos Resultados .................................... 62

3.11 DETERMINAO DE IFN-J .................................................................. 65

3.12 PERFIL HEPTICO E HEMOGRAMA .................................................. 65

3.13 DETERMINAO DE XIDO NTRICO ............................................. 66

3.14 DETERMINAO DE HAPTOGLOBINA ............................................ 66

3.15 DETECO DE ANTICORPOS ANTI-T. gondii ................................... 66

3.16 DETECO DE T. gondii ........................................................................ 67

3.17 ANLISE ESTATSTICA ....................................................................... 67

4 RESULTADOS ........................................................................................ 68

4.1 EXPERIMENTO I .................................................................................... 68

4.1.1 Exames Histo-Patolgicos e Parasitolgicos ......................................... 68

4.1.2 Pesquisa de Anticorpos Anti-T. gondii .................................................. 70

4.1.3 Perfil Heptico ......................................................................................... 70

4.1.4 Determinao de IFN-J ........................................................................... 72

4.1.4.1 IFN-J Srico .............................................................................................. 72

4.1.4.2 Produo de IFN-J .................................................................................... 73

4.1.5 Determinao de NO ............................................................................... 74

4.1.6 Determinao de Haptoglobina ............................................................. 75

4.1.7 Anlise de Subpopulaes de Clulas .................................................... 75

4.1.8 Expresso Gnica .................................................................................... 81

4.2 EXPERIMENTO II ................................................................................... 96

4.2.1 Pesquisa de Anticorpos Anti-T. gondii .................................................. 96

4.2.2 Perfil Heptico ......................................................................................... 96

4.2.3 Determinao de IFN-J ........................................................................... 98

4.2.3.1 IFN-J Srico .............................................................................................. 98

4.2.3.2 Produo de IFN-J .................................................................................... 98

4.2.4 Determinao de Haptoglobina ............................................................. 99

4.2.5 Hemograma ............................................................................................. 100

4.2.6 Expresso Gnica .................................................................................... 102

5 DISCUSSO ............................................................................................ 112

6 CONCLUSES ....................................................................................... 133

REFERNCIAS ...................................................................................... 135

APNDICES .............................................................................................. 145

30

1 INTRODUO

A toxoplasmose uma zoonose de ocorrncia mundial causada pelo protozorio

Toxoplasma gondii (NICOLLE; MANCEAUX, 1908). Este agente se destaca por possuir uma

ampla diversidade de hospedeiros incluindo vrias espcies de mamferos e aves. Inquritos

sorolgicos indicam um elevado nmero de infectados tanto na populao humana quanto nos

animais, entretanto relatos de quadros clnicos severos e infeces letais so pouco freqentes

(DUBEY; BEATTIE, 1988).

O T. gondii um parasita intracelular obrigatrio, capaz de invadir e se multiplicar no

interior de qualquer clula nucleada, sem predileo por tipo tecidual. A infeco se

caracteriza na maior parte dos casos por uma fase inicial aguda de intensa replicao do

parasita, seguida de uma fase crnica, assintomtica em que o parasita se reproduz

lentamente.

Os mecanismos de defesa do hospedeiro exercem um papel crucial no controle da

atividade do parasita. Na fase inicial da infeco ocorre o processo de reconhecimento

antignico e ativao do sistema de defesa especfica. A consolidao da resposta

imunolgica especfica inibe eficientemente a replicao do T. gondii, porm no capaz de

destru-lo. O T. gondii por sua vez possui mecanismos de evaso do sistema imune,

assumindo uma forma de baixa imunogenicidade formando cistos em tecidos onde se mantm

vivel por anos, provavelmente por toda vida do hospedeiro.

Alteraes na funo imunolgica do hospedeiro podem reativar a infeco crnica, o

que a caracteriza como uma doena oportunista. Quando associado a doenas debilitantes e

imunossupressoras produz leses intensas devido a reproduo descontrolada do parasita que

levam o indivduo a bito (DUBEY; BEATTIE, 1988).

31

O principal modelo experimental para o estudo da toxoplasmose a infeco em

camundongos. A manipulao gentica e os recursos de biologia molecular fornecem

informaes valiosas para a compreenso dos mecanismos biolgicos envolvidos na etiologia

da doena. Existem, entretanto, diferenas metablicas entre humanos e camundongos que

devero ser estudadas com a utilizao de espcies animais de grande porte como modelo

experimental (HEIN; GRIEBEL, 2003; MESTAS; HUGHES, 2004).

Em comparao aos camundongos, os sunos apresentam maior resistncia infeco

pelo T. gondii, comportando-se de modo parecido aos humanos. Os sintomas clnicos so

pouco intensos e similares aos observados em outras infeces sistmicas. Quando aparentes

os sintomas so observados nas primeiras semanas ps-infeco, incluindo febre,

linfoadenomegalia, hiporexia e apatia. Aps este breve perodo, a infeco controlada pelo

sistema imune e o parasita se mantm latente em cistos teciduais (DUBEY; BEATTIE, 1988;

DUBEY et al., 1996).

Apesar do grande nmero publicaes sobre o assunto, os mecanismos responsveis

pelo controle da multiplicao e da manuteno dos cistos teciduais em fase de latncia ainda

no foram completamente identificados. O presente trabalho explora a resistncia da espcie

suna toxoplasmose como modelo de estudo para a compreenso dos mecanismos de defesa

envolvidos durante a fase aguda da infeco. Foram quantificados a expresso de 69 genes em

diferentes tecidos do hospedeiro, obtendo-se assim a variao da expresso dos genes em

diferentes dias aps a infeco e tambm o padro de resposta nos diferentes tecidos.

Paralelamente expresso gnica nos tecidos, a resposta imunolgica foi abordada por

indicadores sricos, cultura de clulas e histopatologia.

32

2 REVISO DE LITERATURA1

Infeces experimentais em camundongos so o ponto inicial para o estudo dos

mecanismos de defesa toxoplasmose. A facilidade de manuteno de linhagens isognicas,

aliada possibilidade de manipulao gentica, a obteno de vrias geraes em um curto

espao de tempo e a elevada suscetibilidade da espcie infeco pelo T. gondii tornou o

camundongo o modelo padro para esse tipo de estudo. A supresso ou a introduo de genes

em camundongos geneticamente modificados permitiu determinar o papel fisiolgico da

protena por eles codificada frente a diversas condies experimentais.

