selección de bacterias con capacidad promotora de
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL
UNIDAD SINALOA
Selección de bacterias con capacidad promotora de crecimiento en frijol a partir del banco de microorganismos de la rizósfera CIIDIR 003
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA KARLA MARÍA COTA OCHOA
GUASAVE, SINALOA, MÉXICO DICIEMBRE DE 2012
El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola del
Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR)
Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN), bajo la dirección de la Dra.
Melina López Meyer y el Dr. Francisco R. Quiroz Figueroa. El presente trabajo fue
apoyado económicamente a través del Megaproyecto ”Fortalecimiento de la
rentabilidad del sistema producto-frijol mediante el uso de herramientas
biotecnológicas” apoyado por la Secretaria de Investigación y Posgrado del IPN
(2011-2012). El alumno/a Karla María Cota Ochoa fue apoyado con una beca
CONACyT (Número de registro 366318) y PIFI-IPN (SIP 20120496).
i
DEDICATORIA Y AGRADECIMIENTOS
Totalmente dedicada a mis papas y hermanas, que siempre me han apoyado en todo sin
perderme la fé en ningún instante, y que saben que somos todos para uno y uno para todos!!
Muchas gracias a las personas conocidas durante el trayecto y a mis queridos compañeros del
laboratorio de Interacción Microorganismo planta, Fitomejoramiento molecular y al lab de
Ecología Molecular de la Rizósfera.
A mi comité tutorial: Dr. Nacho, Dra. Claudia, Dra. Diana y Dr. Paco, Gracias por todo lo
aportado.
A la Dra. Melina, muchisisimas gracias por todo lo que me enseñó, por su paciencia y por ser
esa excelente persona.
Alejandro, muchas gracias por ser parte de mi presente morsi , por la paciencia en todo
momento de estrés y la ayuda infinita para terminar el proyecto.
A Analilia, Nadia, Ale, Odette, Oli, Damian, Tavo, Hector, Roger, Luis, Miguel, Chio, Lalo y
Camila. Gracias por su amistad.
Y a mis amigos de la vida, Blanca, Carmina, Irasema, Nestor y Edgar. Gracias!
ii
CONTENIDO
GLOSARIO ................................................................................................................. iv ABREVIATURAS ....................................................................................................... viii ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................ ix ÍNDICE DE CUADROS .............................................................................................. xi RESUMEN ................................................................................................................ xii ABSTRACT ............................................................................................................... xiii 1. INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1 2. ANTECEDENTES ................................................................................................... 3
2.1 El frijol y su importancia en México y Sinaloa .................................................... 3
2.2 Rizósfera ............................................................................................................ 5
2.3 Bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV) ...................................... 6
2.4 Ventajas de la utilización de aislados nativos. ................................................... 8
2.5 Auxinas y su influencia en el crecimiento vegetal. ............................................ 8
2.6 Bacterias solubilizadoras de fosfatos ............................................................... 10
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................... 11 4. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................... 12 5. HIPÓTESIS ........................................................................................................... 13 6. OBJETIVOS .......................................................................................................... 14
6.1 Objetivo general ............................................................................................... 14
6.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 14
7. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 15 7.1 Estrategia del trabajo ....................................................................................... 15
7.2 Reactivación de aislados bacterianos y determinación cualitativa de auxinas . 16
7.3 Pruebas de hemólisis ....................................................................................... 16
7.4 Cuantificación de AIA ....................................................................................... 17
7.5 Cinética de crecimiento (aislados E9 y 5) y producción de auxinas (aislados E9) ............................................................................................................................... 17
7.6 Efecto de auxinas en arquitectura radical de Arabidopsis thaliana. ................. 18
7.7 Pruebas en plantas de frijol .............................................................................. 19
7.7.1 Experimento de aplicación de bacterias productoras de auxinas en rizoconos ............................................................................................................ 19
7.7.2 Experimento de aplicación de bacterias productoras de auxinas en macetas .............................................................................................................. 22
7.7.3 Experimento de aplicación de bacterias solubilizadoras de PO4 en macetas en condiciones de fosfato soluble ...................................................................... 22
7.7.4 Análisis de fosfato inorgánico libre (Pi) en raíces y hojas de frijol ............. 23
