saneamiento de por hidrocarburos del petrÓleo
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA QUÍMICA
E INDUSTRIAS EXTRACTIVAS
SANEAMIENTO DE AGUAS SOMERAS Y SUBTERRÁNEAS CONTAMINADAS CON HIDROCARBUROS DEL PETRÓLEO
TESIS
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE
MAESTRO EN CIENCIAS EN INGENIERÍA QUÍMICA
P R E S E N T A
I.Q.I. YAIR CRUZ NARVÁEZ
DIRECTORES:
DR. JOSE JAVIER CASTRO ARELLANO
DR. ENRIQUE RICO ARZATE
1
MÉXICO D.F., JULIO 2013.
2
i
AGRADECIMIENTOS
A través de estas líneas quiero expresar mi más sincero agradecimiento a todas las
personas que con su soporte científico y humano han colaborado en la realización de
este trabajo de investigación.
Quiero agradecer en primer lugar a las instituciones que han hecho posible la
realización del trabajo por el apoyo económico y de recursos, al Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología (CONACYT, México), al Instituto Politécnico Nacional (IPN) y a
la Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas (ESIQIE).
Muy especialmente a mis directores de tesis, el Dr. José Javier Castro Arellano y al Dr.
Enrique Rico Arzate, por la acertada orientación, el soporte y discusión crítica que me
permitió un buen aprovechamiento del trabajo realizado, y que esta tesis llegara a buen
término.
Especial mención merecen las personas cuya colaboración han sido importantes en el
desarrollo de este trabajo, a la Dra. María Luis Roldán, por las facilidades prestadas
en su laboratorio y el uso de los equipos de microscopía óptica.
Agradezco a mi familia por su comprensión, comunicación constante y apoyo.
ii
DEDICATORIA
Dedico esta tesis a mi madre, por ser el pilar más importante y por demostrarme su
cariño y apoyo incondicional.
A mi padre, por sus consejos, su apoyo y su comprensión a lo largo de esta etapa.
A mi hermana Nallely por su disposición para escuchar y ayudarme en cualquier
momento.
A mi hermano Betuel por su cariño, sus ocurrencias, sus palabras y su paciencia.
iii
CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................... i
DEDICATORIA ............................................................................................................... ii
CONTENIDO .................................................................................................................. iii
ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................. vii
RESUMEN ................................................................................................................... xvi
SUMMARY ................................................................................................................. xvii
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1
CAPITULO I. ANTECEDENTES ................................................................................... 4
1.1. La contaminación por hidrocarburo ....................................................................... 4
1.2. Compuestos xenobióticos ...................................................................................... 6
1.3. Dispersión de contaminantes ................................................................................. 7
CAPITULO II. MÉTODOS DE TRATAMIENTO ....................................................... 11
2.1. Clasificación de tecnologías de remediación ....................................................... 11
2.1.1 Estrategia de remediación .................................................................................. 11
2.1.2 Lugar de realización del proceso de remediación .............................................. 12
2.1.3 Tipo de tratamiento ............................................................................................ 12
2.2. Métodos de separación ......................................................................................... 13
2.4. Tecnologías de transformación abióticos ............................................................ 14
iv
2.5. La biorremediación .............................................................................................. 15
CAPITULO III. BIORREMEDIACIÓN ........................................................................ 19
3.1. Prospectiva de microorganismos ......................................................................... 19
3.2. Microorganismos utilizados en la biorremediación ............................................. 27
3.2.1. Pseudomona aeruginosa. ................................................................................... 28
3.2.2. Pseudomona putida ........................................................................................... 29
3.2.3. Pseudomona fluorescens ................................................................................... 30
3.2.4. Acinetobacter calcoaceticus .............................................................................. 31
3.3. Crecimiento bacteriano ........................................................................................ 35
3.4. Factores que afectan el crecimiento microbiano .................................................. 36
3.4.1. Temperatura ...................................................................................................... 36
3.4.2. Influencia del pH .............................................................................................. 38
3.4.3. Oxígeno disuelto ............................................................................................... 38
3.4.4. Relación C:N:P ................................................................................................. 39
3.5. Adaptación de los microorganismos .................................................................... 40
3.6. Biodegradación de MTBE ................................................................................... 40
3.7. Degradación de BTEX ......................................................................................... 42
3.8. Cinética microbiana ............................................................................................. 44
3.8.1. Modelo matemático de Monod ......................................................................... 46
ESTADO DEL ARTE .................................................................................................... 47
v
CAPITULO IV. METODOLOGÍA ................................................................................ 51
4.1. Adaptación del consorcio ..................................................................................... 52
4.1.1. Preparación de soluciones modelo .................................................................... 53
4.2. Metodología de biodegradación. .......................................................................... 58
CAPITULO V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................... 60
5.1. Adaptación del consorcio. .................................................................................... 60
5.2. Caracterización de muestra real ........................................................................... 62
5.3. Biodegradación. ................................................................................................... 65
5.4. Cinética de biodegradación .................................................................................. 77
5.4.1. Estequiometria .................................................................................................. 77
5.4.2. Balance de masa ................................................................................................ 79
5.4.3. Operación intermitente ..................................................................................... 79
5.5. Tratamiento de datos ............................................................................................ 81
5.5.1. Cálculo de peso seco, masa de CO2 y de sustrato ............................................. 81
5.5.3. Cálculo de los balances de masa. ...................................................................... 84
CONCLUSIONES .......................................................................................................... 95
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 96
ANEXO A CURVA DE REFERENCIA ..................................................................... 115
ANEXO B LINEARIZACIÓN DE LAS ECUACIÓN DE MONOD ......................... 120
ANEXO C ADAPTACIÓN DEL CONSORCIO BACTERIANO .............................. 124
vi
ANEXO D TINCIÓN DE GRAM................................................................................ 128
ANEXO E CÓDIGOS DE POLYMATH .................................................................... 131
vii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 Hidrocarburos que existen como una fase inmiscible y ................................. 5
Figura 3.1 Participación de biosurfactante (rhamnolípido) producido por bacterias del
genero Pseudomonas sp en el consumo de hidrocarburos. ............................................ 21
Figura 3.2 Esquematización de la degradación de alcanos por una bacteria gran-
negativa. .......................................................................................................................... 21
Figura 3.3 Esquema que muestra la principal ruta de degradación de .......................... 26
Figura 3.4 Micrografia de Pseudomona aeruginosa obtenida con microscopio de
barrido. ............................................................................................................................ 28
Figura 3.5 Micrografia de Pseudomona putida obtenida con microscopio de barrido. 30
Figura 3.6 Micrografia de Pseudomona fluorescens obtenida con microscopio de
barrido. ............................................................................................................................ 31
Figura 3.7 Micrografia de Acinetobacter calcoaceticus obtenida con microscopio de
barrido. ............................................................................................................................ 31
Figura 3.8 Micrografía de rotífero obtenida con microscopio óptico. .......................... 33
Figura 3.9 Curva típica de crecimiento para un sistema cerrado. ................................. 36
Figura 3.10 Relación entre la temperatura y las velocidades de crecimiento de
psicrófilos, mesófilos, termófilos y dos hipertermófilos diferentes. .............................. 38
Figura 3.11 Ruta metabólica propuesta para biodegradación aeróbica de MTBE ........ 41
Figura 3.12 Biodegradación microbiana del benceno hasta catecol.............................. 42
Figura 3.13 Biodegradación microbiana del tolueno. ................................................... 43
Figura 3.14 Biodegradación del xileno. ....................................................................... 43
viii
Figura 3.15 Etapas del crecimiento bacteriano como biomasa y de utilización de
sustrato, ........................................................................................................................... 44
Figura 4.1 Etapas consideradas durante el trabajo experimental. ................................. 52
Figura 4.2 Preparación del medio mínimo o solución de sales minerales..................... 52
Figura 4.3 Activación del consorcio microbiano. ......................................................... 53
Figura 4.4 Preparación de soluciones modelo para adaptación y biotratamiento de
sustrato. ........................................................................................................................... 54
Figura 4.5 Monitoreo de producción de CO2. ............................................................... 54
Figura 4.6 Esquema para el monitoreo del consumo de oxígeno utilizado. ................. 55
Figura 4.7 Emplazamiento del valle de México de donde fue recolectada la muestra de
agua real. ......................................................................................................................... 56
Figura 4.8 Esquematización de la toma de muestra real en un predio contaminado en el
valle de México. ............................................................................................................. 56
Figura 4.9 Método utilizado para caracterizar el tipo de contaminación por
hidrocarburos presente en la muestra de agua real. ........................................................ 58
Figura 4.10 Sistema empleado en la realización de la biodegradación. ........................ 58
Figura 4.11 Proceso de biotratamiento utilizado. .......................................................... 59
Figura 5.1 Volumen de oxígeno consumido por el consorcio bacteriano utilizado. ..... 60
Figura 5.2 Monitoreo de crecimiento bacteriano por absorción de CO2 en solución
alcalina. ........................................................................................................................... 61
Figura 5.3 Espectro UV-vis de la muestra de agua real. ............................................... 64
Figura 5.4 Disminución de la demanda química de oxígeno en el agua real, posterior a
la inoculación del consorcio bacteriano. ........................................................................ 65
ix
Figura 5.5 Porcentaje de remoción de materia organica susceptible de oxidación
química obtenido por el consorcio bacteriano. ............................................................... 65
Figura 5.6 Disminución del DQO en las muestras de agua sintéticas y en la muestra de
agua real. ......................................................................................................................... 66
Figura 5.7 Porcentaje de biodegradación de cada sustrato estudiado. .......................... 67
Figura 5.8 Decremento de la concentración de compuestos aromáticos de la muestra
contaminada con diésel (región de 250 a 300 nm). ........................................................ 70
Figura 5.9 Variación en la concentración de compuestos aromáticos en muestra
contaminada con petróleo, en la región entre 250 a 300 nm. ......................................... 70
Figura 5.10 Variación de IC, TOC, y TC en la muestra contaminada con diesel. ....... 71
Figura 5.11 Variación de IC, TOC, y TC en la muestra contaminada con petróleo. ... 71
Figura 5.12 Crecimiento microbiano en la muestra contaminada con diesel. El
desarrollo microbiano se incrementa con la temperatura. .............................................. 72
Figura 5.13 Crecimiento microbiano en la muestra contaminada con petróleo. El
desarrollo microbiano se incrementa con la temperatura. .............................................. 72
Figura 5.14 Cromatogramas obtenidos durante la biodegradación de las muestras
sintéticas de agua contaminadas con diesel. ................................................................... 73
Figura 5.15 Cromatogramas obtenidos durante la biodegradación de las muestras
sintéticas de agua contaminadas con petróleo. ............................................................... 73
Figura 5.16 Disminución de la concentración de hidrocarburos en las muestras
sintéticas de petróleo y diesel. ........................................................................................ 75
Figura 5.17 Porcentaje de biodegradación obtenido. La tasa de biodegradación fue
mayor en el caso del sustrato diesel que en el petróleo. ................................................. 75
x
Figura 5.18 Disminución de la concentración de cada fracción de diesel durante la
biodegradación................................................................................................................ 76
Figura 5.19 Disminución de la concentración de cada fracción de petróleo durante la
biodegradación................................................................................................................ 76
Figura 5.20 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de
biodegradación del diesel a 20ºC. ................................................................................... 85
Figura 5.21 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función
del tiempo del modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de diesel a
20ºC. ............................................................................................................................... 85
Figura 5.22 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de
biodegradación del diesel a 30ºC. ................................................................................... 86
Figura 5.23 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función
del tiempo del modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de diesel a
30ºC. ............................................................................................................................... 87
Figura 5.24 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de
biodegradación del diesel a 40ºC. ................................................................................... 88
Figura 5.25 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función
del tiempo del modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de diesel a
40ºC. ............................................................................................................................... 88
Figura 5.26 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de
biodegradación del petróleo a 20ºC. ............................................................................... 89
Figura 5.27 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función
del tiempo del modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de petróleo
a 20ºC. ............................................................................................................................ 90
Figura 5.28 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de
biodegradación del petróleo a 30ºC. ............................................................................... 91
xi
Figura 5.29 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función
del tiempo del modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de petróleo
a 30ºC. ............................................................................................................................ 91
Figura 5.30 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de
biodegradación del petróleo a 40ºC. ............................................................................... 92
Figura 5.31 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función
del tiempo del modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de petróleo
a 40ºC. ............................................................................................................................ 93
Figura 5.32 Tasa de mantenimiento microbiano en agua contaminada con diesel a 20,
30 y 40ºC. ....................................................................................................................... 94
Figura 5.33 Tasa de mantenimiento microbiano en agua contaminada con petróleo a 20,
30 y 40ºC. ....................................................................................................................... 94
xii
ÍNDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1 Cromatograma de referencia. Concentración de 5000 ppm de diesel en
CCl4. ............................................................................................................................. 115
Ilustración 2 Cromatograma de referencia. Concentración de 2500 ppm de diesel en
CCl4. ............................................................................................................................. 115
Ilustración 3 Cromatograma de referencia. Concentración de 1000 ppm de diesel en
CCl4. ............................................................................................................................. 116
Ilustración 4 Cromatograma de referencia. Concentración de 500 ppm de diesel en
CCl4. ............................................................................................................................. 116
Ilustración 5 Cromatograma de referencia. Concentración de 100 ppm de diesel en
CCl4. ............................................................................................................................. 116
Ilustración 6 Cromatograma de referencia. Concentración de 50 ppm de diesel en CCl4.
...................................................................................................................................... 117
Ilustración 7 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de
agua contaminada con diesel a 20ºC. ........................................................................... 121
Ilustración 8 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de
agua contaminada con diesel a 30ºC. ........................................................................... 121
Ilustración 9 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de
agua contaminada con diesel a 40ºC. ........................................................................... 122
Ilustración 10 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra
de agua contaminada con petróleo a 20ºC. ................................................................... 122
Ilustración 11 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra
de agua contaminada con petróleo a 30ºC. ................................................................... 123
xiii
Ilustración 12 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra
de agua contaminada con petróleo a 40ºC. ................................................................... 123
xiv
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.1 Ejemplos de contaminantes usuales de una refinería agrupados por familia
química. ............................................................................................................................ 5
Tabla 1.2 Compuestos Xenobióticos. .............................................................................. 6
Tabla 1.3 Solubilidad de Hidrocarburos y Derivados. .................................................. 10
Tabla 2.1 Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación in situ y ex situ. . 12
Tabla 2.2 Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación, ........................... 13
Tabla 3.1 Estado del nivel de depuración atendiendo a la observación microbiología. 34
Tabla 3.2 Composición de una célula bacteriana. ......................................................... 39
Tabla 4.1 Composición del medio mínimo o solución de sales minerales utilizada. .... 53
Tabla 4.2 Parámetros fisicoquímicos, normas mexicanas y técnicas analíticas ............ 57
Tabla 5.1 Enzimas involucradas en la biodegradación de hidrocarburos del petróleo. . 62
Tabla 5.2 Resultados de la caracterización de la muestra de agua real. ........................ 63
Tabla 5.3 Identificación del tipo de contaminación presente en la muestra de agua real.
........................................................................................................................................ 64
Tabla 5.4 Valores de referencia de R para tipos de hidrocarburos contaminantes. ....... 64
Tabla 5.5 Espectros de IR-ATR de las muestras al inicio y final del tratamiento. ........ 69
Tabla 5.6 Ecuaciones de referencia obtenidos a partir de cromatogramas de diesel (ver
anexo A). ........................................................................................................................ 74
Tabla 5.7 Variación de la concentración de biomasa para agua contaminada con diesel
y agua contaminada con petróleo, a tres temperaturas diferentes. ................................. 81
xv
Tabla 5.8 Variación de la concentración de DQO y de CO2 durante el tratamiento. .... 81
Tabla 5.9 Coeficientes de rendimiento entre la biomasa, el sustrato y el producto. ..... 82
Tabla 5.10 Ecuaciones de variación de los coeficientes de rendimiento durante el
tiempo de tratamiento para el diesel. .............................................................................. 82
Tabla 5.11 Ecuaciones de variación de los coeficientes de rendimiento durante el
tiempo de tratamiento para el diesel. .............................................................................. 82
Tabla 5.12 Constantes µmáx y Ks obtenidas aplicando una regresión lineal. ................ 83
Tabla 5.13 Balances de masa para agua contaminada con diesel durante el tratamiento a
20ºC. ............................................................................................................................... 84
Tabla 5.14 Balances de masa para agua contaminada con diesel durante el tratamiento a
30ºC. ............................................................................................................................... 86
Tabla 5.15 Balances de masa para agua contaminada con diesel durante el tratamiento a
40ºC. ............................................................................................................................... 87
Tabla 5.16 Balances de masa para agua contaminada con petróleo durante el
tratamiento a 20ºC. ......................................................................................................... 89
Tabla 5.17 Balances de masa para agua contaminada con petróleo durante el
tratamiento a 30ºC. ......................................................................................................... 90
Tabla 5.18 Balances de masa para agua contaminada con petróleo durante el
tratamiento a 40ºC. ......................................................................................................... 92
Tabla 0.1 Modelos de las curvas de referencia para la concentración de hidrocarburos
obtenidos por cromatografía de gases. ......................................................................... 117
xvi
RESUMEN
Entre los diferentes métodos existentes para la eliminación de hidrocarburos
contaminantes en agua, el biotratamiento es la mejor alternativa. Esta consiste en
utilizar microorganismos (hongos, bacterias, algas) para resolver o mitigar el problema,
y es especialmente efectiva en el tratamiento de contaminantes orgánicos, incluido el
petróleo. Para que las bacterias puedan eliminar las sustancias químicas dañinas, el agua
debe tener la temperatura, los nutrientes y la cantidad de oxígeno apropiados. Esas
condiciones permiten que los microorganismos desarrollen su ciclo de vida, propiciando
la fase de crecimiento exponencial, y de este modo asimilen una mayor cantidad de
sustancias químicas (Chaney, y otros, 1995).
En este trabajo se presenta una metodología para la biodegradación de las fracciones
del diesel y del petróleo que se solubilizan en agua. La cual consistió en obtener las
condiciones óptimas, de temperatura, período de adaptación, concentración de sales
necesarias para la homeostasis celular y el desarrollo de los microorganismos. Se
determinó la cinética de la biodegradación de los hidrocarburos presentes en el agua. Se
determinó la concentración inicial de los contaminantes a través de DQO, cromatografía
de gases, espectroscopía UV-vis, espectroscopia de IR-ATR. El desarrollo
microbiológico se efectuó a través de cuenta en placa y la actividad metabólica a través
de la producción de CO2 y consumo de O2.
La biodegradación se realizo en reactores de vidrio de 500 mL, con aireación continua
(flujo de 65 L/h), a temperatura constante de 20, 30 y 40 ºC. Se obtuvieron las cinéticas
de biodegradación correspondientes, así como las constantes de crecimiento
actualizando el modelo de Monod, que relaciona el desarrollo microbiano, el consumo
de sustrato y la generación de producto.
xvii
SUMMARY
Among the different methods available for removing hydrocarbon contaminants in
water, biotreatment is the best alternative. This is to use microorganisms (fungi,
bacteria, algae) to solve or mitigate the problem, and is especially effective in the
treatment of organic contaminants, including oil. For bacteria to remove harmful
chemicals, the water temperature should be, nutrients and oxygen appropriate. These
conditions allow microorganisms develop their life cycle, leading to the exponential
growth phase, and thus assimilate an increased amount of chemicals.
This research presents a methodology for the biodegradation of diesel and oil fractions
solubilized in water. Which consisted in obtaining the optimum conditions of
temperature adjustment period, salt concentration necessary for cell homeostasis and
development of microorganisms. Determined the kinetics of biodegradation of
hydrocarbons in water. Concentration determined initial COD contaminants through,
gas chromatography, UV-vis spectroscopy, IR-ATR spectroscopy. Microbiological
growth was effected by plate count and metabolic activity by CO2 production and O2
consumption.
Biodegradation reactors was performed in 500 ml glass with continuous aeration (flow
of 65 L / h) at a constant temperature of 20, 30 and 40 ° C. Were obtained
corresponding biodegradation kinetics and growth constants Monod updating the model
which relates microbial growth, substrate consumption and product generation.
1
INTRODUCCIÓN
El agua es un recurso primario, indispensable para el desarrollo y mantenimiento de la
vida. La contaminación de este recurso es un problema que afecta la salud de la
población, la integridad del medio ambiente y la calidad de vida. Cuando el
contaminante tiene significativos efectos adversos y es, además, de difícil eliminación,
sea porque se requieren tratamientos costosos, o porque la complejidad de este así lo
dicte, el problema se agrava considerablemente. Esto es particularmente cierto en el
caso de la contaminación del agua por hidrocarburos. El hecho anterior hace que los
hidrocarburos y el agua no se pueden considerar como fluidos inmiscibles ya que en los
primeros existen compuestos solubles.
En el presente trabajo se efectuó un estudio de la biodegradación de petróleo y diesel en
agua y el biotratamiento de una muestra de agua real extraída de un predio del valle de
México, que presenta esta problemática; utilizando un consorcio microbiano que
contiene microorganismos del género Pseudomona. Se llevo a cabo la caracterización
del agua real y la preparación de soluciones sintéticas con sales esenciales para el
desarrollo bacteriano. Se monitoreo la biodegradación de los sustratos hidrocarbonados
a través de DQO, respirometría, absorción de CO2, espectroscopía de UV-vis, infrarrojo
y cromatografía de gases-masas. Se obtienen los perfiles de biodegradación y las curvas
de crecimiento bacteriano.