Por outro lado, infeces em culturas de clulas mostraram a capacidade de resposta

de diferentes isolados de clulas ao parasitismo. Tipos celulares de origens e de funes

variadas como clulas epiteliais (DENNEY; ECKMANN; REED, 1999), fibroblastos

(BLADER; MANGER; BOOTHROYD, 2001; BRENIER-PINCHART et al., 2002;

CHANNON et al., 2002), clulas dendrticas e macrfagos (CHAUSSABEL et al., 2003;

ROBBEN et al., 2004), esplencitos (GAZZINELLI et al., 1993; ROBBEN et al., 2004)

responderam infeco pelo T. gondii por meio de liberao de diferentes fatores ligados

quimiotaxia, induo de resposta inflamatria e com efeito microbicida.

Ambos modelos experimentais, camundongos e cultivo em clulas, tm sido

intensamente explorados no estudo da interao hospedeiro-parasita. Ao considerar diferenas

biolgicas entre espcies e condies laboratoriais artificiais torna-se difcil a extrapolao de

1 Nota da autora: Na reviso de literatura foram utilizadas as siglas e abreviaturas adotadas na publicao original. No experimento da tese, foram utilizadas as siglas de genes conforme o Human Gene Nomenclature Committee (HGNC) do Human Genome Organization (HUGO) apresentandas no site em janeiro de 2004. Devido a constantes atualizaes na nomenclatura, eventuais diferenas podem ser notadas entre as siglas aqui publicadas e siglas atualmente vigentes. As protenas seguem a nomenclatura do The Journal of Immunology Standard Abbreviations. Desta maneira, IFNG, TNF, IL12A, NOS2A referem-se aos genes e IFN-JTNF-D, IL12p35, iNOS referem-se s respectivas protenas.

33

dados experimentais para a compreenso de fenmenos reais. A defesa contra a infeco pelo

T. gondii formada por uma cascata de eventos, envolvendo componentes da imunidade

inata que iro exercer importante papel na consolidao da resposta especfica

A resposta inata pode ser observada em diferentes tipos celulares, independente de sua

origem ou funo primria (YAP; SHER, 1999). Embora inespecfica, possui componentes

importantes para a ativao, a diferenciao celular e a consolidao da defesa especfica.

O controle efetivo da infeco pelo T. gondii feito pela imunidade mediada por

clulas. A defesa celular envolve a ativao escalonada de tipos celulares especializados que

se interagem atravs da expresso de antgenos de superfcie, da secreo de mediadores

especficos, conhecidos como citocinas, e sua interao sobre receptores prprios. Desta

maneira, a avaliao do perfil das citocinas produzidas durante uma dada infeco, fornece

importantes pistas a respeito do grau e da forma de ativao da imunidade celular. Na

literatura as citocinas so tambm encontradas sob as designaes quimiocinas, linfocinas e

fatores de crescimento (PAUL, 1999).

A imunidade humoral representada pela produo de anticorpos especficos o

principal indicador para o diagnstico da toxoplasmose na populao. Possui grande valia

para a deteco dos indivduos infectados, porm no fornece informaes sobre o estado

imune ou a resistncia do hospedeiro (DUBEY; BEATTIE, 1988; FILISETTI; CANDOLFI,

2004).

As citocinas so molculas proteicas, produzidas e secretadas pelas clulas em

resposta a um estmulo, isto , sua produo induzida em um dado momento e cessa to logo

o fator estimulatrio seja eliminado ou reprimido. Exercem funo local sobre os tecidos e

podem possuir atividade autcrina, agindo sobre as prprias celulas produtoras, ou parcrina,

isto , agindo sobre diferentes alvos celulares (PAUL, 1999).

34

Diferentes padres de citocinas so secretados em resposta a diferentes formas de

infeco, resultando em diferentes respostas efetoras. A partir destas observaes,

desenvolveu-se o conceito do paradigma das respostas do tipo Th1/Tc1 e tipo Th2/Tc2. A

resposta Th1/Tc1, envolveria as clulas T helper e citotxicas mediadas por citocinas como o

interferon gama (IFN-J e fator de necrose tumoral alfa (TNF-D que so induzidas por

infeces intracelulares, como por exemplo vrus e bactrias. A resposta Th2/Tc2 por sua vez,

estaria associada s citocinas interleucina-4 (IL-4), IL-5 e IL-13 produzidas em resposta a

infeces extracelulares, por exemplo helmintos. As respostas Th1 e Th2 so contra-

balanceadas por mecanismos de inibio, desta forma, citocinas Th1 inibem a expresso de

citocinas Th2 e a ausncia de estimulao Th1 levaria a produo de resposta Th2

(JANKOVIC; LIU; GAUSE, 2001; PEARCE; SCOTT; SHER, 1999; SZABO et al., 2003).

No que se refere toxoplasmose, a citocina-chave para o estudo da resistncia o

IFN-Jenvolvendo a atividade de clulas Th1. Infeces experimentais em camundongos

revelam que a produo de IFN-J um passo crtico para a proteo do hospedeiro contra a

infeco pelo T. gondii. A ausncia do gene ou a deficincia na produo de IFN-J ou de seu

respectivo receptor leva replicao descontrolada do parasita e o hospedeiro evolui

rapidamente para a morte (FUJIGAKI et al., 2002; SCHARTON-KERSTEN et al., 1996b;

YAP; SHER, 1999).

A produo de IFN-J por linfcitos T e clulas NK responsvel pela ativao de

macrfagos e das prprias clulas NK (FILISETTI; CANDOLFI, 2004) e est fortemente

associado a induo da converso de taquizotos para bradizotos (BOHNE; HEESEMANN;

GROSS, 1993; JONES; BIENTZ; ERB, 1985).

Este efeito protetor do IFN-J deve, entretanto, possuir mecanismos regulatrios

visando impedir efeitos imunopatolgicos. Ao comparar de linhagens de camundongos

suscetveis e resistentes toxoplasmose aguda observou-se, de forma intrigante, nveis de

35

IFN-J sricos mais elevados nas linhagens sucetveis que nas resistentes. Esta elevada

concentrao de IFN-J foi associada a um processo inflamatrio agudo com edema e necrose

tecidual bastante intensas no fgado e no linfonodo mesentrico (MCLEOD et al., 1989). A

produo exacerbada de IFN-J foi tambm observada nas infeces letais causadas por

isolados de T. gondii altamente virulentos (GAVRILESCU; DENKERS, 2001; MORDUE et

al., 2001).

Para melhor compreender a cascata de ativao da resposta Th1 e tomando o IFN-J

como referncia, diversos trabalhos buscam identificar os mediadores resposveis pela

induo da produo de IFN-J, a sinalizao intracelular e as vias efetoras ativadas pelo IFN-

J.

Ao longo da infeco a ativao do sistema imune ocorre por mecanismos mltiplos.