7.7.5 Experimento de aplicación de bacterias solubilizadoras de fosfato PO4 en macetas en condiciones de fosfato insoluble ..................................................... 24
iii
7.7.6 Experimento de combinación de bacteria productora de auxinas y solubilizadora de fosfatos. .................................................................................. 24
8. RESULTADOS ...................................................................................................... 26 8.1 Selección de bacterias productoras de auxinas ............................................... 26
8.2 Prueba de hemólisis ......................................................................................... 27
8.3 Curva estándar de AIA y cuantificación ........................................................... 28
8.4 Cinética de crecimiento y producción de auxinas de los aislados E9 y 5 ......... 31
8.5 Análisis de exudados de bacterias productoras de auxinas E9 y H7 en arquitectura radical en Arabidopsis thaliana .......................................................... 33
8.6 Evaluación de la capacidad promotora de crecimiento de los aislados productores de auxinas y solubilizadoras de fosfato en plantas de frijol a nivel maceta. .................................................................................................................. 35
8.6.1 Experimento de aplicación de bacterias productoras de auxinas en rizocono. ............................................................................................................. 35
8.6.2 Experimento de aplicación de bacterias productoras de auxinas en maceta ........................................................................................................................... 38
8.6.3 Experimento de aplicación de bacterias solubilizadoras de fosfato........... 42
8.6.4 Experimento de aplicación de bacterias solubilizadoras de fosfato a plantas de frijol fertilizadas con fosfato soluble-insoluble ............................................... 45
8.6.5. Combinación de bacteria productora de auxinas y solubilizadora de fosfatos. .............................................................................................................. 49
8.6.6 Análisis de fósforo inorgánico libre (Pi) en raíces y hojas de frijol ............. 53
9. DISCUSIÓN .......................................................................................................... 55 10. CONCLUSIONES ................................................................................................ 65 11. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................... 66 12. ANEXOS ............................................................................................................. 71
ANEXO 1. .............................................................................................................. 71
ANEXO 2. .............................................................................................................. 84
iv
GLOSARIO
Ácido indolacético: metabolito final del triptófano siendo activo en pequeñas
cantidades y está asociado a diversos procesos fisiológicos tales como: dominancia
apical, tropismos, elongación de brotes, inducción de división celular e iniciación de
elongación de raíz.
Ácidos orgánicos: los ácidos orgánicos son una variedad de ácidos que se
concentran habitualmente en los frutos de numerosas plantas. Son compuestos
orgánicos que poseen al menos un grupo ácido. Se distinguen el ácido cítrico,
fórmico, acético, málico, tartárico, salicílico, oxálico, y los grasos.
Absorbancia: cantidad de intensidad de luz que absorbe una muestra.
Auxina: fitohormona que funcionan como reguladoras del crecimiento vegetal.
Esencialmente provocan la elongación de las células. Se sintetizan en las regiones
meristemáticas del ápice de los tallos y se desplazan desde allí hacia otras zonas de
la planta, principalmente hacia la base, estableciéndose así un gradiente de
concentración.
Bacterias promotoras de crecimiento vegetal: bacterias habitantes de la raíz que
estimulan significativamente el crecimiento de las plantas.
Banco de germoplasma: colección de organismos preservada de manera viable.
Consiste en ubicar, recolectar, conservar y caracterizar el plasma germinal de
organismos que, por sus atributos son considerados de interés para beneficio de la
humanidad, además de aportar conocimiento científico orientado a la optimización de
la conservación y uso de los recursos fito-zoogenéticos y/o microbiológicos.
Biofertilizantes: se caracterizan por la presencia de microorganismos vivos que no
causan daño o enfermedad al hombre, a los animales ni a las plantas. Pueden
emplearse bacterias u hongos microscópicos, que se asocian en forma natural con
las raíces de las plantas, beneficiando su crecimiento y el rendimiento de los cultivos.
v
Cinética enzimática: estudia la velocidad de las reacciones químicas que son
catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética y de la dinámica química de una
enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el
metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida
su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas.
Colonización bacteriana: capacidad de las bacterias para establecerse y
multiplicarse en la piel, plantas, y/o mucosas del huésped en cantidades suficientes
que permitan mantener un cierto número poblacional.
Concentración: proporción o relación que hay entre la cantidad de soluto y la
cantidad de disolvente, donde el soluto es la sustancia que se disuelva, el disolvente
la sustancia que disuelve al soluto, y la disolución es el resultado de la mezcla
homogénea de las dos anteriores. A menor proporción de soluto disuelto en el
disolvente, menos concentrada está la disolución.
