sekvenování dna
DESCRIPTION
Sekvenování DNA. MUDr. Michal Jurajda ÚPF LF MU Brno. Sekvenování DNA. Pojmem sekvenování DNA rozumíme proces určení pořadí jednotlivých bází v molekule DNA. Sekvenujeme oligonukleotidy DNA (kolem 500 bp, 1000 bp horní hranice). Sekvenování DNA. Metody sekvenování jsou založeny na: - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/1.jpg)
Sekvenování DNA
MUDr. Michal Jurajda
ÚPF LF MU Brno
![Page 2: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/2.jpg)
Sekvenování DNA
Pojmem sekvenování DNA rozumíme proces určení pořadí jednotlivých bází v molekule DNA.
Sekvenujeme oligonukleotidy DNA (kolem 500 bp, 1000 bp horní hranice)
![Page 3: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/3.jpg)
Sekvenování DNA
Metody sekvenování jsou založeny na:1. specifickém štěpení DNA (Maxam-Gilbert)
2. stop – syntéze (Sanger)
3. postupné syntéze (pyrosequencing)
4. ligaci sond (sequencing-by-ligation, SOLiD™)
![Page 4: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/4.jpg)
Základní princip 1. 2.
Produkce značených oligonukleotidů zakončených specifickou bází
Separace oligonukleotidů pomocí elektroforézy (desky, kapilára)
Detekce fragmentů (autoradiografie, fluorescence)
![Page 5: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/5.jpg)
1. Maxam-Gilbert
Podobně jako Sangerova metoda produkuje směs značených oligonukleotidů různé délky, ovšem pomocí specifického štěpení sekvenované DNA
Svého času rozšířená metoda i přes četné nevýhody (nebezpečné chemikálie, pracný postup)
![Page 6: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/6.jpg)
2. Sangerova metoda
Využívá DNA polymerázy a tzv. „stop nukleotidů“
Při syntéze DNA podle templátu, který představuje sekvenovanou DNA, získáváme směs oligonukleotidů různé délky, které končí specifickou bází
Stále nejpoužívanější postup
![Page 7: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/7.jpg)
![Page 8: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/8.jpg)
Možnosti značení
![Page 9: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/9.jpg)
Dideoxynukleotidy Při Sangerově metodě
používáme dideoxynukleotidy, na které už se nemůže navázat další deoxynukleotid a syntéza řetězce DNA je ukončena.
Pracujeme se 4 paralelními reakcemi. Každá reakční směs se liší přídavkem jednoho ddNTP
ddNTP se přidává v malém množství k dNTP, aby vznikaly náhodně produkty různé délky
2,3- dideoxy
2- deoxy
![Page 10: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/10.jpg)
Uděláme-li 4 reakce se zastavováním v pozicích čtyř různých nukleotidů a naneseme výsledky reakcí paralelně do čtyř drah gelu, můžeme číst úplnou sekvenci od 3’-konce primeru:
A T C G C T A A C T G C C T G C A C…
směr pohybu produktů v gelu
A
![Page 11: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/11.jpg)
![Page 12: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/12.jpg)
Fluorescenční značení
Čtyři terminační nu-kleotidy jsou zna-čeny každý jiným fluorescenčním barvivem
reakce může probíhat v jedné zkumavce, pruhy v gelu se po ozáření excitačním zářením zobrazují v různých barvách podle typu nukleotidu v místě terminace
![Page 13: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/13.jpg)
Využití kapilární elektroforézy pro sekvenování
zkumavka s fluo-rescenčně znače-nými produkty sekvenování
kapilára naplněná polyakrylamidovým gelem
mol
ekul
y se
tříd
í
podl
e ve
likos
ti
excitace emise jedné ze 4 vlnových délek podle typu fluorescenčního barviva, kterým je označen právě procházející nukleotid
![Page 14: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/14.jpg)
Kapilární elektroforéza - detail
http://www.appliedbiosystems.com/lib/multimedia/3100/212k/DSWMEDIA/3100.cfm
![Page 15: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/15.jpg)
Pyrosekvenování
Sekvenování v průběhu syntézy komplementárního vlákna
Postupně se přidáváni nukleotid trifosfáty a sleduje se, který nukleotid se naváže.
![Page 16: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/16.jpg)
Enzyme cascade system
PPi
ATP
![Page 17: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/17.jpg)
Detection of the light
light
time
![Page 18: Sekvenování DNA](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061617/56815228550346895dc06f38/html5/thumbnails/18.jpg)
SOLiD systém