Alm de reconhecimento de antgenos do T. gondii, a leso celular e citlise geram sinais no

especficos que alertam as clulas fagocitrias da presena do agressor (SCOTT; HUNTER,

2002).

Os mecanismos de defesa ativados nesta fase precoce da infeco so mecanismos

inespecficos porm importantes para a organizao da resposta especfica. Nesta fase inicial,

clulas fagocitrias como as clulas dendrticas (DC), moncitos e macrfagos desempenham

um papel essencial no reconhecimento do agente invasor, na apresentao antignica e

gerao sinais especficos para as clulas efetoras (PAUL, 1999).

Nos camundongos a IL-12 a principal citocina indutora da produo de IFN-J. As

DCs controlam a magnitude e a qualidade da resposta Th1 com a produo de interleucina-12

(IL-12) (SCOTT; HUNTER, 2002). A ausncia de IL-12 aumenta a suscetibilidade

infeco, com menor produo de mediadores inflamatrios, maior replicao parasitria e

morte em menor espao de tempo (ARAUJO et al., 2001). Tanto parasitas ntegros quanto

antgenos solveis so capazes de induzir IL-12 e desta forma, estimular clulas efetoras

36

como linfcitos T e clulas Natural Killer (NK) a produzir IFN-J(GAZZINELLI et al., 1994).

Nas clulas NK a sntese de IFN-J dependente de IL-12 e pode ser aumentada pelo IFN-J,

pelo TNF-D e pela IL-2 (GAZZINELLI et al., 1993). Acredita-se que na fase inicial da

infeco, as clulas NK e os macrfagos so os principais responsveis pela resistncia inata,

no-especfica (FILISETTI; CANDOLFI, 2004).

A IL-12 tambm citada como importante citocina na manuteno da resistncia

contra a toxoplasmose crnica. Camundongos IL-12 deficientes conseguiram responder

infeco quando tratados com IL-12 exgena. Ao redor de trs semanas aps a interrupo do

tratamento observou-se um intenso aumento do nmero de cistos imaturos no crebro,

associadas a reas de necrose e morte por encefalite aguda (YAP; PESIN; SHER, 2000).

Da mesma maneira que as DCs e as clulas NK, os macrfagos tambm contribuem na

modulao da imunidade pela secreo de IL-12 e se destacam por exercer funes efetoras

anti-microbianas. A produo de reagentes oxidativos, xido ntrico e atividade de enzimas

lisossomais constituem alguns dos vrios mecanismos microbicidas dos macrfagos

(STAFFORD; NEUMANN; BELOSEVIC, 2002).

O mecanismo de ativao do sistema imune controlado por uma intrincada rede de

citocinas. Parte destes mecanismos j so bem definidos no modelo experimental dos

camundongos, mas alguns experimentos em sunos sugerem possveis diferenas na resposta

entre as espcies. Um exemplo a via de ativao da produo de IFN-J pela ao da IL-12.

Solano-Aguilar et al. (2002) no obtiveram xito ao estimular a produo de IFN-J em

linfcitos de sunos in vitro utilizando IL-12 recombinante (rIL-12) espcie especfica. O

mesmo experimento utilizando linfcitos de bovinos, a rIL-12 suna mostrou-se ativa,

estimulando a produo de IFN-J.

Ao comparar a induo de mRNA em culturas de clulas mononucleares do sangue

perifrico de sunos e bovinos, observa-se um aumento da expresso de IL12RE2 nos bovinos,

37

mas no nas clulas de sunos, o que leva a supor que a baixa resposta dos sunos IL-12

esteja ligada reduzida quantidade de receptores prprios (SOLANO-AGUILAR et al.,

2002).

Este fato leva a considerar a possibilidade de vias alternativas de induo da produo

de IFN-J independentes da IL-12. Sabe-se que camundongos infectados e tratados com

anticorpos monoclonais (mAc) anti-IL12 so capazes de produzir IFN-J (SCHARTON-

KERSTEN et al., 1996a).

O estudo da atividade das citocinas deve portanto englobar todo um conjunto de

citocinas que apresentam funes similares, pois sabe-se que diferentes citocinas so capazes

de produzir o mesmo efeito final e agindo muitas vezes em sinergismo (LUNNEY, 1998). Um

exemplo deste efeito observado na ao sinrgica da IL-18 em relao IL-12, aumentando

a produo de IFN-J (CAI; KASTELEIN; HUNTER, 2000).

Camundongos deficientes de STAT4, protena envolvida na sinalizao intracelular da

IL-12, so muito sensveis a infeco pelo T. gondii por apresentar baixos nveis de IFN-J. A

administrao associada de IL-2 e IL-18 foi capaz de induzir a produo de IFN-J e aumentar

a sobrevida dos camundongos (CAI et al., 2000).

Este mesmo efeito foi observado em camundongos portadores de uma deficincia na

sinalizao da IL-12 que conseguiram recuperar a produo de IFN-J quando tratados com

IL-18 (YAP et al., 2001).

Ao pensar em similaridades estruturais, a IL-23 se assemelha IL-12 ao compartilhar

a mesma a subunidade p40. Ambas so citocinas heterodimricas, diferindo entre si pela

associao das subunidades p19 e p35, respectivamente.

Infeces experimentais em camundongos e estimulao de DCs in vitro indicaram

uma elevao da expresso de mRNA para IL23, levantando uma possvel via alternativa de

ativao do IFN-J. Entretanto, em camundongos geneticamente modificados, a supresso dos

38

genes p40 e p35 geraram maiores prejuzos resposta contra o T. gondii do que a do gene p19

(LIEBERMAN et al., 2004).

Em infeces in vivo fica evidente que juntamente com o IFN-J outras citocinas

inflamatrias agem na proteo contra o T. gondii. A deficincia de receptores para o TNF-D

e a enzima iNOS tambm levam a uma maior suscetibilidade a infeco por T. gondii (YAP et

al., 1998; YAP; SHER, 1999).

Em humanos os mecanismos de ativao associados a taquizotos vivos, mortos e

antgenos solveis de T. gondii (STAg) so distintos. Parasitas vivos induzem a produo de

IL-12 por DC humanas envolvendo vias ligadas a interao de antgenos CD40 e seu

respectivo ligante, o CD40L, o que no observado em estudos com lisados do T. gondii

(SUBAUSTE; WESSENDARP, 2000). Nos camundongos esta interao CD40-CD40L no

essencial resposta imune, pois DCs de camundongos deficientes em CD40 so capazes de

produzir IL-12 em resposta a STAg e infeco com parasitas vivos (REICHMANN et al.,

2000).

A interao CD40-CD40L citada como uma das possveis vias que substituem a via

de sinalizao do TNF (PEARCE; SCOTT; SHER, 1999).

