SCIENCE IMAGING SYSTEMS

Application Note

FLA

No.

Contents

　1. SYBR® Green Iの基礎データ

　2. バッファーの違いによるバックグラウンド比較

　3. 染色時間と蛍光強度

　4. SYBR® Green IによるDNAの検出感度

　5. MacBASでの解析ワンポイントアドバイス

　6. 参考文献

FLA-2000

2

はじめに

　今回は、フルオロ・イメージアナライザーFLA-2000でDNAを高感度に測定できる試薬SYBR® Green Iをご紹介いたします。　SYBR® Green Iは、DNAとインターカレートした状態で強い蛍光を発し、ゲル中のDNAを直接染色することができます。また、DNAとの親和性が高いため、バックグラウンドが低い画像が得られます。FLA-2000では、ゲルをFLUORステージに乗せ、搭載されているSHGレーザーによって簡単に、かつ効率よく測定することができます。Application Note No.2では、SYBR® Green Iの基礎データをベースとし、実験プロトコールの流れにしたがってSYBR® Green Iのレビューがされています。さらにFLA-2000の解析に役立つ「MacBASでの解析ワンポイントアドバイス」コーナーを巻末に設け連載いたします。SYBR® Green Iは、最近開発された試薬でもあり、応用事例が少ないのが現状です。今後Application NoteにFLA-2000を用いた応用事例のご紹介もしていきたいと思っておりますので、宜しくお願い申し上げます。

Summary

・SYBR® Green I の希釈バッファーは、TAEとTBEではバックグラウンドに大きな 差はありません。

・30分程度の染色時間で画像を見ることはできますが、安定した結果を得るには60分程度の染色が必要です。

・FLA-2000はUVトランスイルミネーターに対して約10倍の検出感度を持っています。・SYBR® Green Iの本文中の実験では約5 pgまで検出できています。

Application Note No. 2

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実験プロトコール

ゲル・サンプルの準備

*1　今回のアガロースゲルは、　Boehringer Mannheim社製　アガロースを使用しています。

*2　ゲルは30分程で固まります　が1時間程度待った方が安定　します。

電気泳動

染　　色

*3　脱色の必要はありません。

読み取り*4　ゲルとFLUORステージの　間に空気が入らないように気　をつけて置いてください。左　側からゆっくりとゲルを降ろ　すと空気が入りにくくなりま　す。

SYBR® Green I の基礎データ

画像説明

サンプル：λDNA/Hind IIIアプライ量：

Lane-1： 100ngLane-2： 10ngLane-3： 3ngLane-4： 1ngLane-5： 300pgLane-6： 100pgLane-7： 30pgLane-8： 10pg

上記サンプルをアプライし、50V定電圧で泳動。

FLA-2000読み取り条件

Gradation ：65536(16bit)

Resolution ：50μm

Sensitivity ：F10

Latitude ：5

Sample Mode：Fluor.473nm

:Y520Filter

＊アガロースゲル *1の作製　(1)　アガロースの粉末を1×TAEに溶かし、1%の溶液を作る

かくはん

　(2)　撹拌しながら約90℃まで加熱する　(3)　液温70℃まで放置する　(4)　ゲル作製トレイに(3)の液を投入し、固まるまで放置する*2

→待ち時間 約1時間　　　　＊サンプル調整　TEバッファーでDNAを希釈する

　(1)　1×TAE電気泳動用バッファーをいれる→「ﾊﾞｯﾌｧｰの違いによるﾊﾞｯｸｸﾞﾗｳﾝﾄﾞ比較」章を参照

　(2)　DNAサンプルを各ウェルに投入する　(3)　50 V電圧をかけ、泳動する

→待ち時間 約90分　　　　

　(1)　SYBR® Green Iを希釈。　　 1:10,000になるように1×TAEにいれる　(2)　電気泳動したゲルを 1) の液に静かに振とうしながら浸す*3