En el capítulo 1 se presenta la problemática de la contaminación por hidrocarburos en el
medio ambiente, la clasificación general de estos, así como un panorama acerca de sus
efectos nocivos y de los principales componentes que se consideran xenobióticos. Se
hace un recuento de las diferentes industrias que generan contaminación por
hidrocarburos y que impactan de manera directa o indirecta el recurso del agua.
También se analiza en que puntos del proceso del petróleo hay riesgo de contaminar
este recurso. Se aborda una clasificación de los compuestos xenobióticos que se derivan
de las actividades petroleras o relacionadas con la industria de los hidrocarburos, así
como el daño que pueden causar en un ecosistema. Al final de este capítulo se hace un
2
análisis de las vías de dispersión de los compuestos hidrocarbonados, recurriendo a las
propiedades fisicoquímicas de estos. De esta manera, el lector tendrá un panorama
general de la problemática incipiente que representan estos contaminantes.
En el capítulo 2 se aborda el tema de los diferentes métodos de tratamiento existentes
por contaminación de aguas con hidrocarburos, dividiéndolos en tecnologías de
separación, de aislamiento, de transformaciones abióticas y la biorremediación. Se
presentan las ventajas y desventajas de cada uno de ellos, sus requerimientos mínimos
para poder ser aplicados y los riesgos implícitos. A través de este capítulo, se pretende
llevar al lector hasta la alternativa seleccionada en este trabajo, la biorremediación. Sin
embargo, también se mencionan los inconvenientes y limitaciones de esta tecnología, so
pesándolas con los beneficios que es capaz de reportar.
En el capítulo 3 se trata la tecnología de la biorremediación mas ampliamente, aplicado
a la contaminación de aguas con hidrocarburos, dando de este modo continuidad al
capítulo anterior. Se presenta un panorama de la utilización de microorganismos
capaces de utilizar hidrocarburos y sus derivados y se resaltan las características de los
que más utilizados. Se aborda el crecimiento bacteriano y los factores que afectan su
desarrollo. También se trata el tema de la degradación de los BTEX y del metil terbutil
éter haciendo énfasis en las rutas metabólicas principales. Se analiza el modelo de
crecimiento de microorganismos y se hace hincapié en el modelo de Monod, que
relaciona la biomasa y el consumo de sustrato.
Posteriormente se realiza una revisión sobre la literatura mas reciente que aborda esta
problemática, con lo cual se llega a la justificación de este trabajo y a los objetivos
buscados.
En el capítulo 4 el lector encontrará la metodología que se siguió para realizar las
experiencias, dividiéndolo en dos partes fundamentales, el acondicionamiento del
consorcio bacteriano y el seguimiento de la biodegradación del sustrato hidrocarbonado
por este. Se analiza las razones para el diseño y aplicación de la metodología seguida en
este trabajo. También se especifican los equipos y las técnicas utilizadas para cada
experiencia.
3
En el capítulo 5 se discuten los resultados obtenidos, su análisis e interpretación y se
proponen los modelos cinéticos. Se relaciona cada uno de los resultados obtenidos con
la literatura, mostrando la concordancia y aportando una interpretación sobria de dichos
resultados. En base a estos resultados, se calculan las constantes necesarias para
modelar el proceso de biorremediación de los sustratos utilizados a través de la cinética
de Monod.
Finalmente, a partir de los resultados y de sus análisis de llega a las conclusiones de este
trabajo y se presenta una perspectiva de los puntos que se pueden abordar en trabajos
futuros.
4
CAPITULO I. ANTECEDENTES
1.1. La contaminación por hidrocarburo
Del petróleo se obtienen determinados compuestos que son la base de diversas cadenas
productivas. El petróleo origina una amplia gama de productos: combustibles y
productos petroquímicos utilizados en las industrias de fertilizantes, plásticos,
alimenticia, farmacéutica, química y textil, entre otras. La desproporción entre el
volumen creciente de residuos peligrosos generados y las capacidades existentes de
manejo, vigilancia y control, dan lugar a un incompleto o en el peor de los casos nulo
tratamiento de contaminantes en tiraderos, drenajes municipales, barrancas, en
carreteras y cuerpos de agua. Esto origina contaminación crónica de los suelos y de los
cuerpos de agua superficial y subterránea que son fuente de abastecimiento de agua
potable.
Al transportar el crudo a los sistemas de almacenamiento para su debido tratamiento
existe la posibilidad de derrames del crudo debido a la fatiga y ruptura de tuberías,
bombas y tanques de almacenamiento. Los derrames generan situaciones de extrema
agresión al medio ambiente en sus distintas matrices, muy a pesar de la política de
prevención, contingencia y saneamiento puesta de manifiesto en la actualidad por las
empresas productoras. Una vez que el crudo llega a la refinería, se inicia una de las
fases más críticas para la generación de una matriz de contaminación. En esta actividad
se manejan volúmenes importantes de crudo, los cuales son sometidos al conjunto de
operaciones y procesos de refinación, donde se incluyen materiales auxiliares necesarios
para la obtención de las corrientes que conforman toda la gama de productos
comerciales, tales como, combustibles ligeros y medios (gasolina, kerosén, diesel),
combustibles residuales, aceites lubricantes, y otros productos (López, 1999).
Como consecuencia es posible la presencia en las aguas residuales de la refinería, de
compuestos orgánicos e inorgánicos. En la Tabla 0.1 se presentan algunos compuestos
típicos encontrados en las aguas residuales de una refinería y que provienen de la
actividad propia de los distintos tratamientos físicos y químicos efectuados sobre el
crudo (Office of Research and Standards, 2003).
5
Tabla 0.1 Ejemplos de contaminantes usuales de una refinería agrupados por familia química.
CONTAMINANTE COMPUESTOS REPRESENTATIVOS
Hidrocarburos alifáticos
y
aromáticos
n-hexano, ciclohexano, benceno, tolueno, xilenos,
etilbenceno, 1,2.4 trimetilbenceno, aromáticos
policíclicos, etc.
Olefinas Etileno, propileno, butadieno, estireno
Clorados Tetracloroetileno, tricloroetileno, tetracloruro de
carbono, diclorometano, 1,2 dicloroetano, etc.
Oxigenados Metanol, fenoles, formaldehido, MTBE, MEK
Metálicos Compuestos de níquel, de cobalto y de plomo
Otros Amoniaco, nitratos, ácido fosfórico, ácido fluorhídrico
Fuente: Elaboración propia.
El conjunto de actividades de la industria del petróleo finaliza con la etapa de
almacenamiento y distribución final de los productos comerciales. En esta fase, al igual
que en la de transporte, la matriz de contaminantes está presente con los frecuentes
derrames en tuberías, tanques y en el momento de la distribución de los distintos
productos.
Los hidrocarburos líquidos en fase no acuosa (NAPL, por sus siglas en ingles) presentan
una baja solubilidad en agua, se infiltran en el subsuelo y pueden alcanzar el agua
subterránea (Zhou, y otros, 1997). Los NAPL pueden clasificarse en aquellos cuya
densidad es mayor a la del agua (DNAPL, por sus siglas en inglés) y aquellos más
ligeros que el agua (LNAPL, por sus siglas en inglés). En la figura 1.1 se puede apreciar
como se ubican de acuerdo a su densidad.
Figura 0.1 Hidrocarburos que existen como una fase inmiscible y
separada cuando entran en contacto con el agua o el aire.
Fuente: (Celis Huaiquilaf, 2008)
6
Los LNAPL flotan sobre el nivel freático del acuífero formando capas de espesores que
van de los milímetros a los metros (a dicha fracción se le denomina fase libre). Las fases
volátiles ocupan parte de la zona vadosa y pueden incorporarse al flujo subterráneo. La
fase libre circula en la parte superior del acuífero a una velocidad por lo general menor a
la del flujo del agua subterránea. Las fases solubles de los LNAPL formarán una pluma
en la parte superior de la zona saturada, circulando a una velocidad mayor que la fase
libre. El problema se agrava debido a que las aguas subterráneas son una de las
principales fuentes de suministro para uso doméstico y para el riego en muchas partes
del mundo. De toda el agua dulce disponible, la proporción de agua subterránea alcanza
al 0.6% del total de agua del planeta (Bottura, 2003). En México representa
aproximadamente el 20% (Mazari, 2007).
1.2. Compuestos xenobióticos
Un compuesto xenobiótico es aquel que no se encuentra de forma natural en los
diferentes ecosistemas; se obtienen por síntesis química y llega a los ecosistemas por la
actividad antropogénica urbana o industrial. La contaminación con xenobióticos rompe
el equilibrio normal entre el medio físico, químico y biológico, compatible con la vida.
Su toxicidad radica en su persistencia en el medio donde impactan. Ejemplos de
xenobióticos son los plásticos (cloruro de polivinilo); explosivos (TNT); detergentes
(dodecilbencenosulfonato de sodio); plaguicidas (ácido 2,3,6 - triclorofenolacético;
hexaclorociclohexano; ciclodienos (aldrin); 2,1,1 – tricloro -2,2 – bis (p-clorofenil)
etano (DDT)); colorantes (azocompuestos) y pinturas (metilisobutilcetona). La literatura
especializada también recoge a los hidrocarburos poliaromáticos (naftaleno, fenantreno
y benzopirenos) bajo esta denominación. En la tabla 1.2 se señalan algunos compuestos
xenobióticos importantes. Entre los contaminantes orgánicos se encuentran
principalmente compuestos del grupo BTEX, fenoles, policlorobifenilos (PCB),
hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH) y plaguicidas.
Tabla 0.2 Compuestos Xenobióticos.
Etilen glicol Hidrocarburos aromáticos
Acrilamida Organoclorados
Metil-etil-cetona Nitroaromáticos
Fenoles Lignocelulósicos
Acrilonitrilo Surfactantes
Hidrocarburos Colorantes
Fuente: (Rodríguez, 1998)
7
Las aguas residuales industriales suelen contener compuestos químicos que eran ajenos
a la biosfera hasta el advenimiento de la química industrial (Temminik, 1993) . Estos
compuestos llamados xenobióticos, alteran las rutas metabólicas de los
microorganismos degradadores de las materias orgánicas transportadas por las aguas
residuales.
Las sustancias bíorresistentes (Williams, y otros, 1997) , o recalcitrantes se refieren a
compuestos orgánicos de origen sintético o natural que se resisten a la mineralización en
plantas depuradoras convencionales.
Un gran número de bacterias son capaces de metabolizar compuestos xenobióticos
como fuente de carbono en cultivos puros (Abalos, 2004), sin embargo no siempre una
simple bacteria posee toda la capacidad enzimática necesaria para degradar uno o varios
compuestos orgánicos contaminantes del ecosistema.
Las poblaciones mixtas o consorcios microbianos tienen mayor poder biodegradativo
porque la información genética que codifica al sistema enzimático del consorcio o la
población mixta es más completa y por tanto es más probable la degradación de las
mezclas complejas de xenobióticos presentes de un área dañada (Nápoles, 2005; Nuñez
Moreira, y otros, 2004).
Los géneros bacterianos degradadores de xenobióticos más comunes tanto en suelos
como en aguas son: Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Nocardia y Pseudomonas spp.
(Leahy, y otros, 1990).
1.3. Dispersión de contaminantes
Entre los combustibles destilados del petróleo más comunes se encuentran la gasolina,
kerosina o queroseno, turbosina, diesel, gasóleo y combustóleo. Y aunque han sido
investigados durante mucho tiempo y su química es bien conocida, el estudio como
contaminantes de suelo, e incluso de acuíferos y aire se ha desarrollado en las últimas
décadas.
Generalmente, la distribución de algunos de estos productos se realiza por una enorme
red de ductos (70 %) que recorre gran parte del territorio nacional, conectando las
8
diferentes estaciones y subestaciones de distribución y venta con las refinerías y plantas
petroquímicas del país, que son las encargadas del procesamiento de dichos productos.
Adicionalmente se utiliza la red de carreteras nacionales (30 %) para el transporte de
gasolina, diesel y algunos otros derivados del petróleo. Lo cual implica un riesgo latente
durante el traslado de estas sustancias. Es por eso que hoy en día los derrames de
hidrocarburos y demás sustancias químicas, se consideran como emergencias
ambientales debido a que pueden poner en peligro a la salud humana y recursos
naturales.
El transporte terrestre se realiza por medio de ductos, carreteras y ferrocarril. Los ductos
siempre están sujetos a riesgos de accidentes de diversa índole, que de producirse
significan derrames, explosiones, incendios, desprendimientos de gases de los tanques
de almacenamiento (evapotranspiración: vertimientos de residuos de hidrocarburos).
Por medio de las carreteras y el ferrocarril se transportan productos ligeros, gases
licuados, gasolinas, naftas, etc. En carretera el riesgo es mayor, aunque son menores los
volúmenes transportados. El transporte del petróleo y sus productos se realiza
principalmente por mar (transporte marítimo). Actualmente es del orden de 1,500
millones de toneladas anuales, lo que representa más del 60 % del tráfico marítimo
mundial.
Una vez que penetran los combustibles en el suelo, pueden amenazar la salud pública,
como una consecuencia de su migración y contacto con los mantos freáticos, que en su
gran mayoría son la fuente de abastecimiento de agua para las poblaciones aledañas.
Resultando indispensable tener en cuenta la dispersión de contaminantes en suelos y
acuíferos, ya que una vez que ha ocurrido un derrame en el primer caso se presentan
diversos fenómenos naturales que tienden a dirigirlo hacia las aguas subterráneas. La
combinación de las características del subsuelo, de los contaminantes, la profundidad
del manto freático y las condiciones climatológicas del sitio (temperatura y
precipitación pluvial) puede dar lugar a los diferentes procesos de transporte y
distribución de contaminantes.
Cuando ocurre un derrame en suelos o en cuerpos de agua, los contaminantes
inmediatamente tienden a dispersarse hacia donde el medio físico lo permite. Las
características fisicoquímicas del contaminante, como son la densidad, solubilidad y
9
viscosidad, así como las propias del sitio, como son la unidad del suelo, permeabilidad,
estructura, tamaño de las partículas, contenido de humedad y de materia orgánica,
determinan su permanencia o migración, como se muestra en la tabla 1.3. Esta es la
razón por la que derrames subterráneos que ocurrieron en el pasado, años después se
detectan fuera del predio donde acontecieron, y alejados varios metros e incluso
kilómetros en dirección de la corriente de agua subterránea. Ejemplos de lo anterior se
presentan comúnmente en zonas aledañas a poliductos, centros de almacenamiento y
distribución de combustibles, así como en estaciones de servicio.
Por otro lado, en el país en el área metropolitana de la ciudad de México, zona
metropolitana de la ciudad de Guadalajara, Jalisco; ciudad de Aguascalientes: ciudad de
Monterrey, Nuevo León; ciudad de Toluca, Estado de México por citar algunos
ejemplos, existen sedimentos arcillosos que en muchos casos se encuentran afectados
por fisuras y fracturas. En muchas situaciones la parte superficial de los estratos se
encuentran intemperizada/fracturada y afectada por diversos procesos tal como
extracción de agua, desecación-infiltración, tráfico vehicular y esfuerzos originados por
construcciones en zonas urbanas. Lo anterior implica que en muchas ciudades de la
república Mexicana, se tienen arcillas fracturadas e intemperizadas en donde a pesar de
que constituyen en muchos casos una unidad protectora de los acuíferos que sobre
yacen, la presencia de discontinuidades-heterogeneidades constituyen rutas de
migración preferencial por donde pueden migrar hacia los acuíferos subyacentes los
contaminantes que son derramados en la superficie del terreno (Aguilar, 2005).
Cuando los medios porosos de baja permeabilidad, como las arcillas, se encuentran
intemperizadas y/o fracturadas, las fisuras y fracturas constituyen rutas preferenciales
para la migración de contaminantes, presentándose advección-dispersión de los
contaminantes en las discontinuidades y difusión de las paredes de las fisuras hacia la
matriz porosa (Aguilar, 2005).
Además de las características hidrogeológicas de la cuenca de México, otros fenómenos
que pueden causar/extender la contaminación de sustancias químicas y en particular de
hidrocarburos derivados del petróleo al subsuelo, son la alta compresibilidad de los
sedimentos lacustres, la actividad sísmica y la extracción de agua subterránea
(Figueroa, 1989). Estos fenómenos pueden causar consolidaciones e inducción de
10
esfuerzos lo que eventualmente puede ocasionar la ruptura de tuberías y problemas de
hundimientos diferenciales en estructuras y cimentaciones. Todas las variables en su
conjunto definen el tamaño y la distribución tridimensional del frente de c
contaminación en una zona específica (Ortínez Brito, y otros, 2003).
Tabla 0.3 Solubilidad de Hidrocarburos y Derivados.
Grupo de Hidrocarburo Solubilidad en agua
(mg/L)
Valores numéricos de la solubilidad:
Solubilidad baja < de 10 mg/L
Solubilidad media entre 10 y 1000
mg/L
Solubilidad alta >1000 mg/L
Benceno 1,760
Tolueno 470
Xilenos 172
Etil benceno 140
Fenol 82,000
Fuente: (Fan, y otros, 1995)
De acuerdo con su densidad, los compuestos orgánicos se clasifican en dos grupos:
aquellos cuya densidad es menor a la del agua se denominan ligeros; mientras que los
que poseen una densidad mayor a la del agua se les conoce como densos. Esta
clasificación es importante, ya que es lo que determina el comportamiento de los
contaminantes en el acuífero.
Los ligeros tienden a formar una capa en forma de nata en el nivel freático, y se mueven
horizontalmente en dirección al flujo del agua subterránea, como las gasolinas, los
aceites y el petróleo crudo.
Los densos, por el contrario, migran hacia la base del acuífero creando una columna a
partir de la cual pueden ir en dirección al flujo del agua subterránea, contaminando así
el acuífero en toda su profundidad; ejemplo de estos, son los bifenilos policlorados.
11
CAPITULO II. MÉTODOS DE TRATAMIENTO
El término “tecnología de tratamiento” implica cualquier operación unitaria o serie de
operaciones unitarias que altera la composición de una sustancia peligrosa o
contaminante a través de acciones químicas, físicas o biológicas de manera que
reduzcan la toxicidad, movilidad o volumen del material contaminado (Environmental
Protection Agency (EPA), 2001). Las tecnologías de remediación representan una
alternativa a la disposición de desechos peligrosos que no han sido tratados, y sus
capacidades y posibilidades de éxito, bajo las condiciones específicas de un sitio,
pueden variar ampliamente.
El uso de una tecnología de remediación en particular depende, además de los factores
específicos del sitio y de las propiedades fisicoquímicas del contaminante, de su
disponibilidad, de la fiabilidad demostrada o proyectada, de su estado de desarrollo
(laboratorio, escala piloto o gran escala) y de su costo (Seller, 1999).
2.1. Clasificación de tecnologías de remediación
Las tecnologías de remediación pueden clasificarse de diferentes maneras, con base en
los siguientes principios:
Estrategia de remediación;
Lugar en que se realiza el proceso de remediación;
Tipo de tratamiento.
Es importante mencionar que cada una de estas clasificaciones proporciona diferente
información acerca de las tecnologías de remediación.
2.1.1 Estrategia de remediación
Son tres estrategias básicas que pueden usarse separadas o en conjunto, para remediar la
mayoría de los sitios contaminados:
Destrucción o modificación de los contaminantes. Este tipo de tecnologías busca
alterar la estructura química del contaminante.
12
Extracción o separación. Los contaminantes se extraen y/o separan del medio
contaminado, aprovechando sus propiedades físicas o químicas (volatilización,
solubilidad, carga eléctrica);
Aislamiento o inmovilización del contaminante. Los contaminantes son
estabilizados, solidificados o contenidos con el uso de métodos físicos o
químicos;
2.1.2 Lugar de realización del proceso de remediación
En general, se distinguen dos tipos de tecnología. En la tabla 2.1 se muestran ventajas y
desventajas de estas tecnologías.
In situ. Son las aplicaciones en las que el agua contaminada es tratada, o bien,
los contaminantes son removidos del agua, sin necesidad de extraerla. Es decir,
se realizan en el mismo sitio en donde se encuentra la contaminación;
Ex situ. La realización de este tipo de tecnologías, requiere la extracción,
bombeo o cualquier otro proceso para la movilización del agua contaminada
antes de su tratamiento que puede realizarse en el mismo sitio (on site) o fuera
de él (off site).
Tabla 0.4 Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación in situ y ex situ.
IN SITU EX SITU
Ventajas Permiten tratar el agua sin
necesidad de transportar.
Potencial disminución en
costos.
Menor tiempo de tratamiento.
Más seguros en cuanto a
uniformidad: es posible
homogeneizar y muestrear
periódicamente.
Desventajas Mayores tiempos de
tratamiento.
Pueden ser inseguros en cuanto
a uniformidad: heterogeneidad
en las características del suelo.
Dificultad para verificar la
eficacia del proceso.
Necesidad de transportar el agua.
Aumento en costos e ingeniería
para equipos.
Debe considerarse la manipulación
del material y la posible
exposición al contaminante.
Fuente: Elaboración propia.
2.1.3 Tipo de tratamiento
Esta clasificación se basa en el principio de la tecnología de remediación y se divide en
tres tipos de tratamiento. En la tabla 2.2 se muestran algunas ventajas y desventajas de
cada uno de ellos.
Tratamiento biológicos (biorremediación).Utilizan las actividades metabólicas
de ciertos organismos (plantas, hongos, bacterias) para degradar (destrucción),
transformar o remover los contaminantes a productos metabólicos inocuos.
13
Tratamientos fisicoquímicos. Este tipo de tratamientos, utiliza las propiedades
físicas y/o químicas de los contaminantes o del medio contaminado para
destruir, separar o contener la contaminación.
Tratamientos térmicos. Utilizan calor para incrementar la volatilización
(separación), quemar, descomponer o fundir (inmovilización) los contaminantes.