Na imunidade inata a molcula adaptadora MyD88 est vinculada a ativao dos

receptores Toll-like (TLR). Sabe-se que esta via dos TLRs tambm est envolvida na resposta

infeco, pois camundongos deficientes do gene MYD88 apresentam baixos nveis de IL-12

srico e uma multiplicao descontrolada do T. gondii (SCANGA et al., 2002).

Em oposio ao raciocnio anterior em que diferentes citocinas levam ao mesmo efeito

final, importante ressaltar que uma citocina pode possuir funes mltiplas, isto , uma

nica citocina capaz de induzir diversas vias efetoras. O estudo de uma nica citocina

fornece uma lista de possveis formas de controle da infeco pelo T. gondii, entretanto no

possvel afirmar qual a via mais importante.

39

Ao se falar em clula efetora e atividade anti-microbiana sabe-se que no somente

clulas derivadas da medula ssea, mas tambm clulas somticas de origem no-

hematopoitica respondem ao estmulo do IFN-J e do TNF-Disto , potencialmente vrios

tipos celulares podem responder s citocinas. O mecanismo efetor responsvel pelo controle

do T. gondii ainda no foi elucidado, existindo vrias teorias sobre os possveis fatores

envolvidos.

A produo de reagentes txicos como o xido ntrico (NO) um dos mecanismos

envolvidos no controle das infeces intracelulares por bactrias. A enzima responsvel pela

produo de NO pelas clulas a NO sintase (NOS). Esta enzima encontrada em diversas

isoformas, sendo a iNOS a forma expressa em clulas imunes ativadas (STAFFORD;

NEUMANN; BELOSEVIC, 2002). A induo da iNOS observada em vrios tipos celulares,

entretanto a funo microbicida do xido ntrico (NO) parece estar restrita aos moncitos e

macrfagos (NATHAN; XIE, 1994).

Em camundongos a induo da iNOS e a produo de NO importante na defesa

macrofgica contra o T. gondii, porm acredita-se que no seja o nico mecanismo envolvido

(HAYASHI et al., 1996; YAP; SHER, 1999). Infeces no-letais em camundongos normais

tornam-se letais em camundongos deficientes do gene para a iNOS (DENKERS, 1999). Nos

humanos, esta atividade ainda controversa.

Ativao de mecanismos de depleo de nutrientes ao parasita a outra hiptese para

a diminuio da atividade dos taquizotos. O IFN-J induz uma intensa produo de

indoleamine 2,3-dioxigenase (INDO) nos macrfagos. Esta enzima que seria responsvel pela

depleo de triptofano necessrio para a replicao do T. gondii (PFEFFERKORN, 1984).

Porm somente a depleo de triptofano no suficiente para garantir a inibio da

multiplicao do parasita (MACKENZIE et al., 1999).

40

A interao entre as diversas vias efetoras podem levar a resultados diferentes do

esperado. A produo de NO pode inibir a expresso de INDO em macrfagos ativados por

IFN-J (ALBERATI-GIANI et al., 1997).

A ativao da enzima arginase leva a depleo de arginina. A ausncia de arginina,

substrato para a enzima NO sintase, levaria a uma baixa produo de NO favorecendo o

crescimento parasitrio (VINCENDEAU et al., 2003).

Conforme avanam os conhecimentos acerca das citocinas observa-se uma

necessidade de uma maior compreenso das mltiplas interaes que regem a resposta imune.

Partindo-se do conceito de que o equilbrio entre citocinas pro e anti-inflamatrias seria

fundamental para assegurar o combate da infeco sem levar a auto-destruio de tecidos do

organismo, a ativao de fatores reguladores cumprem um importante papel na fase de

recuperao e regenerao celular (DENKERS, 1999). A atividade regulatria

desempenhada tanto no meio extracelular por meio da secreo de citocinas regulatrias ou no

intracelular pela ao de supressores da sinalizao.

O efeito da hiperativao inflamatria e imunolgica foi descrito em camundongos

com infeces letais. Foram observadas excessiva produo de citocinas como IFN-J e TNF-

D associada a leses intensas em tecido heptico e cerebral (MORDUE et al., 2001).

Dentre as citocinas regulatrias a IL-10 e o TGF-E so as provveis citocinas

envolvidas no controle do efeito Th1 durante a toxoplasmose aguda. Embora primariamente

classificada como uma citocina Th2, trabalhos recentes tm sugerido associar a IL-10 a

clulas T regulatrias (COUSINS; LEE; STAYNOV, 2002; VOLK et al., 2001). Sabe-se que

a IL-10 possui efeito inibitrio sobre as citocinas IL-2, IFN-JTNF-D e fator estimulador de

colnia granuloctica-macrofgica (GM-CSF), inibindo a resposta Th1, por supresso da IL-

12 (LEONARD, 1999).

41

A leso mais severa observada em camundongos deficientes em IL-10 infectados por

T. gondii foi a necrose aguda de segmentos intestinais e do fgado. Interessantemente o

bloqueio do efeito do IFN-J, da IL-12 ou das clulas CD4+ por meio de anticorpos

monoclonais prolongou a sobrevida destes camundongos (SUZUKI et al., 2000).

O TGF-E inibe a atividade macrofgica induzida pelo IFN-J por meio da inibio da

produo de TNF-D (LANGERMANS et al., 2001).

O efeito inibitrio pode ocorrer no meio intracelular. Normalmente a juno da

citocina em seu receptor produz uma sinalizao intracelular que envolve a ativao de

molculas intracelulares como JAKs (Janus family kinases) e STATs (Signal transducers and

activators of transcription). Cabe aos supressores da sinalizao das citocinas (suppressors of

cytokine signaling - SOCS) regular a sinalizao intracelular (FUJIMOTO; NAKA, 2003).

SOCS1 foi inicialmente descrito como uma molcula induzida por STAT (STAT-

induced STAT inhibitor). Atualmente sabe-se que induzida tambm pela insulina,

lipopolissacardeos (LPS), CpG DNA e outras molculas que no ativam STATs. um

regulador negativo da sinalizao de vrias citocinas, entre elas IFN-J, IL-6 e IL-4

(FUJIMOTO; NAKA, 2003).

A ausncia do gene SOCS1 em camundongos causa morte antes de trs semanas de

vida, com retardo no crescimento, linfocitopenia, doena heptica e falncia mltipla de

rgos. Os linfcitos destes camundongos apresentam-se ativados, mesmo quando criados em

condies specific-pathogen-free (SPF). Camundongos SOCS1 e IFNG duplo negativos no

apresentam as leses inflamatrias observadas nos somente SOCS1 negativos e possuem uma

sobrevida maior (FUJIMOTO; NAKA, 2003).