Estrés: reacción fisiológica del organismo en el que entran en juego diversos
mecanismos de defensa para afrontar una situación que se percibe como
amenazante o no óptima para el crecimiento y desarrollo.
Exudados: mezclas complejas de origen vegetal o bacteriano, con consistencia
sólida o semisólida obtenidas través de sus porosidades.
Fertilización: proceso a través del cual se preparará a la tierra añadiéndole diversas
sustancias que tienen el objetivo de hacerla “rica” y disponible los nutrientes para la
siembra y la plantación de semilla.
Fitoregulador: son sustancias químicas producidas por algunas células vegetales en
sitios estratégicos de la planta y estas hormonas vegetales son capaces de regular
de manera predominante los fenómenos fisiológicos de las plantas.
Fosfatos: son las sales o los ésteres del ácido fosfórico. Tienen en común un átomo
de fósforo rodeado por cuatro átomos de oxígeno.
vi
Hemólisis: es el fenómeno de la desintegración de los eritrocitos (glóbulos rojos o
hematíes).
Inóculo: es la cantidad o número de bacterias infectantes que son introducidos
accidental o voluntariamente en los tejidos vivos o en medios de cultivos especiales.
Inoculante: es un concentrado de bacterias específicas, que aplicado
convenientemente a la semilla poco antes de su sembrado, mejora el desarrollo del
cultivo. Su empleo es una práctica agronómica reconocida en el mundo por sus
beneficios productivos y económicos
Microorganismo: también llamado microbio, es un ser vivo que solo puede
visualizarse con el microscopio. La ciencia que estudia los microorganismos es la
microbiología. Son organismos dotados de individualidad que presentan, a diferencia
de las plantas y los animales, una organización biológica elemental. En su mayoría
son unicelulares.
Microorganismo nativo: son aquellos microorganismos que se han desarrollado y
adaptado a ciertas condiciones geográficas, climáticas y edafológicas de cada
región.
Mineralización: la mineralización es la transformación del nitrógeno orgánico en
amonio, mediante la acción de microorganismos del suelo. En general, el término
indica el proceso global de conversión del nitrógeno orgánico en nitrógeno mineral,
fundamentalmente nitrato y amonio.
pH: el potencial de hidrógeno es una medida de la acidez o alcalinidad de una
sustancia química
Patógeno: organismo que causa enfermedad
Resistencia sistémica: las plantas han evolucionado y de esta manera han
desarrollado mecanismos naturales de defensa que les ayudan a protegerse de los
daños ocasionados por los patógenos. Cuando la planta es amenazada por hongos,
vii
bacterias o virus, produce una señal molecular que activa la defensa en toda la
planta, algo parecida a la vacunación en los seres humanos.
Rizósfera: es la zona milimétrica adyacente a las raíces de las plantas donde tiene
lugar una interacción dinámica con los microorganismos.
Simbiosis: una asociación benéfica mutua para dos o más diferentes tipos de
organismos.
Solubilizar: es una medida de la capacidad de disolverse de una determinada
sustancia (soluto) en un determinado medio (solvente); implícitamente se
corresponde con la máxima cantidad de soluto disuelto en una cantidad de solvente
a una temperatura fija y en dicho caso se establece que la solución está saturada.