Tabla 0.5 Ventajas y desventajas de las tecnologías de remediación,
clasificadas de acuerdo con el tipo de tratamiento.
Ventajas Desventajas
Tratamientos
biológicos
Son efectivos en cuanto a
costos.
Son tecnologías más benéficas
para el ambiente.
Los contaminantes
generalmente son destruidos.
Se requiere un mínimo o
ningún tratamiento posterior
Requieren mayores tiempos de
tratamiento.
Es necesario verificar la
toxicidad de intermediarios y/o
productos.
No pueden emplearse si el tipo
de contaminante inhibe el
crecimiento microbiano.
Tratamientos
fisicoquímicos
Son efectivos en cuanto a
costos.
Pueden realizarse en períodos
cortos.
El equipo es accesible y no se
necesita de mucha energía ni
ingeniería.
Los residuos generados por
técnicas de separación, deben
tratarse o disponerse: aumento en
costos y necesidad de permisos.
Los fluidos de ectracción pueden
aumentar la movilidad de los
contaminantes: necesidad de
sistemas de recueración.
Tratamientos
térmicos
Destrucción completa de
contaminantes.
Es el grupo de tratamientos más
costoso.
Fuente: Elaboración propia
2.2. Métodos de separación
En estos métodos se encuentran:
Air sparging. En la aireación in situ, se inyecta aire en la zona saturada contaminada
volatilizando a los contaminantes en burbujas hasta la zona vadosa donde un sistema de
extracción de vapores captura la corriente de aire contaminada.
Movilización y solubilización mejorada. La baja solubilidad de los componentes de
los NAPL se puede mejorar, incrementando la masa de contaminante extraída, con el
lavado mediante surfactantes, con solventes, materia orgánica disuelta y ciclodextrinas
(McCray, y otros, 1998) .
Extracción de vapor. Esta tecnología implica la inyección de vapor para facilitar la
volatilización El proceso se facilita mediante mezcla mecánica del terreno hasta
profundidades de unos 7 metros con ayuda de barrenos.
14
Técnicas electrocinéticas. Necesitan por lo menos un par de electrodos alrededor del
área a tratar, y una corriente DC, de 50 a 150V. El tratamiento electrocinético consta de
varios procesos: electromigración, electroósmosis y electroforesis, que movilizan a los
contaminantes y electrolisis que los degrada (NRC, 1999). Un proceso llamado
LASAGNA combina el transporte electroosmótico con la captura de los contaminantes
por adsorbentes. Este proceso se aplicó en el campo en un sitio contaminado por TCE
(tricloroetileno) con una eficacia del 99 por ciento (NRC, 1999).
2.3. Tecnologías de aislamiento
En estas se engloban en:
Barreras Impermeables. Las barreras impermeables, para las zonas saturada y vadosa,
pueden impedir la migración de los NAPL. Son tecnologías probadas. Su misión es
confinar pequeñas bolsas de NAPL que pueden contaminar el agua subterránea. Hay
barreras verticales, coberteras superficiales, barreras horizontales, y combinaciones de
ellas.
Vitrificación/Encapsulación. Las técnicas de solidificación, estabilización,
vitrificación e inmovilización tienen el objeto de inmovilizar los contaminantes
subterráneos, fijándolos en una matriz sólida, e impermeable.
2.4. Tecnologías de transformación abióticos
Los métodos de transformación abiótica pueden ser in situ o ex situ. Los reactivos de
Fenton son aplicables de ambos modos. Las barreras permeables reactivas se aplican
sólo en el medio subterráneo, y el método UV/peróxido sobre el terreno después de la
extracción. La ventaja de los métodos in situ es que destruyen allí mismo al
contaminante. Los tratamientos ex situ evitan el problema de traslado de los reactivos y
posibilitan reacciones fotoquímicas sobre el terreno. Recientemente vienen recibiendo
atención las transformaciones químicas (redox) in situ: métodos pasivos como barreras
reactivas permeables con limaduras de hierro de valencia cero y, activos con inyección
de soluciones oxidantes (reactivo de Fenton, permanganato) en la zona contaminada.
15
Hidrodeshalogenación de los compuestos clorados. Se han realizado ensayos en lotes
con disolventes clorados con partículas de Pd como catalizador, obteniéndose etano y
ácido clorhídrico (Ordoñez Suárez, s/n). Los etilenos clorados con vidas medias de unos
4 minutos son los más reactivos. Los carbonatos desactivan gradualmente al catalizador.
La hidrodeshalogenación de contaminantes clorados en fase gas con catalizadores (Pd y
Pt) sería un método de destrucción antes de la adsorción con carbono activado u otros
sistemas.
Tecnologías bióticas. Se prefieren las técnicas de tratamiento in situ que son las que se
aplican sin necesidad de trasladar el agua subterránea afectada por el problema. Suelen
ser de utilidad cuando el problema afecta a un volumen muy importante del suelo, que
haga inviable su aislamiento y su tratamiento ex situ, o cuando éste supone un costo
económico que lo hace inviable, ya que el tratamiento in situ suele implicar un menor
costo económico. El tratamiento in situ puede ser de dos tipos: biológico o físico-
químico. La técnica de remediación in situ de carácter biológico es la biorremediación.
2.5. La biorremediación
Consiste en utilizar microorganismos (bacterias) para resolver o mitigar el problema, y
es especialmente efectiva en el tratamiento de contaminantes orgánicos, incluido el
petróleo. Para que las bacterias puedan eliminar las sustancias químicas dañinas, el
suelo y las aguas subterráneas deben tener la temperatura, los nutrientes y la cantidad de
oxígeno apropiados. Esas condiciones permiten que las bacterias crezcan y se
multipliquen, y asimilen más sustancias químicas (Chaney, y otros, 1995).
Los microorganismos pueden ayudar a eliminar la contaminación de las aguas
subterráneas, al igual que del suelo. En este caso, el agua se mezcla con nutrientes y aire
antes de que ser reinyectada al terreno. También pueden bombearse nutrientes y aire por
los pozos, de forma que la mezcla se produzca directamente en profundidad. Los
nutrientes y el aire añadidos ayudan a las bacterias a biorremediar las aguas
subterráneas. Una vez que se han eliminado las sustancias químicas dañinas, las
bacterias ya no tienen “alimento” disponible y mueren.
16
La biorremediación es muy segura, ya que depende de microbios que existen
normalmente en los suelos. Esos microbios son útiles y no representan un peligro para
las personas en el sitio o la comunidad. Además, no se emplean sustancias químicas
peligrosas. Los nutrientes que se añaden para que las bacterias crezcan son fertilizantes
de uso corriente en el césped o el jardín. La biorremediación transforma las sustancias
químicas dañinas en agua y gases inofensivos y, por lo tanto, las destruye totalmente.
Como principales ventajas de esta técnica se pueden indicar las siguientes
(EPA/625/R.94/005 USEPA, 1995):
Es una técnica in situ, lo que evita la necesidad de extraer el suelo, e
incluso el contacto de los trabajadores con el suelo o agua contaminados;
Evita la liberación de gases dañinos al aire y se generan muy pocos
residuos;
Generalmente esta técnica no requiere tanto equipamiento ni trabajo
como la mayoría de los métodos alternativos. Por lo tanto, suele resultar
más económica.
Como inconvenientes, se pueden citar los siguientes:
No es de aplicación más que para la descontaminación de hidrocarburos
biodegradables;
No suele ser efectiva más que en condiciones relativamente superficiales;
Presenta factores intrínsecos que la hacen completamente inviable en
determinados casos.
La biorremediación se considera actualmente como una alternativa tecnológica apta
para la limpieza de suelos y de acuíferos contaminados, donde se aprovecha el potencial
de los microorganismos para mineralizar o transformar residuos orgánicos en
compuestos químicamente más sencillos. El proceso obedece a la capacidad metabólica
de los microorganismos; y la actividad biodegradadora puede ser estimulada por la
adición de nutrientes básicos.
La característica más importante de la biorremediación es que los contaminantes no se
destruyen, sino que través de la actividad microbiana se transforman en compuestos
17
químicamente diferentes. Algunos pueden ser completamente degradados, en forma tal
que se cumple con la primera ley de la termodinámica. Cuando la transformación llega
hasta la generación de dióxido de carbono y agua, entonces se habla de una completa
mineralización.
Una ventaja importante de la biorremediación es su bajo costo en relación con otros
tratamientos. Es difícil hacer una comparación de costos, de ahí que conviene conocer
las características de cada sitio en particular; pero en términos generales, se puede decir
que es por lo menos diez veces más económica que la incineración y tres veces más
económica que algunas tecnologías fisicoquímicas de inmovilización. Este bajo costo se
debe a varios factores, como son un menor gasto de energía; bajo costo de los
nutrientes; y la operación en condiciones ambientales. Eso hace que su uso sea muy
atractivo para los países en vías de desarrollo, como México.
La versatilidad de esta alternativa tecnológica se basa en que puede adaptarse a las
necesidades de cada sitio. Así, puede aplicarse bioestimulación si únicamente se
requiere la adición de nutrientes para la actividad metabólica degradadora de la flora
bacteriana autóctona; bioincremento, cuando la proporción de la flora degradadora
autóctona es muy reducida y se hace necesario añadir microrganismos degradadores
exógenos; o bien bioventeo, cuando es imprescindible el suministro de oxígeno para
estimular la actividad microbiana degradadora presente en el lugar. En cualquiera de las
opciones anteriores puede realizarse fuera del sitio (ex situ) si la contaminación está en
el suelo superficial, pero necesariamente in situ cuando los contaminantes han
alcanzado grandes profundidades, e inclusive el manto freático.
En sitios donde ocurren derrames de hidrocarburos no atendidos inmediatamente, la
flora microbiana presente en el suelo se somete a un proceso de selección natural, en el
que los microorganismos sobrevivientes son aquellos que desarrollan capacidad
degradadora. En estos casos la mejor opción es utilizar la flora autóctona del sitio, en
lugar de agregar microorganismos exógenos. Para tratar derrames recientes,
probablemente será necesario recurrir a preparados microbianos frescos.
En el caso de aguas subterráneas, la biorremediación se aplica a través del bombeo-
tratamiento-recarga, que consiste en extraer el agua subterránea, promover la
18
biodegradación de los contaminantes en biorreactores instalados en la superficie y
posteriormente devolverla al acuífero, o bien inyectar nutrientes y bacterias, de tal
forma que se establezca una recirculación y el sitio mismo se convierta en un
biorreactor.
19
CAPITULO III. BIORREMEDIACIÓN
La contaminación de los recursos acuícolas en el mundo es un problema que ha ido en
aumento, de la mano del desarrollo que ha conseguido la sociedad. Cuando los
contaminantes son hidrocarburos, el problema se agrava, porque los métodos
convencionales para el tratamiento de aguas son insuficientes para conseguir hacerlos
inocuos.
3.1. Prospectiva de microorganismos
El desarrollo de nuevos procesos para este tipo de contaminantes ha ido en aumento en
las últimas décadas, donde los métodos químicos basados en oxidación son los más
destacados. Sin embargo, estos procedimientos en muchos casos resultan imprácticos,
costosos, de difícil adaptación y en muchos casos, generan subproductos que son más
peligrosos que los originalmente presentes (Kvenvolden, y otros, 2003; Holliger, y
otros, 1997; Alvarez, y otros, 1991).
Por lo anterior, la biodegradación es una alternativa viable. Consiste en el uso de la
capacidad degradativa de algunos microorganismos para utilizar los hidrocarburos como
fuente de carbono y convertir estos en sustancias inocuas para la biota. A partir de este
principio se desarrollan procesos de biorremediación. Múltiples microorganismos se
han estudiado, para evaluar tanto su capacidad como su eficiencia degradativa hacia los
hidrocarburos. Estos estudios se realizan utilizando microorganismos individuales o
consorcios microbianos. El tipo de microorganismos con capacidad de utilizar
hidrocarburos incluye hongos, bacterias y algas (Soo Cho, y otros, 1997).
Para que un microorganismo sea capaz de utilizar petróleo o alguna de sus fracciones
hidrocarbonadas como sustrato, es necesario que cuente con las enzimas adecuadas para
dicho sustrato. La variabilidad metabólica que presentan los microorganismos para usar
compuestos hidrocarbonados como fuente de carbono y de energía se debe a la
presencia de algún tipo o grupo de enzimas específicas. (Van Beilen, y otros, 2007) Los
microorganismos son capaces de desarrollar especificidad para metabolizar
contaminantes, llegando a ser selectivos para estos, cuando se encuentran sometidos
ambientalmente a condiciones en las cuales no existe otra fuente de carbono; tal es el
20
caso de la biodegradación de aromáticos policíclicos por microorganismos, la cual es
considerada una técnica altamente efectiva y ambientalmente benigna (Cerniglia, 1992;
Cerniglia, 1997).
En general, el tipo de bacterias que participan en procesos de biodegradación de
derivados hidrocarbonados son gramnegativas. El primer paso para que los
microorganismos metabolicen este tipo de contaminantes es la producción de
biosurfactantes, con el fin de incorporarlos en su metabolismo. Los biosurfactantes son
moléculas complejas que pueden incluir lipopéptidos, glicolipidos, polisacáridos
complejos, ácidos grasos y fosfolípidos (Fritsche, y otros, 2000).
Muchas especies de Bacillus sintetizan lipopéptidos, especies de Pseudomonas y
Candida sintetizan glicolipidos, mientras que algunas especies de Acinetobacter
sintetizan complejos poliliposacáridos. La importancia de dichos biosurfactantes es que
su presencia aumenta la biodisponibilidad de los contaminantes (Moussa, y otros,
2006). El condicionante para que los microorganismos sean capaces de sintetizar
biosurfactantes, es la presencia de carbono, nitrógeno y elementos traza, así como
condiciones apropiadas de temperatura y aireación (Yimin, y otros, 1995; Lin, 1996;
Wouter, y otros, 1998). Dentro de los compuestos que los microorganismos sintetizan
en la superficie celular, por sus efectos, se distinguen dos: aquellos que reducen la
tensión superficial en la interfase del agua y el aire (biosurfactantes) y aquellos que
reducen la tensión interfacial entre la interfase de líquidos inmiscibles o la interfase
liquido-sólido. Estas sustancias también facilitan la difusión de los compuestos
hidrocarbonados dentro de la célula microbiana. En la figura 3.1 se esquematiza este
proceso (Lin, 1996).
Otro mecanismo utilizado por los microorganismos para integrar estos compuestos es
modificar su pared celular, sintetizando lipopolisacáridos o surfactantes no iónicos.
Estos factores son importantes para implementar una estrategia exitosa de
biorremediación, ya que son los factores que influencian la biodegradación y la ecología
de las bacterias degradadoras de los contaminantes. Estos factores también dictan el
grado que se puede lograr de biodegradación del contaminante (Hofritcher, 2000
Germany).
21
Figura 0.2 Participación de biosurfactante (rhamnolípido) producido por bacterias del genero
Pseudomonas sp en el consumo de hidrocarburos.
Fuente: (Hofritcher, 2000 Germany)
En la figura 3.2 se muestra la localización y funciones de los productos del gen alk. Los
productos incluyen alcano hidroxilasa, rubredoxinas, aldehído deshidrogenasa, alcohol
deshidrogenasa, acetil-CoA sintasa, proteína de la membrana exterior que intervienen en
del consumo (AlkL), proteína metil-aceptora transductora que interviene en la
quimiotaxis (AlkN), rubredoxin reductasa (AlkT) y genes de regulación positiva (AlkS)
(van Beilen, y otros, 2001).
Figura 0.3 Esquematización de la degradación de alcanos por una bacteria gran-negativa.
Fuente: (van Beilen, y otros, 2001).
22
La recurrencia de algunas especies microbianas en sitios contaminados con derivados
hidrocarbonados específicos, tales como hidrocarburos poliaromáticos como parte de la
biota nativa, son el fundamento para la aplicación de la biorremediación. Entre dichos
microorganismos se encuentra Pseudomona, Cyclocasticus, Vibrio y Pseudalteromonas.
La participación de los microorganismos nativos en la biodegradación, cuando se
implementa un proceso de biorremediación, debe ser evaluado detalladamente, ya que
su presencia también condiciona la eficiencia de la biodegradación, llegando a
potenciarla en el mejor de los casos. Naturalmente, los microorganismos presentes en
un sitio contaminado (por hidrocarburos), desarrollaran la capacidad de utilizar como
sustrato el contaminante, en menor o mayor grado. Otro factor importante es la
composición del hidrocarburo contaminado, ya que el contenido de metales pesados
puede disminuir e incluso inhibir el desarrollo de parte o de la totalidad de la biota
microbiana existente en el medio, y por tanto afecta directamente el potencial
degradativo de estos organismos (Eckford, y otros, 2002; Eckford, y otros, 2002).
El petróleo, sin embargo, incluye una amplia variedad de compuestos hidrocarbonados,
con características químicas específicas y que por tanto interactúan de maneras muy
variadas en un medio contaminado. Muchos de los compuestos que conforman el
petróleo son considerados peligrosos para la salud tanto de humanos como de animales,
ya que está demostrado que tienen propiedades toxicas y carcinogénicas (Prabhu, y
otros, 2003).
La biorremediación es la alternativa cuyo mecanismo de remoción tiene mayor
participación en casos donde ha ocurrido contaminación de medios acuáticos por
hidrocarburos. Un hecho importante en los procesos de biorremediación del petróleo, es
que las bacterias adicionadas desaparecen con el tiempo, mientras que las bacterias
nativas son capaces de degradar el petróleo en algunos días. El uso de flora nativa ha
centrado el interés en estudiar la bioquímica y la genética involucrada en el proceso de
biodegradación de estos microorganismos (Bicca, y otros, 1999).
La especificidad de cada microorganismo sobre un componente del petróleo o un grupo
de componentes también puede ser estimulada por medio de su adaptación a dicho
sustrato. Para cada fracción del petróleo, se tiene un conjunto de microorganismos con
23
capacidad de metabolizar selectivamente dichas fracciones. Este hecho también permite
utilizar estos microorganismos como biosensores (Langworthy, y otros, 1998; Daunert,
y otros, 2000).
El metabolismo microbiano puede clasificarse de acuerdo a la vía por la cual el
contaminante se biotransforme. En metabolismo aerobio de los alcanos involucra la
acción de la enzima monooxigenasa sintetizada en la membrana celular, la cual
participa activamente en la β-oxidación del ciclo de los ácidos tricarboxilicos. En el
caso de los poliaromáticos, la enzima polioxigenasa participa en la vía de salicilato o en
la vía a través de catecol hasta piruvato. La vía anaerobia involucra procesos tales como
la reducción de Fe(III), denitrificación, condiciones de sulfatoreducción; las cuales se
efectúan en bacterias anoxigénicas fotosintéticas, en consorcios sintrópicos y en
bacterias metanogénicas. Las proteobacterias de diferentes subclases son las
mayormente reportadas en la literatura para este tipo de condiciones, utilizando como
sustrato benceno, tolueno y xilenos (Cerniglia, 1997; Frazer, y otros, 1995).
Para el estudio de la biodegradación, el diesel representa un excelente sustrato, debido a
que su composición es representativa de la fracción soluble en agua del petróleo. Una
manera rápida de seleccionar a los microorganismos con capacidad degradadora es
caracterizando el biosurfactante que producen (Mukherjee, y otros, 2006).
Para estimular la producción de biosurfactantes y facilitar así dicha adaptación, se
adiciona una mezcla de sales minerales que contienen la relación de carbono, nitrógeno
y elementos traza necesaria para el desarrollo microbiano. Bajo este esquema de trabajo,
se espera obtener resultados que confirmen la capacidad degradadora del consorcio
utilizado sobre la mezcla de hidrocarburos contaminantes, y la estimulación de esta,
evaluando así los parámetros más importantes que afectan la eficiencia de la
biodegradación. Estos resultados permitirán desarrollar un sistema de tratamiento en
una escala mayor, fundamentando el proceso en la optimización de los parámetros
importantes que se detecten en el trabajo.
Algunas de las principales características que incorpora el consorcio bacteriano en uso
están bien descritas en la bibliografía especializada; sin embargo, esto no garantiza que
dicho consorcio pueda ser utilizado para cualquier tipo de contaminación por crudo. La
24
influencia de la flora nativa dependerá del sitio en el que ocurra la contaminación, ya
que esta varía de acuerdo al ambiente y a la región. Inclusive, la propia naturaleza del
crudo derramado, su contenido de metales pesados y su grado de dispersión en el medio
serán factores que permitan o inhiban el desarrollo de la biota indígena (Annweller, y
otros, 2000; Becker, 1997).
Esto obliga a concluir que antes de implementar cualquier metodología de
biorremediación, es indispensable contar con una caracterización tanto del lugar como
del tipo de hidrocarburo presente; así como las interacciones existentes en el medio
entre dicho contaminante y otras sustancias presentes naturalmente en el medio de
interés. Todo esto con el fin de obtener resultados óptimos del procedimiento por
aplicar (Suthan, y otros, 1999).
El territorio nacional, por poseer petróleo como un importante recurso natural, sufre la
problemática de los derrames y fugas de crudo, en ambientes especialmente sensibles
por su gran variedad de organismos y microorganismos presentes, tales como los
manglares y pantanos. Ello brinda la oportunidad de estudiar en detalle la flora nativa
que resiste, se adapta y degrada este tipo de contaminantes. Diversos casos se ubican en
regiones con esta problemática en el suroeste del país, las cuales sirven como fuentes de
obtención de microorganismos adaptados (Martínez de villa, y otros, 1995 Jun 5-9).