O padro da resposta contra diferentes agentes indica que ocorrem diferentes

mecanismos de ativao da imunidade adaptativa. Moncitos e clulas dendrticas humanas

infectadas in vitro apresentaram padres de expresso gnica distintos quando incubadas com

42

Mycobacterium tuberculosis, Leishmania major, Leishmania donovani, T. gondii e Brugia

malayi (CHAUSSABEL et al., 2003).

Frente a complexidade de fatores envolvidos na resposta a infeco pelo T. gondii e

considerando a possibilidade da ativao de vias distintas a aquelas observadas nos

camundongos, a espcie suna foi escolhida como modelo de estudo para o presente

experimento.

A compilao das informaes at aqui reunidas foi empregada para listar os

principais genes de interesse no estudo da infeco pelo T. gondii. A compreenso dos fatores

envolvidos na resistncia dos sunos a toxoplasmose aguda poder no futuro apontar novos

caminhos para o desenvolvimento de adjuvantes de vacinas, imunoestimulantes e de terapias.

A tcnica da Real-Time PCR foi escolhida por permitir a quantificao do produto da

PCR de uma forma bastante acurada e de uma maneira bastante simples quando comparada s

provas de PCR competitivo (BUSTIN, 2000; ZARLENGA; HIGGINS, 2001). Robustez, boa

linearidade e capacidade de deteco de pequenas variaes de DNA a tornaram uma boa

alternativa para os estudos de resistncia a doenas, resposta a drogas e funes metablicas.

Visando o emprego da espcie suna como modelo para o estudo de resistncia a

doenas e afeces nutricionais, Dawson et al. (2001) catalogaram seqncias de sunos

publicadas em diferentes bancos de acesso pblico (Genbank, TIGR), desenvolveram e

testaram primers e sondas espcie especficos.

Os primeiros testes da Real-Time RT-PCR em sunos avaliaram o padro de resposta

de 24 genes infeco por T. gondii e por Ascaris suum. Os resultados mostraram-se bastante

consistentes com o esperado, revelando uma tendncia a induo de citocinas Th1 na

toxoplasmose e citocinas Th2 na infeco pelo A. suum (DAWSON et al., 2002a).

A boa performance da Real-Time RT-PCR levou ampliao da lista de genes a

serem testados. Um outro experimento avaliou-se 12 genes em amostras de linfonodo

43

mesentrico e fgado de sunos infectados por T. gondii. Em ambos os tecidos houve forte

induo dos genes IFNG e IRF1. Alm destes dois genes, no fgado observou-se alteraes

tambm em outros genes associados induo da resposta Th1, como HLX1, MYD88,

STAT1, TBX21, CD8A, CD8B e CD28 (DAWSON et al., 2004).

Nos experimentos iniciais de Dawson et al. (2002a) os sunos foram necropsiados aps

7 e 14 dias ps-infeco (DPI) pelo T. gondii e observou-se uma forte induo de IFNG no

dia 7 e uma diminuio da resposta no dia 14, sugerindo uma tendncia a resoluo do

processo aps este perodo. No presente experimento as necrpsias foram realizadas em dias

mais precoces de infeco e avaliados um maior nmero de genes.

Os genes foram selecionados com base em dados registrados em publicaes recentes

a respeito dos fatores ligados resistncia e imunopatologia da toxoplasmose e foram

categorizados segundo a funo primria em: 1) genes housekeeping (constitutivo); 2) defesa

inata e inflamatria; 3) resposta Th1; 4) resposta Th2; 5) efetor; 6) regulatrio; 7) co-

estimulatrio e 8) apoptose.

44

Os principais objetivos deste trabalho foram:

- a quantificao da expresso gnica em tecidos de sunos infectados pelo T. gondii,

- a avaliao da variao da expresso em diferentes perodos durante a infeco aguda,

- a observao do padro de resposta local em diferentes tecidos e desta forma,

- identificar possveis genes associados a resistncia a infeco.

Complementando a avaliao da expresso gnica, a resposta imune dos sunos foi

tambm acompanhada por meio de determinaes sricas de IFN-J, xido ntrico e

haptoglobina; anlise de subpopulaes de clulas por citometria de fluxo e cultura de clulas

para mensurao de produo de IFN-J. A presena do T. gondii foi confirmada pela

identificao do parasita nos tecidos e associado a leses histopatolgicas.

45

3 MATERIAL E MTODO

3.1 LOCAL

O experimento foi realizado nas instalaes do Departamento de Agricultura dos

Estados Unidos da Amrica (USDA), na cidade de Beltsville, Estado de Maryland, EUA. Os

sunos experimentais foram mantidos em instalaes prprias da Unidade de Parasitologia

Animal (APU) seguindo as Normas de Biosegurana do USDA. Todo material biolgico foi

processado nos Laboratrios: Immunology and Disease Resistance Laboratory (IDRL),

Parasite Biology, Epidemiology and Systematics Laboratory (PBESL)1, pertencentes ao

Animal and Natural Resources Institute (ANRI) e Nutrient Requirements and Functions

Laboratory (NRFL), do Beltsville Human Nutrition Research Center, Agricultural Research

Service (ARS), USDA.

3.2 ANIMAIS

Sunos Poland China x Landrace provenientes da fazenda experimental do USDA,

foram alojados em instalaes apropriadas com rao comercial balanceada e gua ad libitum.

O manejo dirio dos animais assim como todo procedimento experimental foram executados

pelo pessoal tcnico responsvel seguindo as normas de conduta aprovadas pelo Beltsville

Area Animal Care and Use Committee do ANRI, USDA.

1 Atualmente IDRL foi incorporado ao PBESL e denominado Animal Parasitic Diseases Laboratory.

46

Antes do incio do experimento, amostras de sangue foram colhidas para deteco de

anticorpos sricos anti-T. gondii por meio da prova de aglutinao modificada (MAT).

3.3 Toxoplasma gondii

Foram utilizadas amostras de T. gondii das cepas VEG e RH fornecidas pelo PBESL.

Oocistos de T. gondii da cepa VEG foram isolados de fezes de gatos

experimentalmente infectados (DUBEY et al., 1996). Aps a esporulao, a infectividade e a

viabilidade dos oocistos foram testados em camundongos (DUBEY et al., 1998) e utilizados

como inculo nas infeces experimentais.

A cepa VEG foi primariamente isolada de um paciente humano portador de HIV,

caracterizada como um isolado avirulento para camundongos e genotipicamente classificada

como do tipo III baseada em anlise do gene SAG (DUBEY et al., 1996; HOWE et al., 1997).