viii
ABREVIATURAS
AIA. Ácido indolacético
Abs. Absorbancia
BPCV. Bacterias promotoras de crecimiento vegetal
cm. Centímetros
DO. Densidad óptica
g. Gramos
h. Horas
min. Minutos
nm. Nanómetro
RPM. Revoluciones por minuto
Trp. Triptófano
UFC. Unidades formadoras de colonias
ix
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura química del ácido 3-indol acético. .............................................. 9 Figura 2. Aislados bacterianos seleccionados creciendo en incubadora. ................. 20 Figura 3. Siembra de semillas de frijol en rizoconos. ............................................... 20
Figura 4. Plantas de frijol cuyas semillas fueron tratadas con las cepas productoras de auxinas E9, H6 y H7. ............................................................... 21
Figura 5. Ensayo de Salkowski. Curva de concentraciones conocidas de ácido indolacético (AIA). ............................................................................................. 26
Figura 6. Prueba de hemólisis de los aislados seleccionados. B10 es un ejemplo de una cepa α-hemolítica (flecha negra); E8 es un ejemplo de
una cepa -hemolítica (flecha amarilla); D1 es un ejemplo de una cepa -hemolítica (flecha blanca). ................................................................................ 27
Figura 7. Prueba de Salkowski al sub-banco CIIDIR-AUX ɣ con (0.005 M) y sin triptófano. .......................................................................................................... 28
Figura 8. Perfil de absorbancia de soluciones de AIA a diferentes concentraciones en un intervalo de 460 a 600 nm. SALK= Salkowski, TRP= Triptófano ............................................................................................... 29
Figura 9. Perfil espectrofotométrico de absorbancia del medio de cultivo de aislados bacterianos productores de auxinas crecidos con y sin triptófano adicionado al medio. ......................................................................................... 30
Figura 10. Curva estándar para concentraciones de AIA en los aislados, a una absorbancia de 530 nm. ................................................................................... 31
Figura 11. Cinética de crecimiento de aislado 5. ...................................................... 32
Figura 12. Cinética de crecimiento y concentraciones de auxinas en el aislado E9. Línea azul (DO) y línea punteada roja (concentraciones de AIA) ............... 33
Figura 13. Aumento de longitud de raíz por efecto de AIA y exudados de bacterias adicionadas al medio MS. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. Experimento realizado una vez. ........................................................................ 34
Figura 14. Número de raíces secundarias de Arabidopsis thaliana crecidas en medio MS con AIA y con exudados de los aislados E9 y H7. El testigo indica medio MS sin AIA. Letras distintas muestran las diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar..................... 34
Figura 15. Efecto de la adición de AIA sobre el número de raíces laterales en Arabidopsis thaliana (panel D), exudado de bacteria E9 (panel B) y H7 (panel C) y testigo en medio MS (panel A) en la longitud y número de raíces laterales de Arabidopsis thaliana. .......................................................... 35
Figura 16. Frijol de variedad Azufrado Higuera a los tres días de siembra en rizoconos. ......................................................................................................... 36
Figura 17. Altura (cm) de las plantas de frijol crecidas en rizoconos cuyas semillas fueron embebidas en suspensiones bacterianas de los aislados E9, H6 y H7, así como en soluciones de 1 µM, 1 nM y 1 pM de AIA disuelto en KOH diluido, las correspondientes concentraciones de KOH y
x
agua como testigo. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar.................................................. 36
Figura 18. Crecimiento de raíz en plantas de frijol crecidas en rizoconos a) peso fresco (g) de raíz y b) peso seco (g) de raíz. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ........................................................................................................... 37
Figura 19. Promedio de altura (cm) de las plantas de frijol tratadas con las bacterias productoras de auxinas E9, H6 y H7 y con agua como testigo. Letras distintas indican diferencias estadísticas significativas. Las barras significan desviación estándar. ......................................................................... 38
Figura 20. Promedio de la suma del número de flores y vainas (estructuras reproductivas) de las plantas de frijol al momento de la cosecha tratadas con las bacterias productoras de auxinas E9, H6 y H7 y con agua (plantas testigo). Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ................................................................. 39
Figura 21. Promedio en el crecimiento en peso fresco (a) y peso seco (b) de la parte aérea de las plantas de frijol tratadas. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras significan desviación estándar. ............... 40
Figura 22. Promedio en el crecimiento (g) de raíz de plantas de frijol tratadas con bacterias productoras de auxinas E9, H6 y H7 y con agua (Testigo) a) peso fresco y b) peso seco. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar..................... 41