La comercialización de dichos microorganismos se ha venido incrementando en los
últimos años. Es indispensable el estudio de las interacciones en el medio que provocan
los contaminantes y las existentes entre los microorganismos de estas zonas. Para esta
problemática, una alternativa es el acondicionamiento de los parámetros que favorezcan
el desarrollo de la microbiota capaz de degradar los hidrocarburos. Esto solo se puede
conseguir conociendo y estudiando estos parámetros (Atlas, y otros, 1992; Atlas, y
otros, 1992; Atlas, y otros, 1995).
La recurrencia del género Pseudomona en sitios que han sufrido esta problemática y la
capacidad de este microorganismo para adaptarse no solo al sustrato sino también a
condiciones aeróbicas o anaeróbicas lo hacen un buen representante de la acción
microbiana en medios con este tipo de presión. Otra razón importante para su estudio en
mayor profundidad, es su posible uso como biosensor, tomándolo como referencia para
25
sitios en los que a través de otras técnicas se ha abordados el problema (Rahman, y
otros, 2003; Cameotra, y otros, 2008; Beal, y otros, 2000; Pornsunthorntawee, y otros,
2008).
En este ámbito, la biodegradación de hidrocarburos del petróleo en ambientes acuáticos
es un tema en el cual falta por hacer y se debe prestar especial atención ya que nuestro
país presenta un problema serio que ha sido relegado, pero que afecta directamente a la
población y a la fauna y flora: el agua es un recurso primario, indispensable para la
conservación de la vida (Colwell, y otros, 1977). No hay vida sin agua.
Los procesos biológicos utilizan microorganismos, entre los que destacan las bacterias,
para llevar a cabo la eliminación de componentes indeseables del agua, aprovechando la
actividad metabólica de los mismos sobre esos componentes proteínicos denominados
enzimas. También se llevan a cabo una serie de reacciones bioquímicas mediante las
cuales los microorganismos utilizan la materia orgánica presente en el agua, la
sintetizan y la aprovechan para proveerse de energía mediante su síntesis (Rodríguez
Fernández Alba, y otros, 2006).
El tratamiento biológico resulta ser un proceso eficiente en la depuración de aguas
residuales que contienen compuestos orgánicos peligrosos (Brenner, y otros, 1992;
Yoong, y otros, 2001). Si bien los compuestos tóxicos como el fenol, hidrocarburos
aromáticos o determinados compuestos xenobióticos contribuyen con la inestabilidad de
los sistemas de tratamientos biológicos de aguas residuales, estos compuestos también
son usados como fuentes de carbono y energía por ciertos grupos de microorganismos
(Yoong, y otros, 2001; Rozich, 1983).
Los sistemas biológicos no sólo son capaces de destoxificar estos residuos, sino también
de completar la oxidación de la materia orgánica tóxica a productos finales simples
como CO2, H2O, NH3, CH4 y biomasa. En la figura 3.3 se esquematiza el proceso
dentro de una bacteria aerobia.
26
Figura 0.4 Esquema que muestra la principal ruta de degradación de
hidrocarburos en microorganismos aerobios.
Fuente: (Chandran, 2010)
Los microorganismos aerobios realizan la oxidación de los contaminantes, sin embargo,
para entender y aplicar eficientemente su función, es necesario considerar sus
limitaciones, algunas de ellas pueden ser la baja disponibilidad en nutrientes, en el
mismo contaminante, en el oxígeno disuelto (si los microorganismos son aerobios); se
requiere una adecuada relación carbono: nitrógeno: fósforo (C:N:P), y tomar en cuenta
el porcentaje de mortandad en relación a la concentración y grado de toxicidad de
ciertas sustancias; además de considerar ciertos parámetros de diseño del sistema de
tratamiento como por ejemplo el tiempo de retención hidráulico y el tiempo de
retención celular.
En México, el conocimiento de esta tecnología de tratamiento es escasa y se deben
establecer líneas de investigación con el propósito de estudiar procesos de vanguardia
en el área que ayuden a resolver los problemas que se producen en los efluentes
industriales debido a productos que no son fácilmente degradables, tales como los
compuestos característicos presentes en un agua residual de refinería que, requieren de
la manipulación de microorganismos especializados para su biodegradación.
27
3.2. Microorganismos utilizados en la biorremediación
La población microbiana es el factor determinante para que ocurra el proceso de
biodegradación. Se necesita una población microbiana adaptada, que posea las enzimas
necesarias que catalicen las reacciones de degradación. Los microorganismos pueden
degradar los contaminantes en forma de cultivos puros, mixtos o consorcios que
siempre es más eficiente que el cultivo puro. En los consorcios se establece una
completa interacción de las especies microbianas.
Los microorganismos se caracterizan por su increíble versatilidad metabólica y
fisiológica que les permite habitar en nichos ecológicos. Las especies como
Pseudomonas, Micrococos, Nocardia; Bacillus, Corynebacterium, Rhodococcus,
Arthrobacter, Corynebacterium, Flavobacterium Cladosporium, Fusarium y muchos
otros ampliamente distribuidos en suelos, lodos, alcantarillados y agua, han sido
reportados como degradadores de compuestos orgánicos por una serie de pasos
incluyendo transferencia de masas, adsorción y reacciones bioquímicas enzimáticas
permitiendo su crecimiento (Pandya, 2007).
Las bacterias son organismos procariotas unicelulares. Su modo habitual de
reproducción es por escisión binaria, aunque algunas especies se reproducen
sexualmente o por geminación. Si bien existen miles de especies diferentes de bacterias,
su forma general encaja dentro de alguna de las 3 siguientes categorías: esféricas,
cilíndricas y helicoidales. El tamaño de las bacterias es muy variable. Los tamaños
representativos son de 0.5 y 1 micra de anchura por 6 a 15 micras de longitud en el caso
de bacterias helicoidales (espirales).
Las bacterias del género Pseudomonas poseen la habilidad para utilizar diversos
substratos, incluyendo aquellos creados por el petróleo. Las Pseudomonas son bacterias
Gram negativas, que pertenecen a la subclase gamma de las Proteobacterias. Las
bacterias del género Pseudomonas poseen la habilidad de utilizar diversos substratos,
incluyendo aquellos creados por el petróleo.
Las Pseudomonas son ubicuas, de gran importancia ambiental, usando técnicas de
cultivo tradicionales se han realizado estudios sobre esta especie (Amann, y otros, 1995;
28
Moore, y otros, 2006). Otros estudios (Duineveld, y otros, 2001; Kaplan, y otros, 2004;
Gerdes, y otros; Popp, y otros, 2006; Ferguson, y otros, 2007), muestran que las
Pseudomomas pueden ser definidas como un miembro predominante en comunidades
de ecosistemas aeróbicos donde están presentes altas concentraciones de petróleo crudo
que actúa como un selector fuerte.
Las comunidades de bacterias predominantemente compuestas de Pseudomonas,
Sphingomonas, y Acidobacteria han sido reportadas por ejemplo en ecosistemas de
suelo-agua subterránea con contaminación de petróleo (Popp, y otros, 2006). La
predominancia de las bacterias Gram-negativas está en su capacidad de resistir a
concentraciones de solventes y en suelos contaminados y en una diversidad de muestras
donde el tratamiento es aplicado.
Algunas de las características de las bacterias del género Pseudomonas se mencionan a
continuación:
3.2.1. Pseudomona aeruginosa.
La Pseudomonas aeruginosa, es un microorganismo usado en biorremediación, presenta
una serie de actividades naturales sobre xenobióticos. Lamentablemente, también es
conocida por ser un patógeno oportunista en humanos y causante de complicaciones
graves en personas inmunosuprimidas, con quemaduras severas o con fibrosis quística.
En la figura 3.4 se muestra una micrografía de la bacteria.
Figura 0.5 Micrografia de Pseudomona aeruginosa obtenida con microscopio de barrido.
Fuente: (Improving Disease Treatment Through Genome Research, 2011)
29
Estudios con relación al desempeño metabólico de la Pseudomonas aeruginosa han
permitido identificarla como degradadora de gran cantidad de sustratos como el n-
hexadecano, mineralización de compuestos alifáticos en condiciones anaerobias, y
degradadora de hidrocarburos aromáticos y poli aromáticos, así como del pireno en
estudios in vitro.
La Pseudomona aeruginosa, es un microorganismo usado y estudiado en
biorremediación y presenta una serie de actividades naturales sobre xenobióticos. Tiene
la capacidad de sintetizar ramnolipidos cuando se encuentra en la fase estacionaria de su
crecimiento, por tal razón esto sólo se puede realizar en la primera fase del proceso de
biorremediación, contribuyendo así con la movilización y solubilización de los
contaminantes durante la fase siguiente de mineralización.
Estudios con relación al desempeño metabólico de la Pseudomonas aeruginosa ha
permitido identificarla como degradadora de gran cantidad de sustratos como el n
hexadecano, mineralización de compuestos alifáticos en condiciones anaerobias, y
degradadora de hidrocarburos aromáticos y poli aromáticos, así como del pireno en
estudios in vitro.
3.2.2. Pseudomona putida
La Pseudomona putida es un saprofito del suelo, oportunista, cosmopolita,
metabólicamente versátil, por poseer una dioxigenasa inicial, aunque no presenta la
dioxigenasa específica para los PAHs por lo cual es una buena candidata para las
aplicaciones biotecnológicas, tales como agricultura, biocatálisis, biorremediación,
biocontrol en protección de las plantas y producción de bioplásticos. En la figura 3.5 se
muestra una micrografía de esta especie.
La P. putida posee la capacidad de colonizar la rizosfera de plantas de cosecha y una
gran capacidad metabólica que facilita el desarrollo de biopesticidas y promotores de
crecimiento de la planta.
30
Figura 0.6 Micrografia de Pseudomona putida obtenida con microscopio de barrido.
Fuente: (Ceprio, 2011)
La degradación de los alcanos por Pseudomona putida se ha estudiado por
secuenciación en el plasmido OCT que codifica una enzima dioxigenasa que convierte
alcanos a aldehídos a través del hidroperoxidasa del n-alkyl sin un intermediario del
alcohol, conocido como la vía de Finnerty; un proceso similar lo presentan los géneros
Acinetobacter sp. y Nocardiodes sp. aunque ellos no poseen este plasmido.
3.2.3. Pseudomona fluorescens
Es un bacilo Gram-negativo, recto o ligeramente curvado pero no vibrioide, es saprófito
(todo lo que ingiere pasa a través de la pared de su citoplasma). Se puede encontrar en
suelo y agua. Es incapaz de formar esporas y crece aeróbicamente. La temperatura
óptima para su funcionamiento es de 25-30 ºC, aunque puede crecer desde los 5 hasta
los 42 ºC aproximadamente. No crece bajo condiciones ácidas (pH 4.5) y necesita
preferentemente pH neutro. Tiene movimiento activo en líquido por sus flagelos polares
(más de 1). Su pigmento fluorescente (fluoresceína) la hace reaccionar frente a la luz
ultravioleta, aunque recién cultivada o después de varios cultivos de laboratorio, puede
ser que no reaccione (Hermoso, 2008). En la figura 3.6 se muestra una micrografía de
este microorganismo.
31
Figura 0.7 Micrografia de Pseudomona fluorescens obtenida con microscopio de barrido.
Fuente: (Matt, 2009)
La Pseudomona fluorescens es degradadora de naftaleno y fenantreno, ventaja que tiene
frente a las otras Pseudomonas, que solo metabolizan naftaleno y asfaltenos.
3.2.4. Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter calcoaceticus es un bacilo Gram negativo, es productor de ácido a partir
de la glucosa, se desarrolla a 41 y 44 ºC, produce a-xilosa y utiliza el malato. En la
figura 3.7 se muestra una micrografía de esta bacteria.
Figura 0.8 Micrografia de Acinetobacter calcoaceticus obtenida con microscopio de barrido.
Fuente: (Microbe Wiki, 2010)
32
En los lodos activos se encuentran diversos organismos vivos. Dentro de los géneros
bacterianos destacan: Spirillum (bacterias móviles helicoidales con forma de bacilos
largos y espiralados), Vitreoscilla (bacterias gram-negativas, aeróbicas o
microaerofilicas, que no tienen color y son filamentosas; producen hemoglobina
bacteriana homodimerica, especialmente bajo condiciones de crecimiento con
limitación de oxigeno), Sphaerotilus (bacteria filamentosa forrada que exhibe una
"falsa" ramificación), Beggiatoa (bacteria filamentosa del sulfuro constituida por
filamentos rectos).
Además de bacterias, existen en los lodos activos, un gran número de especies de
protozoos como flagelos, ciliados y amibas. Los protozoos son organismos de una
célula que puede nutrirse de materia orgánica y bacterias. Nematodos o rotíferos se
clasifican entre los organismos multicelulares.
Normalmente, un lodo activo en un sistema estable presenta estas 3 características:
La población de protozoos se presenta en una densidad superior a 106
individuos L-1
La microfauna se compone principalmente de ciliados reptantes y sésiles,
sin apenas presencia de flagelados;
Las especies y grupos de ciliados están muy diversificadas, de manera
que ningún grupo supera numéricamente a otro con un factor superior a
10.
En el caso de que estas premisas no se cumplan, la identificación del grupo dominante
permitirá obtener información sobre la situación particular del sistema, como se muestra
en la tabla 3.1. Así se puede determinar el estado del sistema con la simple observación
microscópica.
Los protozoos son protistas móviles microscópicos y, por lo general, unicelulares. La
mayoría de los protozoos son heterótrofos aerobios, aunque algunos son anaerobios. Los
protozoos sueles ser mayores que las bacterias, y se suelen alimentar de ellas para la
obtención de energía. De hecho, al consumir bacterias y materia orgánica, los protozoos
33
actúan como purificadores de los efluentes de procesos biológicos de tratamiento de
aguas residuales.
Los protozoos tienen importancia en las cadenas alimentarias como componentes del
plancton. Son considerados como bioindicadores en el proceso de tratamiento de aguas
residuales. Según la forma como se desplazan los protozoos se clasifican en: sacordinos,
ciliados, flagelados y esporozoos.
Los protozoos secretan una capa protectora gruesa que rodea su cuerpo y cesan toda
actividad. Es decir, quedan en estado latente a la espera de la llegada de condiciones
ambientales favorables que les permitan reanudar su actividad. Hay variabilidad
interespecífica (entre especies) en la resistencia de los quistes: resistencia a la
desecación y/o resistencia a las bajas temperaturas.
El rotífero es un animal aerobio, heterótrofo y multicelular. Su nombre procede del
hecho de que disponen de 2 juegos de pestañas giratorias sobre la cabeza, que emplean
para la captura de alimentos y para moverse. Los rotíferos son muy eficaces en la
eliminación de bacterias dispersas y floculadas, así como de pequeñas partículas de
materia orgánica. Su presencia en un efluente indica un proceso aerobio de purificación
biológica muy eficiente (Metcalf, 2004). En la figura 3.8 se muestra una figura de un
rotífero.
Figura 0.9 Micrografía de rotífero obtenida con microscopio óptico.
Fuente: (Wikipedia, 2009)
34
Los ciliados desplazan y capturan el alimento por medio de cilios, filamentos cortos,
vibrátiles y numerosos que rodean su cuerpo. Se caracterizan por ser los únicos
organismos con dos núcleos uno para la reproducción y otro relacionado con la
alimentación.
Cada organismo existente cumple una función fundamental, la de los organismos
ciliados (depredadores en su mayoría), es variada. Estos organismos favorecen la
depuración de efluentes, además, de la reducción de bacterias patógenas.
Tabla 0.6 Estado del nivel de depuración atendiendo a la observación microbiología.
GRUPO DOMINANTE NIVEL DE
DEPURACIÓN POSIBLES CAUSAS
Pequeños flagelados Bajo Oxigenación insuficiente, sobrecarga orgánica, sustancias en
fermentación
Pequeños nadadores (ciliados) Mediocre Lodo con aireación insuficiente
Grandes nadadores (ciliados) Mediocre Sobrecarga orgánica; lodo pobremente aireado
Ciliados reptantes Bueno -
Ciliados sésiles y reptantes Bueno -
Ciliados sésiles En descenso Transitoriedad en la carga orgánica, extracción de lodos reciente,
etc
Amebas desnudas y flagelados Pobre Carga orgánica muy alta poco degradable
Amebas testáceas Bueno -
Las principales interacciones que ocurren entre las diversas especies microbianas son:
1) Competición, que se refiere, como el nombre lo indica, a una competencia en el uso
de un determinado nutriente;
2) Predación, que ocurre cuando un organismo se alimenta de otro, cuando uno ingiere a
otro como sucede en el caso de una ameba o un protozoario que ingiere a células de
levaduras o de algas;
3) Parasitismo, cuando uno se aprovecha o vive a expensas de otro que generalmente
muere;
4) Comensalismo, cuando dos organismos viven simultáneamente sin beneficiarse ni
molestarse;
5) Mutualismo, cuando dos organismos se benefician mutuamente;
35
6) Amensalismo, que se refiere al caso de la excreción de un factor, por parte de un
organismo, que es dañino para el otro, como es el caso de la formación de un antibiótico
por un hongo que inhibe el desarrollo de una bacteria.
Métodos de cultivos básicos y métodos de cultivo independiente están siendo
desarrollados e implementados para mejorar el entendimiento acerca de estas
comunidades microbianas. La separación e identificación de microorganismos
responsables de las transformaciones de los hidrocarburos han sido ampliamente
reconocidas.
La lista de degradación de hidrocarburos por organismos (bacterias, levaduras, hongos y
algas) están disponibles bibliográficamente (Atlas, y otros, 1995; Atlas, y otros, 1981;
Leahy, y otros, 1990; Rosenberg, 2013; Magot, y otros, 2000), los cuales son
microorganismos de los depósitos de petróleo, incluyendo bacterias mesofílicas y
bacterias sulfatoreductoras, metanogénicas, bacterias termofílicas fermentativas, y
bacterias reductoras del hierro (Vieira, y otros, 2009).
3.3. Crecimiento bacteriano
En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar cuatro
fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento microbiano (Granados
Pérez, y otros, 1997), como se muestra en la figura 3.9:
Fase de latencia en la que no hay aumento de población;
Fase logarítmica o exponencial en la que las células se duplican al mismo ritmo;
Fase de crecimiento estacionaria en la que se van agotando los nutrientes y acumulando
productos tóxico;
Fase de muerte o lisis en la que mueren más células que las que se producen. La tasa de
muerte se acelera, haciéndose exponencial.
36
Figura 0.10 Curva típica de crecimiento para un sistema cerrado.
El crecimiento microbiano es el aumento del número de microorganismos a lo largo del
tiempo. Las poblaciones de bacterias crecen de forma exponencial acumulando grandes
números en un periodo de tiempo reducido.
Puesto que el efecto de los microorganismos en la mayoría de los casos depende de su
número, entender cómo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder
reducir sus efectos nocivos y en este caso potenciar los beneficios o aplicaciones. Se
requiere conocer el comportamiento en el crecimiento de bacterias incubadas en el
biorreactor.
3.4. Factores que afectan el crecimiento microbiano
El crecimiento microbiano llevado a cabo tanto en un biorreactor como en un reactor
biológico (de lodos activados, de lecho fluidificado, por mencionar algunos) es
influenciado por una variedad de factores nutricionales y factores físicos. Los factores
físicos incluyen la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto.
La importancia de establecer valores de cada uno de los factores físicos en un
biorreactor o bien en un reactor biológico se mencionan a continuación:
3.4.1. Temperatura
La temperatura a la que opera un reactor influye de manera importante en la actividad
de la biomasa, dado que las reacciones bioquímicas son directamente afectadas por este
37
parámetro. La temperatura no sólo influye en las actividades metabólicas de los
microorganismos, sino también tiene un efecto sobre la velocidad de transferencia de
gases y las características de sedimentación de los sólidos biológicos.
La temperatura ejerce dos efectos importantes sobre la población bacteriana: (1) afecta
en la velocidad de difusión del sustrato y nutrientes dentro de la célula bacteriana y (2)
afecta en la velocidad de la actividad enzimática. Con el incremento de la temperatura,
la velocidad de difusión del sustrato y de los nutrientes dentro de la célula bacteriana se
incrementa, y la velocidad de la actividad enzimática incrementa. La velocidad de
difusión y la actividad enzimática decrece cuando la temperatura disminuye.
Entonces el incremento de la actividad bacteriana se realiza manteniendo una
temperatura cálida, un operador en una planta de tratamiento de aguas residuales puede
reducir los sólidos (bacterias) y mantener aún un tratamiento aceptable en el agua
residual. Sin embargo, con la disminución de la actividad bacteriana mediante una
disminución de la temperatura en el agua residual, un operador en una planta de
tratamiento de aguas residuales puede necesitar incrementar la concentración de sólidos
con el fin de mantener aceptable el tratamiento del agua residual (Gerardi, 2006).
Así que el impacto de la temperatura sobre la actividad bacteriana es importante. Por
cada 10 ºC de incremento en la temperatura, la actividad enzimática se duplica. Sin
embargo, por encima de una cierta temperatura algunas proteínas particulares pueden
sufrir daños irreversibles. En consecuencia, dentro de un cierto margen, un aumento de
temperatura supone un incremento en el crecimiento y en el metabolismo hasta un punto
en que tienen lugar las reacciones de inactivación. Por encima de tal punto, las
reacciones celulares caen rápidamente a cero. Así, para cada organismo existe una
temperatura mínima por debajo de la cual no es posible el crecimiento, una óptima a la
que se produce el crecimiento más rápido, y una temperatura máxima por encima de la
cual no es posible el crecimiento (Madigan, 2004).