→待ち時間 約1時間　　　　→「染色時間と蛍光強度」章を参照　　　　　　　　

　(1)　ゲルをFLUORステージにのせる*4

　(2)　Image Readerを起動する　(3)　上記画像のFLA-2000読み取り条件を設定し、　　 Readボタンをクリックする

Application Note No. 2

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試薬の性質

Fig.1-1　励起・蛍光スペクトル励起極大波長は494nm、蛍光極大波長は521nmです。

試薬分類

取扱注意事項

蛍光色素（インターカレーション型）

dsDNAとインターカレートし蛍光を発します。SYBR®

GreenにはSYBR® Green IとSYBR® Green IIの2種類あり、dsDNAにはSYBR® Green Iが、ssDNAとRNAにはSYBR®

Green IIが適しています。

特　長

対象サンプル dsDNA、ssDNA、RNA

遮光した状態で冷凍庫に入れてください。保存状態

DNAにインターカレートするため、変異原性の可能性があります。必ず手袋を着用して使用してください。

製 造 元 Molecular Probes社

励起・蛍光スペクトル

DNA量と蛍光強度の関係

名　称 SYBR® Green I（ サイバー グリーン I ）

dsDNAダブルストランド（二本鎖）DNA

ssDNAシングルストランド（一本鎖）DNA

Fig.1-2　λDNA/Hind IIIの SYBR®

Green I 染色ゲルの定量性図左： DNA量と蛍光強度の関係

分布図図右： 左図○印部分の拡大図FLA-2000用解析ソフトMacBASのプロファイル機能を用いて定量しました。（LAUはFLA-2000の蛍光強度表示単位で、Linear Arbiturary Unitの略です）

Fig.1-1

FLA-2000(473nm)

200 300 400 500 600 700 800

波長（nm）�

蛍光強度�

ExEm

Fig.1-2

＊左図○印部分の拡大図

Application Note No. 2

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Fig.2-1　TAEとTBEのバックグラウンド比較画像　左：アガロースゲル 1×TAE

電気泳動バッファー 1×TAE希釈バッファー 1×TAE

画像　右：アガロースゲル 1×TBE電気泳動バッファー 1×TBE希釈バッファー 1×TBE

DNAサンプルはGIBCOBRL社のHighDNA MASSTM Ladderを使用しています。

< DNA量／バンド >Lane-1 Lane-2 Lane-3 Lane-410 ng 1 ng 100 pg 10 pg6 ng 600 pg 60 pg 6 pg4 ng 400 pg 40 pg 4 pg3 ng 300 pg 30 pg 3 pg2 ng 200 pg 20 pg 2 pg1 ng 100 pg 10 pg 1 pg

Fig.2-2　各希釈バッファーの違いによるバックグラウンド比較画像左上：アガロースゲル 1×TAE

電気泳動バッファー 1×TAE希釈バッファー 1×TAE

画像右上：アガロースゲル 1×TAE電気泳動バッファー 1×TAE希釈バッファー 1×TBE

画像左下：アガロースゲル 1×TAE電気泳動バッファー 1×TAE希釈バッファー 1×TE

画像右下：アガロースゲル 1×TAE電気泳動バッファー 1×TAE希釈バッファー 1×水

DNAサンプルはFig.2-1と同一サンプルを使用。

TAEとTBEのバックグラウンド　一般的には電気泳動バッファーとしてTAEかTBEが用いられます。TAEは数kb以上の長いDNAの分離に、TBEは短いDNAの分離に適しています。検出感度はバックグラウンドに大きく依存するため、今回は電気泳動バッファーおよびSYBR® Green I の希釈バッファーにTAEを用いた系とTBEを用いた系でのバックグラウンドの比較を行いました。　TAEとTBEでは、若干TBEの方がバックグラウンドが高めになります。しかし以下の画像が示すとおり、検出感度に大きく影響するほどの差はないことが分かります。

SYBR® Green I 希釈バッファーの違いによるバックグラウンド　SYBR® Green Iの希釈バッファーとして、TAE、TBE、TE、水を使用し、比較を行いました。以下の画像から、TEおよび水バッファーのバックグラウンドが高くなることが分かります。