Figura 23. Promedio de la altura (cm) de plantas de frijol inoculadas con las bacterias solubilizadoras de fosfatos 5, 13 y 25 y control de agua (Testigo). Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ................................................................. 42
Figura 24. Crecimiento de parte aérea de plantas de frijol inoculadas con las bacterias solubilizadoras de fosfatos 5, 13 y 25 y testigo con agua. a) peso fresco y b) peso seco. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar..................... 43
Figura 25. Crecimiento de raíz en plantas de frijol con n días de edad e inoculadas con las bacterias solubilizadoras de fosfatos 5, 13 y 25 y el testigo. a) peso fresco y b) peso seco. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar..................... 44
Figura 26. Altura de las plantas de frijol tratadas con la bacteria 5, la cual es capaz de solubilizar fosfatos y plantas no inoculadas (testigo) bajo tres diferentes condiciones de disponibilidad de fosfato. El registro de los datos fue realizado usando plantas con 42 días de edad. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ........................................................................................................... 45
Figura 27. Suma del número de flores y vainas de plantas de frijol tratadas con la bacteria 5, la cual es capaz de solubilizar fosfatos y plantas no inoculadas (testigo) bajo tres diferentes condiciones de disponibilidad de fosfato. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ................................................................. 46
Figura 28. Promedio de crecimiento (g) de la parte aérea de plantas de frijol tratadas con la bacteria 5, la cual es capaz de solubilizar fosfatos y
xi
plantas no inoculadas (testigo) bajo tres diferentes condiciones de disponibilidad de fosfato. (a) peso fresco y (b) peso seco. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ........................................................................................................... 47
Figura 29. Promedio de crecimiento (g) de raíz de plantas de frijol tratadas con la bacteria 5, la cual es capaz de solubilizar fosfatos y plantas no inoculadas (testigo) bajo tres diferentes condiciones de disponibilidad de fosfato. (a) peso fresco y (b) peso seco. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ........................................................................................................... 49
Figura 30. Promedio de altura (cm) de plantas de frijol crecidas en cuarto de crecimiento a 25°C e inoculadas con las bacterias E9 y 5, así como una combinación de ambas y un testigo no inoculado. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ........................................................................................................... 50
Figura 31. Suma del número de flores y vainas de plantas de frijol crecidas en cuarto de crecimiento a 25°C e inoculadas con las bacterias E9 y 5, así como una combinación de ambas y un testigo no inoculado. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ......................................................................................... 50
Figura 32. Promedio de crecimiento (g) de parte aérea de plantas de frijol crecidas en cuarto de crecimiento a 25°C e inoculadas con las bacterias E9 y 5, así como una combinación de ambas y un testigo no inoculado. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ......................................................................... 51
Figura 33. Promedio de crecimiento de raíz (g) de plantas de frijol crecidas en cuarto de crecimiento a 25°C e inoculadas con las bacterias E9 y 5, así como una combinación de ambas y un testigo no inoculado. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. ......................................................................................... 52
Figura 34. Cantidad total final de fósforo inorgánico en hojas de frijol. .................... 53 Figura 35. Cantidad total final de fósforo inorgánico en raíz de frijol ........................ 54
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Tratamientos aplicados en el experimento de rizoconos. ........................ 20 Cuadro 2. Absorbancia y concentración de AIA de los aislados E9, H6 y H7 en
medio LB con y sin triptófano. ........................................................................... 31
xii
RESUMEN
La utilización de bacterias promotoras de crecimiento es una estrategia que se está empleando en
muchos lugares del mundo para beneficiar a los cultivos y sustituir al mismo tiempo el uso de insumos
químicos en la agricultura. Es recomendable la utilización de microorganismos nativos ya que se
encuentran adaptados a los suelos y ambientes propios de cada región. Entre éstos, existen bacterias
capaces de producir fitohormonas como las auxinas, las cuales actúan sobre la elongación y la
división celular jugando un papel importante en el crecimiento de órganos y frutos. Por otro lado, las
bacterias solubilizadoras de fosfatos aumentan la disponibilidad de este nutriente promoviendo de esta
manera el crecimiento vegetal. La estrategia de utilizar bacterias promotoras de crecimiento
representa una alternativa para propiciar una redirección hacia una agricultura más sustentable. Por lo
tanto, el objetivo principal de este proyecto fue seleccionar bacterias con capacidad promotora de
crecimiento vegetal en frijol a partir del banco de microorganismos de rizósfera de maíz CIIDIR 003.