Aunque existe todo un espectro continuo entre los microorganismos, desde los que
tienen su temperatura óptima a temperaturas muy bajas hasta los que la tienen muy alta,
se pueden distinguir cuatro grupos de microorganismos con relación a su temperatura
óptima: psicrófilos, con temperatura óptimas bajas; mesófilos, con temperaturas óptimas
38
moderadas; termófilos, con altas temperaturas óptimas; e hipertermófilos, con
temperaturas óptimas muy elevadas, como se muestra en la figura 3.10.
Figura 0.11 Relación entre la temperatura y las velocidades de crecimiento de psicrófilos, mesófilos,
termófilos y dos hipertermófilos diferentes.
Fuente: (Madigan, 2004)
3.4.2. Influencia del pH
Para la mayoría de las bacterias el pH óptimo de crecimiento usualmente está cercano al
neutro (entre 6.8 y 7.2), y no pueden tolerar niveles de pH por arriba de 9.5 o por debajo
de 4.0. El pH puede afectar en el grado de toxicidad del contaminante, pues a un pH
determinado las moléculas pueden estar ionizadas y ser menos tóxicas para el
microorganismo que la molécula sin ionizar.
3.4.3. Oxígeno disuelto
Las bacterias crecen en presencia o ausencia de oxígeno molecular y son clasificadas en
tres grandes grupos de acuerdo a sus necesidades del oxígeno molecular. Estos grupos
son las aerobias, las anaerobias y las anaerobias facultativas. Las primeras requieren
oxígeno para degradar el sustrato. Las bacterias anaerobias no usan el oxígeno
molecular para degradarlo.
Entre las bacterias aerobias y anaerobias están las bacterias anaerobias facultativas. El
término facultativo implica la habilidad de vivir bajo diferentes condiciones. Este tipo
de bacterias tiene la habilidad de usar el oxígeno molecular u otra molécula para
degradar el sustrato cuando el oxígeno no se encuentra disponible. Estas bacterias
39
prefieren el oxígeno a otro tipo de moléculas tales como NO3- para degradar el sustrato.
Las bacterias desnitrificantes, Bacillus, Escherichia, y Pseudomonas son ejemplo de
bacterias anaerobias facultativas (Gerardi, 2006). El factor nutricional microbiano se
refiere a la relación carbono: nitrógeno : fósforo (C:N:P).
3.4.4. Relación C:N:P
Las bacterias son tal vez los más diversos y versátiles organismos en cuanto a sus
requerimientos nutricionales. Existen considerables variaciones en sus requerimientos
específicos para su crecimiento. Las bacterias son aproximadamente el 80 % de agua y
el 20 % de material seco, de éste, aproximadamente el 90 % es orgánico y el 10 % es
inorgánico (tabla 3.2). Una fórmula orgánica simple que representa una célula
bacteriana es C5H7O2N . La mayoría de los elementos (macroelementos) en la
composición de la célula bacteriana incluyen C, H, N, O, P y S. Los elementos tales
como Ca, Fe, K, Mg y Na (microelementos) son requeridos en cantidades pequeñas para
las bacterias, y los elementos traza incluyen Co, Mn, Mo, Ni, y Zn son requeridos en
una cantidad relativamente pequeña. La adición de nutrientes a un tratamiento biológico
de aguas residuales industriales puede ser requerido para lograr la degradación de la
materia orgánica. En la tabla 3.2 se muestra la composición de una célula bacteriana.
Tabla 0.7 Composición de una célula bacteriana.
ELEMENTO COMPOSICIÓN
PROMEDIO
RANGO EN
COMPOSICIÓN
Carbón 50 45 – 55
Oxígeno 20 16 – 22
Nitrógeno 14 12 – 16
Hidrógeno 8 7 – 10
Fósforo 3 2 – 5
Azufre 1 0.8 – 1.5
Potasio 1
Sodio 1
Calcio 0.5
Cloro 0.5
Magnesio 0.5
Hierro 0.2
Elementos
traza
0.1
Donde ª Los rangos de los elementos son dados sólo para los macroelementos.
Fuente : (Gerardi, 2006)
40
La relación de C:N:P ha sido discutida en la literatura (Pinto Mariano, y otros, 2007;
Lee, y otros, 2007; Ferguson, y otros, 2003; Madigan, y otros, 2004; Strynar, y otros,
1999) asumiendo cada sistema con relaciones óptimas de C:N:P en función del tipo de
efluente que se trate, la concentración del carbón y de su disponibilidad y de la
habilidad de cada microorganismo para degradar los contaminantes.
3.5. Adaptación de los microorganismos
Cuando se trata de aguas residuales industriales, particularmente para la remoción de
compuestos orgánicos específicos, es necesario aclimatar la biomasa al agua residual.
La adaptación o aclimatación de una comunidad microbiana a un contaminante dado,
determina la rapidez con la que el compuesto puede ser transformado y/o mineralizado.
Esta adaptación puede ocurrir por 3 mecanismos: a) inducción o depresión de enzimas
específicas, b) cambios genéticos que deriven en nuevas capacidades metabólicas y c)
enriquecimiento selectivo de microorganismos capaces de transformar un compuesto de
interés.
El periodo de aclimatación se define como la duración de tiempo entre la adición de un
compuesto en un ambiente y una evidencia de su pérdida detectable. La aclimatación de
los microorganismos a los compuestos orgánicos es una fase importante en el proceso
de biodegradación, especialmente para los compuestos difíciles de biodegradar. Su
duración cuando los cultivos mixtos son expuestos a compuestos químicos nuevos e
inusuales, varía desde unas pocas horas hasta varias semanas o meses. La duración
depende del tipo de compuesto y un número de condiciones ambientales (Prieto Díaz, y
otros, 1999). La fase de aclimatación se considera que termina con el inicio del periodo
de la biodegradación. Muchos estudios realizados con compuestos tóxicos muestran que
incluso después de una extensa adaptación microbiana celular exhiben cinéticas de
crecimiento inhibitorias (Rozich, 1983; Rozich, y otros, 1986; D'Adamo, y otros, 1984).
3.6. Biodegradación de MTBE
Se ha reportado la biodegradación de MTBE por microorganismos de diferentes
orígenes (Bradley, y otros, 1999; Bradley, y otros, 2001; Fortin, y otros, 2001; Kane, y
otros, 2001; Landmeyer, y otros, 2001; Park, y otros, 1997; Salanitro, y otros, 1994). La
41
degradación aeróbica de MTBE ha sido observada en laboratorios con consorcios
microbianos (Fortin, y otros, 2001) y con cultivos puros (Hatzinger, y otros, 2001;
Francois, y otros, 2002). Durante el crecimiento con MTBE, algunos intermediarios de
la vía de degradación fueron detectados, ter-butil formiato (TBF), ter-butil alcohol
(TBA) 2-hidroxiácido butírico (HIBA) y acetona, como se muestra en la figura 3.11.
Varias actividades enzimáticas envuelven la vía de degradación del MTBE y fueron
estudiadas a nivel fisiológico: una MTBE/TBA monooxigenasa (Francois, y otros,
2002), una TBF esterasa y una acetona monooxigenasa (Francois, y otros, 2003).
Figura 0.12 Ruta metabólica propuesta para biodegradación aeróbica de MTBE
Fuente: (Francois, y otros, 2002).
42
La molécula de MTBE se caracteriza por la presencia de un enlace éter y un alto
impedimento estérico del carbono del grupo ter-butil enlazado al grupo metoxi. Los
éteres alquílicos son moléculas estables (ΔG0 de la formación del enlace éter = 360
kJ/mol) (White, y otros, 1996). La recalcitrancia del MTBE se atribuye a su estructura
química, específicamente al enlace éter y al átomo de carbono terciario son los
responsables de la dificultad en la biodegradación (Ostler, 1996). De lo anterior se
infiere que hay una alta demanda de energía para la degradación de MTBE que se
refleja por la baja eficiencia de producción de biomasa.
3.7. Degradación de BTEX
La degradación del benceno es similar a la de otros aromáticos. El benceno es digerido
por las dioxigenasa que provocan la ruptura del núcleo por hidroxilación de manera que
la molécula sea químicamente más accesible. Estas reacciones se presentan en las
figuras 3.12, 3.13 y 3.14.
Figura 0.13 Biodegradación microbiana del benceno hasta catecol.
Fuente: (Rittman, 1994).
La oxidación de los hidrocarburos produce ácidos grasos que son utilizados por las
bacterias o liberados al medio. Si este es el caso, el pH del medio disminuye, por lo que
puede utilizarse este parámetro para evaluar la degradación.
43
Figura 0.14 Biodegradación microbiana del tolueno.
Fuente: (Rittman, 1994).
Figura 0.15 Biodegradación del xileno.
Fuente: (Rittman, 1994).
44
La biodegradación de aromáticos disustituidos, produce ácido acético como producto
adicional, por lo que el medio donde se encuentre presente un contaminante de este tipo
presentará una disminución significativa del pH.
El ácido pirúvico, por su parte, entra como iniciador del ciclo de Krebs en las bacterias
degradadoras, con ayuda de la acetil coenzima A (Lehninger: Nelson, y otros, 2000).
3.8. Cinética microbiana
La relación entre el crecimiento celular y la utilización del sustrato puede ilustrarse con
un reactor batch. Si Cs representa la cantidad de sustrato soluble (en mg/L) y Cc
representa la cantidad de biomasa (en mg/L), la rapidez de consumo de sustrato es
dCs/dt, y la rapidez de crecimiento de biomasa es dCc/dt, ambos fenómenos pueden
representarse con las curvas que se muestran en la figura 3.15.
Figura 0.16 Etapas del crecimiento bacteriano como biomasa y de utilización de sustrato,
en función del tiempo.
La curva de biomasa está formada por varios segmentos que justifican un examen
minucioso. Los microorganismos tienen que aclimatarse primero a su ambiente y al
alimento disponible. Este periodo de aclimatación es llamado fase de retardo, y varía en
extensión dependiendo de la historia de los microorganismos sembrados. Si los
microorganismos están adaptados a un ambiente y sustrato similares, la fase de retardo
será muy breve. Una vez que se ha iniciado el crecimiento, continuará rápidamente. Las
células bacterianas se reproducen por fisión binaria, esto es, se dividen en segmentos
para formar dos nuevas células independientes entre sí. El tiempo de regeneración, o
45
tiempo requerido para que una célula madure y se separe, puede ser tan corto como 20
minutos, y depende también de factores ambientales y del suministro de sustrato.
Cuando está ocurriendo el máximo crecimiento, el comportamiento es de tipo
logarítmico, razón por la cual se denomina a este segmento de la curva fase logarítmica.
La rapidez de reproducción es exponencial, de acuerdo con la siguiente ecuación:
Ecuación 0.1
Donde N es el número de microorganismos producidos a partir de uno individual
después de n veces de regeneración.
El crecimiento máximo no puede continuar indefinidamente. El alimento disponible
puede agotarse, las condiciones ambientales pueden cambiar (por ejemplo,
sobrepoblación, acumulación de productos de desecho, etc.), y puede desarrollarse una
población de depredadores. Las células que son incapaces de obtener alimento de
fuentes externas inician el catabolismo endógeno, es decir, catabolizan el protoplasma
almacenado para mantener su energía. Otras células mueren, o se rompen liberando su
protoplasma, el cual se agrega al alimento disponible. Esta etapa se representa en la
figura 3.15 con el nombre de fase estacionaria y representa el tiempo durante el cual la
producción de nuevo material celular es aproximadamente igualado por muerte y
respiración endógena.
Mientras que en la fase estacionaria todavía existe algo de reproducción, la respiración
endógena y la muerte predominan en el cuarto segmento de la curva, denominado fase
endógena. En esta última fase, la biomasa decrece lentamente, acercándose
asintóticamente al eje de las abscisas.
El método más común para la cuantificación de biomasa es la prueba de sólidos
suspendidos. Cuando el agua residual contiene solamente material orgánico, esta prueba
debe ser bastante representativa, aunque no hay distinción entre células vivas y muertas.
La prueba de sólidos suspendidos volátiles es una prueba más adecuada cuando la
muestra de agua residual contiene una fracción medible de materiales inorgánicos
suspendidos. Ninguna de las dos pruebas exhibe la diferencia entre sólidos biológicos y
partículas orgánicas originalmente presentes en el agua residual.
46
Durante la fase de crecimiento logarítmico, la biomasa se incrementa de acuerdo con la
siguiente expresión:
Ecuación 0.2
Donde
dCc/dt = rapidez de crecimiento de la biomasa, en mg/Lt-1
.
Cc = concentración de biomasa en mg/L.
µ = constante de rápidez de crecimiento, en t-1
.
3.8.1. Modelo matemático de Monod
Si en un cultivo uno de los requerimientos esenciales para el crecimiento (sustrato y
nutrientes), estuviera presente sólo en cantidades limitadas, se agotaría primero y el
crecimiento cesaría. El modelo matemático de Monod (Monod, 1949) asume que la
rapidez de asimilación del sustrato, y en consecuencia la rapidez de producción de
biomasa, está limitada por la rapidez de reacción de las enzimas involucradas en el
compuesto alimenticio que está en menor cantidad con respecto a sus necesidades. La
ecuación de Monod es:
Ecuación 0.3
Donde:
µmáx = constante de rapidez máxima de crecimiento; t -1
Cs = concentración en la solución del sustrato limitante del crecimiento, mg/l de DBO,
DQO o COT
Ks = constante media de saturación, esto es, la concentración del sustrato limitante.
La rapidez de crecimiento de biomasa es una función hiperbólica de la concentración de
alimento.
47
ESTADO DEL ARTE
El petróleo es una mezcla compleja de hidrocarburos y otros compuestos orgánicos,
incluidos algunos constituyentes organometálicos, destacando complejos de vanadio y
niquel. El petróleo es recuperado de diferentes reservorios variando ampliamente en
composición y propiedades físicas. Sin embargo, es ampliamente reconocido que sirve
de sustrato para el crecimiento microbiano (Bushnell, y otros, 1941; Rhykerd, y otros,
1999), generándose productos del metabolismo microbiano (Ehrlich, 1995).
Se ha hecho una amplia variedad de estudios acerca de la biotransformación,
biodegradación y biorremediación de hidrocarburos del petróleo (Atlas, y otros, 1995;
Atlas, y otros, 1992; Becker, 1997; McClay, y otros, 2000; Prince, 1997; Rosenberg,
1993) y el interés en explorar organismos degradadores para aplicación en la limpieza
medioambiental se ha tornado en el centro de la microbiología del petróleo (Atlas, y
otros, 1981). Un tema común en la literatura reciente se enfoca en el análisis de los
factores, tales como nutrientes, estado físico del hidrocarburo, oxígeno, temperatura,
salinidad y presión, que influencian la velocidad de biodegradación de los
hidrocarburos, con un enfoque a la aplicación medioambiental (Atlas, y otros, 1981).
Los estudios metabólicos se han implementado en vías de biodegradación aerobias para
los alcanos, cicloalcanos e hidrocarburos aromáticos y policíclicos (Cerniglia, 1997;
Cerniglia, 1992; Juhasz, y otros, 2000; Kämpfer, y otros, 1993; Perry, 1984; Smith,
1990; Sutherland, 1992; Watkinson, y otros, 1990).
Los avances más significativos, a través del desarrollo y aplicación de técnicas
moleculares, son la comprensión del proceso de catabolismo de los hidrocarburos. Este
enfoque molecular ha contribuido a la caracterización en detalle de la estructura de la
membrana bacteriana (de Bont, 1998; Heipieper, y otros, 1994; Sikkema, y otros, 1995).
El aislamiento e identificación de microorganismos responsables de transformación de
hidrocarburos ha sido reconocido como un principio fundamental para su aplicación y
en la literatura están disponibles listas de organismos degradadores de hidrocarburos
(bacterias, levaduras, hongos y algas) (Atlas, y otros, 1981; Atlas, y otros, 1995; Leahy,
y otros, 1990; Rosenberg, 1992).
48
Una aplicación común de la microbiología del petróleo, abarca la remediación de
derrames de hidrocarburo (Prince, 1997; Prince, y otros, 1999; Swannell, y otros, 1999),
el tratamiento basado en humedales y fermentación (Geerdink, y otros, 1996; Jack, y
otros, 1994; Knight, y otros, 1999; Roy, y otros, 2000; Simon, y otros, 1999),
biofiltración de hidrocarburos volátiles (Ergas, y otros, 1999), recuperación mejorada de
petróleo con microorganismos (Banat, y otros, 2000; Donaldson, y otros, 1989) y
evaluación basada en comunidades microbianas (MacNaughton, y otros, 1999).
El tratamiento de derrames en costas y problemas asociados en remediación mar abierto
ha sido discutido en numerosos casos (Atlas, y otros, 1992; Atlas, y otros, 1995; Bartha,
1986; Prince, 1993; Swannell, y otros, 1996). Otra aplicación práctica incluye el
tratamiento de residuos de refinería (Atlas, y otros, 1992; Bartha, 1986).
La recuperación de hidrocarburos pesados, facilitada por microorganismos, fue sugerida
en la de cada de los 20’s y retomada en los 80’s (Donaldson, y otros, 1989).
Las bacterias con enzimas capaces de metabolizar petróleo se han utilizado para el
desarrollo de biosensores (Daunert, y otros, 2000). Estos sistemas se han aplicado en el
monitoreo ambiental de concentración y toxicidad de contaminantes durante la
implementación de procesos de remediación.
La caracterización del tipo de hidrocarburo presente en un recurso acuífero ha sido
abordado por diversos autores. Prieto Díaz y col. propusieron una metodología sencilla,
asequible y rápida para identificar el tipo de hidrocarburo presente en agua contaminada
realizando una extracción con CCl4, eliminando húmedad, rotoevaporando hasta
sequedad, para luego solubilizar en hexano el soluto obtenido, de esta forma a través de
espectroscopia de UV-vis se realiza la discriminación del tipo de contaminante (Prieto
Díaz, y otros, 1999).
Huang y col. realizaron un estudio sobre la degradación de ácidos nafténicos, en un
reactor batch y en un reactor continuo, utilizando un consorcio bacteriano desarrollado
en laboratorio, obteniendo una velocidad de degradación de 209 mg/Lh con un tiempo
de residencia de 0.15h (Huang, y otros, 2011).
49
Takahata y col. estudiaron la biodegradación por atenuación natural de agua subterránea
contaminada con benceno, tolueno y xilenos, tratado con bombeo y aireación, durante
un período de 73 semanas; obteniendo a través de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR, por sus siglas en inglés) la identificación de los microorganismos nativos
(Takahata, y otros, 2006).
Luo y col. produjeron un consorcio microbiano a través del enriquecimiento de
muestras de agua de mar del puerto de Xiamen, China, contaminadas con una mezcla
de hidrocarburos policíclicos aromaticos. Lograron identificar y aislar 3 diferentes tipos
de bacterias pertencientes a los géneros Ochrobactrum, Stenotrophomona y
Pseudomona. Después probaron el consorcio utilizando como sustrato modelo
benzo(a)pireno, obteniendo una eficienca de degradación del 44.07% (Luo, y otros,
2009).
Auffret y col. evaluaron la capacidad degradadora de un consorcio bacteriano del
género Rhodococcus sobre una mezcla de hidrocarburos, gasolina y diesel, obteniendo
eficiencias de 43 y 73% (Auffret, y otros, 2009).
González y col. estudiaron el efecto de surfactantes sobre el crecimiento y la
velocidad de degradación microbiano sobre un hidrocarburo policíclico aromático, de
un consorcio obtenido de una muestra de suelo contaminado con petróleo. Obuvieron
eficiencias cercanas al 30% de disminución de la toxicidad (González, y otros, 2011).
Pactao y col. evaluaron dos consorcios microbianos para degradar una mezcla de
hidrocarbuos aromáticos y alifáticos. La evaluación fue realizada en condiciones
aerobias utilizando como sustratos modelo de alifáticos n-octano y n-decano y como
sustratos modelos de aromaticos tolueno, etilbenceno y p-xileno. Las eficiencias de
degradación para alifáticos fue de 17% y para arómaticos de 38% en un período de 72
horas de tratamiento (Pactao Bacosa, y otros, 2011).
Ma y col. analizaron la evolución de la calidad del agua contaminada por petróleo en el
río Malian, en China, durante 20 años (Ma, y otros, 2011).
Lizardi y col. evaluaron la velocidad de transferencia de hexadecano y de oxígeno
simultáneamente en un biorreactor utilizando un consorcio bacteriano con capacidad de
50
degradar hidrocarburos. Lograron una reducción del 33% en el consumo de energía
neta durante 7 días de tratamiento (Lizardi-Jiménez, y otros, 2012).
51
CAPITULO IV. METODOLOGÍA
La problemática actual en el país referente a la contaminación de aguas con
hidrocarburos a generado el desarrollo de tecnologías que eliminen efectivamente la
concentración de hidrocarburos en el agua subterránea. Este problema se agrava con el
paso de los años debido a la enorme cantidad de franquicias petroleras que instalan
gasolineras en suelos no aptos para estos propósitos, por un lado y a la falta de una
normatividad más severa para regular la forma en que se deben construir.
Además de los predios sobre los que se ubican refinerías las cuales a falta de
mantenimiento o a las condiciones del equipo generan contaminación sobre el suelo y el
agua debido a fugas y derrames. Sin embargo, es evidente por trabajos previos que
existe flora nativo en el subsuelo que es capaz de efectuar la degradación de estos
contaminantes; por tanto, tomando en cuenta estos hechos, se pretende desarrollar un
proceso en el cual, propiciando las condiciones de desarrollo óptimo de dicha flora
nativa, se puede conseguir una limpieza efectiva y al mismo tiempo degradar los
hidrocarburos presentes en estas aguas.