TAE (Tris-Acetate, EDTA)　0.04M Tris　0.04M 氷酢酸　0.001M EDTA (pH8.0)TBE (Tris-Borate, EDTA)　0.089M Tris　0.089M ホウ酸　0.002M EDTA (pH8.0)

TE (Tris-HCl, EDTA)　0.01M Tris　0.001M EDTA　HClを加えてpH8.0に調整する

バッファーの違いによるバックグラウンド比較

TAE TBE

Fig.2-1

TAE TBE

TE 水

Fig.2-2

Application Note No. 2

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文献中に見られた染色条件　SYBR® Green Iを用いた文献での染色時間は下表の様でした。いずれもPCR後のDNAを検出する目的で使われています。

ゲ　　　ル 染色液 染色時間 文献

3% Nu Sieve agarose 1:10,000 25分 1)1% GTG agarose / 1× TAE

10% ポリアクリルアミド 1:10,000 45分 2)17cmx13.5cmx1.5mm / 50mM Tris-HCl

7.5% ポリアクリルアミド 1:20,000 5-20分 3)

Fig.3-1　SYBR ® G r een IとEtB rにおける染色時間と蛍光強度

　染色にはゲルや電気泳動バッファーに予めSYBR® Green Iを入れておく方法（文献 1) 参照）や電気泳動後のゲルをSYBR® Green I染色液中で振とうする方法（文献 1), 2), 3) 参照）があります。　振とう法における所要時間の一つの目安として、厚さ5mmの1%アガロースゲルにおける染色時間と蛍光強度を調べると以下のようになりました。従来法（EtBr）と比較してほぼ同等の30分～60分以上振とうする必要があります。

PCR (Po l yme rase Cha inReaction)特定のDNAを多量に複製する方法です。耐熱性DNAポリメラーゼを用いて複製します。高温でd s D N AをssDNAに温度サイクリング（高温→低温→高温）を繰り返すことで特定のDNAを倍 に々増やします。

染色時間と蛍光強度

0 50 100 150 200 250

経過時間（min）�

バンド定量値（a.u.）�

EtBr

SYBR Green I

20

40

60

80

100

120

140

160

Fig.3-1

Application Note No. 2

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Fig.4-1　FLA-2000とUVトランスイルミネーターとの比較画像　左：UVトランスイルミネーター

（312nm）画像　右：FLA-2000

λDNA/Hind IIIをLane1-8に各々100ng, 10ng, 3ng, 1ng, 300pg,100pg, 30pg, 10pg アプライし、電気泳動。

→実験プロトコールは、「SYBR®

Green Iの基礎データ」章を参照。

　FLA-2000では、UVトランスイルミネーターの約10倍の感度で検出を行うことができました。　上記の実験では、UVトランスイルミネーターでは、47.7pgまでしか検出できていないのに対し、FLA-2000では4.77pgまで検出できています。

　λDNA/Hind IIIサンプルで、4.77pgまで検出することができました。　SYBR® Greenは、EtBrと比べてバックグラウンドが低い画像を得ることができます。

FLA-2000とUVトランスイルミネーターとの比較

SYBR® Green I の検出限界

Fig.4-2　FLA-2000の検出限界画像　：Fig.4-1と同一サンプル

バンドごとのDNA量（拡大図）

ｱﾌﾟﾗｲ量100ng 10ng 3ng 1ng 300pg 100pg 10pg30pg

1.16ng 116g 34.9pg 3.49pg 349fg11.6pg 1.16pg 116fg

4.18ng 418pg 125pg 41.8pg 12.5pg 4.18pg 1.25pg 418fg4.78ng 478pg 144pg 47.8pg 14.4pg 4.78pg 1.44pg 478fg

8.99ng 899pg 269pg 89.9pg 26.9pg 8.99pg 2.69pg 899fg13.5ng 1.35ng 405pg 135pg 40.5pg 13.5pg 4.05pg 1.35pg19.4ng 1.94ng 582pg 194pg 58.2pg 19.4pg 5.82pg 1.94pg47.7ng 4.77ng 1.43ng 477pg 143pg 47.7pg 14.3pg 4.77pg