Taquizotos de T. gondii da cepa RH foram isolados e purificados do lquido asctico

de camundongos experimentalmente infectados e utilizados como controle positivo nas

reaes de PCR.

3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Foram realizados dois experimentos similares, utilizando sunos com idades variando

de trs a cinco meses de idade infectados oralmente com 4,5 x 105 oocistos de T. gondii (cepa

47

VEG). Os animais infectados foram necropsiados aps dois, quatro, sete e 14 dias de

infeco. Para cada dia de infeco, foi necropsiado um animal controle.

Os grupos experimentais foram denominados 2DPI, 4DPI, 7DPI e 14DPI de

acordo com o tempo de infeco em dias ps-infeco e Controle para o grupo de animais

no-infectados.

EXPERIMENTO I

No primeiro experimento (EXP I) foram utilizados doze animais. Os grupos 2DPI e

4DPI eram constitudos por trs animais, enquanto que os grupos Controle, 7DPI e 14DPI

eram formados por dois animais.

A resposta de defesa dos animais foi avaliada por meio de:

- Mensurao da expresso gnica em amostras de linfonodos mesentrico (LN M),

hepato-esplnico (LN HS), leo-clico (LN IC), clulas mononucleares do sangue perifrico

(CMSP), fgado, bao, timo, jejuno e leo por meio de transcrio reversa seguida de reao

em cadeia pela polimerase em tempo real (Real-Time RT-PCR).

- Mensurao dos nveis sricos de IFN-J, de xido ntrico (NO) e de haptoglobina.

- Produo de IFN-J pelas clulas mononucleares do sangue perifrico (CMSP) e

linfonodos.

- Anlise de subpopulaes de clulas por citometria de fluxo (FCM).

A presena do T. gondii e as leses teciduais foram avaliadas por meio de:

- Deteco de T. gondii em amostras de LN M, fgado, pulmo, bao e leo por meio

da Real-Time PCR.

48

- Exames histopatolgicos corados pela Hematoxilina e Eosina (HE) e

imunohistoqumica (IHQ).

- Funo e leso heptica foi avaliada por meio de mensurao srica de enzimas

hepticas, protenas totais, albumina, globulinas, bilirrubinas total e direta.

A partir dos resultados preliminares do EXP I, procedeu-se um segundo experimento

(EXP II), em que foram testados um painel distinto de genes na Real-Time RT-PCR. Foram

mantidos 30 genes do painel anterior, excludos 18 e includos 18 novos genes.

EXPERIMENTO II

No segundo experimento (EXP II) foram utilizados 16 animais, quatro controles e trs

animais para cada grupo infectado (2DPI, 4DPI, 7DPI e 14DPI).

A resposta imune destes animais foi acessada por meio de:

- Mensurao da expresso gnica em linfonodos mesentrico e hepato-esplnico,

fgado, jejuno e leo utilizando Real-Time RT-PCR.

- Mensurao dos nveis sricos de haptoglobina.

- Produo de IFN-J pelas CMSP, clulas dos LN M e LN HS.

A infeco e a leso causada pelo T. gondii foi avaliada por meio de:

- Exames histopatolgicos corados pela HE e IHQ.

- Perfil heptico por meio de mensurao srica de enzimas hepticas, protenas totais,

albumina, globulinas, bilirrubinas total e direta.

49

3.5 SACRIFCIO DOS SUNOS E COLHEITA DAS AMOSTRAS

Animas foram sacrificados por superdosagem de anestsicos e imediatamente

necropsiados. Amostras de tecidos e sangue foram separados e adequadamente

acondicionados para cada prova a ser realizada (Figura 3.1):

1) Colheita de tecidos para mensurao de expresso mRNA: Fragmentos de

linfonodos mesentrico, traqueo-bronquial, leo-clico e hepato-esplnico; jejuno, leo,

fgado, bao e timo foram colhidos e imediatamente congelados em nitrognio (N2) lquido,

transportados ao laboratrio e mantidos em freezer 70C at o processamento.

2) Sangue total em tubos contendo anti-coagulante (cido etileno diaminotetracetato

sdico - EDTA) para separao das CMSP e hemograma.

3) Linfonodos (hepato-esplnico, traqueo-bronquial, mesentrico) em meio de colheita

(Apndice A) para separao de clulas mononucleares para FCM e cultivo em meio para

avaliao da produo de IFN-J.

4) Amostras de LN M, fgado, bao, pulmo e leo foram mantidas em gelo e enviadas

ao laboratrio para extrao de DNA para deteco de T. gondii.

50

5) LN M, fgado, bao, pulmo e leo foram fixados em formol tamponado para exame

histopatolgico.

6) Sangue para separao de soro para deteco de anticorpos sricos anti-T. gondii,

avaliao do perfil heptico, IFN-J srico, NO e haptoglobina.

Todos os animais e material descartvel utilizados foram incinerados aps a colheita

das amostras.

Figura 3.1 - Organograma de colheita e exame das amostras dos sunos experimentais Beltsville - 2003

3.6 ISOLAMENTO E PREPARO DAS CLULAS

Procedeu-se o isolamento de clulas do sangue perifrico e dos linfonodos

mesentrico, hepato-esplnico e traqueo-bronquial para a realizao das culturas in vitro (item

Sunos infectados por T. gondii

DNAReal-Time PCR

T. gondii

mRNAReal-Time RT-PCRexpresso de genes

HistologiaH&EIHQ

TECIDOSLN M, LN HS, LN TB

Fgado, Bao, SangueJejuno, leo, Timo

CulturaProduo de IFN-J

FCMAg de superfcie

CLULAS

CMSP, LN M,LN HS, LN TB

Ac a-T. gondiiMAT

NO

IFN-JELISA

Funo hepticaAST, ALP, ALTPT, Alb, Glob,

Bilirrubina

Haptoglobina

SORO

HemogramaContagens deeritrcitos eleuccitos

SANGUE TOTAL

51

3.7), anlise fenotpica de subpopulaes por citometria de fluxo (item 3.8) e extrao de

RNA (item 3.9.1).

3.6.1 Separao de Clulas Mononucleares do Sangue Perifrico

Clulas mononucleares circulantes no sangue perifrico foram separadas por meio de

gradiente de densidade. Para isto, foram colhidos 15 a 20 ml de sangue total em tubos

contendo EDTA e imediatamente enviados ao laboratrio para o processamento.

Clulas mononucleares foram separadas utilizando o meio para separao de linfcitos

(Lymphocyte Separation Medium, LSM, Cappel, Aurora, EUA)2 conforme instrues da bula.