Desarrollar un proceso bioquímico que elimine y degrade hidrocarburos de fracción
media de aguas subterráneas contaminadas en un biorreactor que sea capaz de efectuar
la degradación de compuestos del petróleo.
Mediante un sistema de aireación, acoplado con un tratamiento biológico (biorreactor)
para lograr la eliminación y degradación de los componentes de diesel y del petróleo
que contamine aguas subterráneas.
Establecer una cinética de biodegradación de estos componentes durante el proceso.
El trabajo experimental se dividió en dos etapas, la primera fue la adaptación del
consorcio bacteriano y la segunda la biodegradación del sustrato en medio acuoso. En la
Figura 0.17 se muestran dichas etapas. Se utilizó una muestra de agua contaminada
obtenida de un predio contaminado (a la cual se le denomino muestra de agua real) y
dos muestras de agua que fueron contaminadas con diesel y petróleo (a las cuales se les
denomino sintéticas).
52
Figura 0.17 Etapas consideradas durante el trabajo experimental.
4.1. Adaptación del consorcio
Es indispensable, para el crecimiento de un microorganismo, que en el medio existan
los nutrientes necesarios para su desarrollo. Estos nutrientes no solo abarcan sustratos
orgánicos, sino también sales inorgánicas, así como condiciones adecuadas de
temperatura, pH y oxígeno. Considerando lo anterior, se preparó una solución de sales
minerales denominada medio mínimo. En la figura 4.2 se muestra el procedimiento para
la preparación de dicha solución.
Figura 0.18 Preparación del medio mínimo o solución de sales minerales.
ETAPAS DE EXPERIMENTACIÓN
ADAPTACIÓN DEL CONSORCIO
Conformación de consorcio
Selección de sustrato (muestras sintéticas)
Caracterización del agua
BIODEGRADACIÓN
Caracteristicas de l biorreactor
Condiciones de operación
Técnicas analiticas e intrumentales de
seguimeinto
Agua destilada
Sales minerales escenciales
Ajuste de pH a 7.2
Solución de sales minerales
NaCl
CaCl2
FeCl2
NH4Cl
MgCl
KH2PO4
Elementos traza
53
La formulación del medio mínimo se muestra en la tabla 4.1. Una vez preparado el
medio, se ajusta a pH de 7.2 mediante la adición de HCl 0.01N, dentro del rango óptimo
para el desarrollo del consorcio bacteriano, el cual va de 6.5 a 7.5 (Borkowski, y otros,
2009). Posteriormente se esterilizó en autoclave a 121º C, a una presión de 15 kg/cm2
por 15 minutos.
Tabla 0.8 Composición del medio mínimo o solución de sales minerales utilizada.
Medio mínimo Solución de elementos traza
FeCl2 0.1%...........................1.2 mL
KH2PO4 …………………0.5 g
MgCl …………………….0.4 g
NaCl ……………………..0.4 g
NH4Cl …………………....0.4 g
CaCl2 …………………….0.05 g
Solución elementos traza …1.0 mL
Agua destilada …………..1000 mL
ZnSO4………………... 10 mg
MnCl2 ………………… 3.0 mg
H3BO4………………… 30 mg
CoCl2 ............................. 20 mg
CuCl2 …………………. 1.0 mg
NiCl2 ………………….. 2.0 mg
Na2MoO4……………… 3.0 mg
El medio mínimo o solución de sales minerales esenciales fue contaminada en una proporción de 9:1 con
respecto al sustrato considerado (diesel o petróleo), manteniéndose en agitación a 20 rpm a 30ºC por un
periodo de 72 horas. Posteriormente se separó solo la fase acuosa. Esta fase se consideró el 100%,
haciendo diluciones con la solución de sales minerales a 70, 50, 30 y 10% respectivamente. En cada
dilución se agregó 1 g de soporte sólido con el consorcio, el cual se colocó en papel filtro, como se
muestra en la figura 4.3.
Figura 0.19 Activación del consorcio microbiano.
4.1.1. Preparación de soluciones modelo
En la figura 4.4 se esquematiza el procedimiento empleado para la preparación de las
soluciones modelo con petróleo y diesel mexicano. Estas soluciones se caracterizaron
para determinar la contaminación inicial a través de la medición de Demanda Química
de Oxígeno (DQO), Carbono Orgánico Total (COT), Carbono Inorgánico (CI) y
Carbono Total (CT).
54
El acondicionamiento del consorcio fue monitoreado por medio de la producción de
CO2 y el consumo de O2. El monitoreo de CO2 se realizó mediante la titulación de una
solución de NaOH 0.1N con HCl 0.1 N en presencia de fenolftaleína bajo el siguiente
principio:
SUSTRATO + BACTERIAS BIOMASA + CO2 + H2O
CO2 + NaOH NaHCO3
El CO2 producto de la mineralización del sustrato por el consorcio bacteriano es
adsorbido en la solución básica.
Figura 0.20 Preparación de soluciones modelo para adaptación y biotratamiento de sustrato.
En la figura 4.5 se presenta el método para realizar el monitoreo de la producción de
CO2.
Figura 0.21 Monitoreo de producción de CO2.
Frascos sellados hermeticamente se colocaron 15 mL de NaOH
En cada frasco se coloco un tubo de ensayo con 5 mL de agua contaminada.
Se titulo por triplicado alicuotas de 5 mL de NaOH por 5 días con
HCl 0.1 N
Solución de
sales minerales
Adición de dieselmexicano una parte
de diesel por nueve partes de
solución de sales
Agitación a 20 rpm
por 72 horas a 30ºc
Extracción de fase
acuosa
Medición DQO, COT, CI, CT
Adición de petroleo una parte de
petroleo por nueve partes de solución
de sales
55
El monitoreo del consumo de oxígeno se efectúo a través de respirometría. Se colocó
dentro de un frasco 10 mL de agua contaminada junto con un tubo de ensayo con
cristales de NaOH, el CO2 generado por la mineralización del sustrato se adsorbió
directamente por los cristales básicos, registrándose un desplazamiento en el nivel del
líquido manométrico como se aprecia en la figura 4.6; a) En un tubo de ensaye se
colocan cristales de NaOH; b) agua contaminada con hidrocarburos e inoculada con
consorcio bacteriano y c)fluido manómetrico, la diferencia en altura permite la
cuantificación de consumo de oxígeno.
Figura 0.22 Esquema para el monitoreo del consumo de oxígeno utilizado.
56
4.1.2 Recolección y caracterización de muestra real.
Dentro de las muestras consideradas para el biotratamiento, se utilizo una muestra de
agua real proveniente de un emplazamiento en el valle de México (figura 4.7), la cual se
obtuvo bajo el esquema mostrado en la figura 4.8, de acuerdo a la norma NMX-AA-
003-1980.
Figura 0.23 Emplazamiento del valle de México de donde fue recolectada la muestra de agua real.
Figura 0.24 Esquematización de la toma de muestra real en un predio contaminado en el valle de
México.
Toma de muestra
de predio
Conservación de muestra a
4ºc en frasco ambar para
transporte a laboratorio
Caracterización de agua:
Cloruros
Dureza de calcio
Dureza de magnesio
Dureza total
Conductividad
pH
Caracterización de tipo de
contaminación
57
Previo a realizar el tratamiento, esta muestra de agua fue caracterizada determinando los
parámetros mostrados en la figura 4.8. La caracterización fisicoquímica del agua se
realizo de acuerdo a la normatividad vigente, tal como se muestra en la tabla 4.2.
Tabla 0.9 Parámetros fisicoquímicos, normas mexicanas y técnicas analíticas
empleadas en la caracterización del agua contaminada.
PARÁMETRO NORMA MÉTODO EQUIPO
pH NMX-AA-008-SCFI-
2001
Potenciométrico Potenciómetro (marca:
Corning)
Cloruros NMX-AA-073-SCFI-
2001
Titrimétrico Balanza analítica (marca:
Sartorius,
modelo: TE1245)
Dureza de calcio --- Titrimétrico Balanza analítica (marca:
Sartorius,
modelo: TE1245)
Dureza de
magnesio
--- Titrimétrico Balanza analítica (marca:
Sartorius,
modelo: TE1245)
Dureza total NMX-AA-072-SCFI-
2001
Titrimétrico Balanza analítica (marca:
Sartorius,
modelo: TE1245)
Conductividad NMX-AA-093-SCFI-
2000
Conductimétrico Potenciómetro (marca:
Corning)
Demanda química
de oxígeno
NMX-AA-30-SCFI-2001 Espectrofotométri
co
Termo-reactor (marca:
Hach);
Espectrofotómetro
(marca: Hach,
modelo: DR 2700)
Nitrogeno total NMX-AA-026-SCFI-
2001
HACH Termo-reactor (marca:
Hach);
Espectrofotómetro
(marca: Hach,
modelo: DR 2700)
Fosforo total NMX-AA-029-SCFI-
2001
HACH Termo-reactor (marca:
Hach);
Espectrofotómetro
(marca: Hach,
modelo: DR 2700)
Sólidos
suspendidos
totales
NMX-AA-034-SCFI-
2001
Peso seco Balanza analítica (marca:
Sartorius,
modelo: TE1245); estufa
eléctrica (marca:
Termolyne, modelo:)
Sólidos
suspendidos
volátiles
NMX-AA-034-SCFI-
2001
Peso seco Balanza analítica (marca:
Sartorius,
modelo: TE1245); mufla
(marca:
Furnance, modelo:
48000)
Carbono orgánico
total
Oxidación térmica Analizador TOC
(marca:General Electric,
serie:)
58
La caracterización del tipo de contaminación presente en la muestra de agua real, se
realizo a través del método descrito en la figura 4.9 (Prieto Díaz, y otros, 1999).
Figura 0.25 Método utilizado para caracterizar el tipo de contaminación por hidrocarburos presente en la
muestra de agua real.
Fuente: (Prieto Díaz, y otros, 1999)
4.2. Metodología de biodegradación.
Después de la adaptación del consorcio microbiano, se procedió al biotratamiento.
Para llevar a cabo este proceso se construyó un sistema consistente de biorreactores de
vidrio de fase libre, con capacidad de 0.5 L, los cuales se airearon hasta saturación con
bombas de marca ELITE 800 con capacidad de 65 L/h, en un sistema isotérmico que
permitió mantener la temperatura fija en 20, 30 y 40 ºC, como se muestra en la figura
4.10.
Muestra de 250 mL de agua
En embudo separador agregar 5mL CCl4
Agitar vigorosamente 1 minuto
Repetir 3 veces la operacion , desechar
fase acuosa (remanente).
Hacer la operación hasta completar 1 L de
muestra.
Agregar 5 g sulfato de sodio anhidro, filtrar y
rotoevaporar a sequedad.
Disolver producto seco en hexano o heptano.
Espectro UV-vis.
59
Figura 0.26 Sistema empleado en la realización de la biodegradación.
El biorreactor operó de manera intermitente, con un suministro continuo de aire para
garantizar la saturación de oxigeno.
La operación se realizo de la siguiente manera:
1. Se cargó cada biorreactor con la muestra de agua real y con las soluciones
sintéticas de agua contaminada con diesel y con petróleo hasta un volumen de
495 mL;
2. Se estabilizó la temperatura del sistema con un baño ThermoScience;
3. Se inocularon 5 mL de consorcio adaptado, realizando la cuenta microbiana en
el momento de la inoculación (relación de inoculación 1:100);
4. Se mantuvieron las condiciones de temperatura y aireación por un período de 5
días, monitoreando los parámetros mostrados en la figura 4.11.
BIORREACTOR
HOMOGENEO
BATCH
V= 0.5 L
QAIRE=65 L/h
T= 20, 30 Y 40 ºC
495 mL FASE
ACUOSA
5 mL INÓCULO
DQO
COT
CI
CT
TPH
UV-VIS
IR-ATR
GC-MASS-FID
CONTEO EN
PLACA
TURBIDIMETRÍA
60
Figura 0.27 Proceso de biotratamiento utilizado.
61
CAPITULO V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Adaptación del consorcio.
Durante la adaptación a un sustrato, el crecimiento bacteriano es sostenido, sin cambios
(Atlas, y otros, 2002). Esto se refleja en la actividad metabólica del consorcio, ya que ni
el consumo de oxígeno ni la generación de bióxido de carbono presenta un cambio
durante esta etapa. Las figuras 5.1 y 5.2 muestran el tiempo en el que el consorcio pasó
por esta etapa.
Figura 0.28 Volumen de oxígeno consumido por el consorcio bacteriano utilizado.
El primer paso para la adaptación de un microorganismo es la producción de
biosurfactantes por parte de la membrana celular, con esto aumenta la biodisponibilidad
del sustrato (Barkay, y otros, 1999). Durante esta etapa, la membrana celular genera
moléculas de biosurfactante que envuelven el sustrato, en este caso los hidrocarburos,
formando micelas, permitiendo el ingreso del sustrato al interior celular (Hofritcher,
2000 Germany).
0
50
100
150
200
250
300
350
0 1 2 3 4 5 6 7 8
V O
2(m
L)
Tiempo (dias)
Diesel Petróleo Real
Agua contaminada con:
62
Figura 0.29 Monitoreo de crecimiento bacteriano por absorción de CO2 en solución alcalina.
Cuando esta etapa ha sido superada, es decir, cuando el consorcio ha logrado sintetizar,
producir e introducir el sustrato, comienza la degradación enzimática. La capacidad
degradativa de un microorganismo hacia una familia de sustratos viene dado por la
presencia de un grupo de enzimas de la familia del citocromo p450 (Van Beilen, y otros,
2007).
Una vez, que el sustrato ingresó al interior del microorganismo, las enzimas
monooxigenasas comienzan a disminuir el tamaño de la molécula de sustrato para que
este a su vez, se integre al proceso respiratorio de la célula, es decir al ciclo de los
ácidos tricarboxílicos (Hofritcher, 2000 Germany).
Es necesario la integración de iones fosfato, sulfato, hierro y amonio, para que el
proceso de degradación y el ciclo de los ácidos tricarboxílicos se efectué de manera
completa. Esta es la razón por la que se preparó una solución de sales minerales, ya que
estas son requeridas en cantidades mínimas. Dado que todas las reacciones del proceso
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 1 2 3 4 5 6
nC
O2(m
ol)
Tiempo (dias)
Diesel Petróleo Real
Agua contaminada con:
63
de biodegradación son enzimáticas, la participación de dichas sales es vital para el
aporte o trasporte de energía durante el proceso. En la tabla 5.1 se enlistan algunas
enzimas involucradas en la biodegradación de hidrocarburos del petróleo (Zimmer, y
otros, 1996).
Tabla 0.10 Enzimas involucradas en la biodegradación de hidrocarburos del petróleo.
ENZIMAS SUSTRATOS MICROORGANISMOS REFERENCIAS
Metano
monooxigenasas
solubles
C1-C8, alcanos,
alquenos y cicloalcanos.
Methylococcus
Methylosinus
Methylocystis
Methylomonas
Methylocella
(McDonald, y otros,
2006)
Metano
monooxigenasas
particuladas
C1-C5 (halogenados),
alcanos y cicloalcanos.
Methylobacter
Methylococcus
Methylocystis
(McDonald, y otros,
2006)
AlkB relacionados
Alcano hidroxilasas
C5-C16, alcanos, ácidos
grasos, alquil bencenos,
cicloalcanos y
homologos.
Pseudomonas
Burkholderia
Rhodococcus
Mycobacterium
(Jan, y otros, 2003)
P450 eucariontico C10-C16, alcanos y
ácidos grasos.
Candida maltosa
Candida tropicalis
Yarrowia lipolytica
(Iida, y otros, 2000)
Sistema bacterial de
oxigenasas p450
C5-C16, alcanos y
cicloalcanos.
Acinetobacter
Caulobacter
Mycobacterium
(Van Beilen, y otros,
2006)
Dioxigenasas C10-C30, alcanos. Acinetobacter sp. (Maeng, y otros, 1996)
Fuente: (Zimmer, y otros, 1996)
5.2. Caracterización de muestra real
Cuando se realizó la recolección del agua se pudo percibir que ésta tenía olor a
hidrocarburos, indicando la presencia de estos en fase acuosa. Además el agua era de
tonalidad verde, indicando con ello la presencia de organismos fotolitoautotrofos
(algas); por otro lado, se observó un burbujeo suave en el manto freático síntoma de la
realización de digestión anaerobia. Sin embargo no sólo los procesos de acidogénesis y
metanogénesis están involucrados, existen muchos procesos simultáneos en un sistema
en donde se tiene principalmente la presencia de sustrato, nutrientes, luz solar,
condiciones tanto aerobias, microaerobias, anóxicas y anaerobias. Por lo que en el
medio ambiente diferentes tipos de microorganismos se encuentran conviviendo, este
hecho determina el establecimiento de una serie de interacciones que posee diversos
grados de complejidad. Las relaciones entre poblaciones mixtas pueden ser
favorecedoras, perjudiciales o indiferentes (Pactao Bacosa, y otros, 2011).
64
Los resultados de la caracterización de la muestra de agua real se muestran en la tabla
5.2. Los valores más significativos son aquellos que indicaron si era necesario
acondicionar la muestra para permitir el desarrollo del consorcio bacteriano.
Tabla 0.11 Resultados de la caracterización de la muestra de agua real.
PARÁMETRO UNIDAD VALOR
pH Unidades de pH 6.93
Cloruros mg/L 378.13
Dureza de calcio mg/L 355
Dureza de magnesio mg/L 125
Dureza total mg/L 480
Conductividad µS 1051
Demanda química de oxígeno mg/L 1868
Nitrógeno total mg/L ND
Fosforo total mg/L 0.21
Sólidos suspendidos totales mg/L 34.6
Sólidos suspendidos volátiles mg/L 10.4
Carbono orgánico total mg/L 370
De acuerdo a los resultados obtenidos, se acondiciono la muestra de agua real
agregando únicamente sales de nitrato y fosfato. El pH se encontró en el rango de
desarrollo del consorcio bacteriano, entre 6.5 y 7.5 (Borkowski, y otros, 2009), por lo
que no fue necesario ajustarlo.
La caracterización del tipo de contaminación presente en la muestra de agua real
representó un reto. El método seguido para identificar el tipo de contaminación presente
es el señalado por Prieto Díaz y col. (Prieto Díaz, y otros, 1999), con la variación de que
no se roto evaporó hasta sequedad, sino que se optó por eliminar este paso y disolver en
hexano el extracto obtenido, para evitar pérdidas de hidrocarburos presentes por el
efecto del calor. El espectro UV-visible obtenido siguiendo dicha metodología se
muestra en la figura 5.3.
65
Figura 0.30 Espectro UV-vis de la muestra de agua real.
La relación de los valores de absorbancia en las longitudes de onda a 228 y 256 nm,
permite entrar en una tabla propuesta por Prieto Díaz, con el fin de identificar el tipo de
contaminación. En la tabla 5.3 se muestran los resultados obtenidos y en la tabla 5.4 se
muestra la selección del tipo de contaminación.
Tabla 0.12 Identificación del tipo de contaminación presente en la muestra de agua real.
LONGITUD DE ONDA (NM) ABSORBANCIA
228 0.871
256 0.580
R=Abs228/Abs254 1.5
Tabla 0.13 Valores de referencia de R para tipos de hidrocarburos contaminantes.
TIPO DE HIDROCARBURO RANGO DE R
FUEL OIL Y PETRÓLEOS COMBUSTIBLES
LIGEROS 1.5 – 1.7
Crudo 1.7 – 2.0
Aceites lubricantes 2.6 – 3.6
Diesel 4.9 – 7.7
Keroseno 11.3 – 12.3
Fuente: (Martínez de villa, y otros, 1995 Jun 5-9)
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 200 400 600 800 1000
Ab
sorb
anci
a
Longitud de onda (nm)
66
5.3. Biodegradación.
Los resultados de la degradación de muestra real se muestran en la figura 5.4 y 5.5. La
disminución de la demanda química de oxigeno (DQO) confirma la utilización de los
contaminantes.
Figura 0.31 Disminución de la demanda química de oxígeno en el agua real, posterior a la inoculación
del consorcio bacteriano.
Figura 0.32 Porcentaje de remoción de materia organica susceptible de oxidación química obtenido por
el consorcio bacteriano.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
DQ
O (
mg/
L)
Tiempo (días)
MUESTRA REAL
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20
%R
EMO
CIÓ
N
Tiempo (días)
%REMOCIÓN
67
La tasa máxima de remoción se alcanza entre el quinto y el sexto día. Después de este
período de tiempo, el decrecimiento del sustrato disponible adopta un comportamiento
asintótico. En el sexto día se alcanzo un porcentaje de remoción del 80%.
En el agua real, además de los microorganismos inoculados, también se encuentran
presentes microorganismos autóctonos, los cuales pueden contribuir de manera positiva
o negativa con la velocidad y tasa de degradación (Reinhard, y otros, 1984; Barker J., y
otros, 1986; Major D. W., 1988; Grbic-Galic, y otros, 1987; Haag, y otros, 1991;
Kazumi, y otros, 1997). Algunas de las sustancias que secretan estos microorganismos
pueden facilitar el metabolismo de los contaminantes para otros organismos o inhibir su
actividad. Identificar la capacidad de biotrasformación de los microorganismos nativos,
es una clave fundamental en la formulación de las estrategias para la aplicación de un
bioproceso (Vroblesky, y otros, 1994; Borden, y otros, 1995).
En la figura 5.6 se señala la disminución del DQO en función del tiempo de tratamiento,
de cada una de las muestras empleadas. El porcentaje de biodegradación para cada
sustrato se muestra en la figura 5.7.
Figura 0.33 Disminución del DQO en las muestras de agua sintéticas y en la muestra de agua real.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 1 2 3 4 5 6
DQ
O (
mg/
L)
Tiempo (días).
