Secuenciación de DNA

Bases de la Secuenciación:

• Mediante una técnica llamada electroforesis se pueden separar los fragmentos de ADN que difieren en longitud por una base. – Con marcaje radiactivo y una placa de

autoradiografía se pueden detectar los nucleótidos. (Secuenciación Manual)

– Con el uso de luz monocromática y fotodetectores, las distintas bases pueden ser identificadas. (Secuenciación Automática)

Dideoxinucleótidos (ddNTP´s)

Método de Sanger

Requerimientos:

• Reacción de PCR con:– 1 Solo partidor marcado radiactivamente.

– ddNTP´s– 4 Reacciones de PCR (una para cada ddNTP)

– Revelado en una placa autoradiográfica.

Reacciones de PCR

Secuenciación Automática.

Diclororhodaminas

O

O

HO

-O2C

C

N H

HN

O

O

O

CO2-

Cl

Cl

NHH2N

O DNA

Amax 490 nm Emax 540 nm

(dR110/Fam)

O

O

HO

-O2C

C

N H

HN

O

O

O

CO2-

Cl

Cl

NH N

O DNA

Amax 490 nm Emax 565 nm

(dR6G/Fam)

O

O

HO

-O2C

C

N H

HN

O

O

O

CO2-

Cl

Cl

NMe2+Me2N

O DNA

Amax 490 nm Emax 590 nm

(dTamra/Fam)

O

O

HO

-O2C

C

N H

HN

O

O

O

CO2-

Cl

Cl

NN

O DNA

Amax 490 nm Emax 615 nm

+

(dRox/Fam)

Las Cuatro Moléculas de BigDyes

Laser

Espectrógrafo

Arreglo de capilares Ventana de detección

Cámara CCD

Sistema de DetecciónSistema de Detección

Dato Crudo

Bacillus thuringiensisBacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensisBacillus thuringiensis

• Ampliamente distribuido en el ambiente.

• En fase estacionaria produce ICP’s (Inclusión cristalina protéica).

• Tóxico frente a larvas de insectos y nemátodos.

• Utilizado en el antiguo Egipto es considerado uno de los primeros biopesticidas.

Plantas BtPlantas Bt

• Cry1Ab (en maíz)

• Cry1Ac (en algodón)

• Cry3A (en patata)

Genoma de Genoma de B. thuringiensisB. thuringiensis

• Tamaño aproximado de entre 2,4 a 5,7 Mb. (Genoma Humano 3.200 Mb).

• Análisis de las proteínas de los ICP’s indicaban la presencia de una proteína de 140 KDa.

• Genética reversa para encontrar el gen.

• Código genético degenerado.– 1 Aminoácido => > 1 codón

TIQGGDDVFKENYVTLPGTFDECYPTYLYQKIDESKLKAYTRYQL

RGYIGDSQDLEIYLIRYNAKHEIVNVPGTGSLWTLSVENSIGPCG

EPNRCAPHLEWNPNLECSCREGEKCAHHSHHFSLDIDVGCTDLNE

DLGVWAIFKIKTQDGHARLGNLEFLEEKPLVGEALARVKRAEKKW

RDKREKLELETNIVYKEAKESVDALFVNSQYDRLQADT

NIAMIHAADKRVHSIREAYLPELSII

244 aminoácidos => 244x3 nucleótidos 732 nucleótidos

Secuencia de la proteína CrySecuencia de la proteína Cry

IUPAC amino acid code Three letter code Amino acid

A Ala Alanine

C Cys Cysteine

D Asp Aspartic Acid

E Glu Glutamic Acid

F Phe Phenylalanine

G Gly Glycine

H His Histidine

I Ile Isoleucine

K Lys Lysine

L Leu Leucine

M Met Methionine

N Asn Asparagine

P Pro Proline

Q Gln Glutamine

R Arg Arginine

S Ser Serine

T Thr Threonine

V Val Valine

W Trp Tryptophan

Y Tyr Tyrosine

IUPAC nucleotide code Base

A Adenine

C Cytosine

G Guanine

T (or U) Thymine (or Uracil)

R A or G

Y C or T

S G or C

W A or T

K G or T

M A or C

B C or G or T

D A or G or T

H A or C or T

V A or C or G

N any base

. or - gap

T I Q G G D DACN ATH CAR GGN GGN GAY GAYACC ATC CAA GGG GGA GAT GACVFKENYVTLPGTFDECYPTYLYQKIDESKLKAYTRYQLRGYIGDSQDLEIYLIRYNAKHEIVNVPGTGSLWTLSVENSIGPCGEPNRCAPHLEWNPNLECSCREGEKCAHHSHHFSLDIDVGCTDLNEDLGVWAIFKIKTQDGHARLGNLEFLEEKPLVGEALARVKRAEKKWRDKREKLELETNIVYKEAKESVDALFVNSQYDRLQADTNIAMIHAADKRVHSIREAYL P E L S I IYTN CCN GAR YTN WSN ATH ATHCTT CCA GAG TTA TCT ATA ATT

Secuencia de la proteína CrySecuencia de la proteína Cry

Gen Cry-1Gen Cry-1 1 ACCATCCAAG GGGGAGATGA CGTATTCAAA GAGAATTACG TTACACTACC AGGTACCTTT 61 GATGAGTGCT ATCCAACGTA TTTATATCAA AAAATAGATG AGTCGAAATT AAAAGCCTAT 121 ACCCGTTATC AATTAAGAGG GTATATCGGG GATAGTCAAG ACTTAGAAAT CTATTTAATT 181 CGTTACAATG CAAAACACGA AATAGTAAAT GTACCAGGTA CAGGGAGTTT ATGGACTCTT 241 TCTGTAGAAA ATTCAATTGG ACCTTGTGGA GAACCGAATC GATGCGCGCC ACACCTTGAA 301 TGGAATCCTA ATCTAGAGTG TTCTTGCAGA GAAGGGGAAA AATGTGCCCA TCATTCCCAT 361 CATTTCTCCT TGGACATTGA TGTTGGATGT ACAGACTTAA ATGAGGACTT AGGTGTATGG 421 GCGATATTCA AGATTAAGAC GCAAGATGGC CATGCAAGAC TAGGAAATCT AGAGTTTCTC 481 GAAGAGAAAC CATTAGTAGG GGAAGCACTA GCTCGTGTGA AAAGAGCGGA GAAAAAATGG 541 AGAGACAAAC GTGAAAAATT GGAATTGGAA ACAAATATTG TTTATAAAGA GGCAAAAGAA 601 TCTGTAGATG CTTTATTTGT AAACTCTCAA TATGATAGAT TACAAGCGGA TACCAACATC 661 GCGATGATTC ATGCGGCAGA TAAACGCGTT CATAGCATTC GAGAAGCATA TCTTCCAGAG 721 TTATCTATAA TT

Estrategias posterioresEstrategias posteriores

• Clonado en el vector necesario.

• Chequeo de los clones mediante técnicas de biología molecular.

• Mapas de restricción.• Secuenciación.

• Transformación y selección de los organismos transformantes.