As clulas recuperadas foram lavadas em meio PBL (Apndice B) e ressuspensas em meio

blastognico (Apndice C).

A determinao do nmero total de clulas e a estimativa da porcentagem de clulas

vivas foram feitas por microscopia ptica utilizando Azul de Trypan e hemocitmetros de

Neubauer.

3.6.2 Separao de Clulas dos Linfonodos

A separao das clulas dos linfonodos foi realizado segundo Solano-Aguilar (2000).

(SOLANO-AGUILAR et al., 2000). As amostras de linfonodo removidas durante a necrpsia

2 Composio LSM=6,2g Ficoll e 9,4 Na diatrizoate / 100ml; Densidade = 1.0770-1.0800 g/ml a 20C.

52

foram imediatamente colocadas em tubos cnicos contendo meio de colheita (Apndice A) e

mantidas em recipientes contendo gelo.

Aps a remoo tecido conjuntivo e adiposo adjacente, o linfonodo foi delicadamente

cortado em pequenos fragmentos em placas de Petri contendo meio de colheita, liberando as

clulas do tecido. A suspenso de clulas foi filtrada em malhas de nylon estreis de 210 Pm.

As clulas foram lavadas em HBSS (Hanks Balanced Salt Solution, Gibco, EUA) ou

RPMI-1640 (Invitrogen, Calsbad, EUA) e ressuspensas em meio blastognico. A contagem

do nmero total de clulas e da porcentagem de viabilidade foi realizada seguindo o mesmo

procedimento descrito acima.

3.7 CULTURA IN VITRO

Para avaliao da atividade das CMSP e das clulas dos LN, estas foram incubadas a

2,5 x 106/ml em meio de cultura completo (Apndice D) estimuladas com Concanavalin A

(ConA - Sigma, Saint Louis, EUA) a 10 Pg/ml por 48 horas a 37C e 5% de CO2. Ao trmino

do perodo de incubao o sobrenadante foi separado por centrifugao e mantido a 20C

para posterior mensurao de IFN-J.

53

3.8 ANLISE DE SUBPOPULAES DE CLULAS

A caracterizao fenotpica de sub-populaes de CMSP e clulas isoladas dos LN M,

HS e TB foi realizada por citometria de fluxo aps a identificao por meio de anticorpos

monoclonais anti: CD45 (clone 74-9-3), SLAI (clone PT85), CD2 (clone MSA4), CD16

(clone G7), CD3 (clone BB23 8E6), CD25 (clone 231-3B2), CD4 (clone 74-12-4), CD8

(clone 76-2-11), SLAII DQ (clone TH16), SWC3 (clone 74-22-15B) e CD21 (clone CC51)

(SAALMUELLER et al., 1998). Aps incubao com anti-Ig especfico (IgG1, G2a ou G2b)

conjugado a isotiocianato de fluorescena (FITC) ou ficoeritrina (PE), a proporo relativa das

sub-populaes foi estimada aps a leitura de dez mil clulas por citometria de fluxo no

EPICS-XL MCL (Beckman-Coulter, EUA). Foram tambm realizadas as determinaes de

populaes de clulas duplo-positivas (DP) para CD2/CD16, CD3/CD25, CD4/CD8 e

SWC3/SLADQ. (SOLANO-AGUILAR et al., 2001; SOLANO-AGUILAR et al., 2000).

3.9 PREPARO DAS AMOSTRAS PARA A REAL-TIME RT-PCR

As amostras de tecidos e clulas foram conservadas em freezer 70C para a

determinao da expresso gnica. Foram realizadas extraes do RNA, determinao da

concentrao do RNA, remoo de possveis resduos de DNA genmico, verificao da

qualidade e da concentrao do RNA aps o tratamento com DNase e sntese de cDNA.

54

3.9.1 Extrao de RNA

Amostras de clulas ou de tecido foram homogenizadas no reagente Trizol

(Invitrogen, Carlsbad, EUA). Foram empregadas as propores de: 1x107 clulas em 1 ml de

reagente Trizol ou at 50 mg de tecido em 1 ml de reagente Trizol. Os tecidos congelados

foram inicialmente macerados com cadinho e pistilo em nitrognio lquido e imediatamente

homogenizadas em Trizol utilizando homogenizador de tecidos (Polytron, EUA).

O RNA foi extrado seguindo protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, EUA) e

mantido em freezer 70C.

3.9.2 Quantificao de RNA por Espectrofotometria

Amostras de RNA foram diludas em tampo TrisEDTA (10mM Tris-HCl, 1mM

EDTA pH 8,0). A concentrao do RNA foi estimada aps leitura da absorvncia a 260 e 280

nm em espectrofotmetro (DU640, Beckman Coulter, EUA).

55

3.9.3 Tratamento com DNase

Com intuito de remover possveis resduos de DNA genmico, todas as amostras de

RNA foram adsorvidas em colunas RNeasy (Qiagen, Valencia, EUA) e incubadas com DNase

(RNase-free DNase set, Qiagen, Valencia, EUA).

3.9.4 Determinao da Concentrao e da Qualidade do RNA

A concentrao e a integridade do RNA foram mensuradas pelo RNA 6000 nano

Assay utilizando o equipamento Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto,

EUA). A quantificao do RNA foi determinado baseado no padro RNA 6000 Ladder

(Ambion, Austin, EUA).

56

3.9.5 Sntese de cDNA

cDNA foi sintetizado por transcriptase reversa a partir de 10 Pg de RNA total

utilizando Superscript II RnaseH- Reverse Transcriptase e Oligo(dT)12-18 (Invitrogen,

Carlsbad, EUA) em presena de inibidores de ribonucleases (RNaseOUT recombinant

ribonuclease inhibitor, Invitrogen, Carlsbad, EUA), seguindo as recomendaes do fabricante.

As amostras de cDNA foram mantidas em freezer 20C at a realizao das provas

de Real-Time PCR.

3.10 REAL-TIME PCR

Reagentes espcie especficos foram desenvolvidos para a realizao da Real-Time

PCR. Antes do incio dos experimentos, a capacidade de deteco das variaes na expresso

dos genes foi testado em sunos submetidos a diferentes infeces (DAWSON et al., 2002b).

57

3.10.1 Genes

A seleo dos genes foi realizada a partir de dados obtidos da literatura referente a

defesa contra a toxoplasmose em camundongos. Foi dada nfase resposta associada ao IFN-

J, genericamente conhecida como resposta Th1 e tambm includos genes ligados induo,

modulao, apoptose e resposta inflamatria conforme apresentado no quadro 3.1. Os genes

podem possuir funes diferentes das aqui listadas porm foram arbitrariamente organizados

segundo a funo primria pela qual foi testado.