Real
Diesel
Petroleo
Referencia
68
Figura 0.34 Porcentaje de biodegradación de cada sustrato estudiado.
La facilidad de biodegradación de cada uno de los sustratos depende de la estructura y
composición de cada uno de los contaminantes presentes.
De las distintas familias de hidrocarburos, los n-alcanos y los alcanos ramificados de
cadena intermedia (C10-C20) son los sustratos más fácilmente degradables por los
microorganismos, y que por lo tanto tienden a ser eficazmente biodegradados.
Sin embargo, los alcanos de cadena larga (>C20) son más difíciles de degradar debido a
su elevado peso molecular y su baja solubilidad en agua.
Los cicloalcanos, por norma general, se degradan más lentamente que los n-alcanos y
los alcanos ramificados.
Así mismo los hidrocarburos poliaromáticos que contienen de 2 a 3 anillos aromáticos
pueden ser biodegradados eficazmente en condiciones óptimas, mientras que los que
tienen 4 anillos, y especialmente, los de 5 o más anillos bencénicos presentan una
mayor recalcitrancia inherente y una baja solubilidad (Aycachi Inga, y otros, 2008;
Vignesh, y otros, 2011; Fortin, y otros, 1997; Langworthy, y otros, 1998).
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6
%B
IOD
EGR
AD
AC
ION
Tiempo (días).
Real
Diesel
Petroleo
69
El diesel es el sustrato que se biodegrado mas fácilmente debido a las estructuras
presentes. En la tabla 5.5 se muestran los análisis de IR-ATR para cada uno de los
sustratos al inicio y al final del tratamiento.
En las muestras iniciales se encuentran presentes los picos característicos de los enlaces
CH, CH2 y CH3, entre las regiones de 2950 y 3000 cm-1
, propios de las vibraciones C-H
(Lafont J., y otros, 2011).
La ausencia de las bandas en esta región, permiten suponer una biodegradación de los
contaminantes mayor al 90%, lo cual es coincidente con los resultados obtenidos a
través del seguimiento por DQO.
En los espectros al final del tratamiento, se muestra también el de agua destilada. La
aplicación de IR permitió confirmar de manera cualitativa la capacidad biodegradativa
del consorcio utilizado.
70
Tabla 0.14 Espectros de IR-ATR de las muestras al inicio y final del tratamiento.
MUESTRA INICIAL (DÍA 0) MUESTRA FINAL (DÍA 3)
Muestra
Real
Muestra
sintética
con
diesel
Muestra
sintética
con
petróleo
La disminución de la concentración de aromáticos se monitoreo mediante
espectroscopia de UV-visible. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 5.8 y
5.9. La presencia de aromáticos se pone de manifiesto por el pico presente entre 250 –
300 nm.
01000 2000 3000 4000 5000
Wavelength(cm-1)
0 1000 2000 3000 4000 5000
Wavelength (cm-1)
Destilada
Aguafinal
01000 2000 3000 4000 5000
wavelength(cm-1) 0 1000 2000 3000 4000 5000
Wavelength(cm-1)
DESTILADA
Aguafinal
01000 2000 3000 4000 5000
wavelength (cm-1) 0 1000 2000 3000 4000 5000
Wavelength(cm-1)
Destilada
AGUAFINAL
71
Figura 0.35 Decremento de la concentración de compuestos aromáticos de la muestra contaminada con
diésel (región de 250 a 300 nm).
Figura 0.36 Variación en la concentración de compuestos aromáticos en muestra contaminada con
petróleo, en la región entre 250 a 300 nm.
La disminución de la cantidad de aromáticos en la muestra contaminada con diesel es
uniforme en el tiempo, mientras que en el caso de la muestra contaminada con petróleo
hay variaciones. Cuando se produce ruptura de algún compuesto con más de un núcleo
aromático por parte de los microorganismos, la concentración de dicho compuesto
aumenta, es decir, si previamente existía 1 mol de un compuesto poliaromático, ahora
existirán n moles de monoaromáticos (Janbandhu, y otros, 2011; González, y otros,
2011).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 200 400 600 800 1000
Ab
sorb
anci
a
Longitud de onda (nm)
Diesel dia 0
Diesel dia 1
Diesel dia 2
Diesel dia 3
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 200 400 600 800 1000
Ab
sorb
anci
a
Longitud de onda (nm)
Petroleo dia 0
Petroleo dia 1
Petroleo dia 2
Petroleo dia 3
72
Los resultados obtenidos a través de carbono orgánico total, carbono inorgánico y
carbono total se muestran en las figuras 5.10 y 5.11. Este parámetro permite establecer
la cantidad de materia orgánica presente en el agua contaminada inicial.
Figura 0.37 Variación de IC, TOC, y TC en la muestra contaminada con diesel.
Figura 0.38 Variación de IC, TOC, y TC en la muestra contaminada con petróleo.
El incremento de la cantidad de carbono orgánico total se debe al crecimiento de los
microorganismos en la muestra. Esto sucede a expensas de la materia orgánica
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 1 2 3
mg/
L
Tiempo (días)
IC
TOC
TC
0
5
10
15
20
25
30
35
0 1 2 3
mg/
L
Tiempo (días)
IC
TOC
TC
73
disponible, es decir el hidrocarburo contaminante, por lo que hay una disminución en la
cantidad de carbono inorgánico a lo largo del tratamiento. El incremento de la materia
orgánica se corresponde con el crecimiento de la población microbiana (figura 5.12 y
5.13).
Figura 0.39 Crecimiento microbiano en la muestra contaminada con diesel. El desarrollo microbiano se
incrementa con la temperatura.
Figura 0.40 Crecimiento microbiano en la muestra contaminada con petróleo. El desarrollo microbiano
se incrementa con la temperatura.
0.00E+00
2.00E+08
4.00E+08
6.00E+08
8.00E+08
1.00E+09
1.20E+09
1.40E+09
1.60E+09
1.80E+09
2.00E+09
0 1 2 3
UFC
/mL
Tiempo (días)
Diesel 20ºC
Diesel 30ºC
0.00E+00
1.00E+08
2.00E+08
3.00E+08
4.00E+08
5.00E+08
6.00E+08
7.00E+08
8.00E+08
0 1 2 3
UFC
/mL
Tiempo (días)
Petroleo 20ºC
Petroleo 30ºC
74
El desarrollo microbiano mejora con el incremento de la temperatura de tratamiento,
siempre que se encuentre dentro del rango de desarrollo. Los cromatogramas de la
biodegradación de hidrocarburos se muestran en las figuras 5.14 y 5.15.
Figura 0.41 Cromatogramas obtenidos durante la biodegradación de las muestras sintéticas de
agua contaminadas con diesel.
Figura 0.42 Cromatogramas obtenidos durante la biodegradación de las muestras sintéticas de agua
contaminadas con petróleo.
Día 1 Día 0
Día 2 Día 3
Día 0 Día 1
Día 2 Día 3
75
En la tabla 5.6 se obtienen las ecuaciones de ajuste para determinar el contenido de
hidrocarburos totales a partir de la curva de referencia.
Tabla 0.15 Ecuaciones de referencia obtenidos a partir de cromatogramas de diesel (ver anexo A). NÚMERO DE
CARBONOS ECUACIÓN R2
HCtotal Y=337.12X-429.76 0.9954
C12 Y=371.32X-40.283 0.9879
C16 Y=351.96X-22.385 0.9761
C17 Y=358.25X-36.499 0.9750
C18 Y=382.88X-12.846 0.9433
C19 Y=367.93X-18.632 0.9620
C20 Y=394.3X-17.363 0.9377
C21 Y=360.24X-8.4409 0.9738
C22 Y=381.23X-10.447 0.9670
C23 Y=436.01X-10.82 0.9251
En la figura 5.16 se muestra la disminución en la concentración de hidrocarburos totales
durante la biodegradación, seguido a través de cromatografía de gases. La concentración
obtenida a través de este método directo y de la medición indirecta de DQO coincide,
señalando una tasa de biodegradación del 95.8% para el diesel y del 93.8% para el
petróleo (figura 5.17).
Las diferencias en las tasas de degradación obtenidas en cada uno de los sustratos,
obedecen a la naturaleza de cada uno de estos. Los resultados también coinciden con la
figura 5.6, donde la misma tendencia fue observada.
76
Figura 0.43 Disminución de la concentración de hidrocarburos en las muestras sintéticas de petróleo y
diesel.
Las fracciones que se degradaron (figura 5.18 y 5.19) en el caso del diesel, las
que representaron mayor dificulta fueron las correspondientes a C18, C21, C22 y C23 y
en el caso del petróleo al C22 y C23. Esto obedece a la estructura de las fracciones
presentes, lo que incrementó la dificultad para que los microorganismos los
degradadarán.
Figura 0.44 Porcentaje de biodegradación obtenido. La tasa de biodegradación fue mayor en el caso del
sustrato diesel que en el petróleo.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
0 1 2 3
mg/
L H
idro
carb
uro
s to
tale
s
Tiempo (días)
Conc. diesel
Conc. petroleo
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3
%B
iod
egr
adac
ión
Tiempo (días)
%Biodegradacion diesel
%Biodegradación petroleo
77
Figura 0.45 Disminución de la concentración de cada fracción de diesel durante la biodegradación.
El proceso de biodegradación bacteriano se caracteriza por que los sustratos complejos
son fraccionados en cadenas simples y posteriormente metabolizados. En las figuras
5.18 y 5.19 se evidencia este paso.
Figura 0.46 Disminución de la concentración de cada fracción de petróleo durante la biodegradación.
En el caso del petróleo, la prevalencia de una pequeña cantidad de C23 probablemente
se deba al grado de complejidad de componentes hidrocarbonados de mayor peso
molecular, los cuales originan esta fracción.
0
100
200
300
400
500
600
0 1 2 3
mg/
L
Tiempo (días)
C12
C16
C17
C18
C19
C20
C21
C22
C23
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 1 2 3
mg/
L
Tiempo (días)
C12
C16
C17
C19
C20
C21
C22
C23
78
5.4. Cinética de biodegradación
El modelo utilizado para el crecimiento celular, es la ecuación de Monod (Fogler, 2008;
Monod, 1949) para crecimiento exponencial:
Ecuación 0.4
Donde:
rg=velocidad de crecimiento de la célula, mg/L dia;
CC=concentración de células, mg/L
µ=velocidad de crecimiento específico, dia-1
La velocidad de crecimiento específico de la célula se puede expresar como:
[dia
-1] Ecuación 0.5
Donde
µmáx=velocidad de reacción específica de crecimiento máximo, dia-1
KS=contante de Monod, mg/L
Cs=concentración de sustrato, mg/L
Los valores representativos de máx y Ks son 1.3 h-1
y 2.2x10-5
mol/dm3,
respectivamente, que son los valores de parámetros para crecimiento de E. coli sobre
glucosa (Fogler, 2008). Al combinar las dos ecuaciones anteriores se llega a la ecuación
de Monod para la velocidad de crecimiento de células bacterianas.
Ecuación 0.6
5.4.1. Estequiometria
La estequiometria del crecimiento celular es muy compleja y varía con el sistema de
microorganismos, los nutrimentos y las condiciones ambientales, como pH, temperatura
y potencial redox. Tal complejidad es particularmente cierta cuando más de un
nutrimento contribuye al crecimiento de células, como en este caso. Por lo anterior, para
efectuar los cálculos estequiométricos se requiere la siguiente simplificación:
79
Células + sustrato más células + producto
Con el propósito de relacionar el sustrato consumido, las nuevas células formadas y el
producto generado, se definen los coeficientes de rendimiento. El coeficiente de
rendimiento para células y sustrato es:
Ecuación 0.7
Ecuación 0.8
La formación de producto puede tener lugar durante diversas fases del ciclo del
crecimiento de la célula. Cuando la formación de producto sólo ocurre durante la fase
de crecimiento exponencial, la velocidad de formación de producto es:
Ecuación 0.9
Donde
Ecuación 0.10
El coeficiente de rendimiento estequiométrico que relaciona la cantidad de producto
formado por masa de sustrato consumido es:
Ecuación 0.11
Además del consumo de sustrato para producir nuevas células, parte del sustrato se
emplea simplemente para mantener las actividades cotidianas de las células. El término
correspondiente de utilización para mantenimiento es:
Ecuación 0.12
La ecuación para relacionar la tasa de consumo de nutrimentos, -rs, con las velocidades
de crecimiento celular, generación de producto y mantenimiento celular es:
80
Ecuación 0.13
Ecuación 0.14
Como el producto se sintetiza durante la fase de crecimiento, no es posible separar la
cantidad de sustrato consumido para crecimiento celular de la que se consume para
sintetizar producto (ya que el producto sintetizado es utilizado para el desarrollo
celular), todo el sustrato consumido se agrupa en el coeficiente estequiométrico YS/C.
5.4.2. Balance de masa
Hay dos formas en las que es posible explicar el crecimiento de los microorganismos.
Una es tomar en cuenta el número de células vivas y la otra la masa de las células vivas.
Para este caso se usara la segunda. Un balance de masa para el microorganismo en
reactor continuo de mezcla perfecta de volumen contante es:
Ecuación 0.15
Ecuación 0.16
El balance de sustrato correspondiente es:
Ecuación 0.17
Ecuación 0.18
5.4.3. Operación intermitente
El sistema de tratamiento empleado fue intermitente, donde υ = υ0 = 0 y los balances de
masa son los siguientes:
81
Células
Ecuación 0.19
Dividiendo entre el volumen del reactor V se tiene:
Ecuación 0.20
Sustrato
La velocidad de desaparición del sustrato, -rs, se deriva del sustrato empleado para
crecimiento celular y el sustrato empleado para mantenimiento celular:
Ecuación 0.21
Dividiendo entre V se obtiene el balance de sustrato para la fase de crecimiento:
Ecuación 0.22
Producto
La velocidad de formación de producto, rp, puede relacionarse con la velocidad de
consumo de sustrato a través del siguiente balance:
Ecuación 0.23
Estos tres balances generan un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias de primer
orden.
82
5.5. Tratamiento de datos
La obtención de las cinéticas de biodegradación de los sustratos hidrocarbonados fueron
obtuvieron bajo el siguiente procedimiento.
5.5.1. Cálculo de peso seco, masa de CO2 y de sustrato
La ecuación que relaciona el número de células microbianas con la masa de peso seco
es (Sánchez Gonzales, 2012):
Ecuación 0.24
Donde
Wseco[=] mg/L
UFC[=] número de microorganismos por mL
La concentración de biomasa para cada sustrato hidrocarbonado se muestra en la tabla
5.7.
Tabla 0.16 Variación de la concentración de biomasa para agua contaminada con diesel y agua
contaminada con petróleo, a tres temperaturas diferentes.
TIEMPO
(DÍAS)
WSECO (AGUA CONTAMINADA CON
DIESEL) [MG/L]
WSECO (AGUA CONTAMINADA CON
PETRÓLEO) [MG/L]
Temp. 20ºC 30ºC 40ºC 20ºC 30ºC 40ºC
0 3383.356 3383.286 3383.349 3383.356 3383.286 3383.349
1 4327.6 5517.6 6357.6 5272.6 5517.6 6077.6
2 5521.1 7232.6 10382.6 6357.6 6725.1 7652.6
3 6357.6 9682.6 15632.6 7197.6 7617.6 8632.6
La concentración del sustrato (medido como DQO) y de producto (como CO2)
muestran en la tabla 5.8.
Tabla 0.17 Variación de la concentración de DQO y de CO2 durante el tratamiento.
TIEMPO
(DÍAS)
AGUA CONTAMINADA CON DIESEL AGUA CONTAMINADA CON
PETRÓLEO
mCO2 [mg/L] mDQO [mg/L] mCO2 [mg/L] mDQO [mg/L]
0 0 2640 0 1200
1 528 630 352 210
2 1848 125 528 130
3 2200 108 968 107
83
5.5.2. Calculo de los coeficientes de rendimiento y de los parámetros µmáx
y Ks
Los coeficientes de rendimiento entre la biomasa, el sustrato y el producto durante el
tratamiento se muestra en la tabla 5.9. En la tabla 5.10 y 5.11 se muestran las ecuaciones
de variación en el tiempo de los coeficientes de variación para el diesel y el petróleo,
respectivamente.
Tabla 0.18 Coeficientes de rendimiento entre la biomasa, el sustrato y el producto.
Tabla 0.19 Ecuaciones de variación de los coeficientes de rendimiento durante el tiempo de tratamiento
para el diesel.
Tabla 0.20 Ecuaciones de variación de los coeficientes de rendimiento durante el tiempo de tratamiento
para el diesel.
AGUA CONTAMINADA CON DIESEL AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO
Temperatura 20ºC 30ºC 40ºC 20ºC 30ºC 40ºC
Yc/s [g/g] 0.469 1.061 1.479 1.908 2.155 2.721
Ys/c [g/g] 2.128 0.941 0.675 0.524 0.463 0.367
Yp/c [g/g] 0.559 0.247 0.177 0.186 0.164 0.130
Yp/s [g/g] 2.613 2.200
Ys/p [g/g] 0.000382 0.000454
AGUA CONTAMINADA CON DIESEL
Temperatura 20ºC 30ºC 40ºC
Ys/c [g/g] y = 0.6513x2 - 2.3568x + 2.1286 y = 0.1799x2 - 0.8272x + 0.9418 y = 0.214x2 - 0.7644x + 0.6758
Yp/c [g/g] y = -0.616x2 + 1.1629x + 0.5591 y = -0.5741x2 + 1.0964x + 0.2474 y = -0.2057x2 + 0.3561x + 0.1775
AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO
Temperatura 20ºC 30ºC 40ºC
Ys/c [g/g] y = 0.202x2 - 0.6522x + 0.524 y = 0.1785x2 - 0.5761x + 0.4639 y = 0.1447x2 - 0.4613x + 0.3674
Yp/c [g/g] y = 0.1928x2 - 0.2169x + 0.1863 y = 0.183x2 - 0.2021x + 0.1649 y = 0.1781x2 - 0.197x + 0.1306
84
Para encontrar los parámetros de la ley de velocidad µmáx y Ks se efectua una regresión
de los datos con la forma de Hanes-Woolf de la ecuación de Monod:
Ecuación 0.25
Al graficar los términos Cc/rg vs (1/Cs), la intersección con el eje de las abscisas es el
inverso de a constante µmáx y la pendiente es la relación entre Ks/µmáx. En la tabla 5.12
se muestran los valores obtenidos de las constantes así como el coeficiente de
correlación para el ajuste lineal aplicado.
Durante el tratamiento, al aumentar la temperatura en un mismo sustrato, la velocidad
de reacción especifica máxima (µmáx) se incrementa. Cuando el sustrato incrementa su
complejidad, como en el caso del petróleo en comparación con el diesel, su valor
también aumenta. Este resultado concuerda con el planteamiento de la cinética de
Monod, debido a que la velocidad de reacción de crecimiento depende de la estructura
y concentración del sustrato y de la temperatura de crecimiento del microorganismo
(Tabla 5.12).
Tabla 0.21 Constantes µmáx y Ks obtenidas aplicando una regresión lineal.
AGUA CONTAMINADA CON DIESEL AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO
20ºC 30ºC 40ºC 20ºC 30ºC 40ºC
µmáx
[dia-1
]
0.3098 0.4841 0.6748 1.1976 1.6085 3.7693
Ks
[mg/L]
109.468 99.951 78.946 815.904 1096.493 2555.107
R2
0.93 0.86 0.90 0.95 0.94 0.93
85
5.5.3. Cálculo de los balances de masa.
En las tabla 5.13, 5.14 y 5.15 se presentan los balances de masa para las muestras de
agua contaminadas con diesel, durante el tratamiento a 20ºC, 30ºC y 40ºC,
respectivamente.
Tabla 0.22 Balances de masa para agua contaminada con diesel durante el tratamiento a 20ºC.
AGUA CONTAMINADA CON DIESEL
Temperatura 20ºC
Balance de
células (Wseco) Cc
Cs
CsCc
dt
dCc045.0
468.109
3098.0
Balance de
sustrato (DQO) Cc
Cs
CsCc
dt
dCs065.0)
468.109
3098.0)(2.1286 +2.3568t - 0.6513t( 2
Balance de
producto (CO2) Cs
CsCc
dt
dCp
468.109
3098.0)0.5591 +1.1629t + -0.616t( 2
El término de muerte celular, kd, limita el crecimiento celular, y su efecto es evidente
después de la etapa exponencial de crecimiento. La constante de mantenimiento celular,
m, es la cantidad de sustrato que se utiliza para el crecimiento y para los procesos
metabólicos dentro del microorganismo. En la figura 5.20, se observa que cuando la
tasa de crecimiento celular empieza a decrecer después de dos días y medio de
tratamiento. En este punto la tasa de muerte se incrementa drásticamente. La tasa de
mantenimiento celular permanece prácticamente constante a lo largo de los tres días de
tratamiento.
86
Figura 0.47 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de biodegradación del diesel a
20ºC.
En la figura 5.21, se muestran los datos experimentales y las predicciones del modelo de
Monod para el diesel a 20ºC.
Figura 0.48 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función del tiempo del
modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de diesel a 20ºC.
La misma tendencia se observa en los perfiles de velocidad mostrados en las figuras
5.22 y 5.24.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
0 1 2 3
Ve
loci
dad
mg/
Lh
Tiempo (días)
rg
rsm
rd
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0 1 2 3
Co
nce
ntr
ació
n (
mg/
L)
Tiempo (días)
Cc Monod
Cs Monod
Cp Monod
Cc exp
Cs exp
Cp exp
87
Tabla 0.23 Balances de masa para agua contaminada con diesel durante el tratamiento a 30ºC. AGUA CONTAMINADA CON DIESEL
Temperatura 30ºC
Balance de
células (Wseco) Cc
Cs
CsCc
dt
dCc040.0
951.99
4841.0
Balance de
sustrato (DQO) Cc
Cs
CsCc
dt
dCs065.0)
951.99
4841.0)(0.9418 +0.8272t - 0.1799t( 2
Balance de
producto (CO2) Cs
CsCc
dt
dCp
951.99
4841.0)0.2474 +1.0964t + -0.5741t( 2
Figura 0.49 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de biodegradación del diesel a
30ºC.