SYBR® Green I の検出感度

UV FLA

Fig.4-1

4.77pg（拡大図）

Fig.4-2

Application Note No. 2

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　ここでは、FLA-2000用解析ソフトMacBASを用いた解析のワンポイントアドバイスをQ&A方式でご紹介いたします。

A.1　MacBASでは、データをSYBR® Green Iらしい擬似カラーで表示させることが簡単にできます。以下の手順にしたがってデータをカラー表示させてみましょう。

　まず、SYBR® Green Iの画像を開き、ImageメニューからColor Type*1のサブメニューにあるGreenを選択してください。選択するだけで簡単にSYBR® Green Iらしいグリーンの擬似カラー表示にかわります。

画像を開くFile ━ Open...

*1画像を開いた時のColor Typeの初期設定はNegative Grayになっています。

　さらに、ImageメニューからBrightness/Contrast*2のLinear...を選択してください。下のようなChange Curveダイアログ上で階調調整*3することにより、より美しく表示させることも可能となります。

* 2 画像を開いた時の B r i g h t -ness/Contrastの初期設定はSigmoidになっています。

これを選択

ここには今開いている画像のヒストグラムが表示されています。バックグラウンドノイズの消去の際参考にしてください

グラデーションバーのなかにカーソルをいれて、マウスを押しながら左右に動かしてくださいカーソルの移動によって画像のグラデーションが自動的に変化します

調整が終了したらここをクリックして階調を確定させます

Q.1　SYBR® Green Iを用いて作製したサンプルをFLA-2000で読み取りました。現在はグレースケールで表示されていますが、SYBR® Green Iらしいグリーンで表示させたいと思います。どうしたらよいでしょうか？

解析の流れ

・画像を開く・画像を見やすくする・定量する・プリントする・他のソフトウェアで活用する・データを保存させる・終了させる

*3ここで変更されるのは表示上の階調のみであり、定量時の画像データには一切影響しません。

MacBASでの解析ワンポイントアドバイス

Application Note No. 2

機事 SG-98/03-E i -2 -1

著者・編集

三浦　研二土谷　徹長島　眞喜子今井　千織（富士写真フイルム）

1998年 3月発行

1) Schneeberger, C., Speiser, P., Kury, F., Zeillinger, R. Quantitative detection

of reverse transcriptase-PCR products by means of a novel and sensitive

DNA stain. PCR Methods and Applications 4:234-238 (1995)

2) Piatyszek, M.A., Kim, N.W., Weinrich,S. L., Hiyama, K., Hiyama, E., Wright,

W.E., and Shay, J. W. Detection of telomerase activity in human cells and

tumors by a telomeric repeat amplification protocol (TRAP), Methods in

Cell Science, 17, 1-15 (1995)

3) Karlsen, F., Steen, H. B., Nesland, J. M. SYBR Green I DNA staining in-

creases the detection sensitivity of viruses by polymerase chain reaction,

Journal of Virological Methods 55:153-156 (1995)

4) Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrr

gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture

of bacterial species, Applied and Environmental Microbiology 61:2798-2801

(1995)

5) Kishida, T., Tamaki, Y., Kuroki, K., Fukuda, M., Wang, W., PCR amplifi-

cation of D2S44 (YNH24) alleles, Jpn. J. Legal Med. 49: 299-303 (1995)

6) Schmidt, D. M., Ernst J. D. A fluorometric assay for the quantification of

RNA in solution with nanogram sensitivity, Anal. Biochem. 232:144-146

(1995)

7) Law, J. C., Facher, E. A., Deka, A. Nonradioactive single-strand conforma-

tion polymorphism analysis with application for mutation detection in a mixed

population of cells, Anal. Biochem. 236:373-375 (1996)

8) Skeidsvoll, J., and Ueland, P. M. Analysis of double-stranded DNA by cap-

illary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection using the

monomeric dye SYBR Green I , Anal. Biochem. 231:359-365 (1995)

SYBR は米国 Molecular Probes社の登録商標です。MASS は米国 LIFE TECHNOLOGIES社の商標です。

参考文献