As siglas seguem a nomenclatura oficial adotada para genes humanos conforme o

Human Gene Nomenclature Committee (HGNC) do Human Genome Organization (HUGO).

Devido a constantes atualizaes na nomenclatura, possveis diferenas podem ser notadas

entre as siglas aqui adotadas e as atualmente vigentes. As informaes do quadro referem-se

s publicadas em janeiro de 2004 no site e foram

mantidos os nomes originais em ingls.

58

(continua)

Funoprimria Gene Nome e nomes alternativos

Nmero de acesso EXP

Housekeeping RPL13A Ribosomal protein L13a Z84103 I

Housekeeping RPL32 Ribosomal protein L32 F14630 I e II

Inato / Inflamatrio IFNA1 Interferon, alpha 1 X57191 I e II

Inato / Inflamatrio IL1B Interleukin 1, beta X74568 I e II

Inato / Inflamatrio IL6 Interleukin 6, interferon beta 2 M86722 I e II

Inato / Inflamatrio ORM1 OrosomucoidD-acid glycoprotein M35990 I

Inato / Inflamatrio TNF

Tumor necrosis factor; TNF superfamily, member 2, TNFA X54001 I e II

Inato / Inflamatrio TNFRSF1A

Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1A, TNFR p55, TNFR1 U19994 I

Inato / Inflamatrio TLR2 Toll-like receptor 2 BF442348 I e II

Inato / Inflamatrio TLR4 Toll-like receptor 4 TC43435 I e II

Inato / Inflamatrio CRP C-Reactive protein, pentraxin-related AB005545 II

Inato / Inflamatrio MYD88

Myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88 AY435217 II

Inato / Inflamatrio FCGR3A

Fc fragment of IgG, low affinity IIIa, receptor , CD16 AF372453 II

Inato / Inflamatrio IL8 Interleukin 8, CXCL8 M86923 II*

Inato / Inflamatrio CCL2 Chemokine (C-C motif) ligand 2, MCP-1 Z48479 II*

Inato / Inflamatrio CCL5 Chemokine (C-C motif) ligand 5, RANTES F14636 II*

Quadro 3.1 Genes avaliados pela Real-Time RT-PCR nos sunos infectados por T. gondii. Funo primria, siglas dos genes, nomes e nomes alternativos, nmero de acesso no Genbank das seqncias utilizadas para o desenho dos primers e sondas e nmero do experimento (EXP) em que foi testado Beltsville - 2003

59

(continua)


Nmero de acesso EXP

Th1 IFNG Interferon gamma X53085 I e II

Th1 IFNR1 Interferon gamma receptor 1, CDw119 II

Th1 IL12A Interleukin 12A (Natural killer cell

stimulatory factor 1, cytotoxic lymphocyte maturation factor 1, p35)

L35765 I e II

Th1 IL12B Interleukin 12B (Natural killer cell

stimulatory factor 2, cytotoxic lymphocyte maturation factor 2, p40)

U08317 I e II

Th1 IL12RB2 Interleukin 12 receptor, beta 2 AF448143 I e II

Th1 IL15 Interleukin 15 U58142 I e II

Th1 IL18 Interleukin 18, interferon-gamma-inducing-factor AF176949 I e II

Th1 IL18R Interleukin 18 receptor AB079258 II

Th1 IL23A Interleukin 23, alpha subunit p19, SGRF AB030002 I

Th1 IRF1 Interferon regulatory factor 1 TC86234 I e II

Th1 HLX1 H2.0-like homeo box 1 TC98154 II**

Th1 ICSBP1 IFN consensus sequence binding protein 1 AY435218 II**

Th1 TBX21 T-bet AY435216 II**

Th1 LEP Leptin F167719 I

Th1 LEPR Leptin Receptor AF203034 I

Th1 STAT1 Signal transducer and activator of transcription 1, 91kDa TC95137 I e II

Th1 STAT4 Signal transducer and activator of transcription 4 AB020984 I e II*

Th1 SOCS1 Suppressor of cytokine signalling 1, STAT-induced STAT inhibitor 1, SSI1 TC63788 I

Th1 SOCS2 Suppressor of cytokine signalling 2, STAT-induced STAT inhibitor 2, SSI2 BE031084 I


60

(continua)


Nmero de acesso EXP

Th2 IL4 Interleukin 4 X68330 I e II

Th2 IL5 Interleukin 5, colony-stimulating factor, eosinophil SSC010088 I e II*

Th2 IL13 Interleukin 13 AF385626 I e II

Th2 GATA3 GATA binding protein 3 TC62266 II

Th2 STAT6 Signal transducer and activator of transcription 6 TC56734 I

Th2 SOCS3 Suppressor of cytokine signalling 3, STAT-induced STAT inhibitor 3, SSI3 BM485092 I

Efetor INDO Indoleamine-pyrrole 2,3 dioxygenase, IDO TC38943 I e II

Efetor NOS2A Nitric oxide synthase 1, inducible, iNOS U59390 I e II

Efetor ARG1 Arginase 1, liver AYO39112 I e II

Efetor SLC11A1

Solute carrier family 11, proton-coupled divalent metal ion transporters, member 1

(Natural Resistance Associated Macrophage Protein, NRAMP1)

AF132037 I e II

Efetor SLC11A2

Solute carrier family 11, proton-coupled divalent metal ion transporters, member 2

(Natural Resistance Associated Macrophage Protein, NRAMP2)

AW417353 I

Efetor IGM IgM, Immunoglobulin M constant region M92050 I e II

Efetor IGG IgG, Immunoglogulin G constant region AF062384 I e II

Efetor IGA IgA, Immunoglobulin A constant region U12594 I e II

Efetor CD19 B-lymphocyte antigen AF466765 I

Regulatrio IL2 Interleukin 2 X56750 I

Regulatrio IL2RA Interleukin receptor, alpha; CD25 U78317 I

Regulatrio IL10 Interleukin 10 L20001 I e II


61

(concluso)


Nmero de acesso EXP

Regulatrio TGFB1 Transforming growth factor, beta 1 M23703 I e II

Regulatrio TGFB2 Transforming growth factor, beta 2 X70142 I

Regulatrio TGFB3 Transforming growth factor, beta 3 X14150 I

Regulatrio CSF2 GM-CSF, Colony stimulating factor 2, granulocyte-macrophage D21074 I

Regulatrio MHC2TA MHC class II transactivator, CIITA AY084053 I e II

Co-estimulatrio ICOS Inducible T-cell co-stimulator BE015025 II

Co-estimulatrio CD3E

CD3E antigen,

sandra mayumi nishi fdfd

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