La concentración de biomasa predicha por el modelo de Monod, se desvía con el
aumento de la temperatura (ver figuras 5.23 y 5.25). El consumo de sustrato que el
modelo predice es menor al consumo obtenido. Esto puede deberse a que se tomo como
masa de sustrato a toda la materia presente susceptible de oxidación y no solo al sustrato
hidrocarbonado, de esta forma la biomasa que se genera en el tiempo contribuye a esta
medida. Sin embargo, la medida del sustrato directo medido por cromatografía de gases
indico que la degradación alcanza su pico mayor y se vuelve asintótico durante el
primer dia de tratamiento (ver figura 5.18).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 1 2 3
Ve
loci
dad
mg/
Lh
Tiempo (días)
rg
rd
rsm
88
Figura 0.50 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función del tiempo del
modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de diesel a 30ºC.
El balance que se muestra en la tabla 5.15, a una temperatura de 40ºC para el diesel, se
observa que la tasa de muerte es mayor. Esto debido a que la tasa de crecimiento celular
también lo fue, por lo que el número de bacterias que murieron también se incrementó.
Tabla 0.24 Balances de masa para agua contaminada con diesel durante el tratamiento a 40ºC.
AGUA CONTAMINADA CON DIESEL
Temperatura 40ºC
Balance de
células (Wseco) Cc
Cs
CsCc
dt
dCc12.0)
946.78
6673.0
Balance de
sustrato (DQO) Cc
Cs
CsCc
dt
dCs018.0)
946.78
6673.0)(0.6758 +0.7644t - 0.214t( 2
Balance de
producto (CO2) Cs
CsCc
dt
dCp
0000746.0
6673.0)0.1775 +0.3561t + -0.2057t( 2
El perfil de velocidades a esta temperatura (figura 5.24), indica que la tasa de
crecimiento fue la mayor, pero también que la tasa de muerte se incremento.
Nuevamente, la tasa destinada al mantenimiento celular fue constante durante el periodo
de tratamiento.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 1 2 3
Co
nce
ntr
ació
n (
mg/
L)
Tiempo (días)
Cc Monod
Cs Monod
Cp Monod
Cc exp
Cs exp
Cp exp
89
Figura 0.51 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de biodegradación del diesel a
40ºC.
Figura 0.52 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función del tiempo del
modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de diesel a 40ºC.
En el tratamiento de la muestra de agua contaminada con petróleo, las velocidad de
crecimiento máximo fue 3 veces mayor a la presentada por el diesel a las
correspondientes temperaturas de tratamiento (tabla 5.16, 5.17 y 5.18). Así también el
valor debió a la muerte celular, lo cual limita el crecimiento celular.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
0 1 2 3
Ve
loci
dad
(m
g/Lh
)
Tiempo (días)
rg
rsm
rd
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
0 1 2 3
Co
nce
ntr
ació
n (
mg/
L)
Tiempo (días)
Cc Monod
Cs Monod
Cp Monod
Cc exp
Cs exp
Cp exp
90
Tabla 0.25 Balances de masa para agua contaminada con petróleo durante el tratamiento a 20ºC.
AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO
Temperatura 20ºC
Balance de
células (Wseco) Cc
Cs
CsCc
dt
dCc15.0
904.815
1976.1
Balance de
sustrato (DQO) Cc
Cs
CsCc
dt
dCs01.0)
904.815
1976.1)(0.524 +0.6522t - 0.202t( 2
Balance de
producto (CO2) Cs
CsCc
dt
dCp
904.815
1976.1)0.1649 +0.2021t - 0.183t( 2
El perfil de velocidades que se muestra en las figuras 5.26, 5.28 y 5.30 indica que los
microorganismos pasaron por un proceso de readaptación al sustrato. Cuando se realizo
la adaptación del consorcio, este se adapto únicamente al diesel, por lo que al utilizar
como contaminante un sustrato de mayor complejidad represento un nuevo cambio en
las condiciones del medio.
Figura 0.53 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de biodegradación del petróleo
a 20ºC.
Esta adaptación es evidente en la concavidad positiva presente en el perfil de velocidad
de crecimiento de las tres figuras.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 1 2 3
Ve
loci
dad
(m
g/Lh
)
Tiempo (días)
rg
rsm
rd
91
Un efecto adicional de este proceso se observa en la muy elevada tasa de muerte, lo que
también es función de la toxicidad del petróleo para el consorcio microbiano.
Figura 0.54 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función del tiempo del
modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de petróleo a 20ºC.
La predicción del modelo para este sustrato presento mayor desviación que en el caso
del diesel (figuras 5.27, 5.29 y 5.31).
Tabla 0.26 Balances de masa para agua contaminada con petróleo durante el tratamiento a 30ºC. AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO
Temperatura 30ºC
Balance de
células (Wseco) Cc
Cs
CsCc
dt
dCc12.0
493.1096
6085.1
Balance de
sustrato (DQO) Cc
Cs
CsCc
dt
dCs025.0)
493.1096
6085.1)(0.4639 +0.5761t - 0.1785t( 2
Balance de
producto (CO2) Cs
CsCc
dt
dCp
493.1096
6085.1)0.1649 +0.2021t - 0.183t( 2
Una tendencia en la tasa de muerte, que se obtuvo en el perfil de velocidades fue que al
final del periodo de readaptación al nuevo sustrato, la tasa de muerte comienza a caer,
esto se nota en el cambio en la concavidad de rd en las figuras 5.26, 5.28 y 5.30.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 1 2 3
Co
nce
ntr
ació
n (
mg/
L)
Tiempo (días)
Cc Monod
Cs Monod
Cp Monod
Cc exp
Cs exp
Cp exp
92
Figura 0.55 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de biodegradación del
petróleo a 30ºC.
Figura 0.56 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función del
tiempo del modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de petróleo a 30ºC.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 1 2 3
Ve
loci
dad
(m
g/Lh
)
Tiempo (días)
rg
rsm
rd
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 1 2 3
Co
nce
ntr
ació
n (
mg/
L)
Tiempo (días)
Cc Monod
Cs Monod
Cp Monod
Cc exp
Cs exp
Cp exp
93
Tabla 0.27 Balances de masa para agua contaminada con petróleo durante el tratamiento a 40ºC.
AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO
Temperatura 40ºC
Balance de
células (Wseco) Cc
Cs
CsCc
dt
dCc20.0
107.2555
7693.3
Balance de
sustrato (DQO) Cc
Cs
CsCc
dt
dCs012.0)
107.2555
7693.3)(0.3674 +0.4613t - 0.1447t( 2
Balance de
producto (CO2) Cs
CsCc
dt
dCp
107.2555
7693.3)0.1306 +0.197t - 0.1781t( 2
El análisis de la figura 5.30, indica que existe una concentración de sustrato en la cual
toda actividad metabólica debe cesar, y por lo tanto sobrevenir la muerte celular. Esto
también se nota en la tasa de mantenimiento celular, la cual es muy pequeña, lo que
indica una inversión significativa de energía y de recursos metabólicos en la actividad
celular para adaptarse al petróleo.
Figura 0.57 Perfil de velocidades obtenido con el modelo de Monod para de biodegradación del petróleo
a 40ºC.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
0 1 2 3
Ve
loci
dad
(m
g/Lh
)
Tiempo (días)
rg
rsm
rd
94
Figura 0.58 Predicción de concentraciones de biomasa, sustrato y producto en función del tiempo del
modelo de Monod, comparado con los datos experimentales de petróleo a 40ºC.
El aporte de energía al consorcio como temperatura tuvo un efecto significativo sobre la
tasa de mantenimiento. A mayor temperatura, la tasa de mantenimiento fue menor, es
decir, la energía invertida por parte de la celula para sus actividades se reduce (Figura
5.32 y5.33). Esto permite concluir que es posible aportar energía al consorcio para
facilitar sus actividades metabolicas y aumentar su eficiencia sobre el sustrato. Este
comportamiento no se ha reportado en la literatura.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
0 1 2 3
Co
nce
ntr
ació
n (
mg/
L)
Tiempo (días)
Cc Monod
Cs Monod
Cp Monod
Cc exp
Cs exp
Cp exp
95
Figura 0.59 Tasa de mantenimiento microbiano en agua contaminada con diesel a 20, 30 y 40ºC.
Figura 0.60 Tasa de mantenimiento microbiano en agua contaminada con petróleo a 20, 30 y 40ºC.
0
100
200
300
400
500
600
700
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
rsm
(m
g/Lh
)
Tiempo (días)
T=20ºC
T=30ºC
T=40ºC
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 1 2 3
rsm
(m
g/Lh
)
Tiempo (días)
T=20ºC
T=30ºC
T=40ºC
96
CONCLUSIONES
La cinética de Monod, para este consorcio, describe adecuadamente el
crecimiento bacteriano, no así, la utilización de sustrato ni la generación de
producto. Esto debido a que la medida del sustrato se realizo a través de DQO, el
cual es capaz de oxidar las células microbianas, lo cual puede incrementar el
valor del contaminante presente.
Estimular la producción de biosurfactantes y facilitar asi dicha adaptación, se
adiciona una mezcla de sales minerales que contienen la relación de carbono,
nitrógeno y elementos traza necesaria para el desarrollo microbiano.
El tiempo para alcanzar un grado de degradación de contaminantes fue de 3 días,
observando que existe un intervalo óptimo de temperatura de operación entre 30
y 40 ºC.
La tasa de mantenimiento se reduce, realizando el aporte de energía al sustrato,
por lo que las actividades metabólicas dentro de la célula microbiana se enfocan
en la degradación del sustrato. Esto mejora el rendimiento general del consorcio.
Se puede inferir, que la concentración de petróleo en la que todo metabolismo
microbiano cesa para el consorcio utilizado, es menor a la concentración de
diesel.
Es posible reducir la contaminación del agua por hidrocarburos a valores que ya
no representen toxicidad al medio ambiente cumpliando con la normatividad
ambiental vigente
El proceso es viable dese el punto de vista económico
El proceso es reproducible en otras latidudes y aplicable a otros contaminantes
derivados del petróleo semejantes.
La adaptación del consorcio al sustrato aumenta la eficiencia de la degradación.
Se obtuvieron eficiencias de biodegradación del 95 % para el diesel y del 90%
para el petróleo, con una adaptación previa del consorcio bacteriano.
97
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784-789.
116
ANEXO A CURVA DE REFERENCIA
La curva de referencia se realizo a través de cromatografía de gases con detector FID.
Se prepararon estándares de referencia a una concentración de 5000, 2500, 1000,500,
100 y 50 ppm de diesel en CCl4. Los cromatogramas se muestran en las ilustraciones 1
a 6. En la tabla 0-1 se muestra las curvas de referencia obtenidas de estos
cromatogramas.
Ilustración 1 Cromatograma de referencia. Concentración de 5000 ppm de diesel en CCl4.
Ilustración 2 Cromatograma de referencia. Concentración de 2500 ppm de diesel en CCl4.
117
Ilustración 3 Cromatograma de referencia. Concentración de 1000 ppm de diesel en CCl4.
Ilustración 4 Cromatograma de referencia. Concentración de 500 ppm de diesel en CCl4.
Ilustración 5 Cromatograma de referencia. Concentración de 100 ppm de diesel en CCl4.
118
Ilustración 6 Cromatograma de referencia. Concentración de 50 ppm de diesel en CCl4.
Tabla 0.28 Modelos de las curvas de referencia para la concentración de hidrocarburos obtenidos
por cromatografía de gases.
Nº
Carbonos
Curvas de referencia Ecuación R
2
HCtotal
Y=337.12X-429.76 0.9954
C12
Y=371.32X-40.283 0.9879
C16
Y=351.96X-22.385 0.9761
y = 337.12x - 429.76 R² = 0.9954
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00
mg/
L
Área
y = 371.32x - 40.283 R² = 0.9879
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
mg/
L
Área
y = 351.96x - 22.385 R² = 0.9761
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 0.5 1 1.5 2 2.5
mg/
L
Área
119
C17
Y=358.25X-36.499 0.9750
C18
Y=382.88X-12.846 0.9433
C19
Y=367.93X-18.632 0.9620
C20
Y=394.3X-17.363 0.9377
y = 358.25x - 36.499 R² = 0.975
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 0.5 1 1.5 2 2.5
mg/
L
Área
y = 382.88x - 12.846 R² = 0.9433
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 0.5 1 1.5 2 2.5
mg/
L
Área
y = 367.93x - 18.632 R² = 0.962
0
100
200
300
400
500
600
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
mg/
L
Área
y = 394.3x - 17.363 R² = 0.9377
0
100
200
300
400
500
600
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
mg/
L
Área
120
C21
Y=360.24X-8.4409
0.9738
C22
Y=381.23X-10.447 0.9670
C23
Y=436.01X-10.82 0.9251
y = 360.24x - 8.4409 R² = 0.9738
0
50
100
150
200
250
300
350
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
mg/
L
Área
y = 381.23x - 10.447 R² = 0.967
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
mg/
L
Área
y = 436.01x - 10.82 R² = 0.9251
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
mg/
L
Área
121
ANEXO B LINEARIZACIÓN DE LAS ECUACIÓN DE MONOD
La linearización de la ecuación de Monod a través de Hanes-Wolf para el cálculo de las
constates µmáx y Ks se presenta a continuación.
A partir del modelo de Monod:
CcKs
Cs
Cc
rg
dt
dCc
Ccmáx
1
Obteniendo el recíproco:
máxmáx Cs
Ks
rg
Cc 11
Esta forma de la ecuación, adquiere la forma de la línea recta y = mx + b. Las graficas
de Cc/rg vs 1/Cs se presentan en las ilustraciones 7, 8, 9; para el diesel y 10, 11 y 12
para el petróleo. La velocidad se obtuvo ajustando la concentración de la biomasa y el
tiempo a un polinomio de orden 2, y derivando posteriormente en función del tiempo
como lo señala Ong (Ong, 1983).
122
Ilustración 7 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de agua
contaminada con diesel a 20ºC.
Ilustración 8 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de agua
contaminada con diesel a 30ºC.
y = 353.3x + 3.2274 R² = 0.9347
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
Cc/
rg (
día
-1)
1/Cs (L/mg)
y = 206.44x + 2.0654 R² = 0.863
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
Cc/
rg (
día
-1)
1/Cs (L/mg)
123
Ilustración 9 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de agua
contaminada con diesel a 40ºC.
Ilustración 10 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de agua
contaminada con petróleo a 20ºC.
y = 116.99x + 1.4819 R² = 0.908
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
Cc/
rg (
día
-1)
1/Cs (L/mg)
y = 681.28x + 0.835 R² = 0.953
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009
Cc/
rg (
día
-1)
1/Cs (L/mg)
124
Ilustración 11 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de agua
contaminada con petróleo a 30ºC.
Ilustración 12 Linearización de la ecuación de Monod por Hanes-Wolf para la muestra de agua
contaminada con petróleo a 40ºC.
y = 681.69x + 0.6217 R² = 0.9491
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009
Cc/
rg (
día
-1)
1/Cc (L/mg)
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009
Cc/
rg (
día
-1)
1/Cc (L/mg)
125
ANEXO C ADAPTACIÓN DEL CONSORCIO BACTERIANO
Preparación del medio mínimo se muestra en las ilustraciones.
1.- Adición de sales minerales y ajuste de pH a 7.2.
2.- Esterilización del medio mínimo en autoclave a 121 ºC durante 20 minutos.
126
Contaminación con diesel y petróleo.
1.- Adición de una unidad de hidrocarburo por nueve unidades de solución de sales
minerales.
2.- Agitación por 72 horas, a 20 rpm, a una temperatura de 30ºC.
3.-Separación de la fase acuosa, la cual contiene la fracción del hidrocarburo capaz de
saturar la solución de sales minerales.
127
Adaptación del consorcio bacteriano.
1.- Presentación del consorcio bacteriano utilizado, soportado en cáscara de trigo.
2.-Pesar 1 g de consorcio por cada 100 mL de fase acuosa contaminada con
hidrocarburos.
3.- Adición en cartuchos de papel filtro del consorcio bacteriano. Se agrega cada
cartucho a 100 mL de fase acuosa contaminada.
128
4.- Agitación a 20 rpm, durante 72 horas, a temperatura constante de 30ºC. Al final de
este período, las soluciones se consideran inoculo adapatado.
Imágenes obtenidas con microscopia óptica en aumento de 60 y 100X.
60X 100X
129
ANEXO D TINCIÓN DE GRAM
El consorcio fue teñido mediante la técnica de Gram. La técnica se describe a
continuación:
Extensión:
En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca una gota de
agua destilada a la que. con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se
lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensión por el
calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.
130
Coloración:
Un minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial) se lava con agua destilada.
Un minuto en lugol (mordiente), se decolora con alcohol de 95° (decolorante), se lava
con agua destilada.
Un minuto en fucsina básica (colorante de contraste) se lava con agua corriente se seca
suavemente y sin frotar con papel de filtro.
131
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña de aceite
de cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersión.
En las ilustraciones se muestra fotografías del consorcio utilizado con tinción de gram.
Tinción de gram aplicada al consorcio bacteriano utilizado. Gram (-)
132
ANEXO E CÓDIGOS DE POLYMATH
TEMP. AGUA CONTAMINADA CON DIESEL AGUA CONTAMINADA CON PETRÓLEO
20 ºC t(0) = 0
t(f) = 3
rg = (umax * Cs * Cc) / (Ks + Cs)
rsm = m * Cc
rd = kd * Cc
Ypc = -0.616 * t ^ 2 + 1.1629 * t + 0.5591
Ysc = 0.6513 * t ^ 2 - 2.3568 * t + 2.1286
Ks = 109.468
umax = 0.3098
m = 0.065
kd = 0.045
d(Cp)/d(t) = rg * Ypc
Cp(0) = 0.0
d(Cs)/d(t) = Ysc * (-rg) - rsm
Cs(0) = 2640
d(Cc)/d(t) = rg - rd
Cc(0) = 3383.356
t(0) = 0
t(f) = 3
rg = (umax * Cs * Cc) / (Ks + Cs)
rsm = m * Cc
rd = kd * Cc
Ypc = 0.1928 * t ^ 2 - 0.2169 * t + 0.1863
Ysc = 0.202 * t ^ 2 - 0.6522 * t + 0.524
Ks = 815.904
umax = 1.1976
m = 0.01
kd = 0.15
d(Cp)/d(t) = rg * Ypc
Cp(0) = 0.0
d(Cs)/d(t) = Ysc * (-rg) - rsm
Cs(0) = 1200
d(Cc)/d(t) = rg - rd
Cc(0) = 3383.356
30 ºC t(0) = 0
t(f) = 3
rg = (umax * Cs * Cc) / (Ks + Cs)
rsm = m * Cc
rd = kd * Cc
Ypc = -0.5741 * t ^ 2 + 1.0964 * t +
0.2474
Ysc = 0.1799 * t ^ 2 - 0.8272 * t + 0.9418
Ks = 99.951
umax = 0.4841
m = 0.065
kd = 0.040
d(Cp)/d(t) = rg * Ypc
Cp(0) = 0.0
d(Cs)/d(t) = Ysc * (-rg) - rsm
Cs(0) = 2640
d(Cc)/d(t) = rg - rd
Cc(0) = 3383.286
t(0) = 0
t(f) = 3
rg = (umax * Cs * Cc) / (Ks + Cs)
rsm = m * Cc
rd = kd * Cc
Ypc = 0.183 * t ^ 2 - 0.2021 * t + 0.1649
Ysc = 0.1785 * t ^ 2 - 0.5761 * t + 0.4639
Ks = 1096.493
umax = 1.6085
m = 0.025
kd = 0.12
d(Cp)/d(t) = rg * Ypc
Cp(0) = 0.0
d(Cs)/d(t) = Ysc * (-rg) - rsm
Cs(0) = 1200
d(Cc)/d(t) = rg - rd
Cc(0) = 3383.286
40 ºC t(0) = 0
t(f) = 3
rg = (umax * Cs * Cc) / (Ks + Cs)
rsm = m * Cc
rd = kd * Cc
Ypc = -0.2057 * t ^ 2 + 0.3561 * t +
0.1775
Ysc = 0.214 * t ^ 2 - 0.7644 * t + 0.6758
Ks = 78.946
umax = 0.6748
m = 0.018
kd = 0.12
d(Cp)/d(t) = rg * Ypc
Cp(0) = 0.0
d(Cs)/d(t) = Ysc * (-rg) - rsm
Cs(0) = 2640
d(Cc)/d(t) = rg - rd
Cc(0) = 3383.349
t(0) = 0
t(f) = 3
rg = (umax * Cs * Cc) / (Ks + Cs)
rsm = m * Cc
rd = kd * Cc
Ypc = 0.1781 * t ^ 2 - 0.197 * t + 0.1306
Ysc = 0.1447 * t ^ 2 - 0.4613 * t + 0.3674
Ks = 2555.107
umax = 3.7693
m = 0.012
kd = 0.20
d(Cp)/d(t) = rg * Ypc
Cp(0) = 0.0
d(Cs)/d(t) = Ysc * (-rg) - rsm
Cs(0) = 1200
d(Cc)/d(t) = rg - rd
Cc(0) = 3383.349
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