Primeramente, 5,422 aislados fueron probados en cuanto a su capacidad de producir auxinas
mediante una reacción colorimétrica que utiliza el reactivo de Salkowski. Posteriormente, las bacterias
seleccionadas fueron evaluadas en una prueba de hemólisis descartando aquellas que presenten
hemólisis α (parcial) o β (total). Los aislados seleccionados como productores de auxinas fueron
probados en cuanto a su capacidad de inducir mayor número de raíces secundarias y pelos
absorbentes en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Adicionalmente de los aislados seleccionados
como productores de auxinas y solubilizadoras de fosfato se probó su promoción de crecimiento en
plantas de frijol cultivadas en macetas. A través de estos escrutinios, se identificaron a 250 aislados
productores de auxinas de los cuales 35 resultaron ɣ-hemolíticos y cualitativamente fueron
seleccionados tres aislados productores de auxinas (E9, H6 y H7), los cuales fueron probados como
promotores de crecimiento en frijol en maceta, resultando el aislado E9 (Bacillus spp.), pero no los H6
y H7, mostrando una promoción de crecimiento de raíces tanto en peso fresco como en peso seco. De
los tres aislados solubilizadores de fosfatos (5, 13 y 25) probados en plantas de frijol a nivel maceta se
obtuvo un incremento en peso fresco y seco en raíz del aislado 5 (Bacillus circulans). Finalmente,
probamos la capacidad del aislado 5 para solubilizar fosfato de estado insoluble (fosfato tricálcico,
Ca3(PO4)2) adicionado en las soluciones de fertilización (Hoagland) en porcentajes de 90% y 100%,
encontrando que el tratamiento con 100% de fosforo insoluble con y sin bacteria resultaron diferentes
entre sí destacándose la que tenía la adición de la bacteria. BPCV identificadas como productoras de
auxinas (E9) y solubilizadores de fosfato (5) fueron capaces de promover el crecimiento vegetal en
frijol crecidas en macetas y candidatos para ser probadas como promotores de crecimiento bajo
condiciones de campo.
xiii
ABSTRACT
The use of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) is a strategy that is being used in
many places around the world, to benefit the agriculture, and to try to replace the use of
agrochemicals. It is highly recommended to use native microorganisms, as they are pre-
adapted to soil and environmental conditions specific from each area. Among them, we can
find strains which are able to produce phytohormones such as auxins, which act directly on
cell elongation and division, and playing a mayor role on organ and fruit growth (Salisbury et
al., 1994), Also bacterial strains that are able to solubilize phosphate and make it available to
the plant are commonly used as PGPRs. The use of these microorganisms represents an
alternative against conventional agriculture. Hence, our goal in this project was to select
strains able to promote growth of common bean from a bank of maize rhizospheric bacteria
named CIIDIR 003. First, 5,422 isolates were tested for their ability to produce auxins through
the Salkowski colorimetric technique. Subsequently, the selected bacteria were evaluated
using a hemolysis screening assay discarding those which presented α (partial) or β
(complete) hemolysis. Isolates selected as auxin producers were tested for their ability to
increase the number of secondary roots and root hairs in the model plant Arabidopsis
thaliana. Finally, isolates selected as auxin-producers and phosphate-solubilizers were tested
to promote growth in common bean plants in pot experiments. 250 auxin-producer isolates
were obtained and 35 of them were ɣ-hemolytic. Out of them, the three best auxin producer
isolates were selected (E9, H6 and H7). Pot experiments indicated that E9 but not H6 and
H7, showed a growth promoting effect in root fresh and dry weight. Three phosphate
solubilizing isolates (5, 13 and 25) were tested in pots, and it was observed an increase in
root fresh and dry weight with isolate 5 (Bacillus circulans). Finally, we tested under controlled
conditions the ability of isolate 5 to solubilize insoluble phosphorus (tricalcium phosphate [Ca3
(PO4)2]) added into the fertilization solution at 90 and 100%. It was found that the presence of
isolate 5 promote growth of common bean plants fertilized 100% insoluble phosphorus
compared to plants with no bacteria. Strains previously identified as PGPR (5) and (E9) were
capable to promote de root growth under laboratory conditions.
1
1. INTRODUCCIÓN
La interacción entre microorganismos del suelo y las plantas ocurre en la
rizósfera, la cual es la zona adyacente a las raíces que se ve influenciada por la
actividad metabólica de las plantas. Las rizobacterias, las cuales colonizan la
superficie de las raíces y el suelo adyacente a las mismas, puede influenciar el
crecimiento vegetal tanto positiva como negativamente (Nehl et al., 1996). Además,
existen bacterias que viven en el tejido vegetal y pueden inducir resistencia sistémica
a enfermedades vegetales o promover el crecimiento vegetal (Chanway, 1996). Por
todo esto, existe un considerable interés por identificar bacterias de la rizósfera que
puedan tener algún efecto positivo en el crecimiento vegetal y puedan ser utilizadas
como bacterias promotoras de crecimiento en diferentes cultivos de importancia para
el estado de Sinaloa.
El frijol es una leguminosa de gran relevancia en México siendo Sinaloa el
cuarto productor a nivel nacional (SIAP-SAGARPA, 2012). Además, es un cultivo
central en la dieta de la población mexicana siendo así una actividad de importancia
económica y de subsistencia fundamental para muchas familias en el país.
Esto hace que exista interés por aumentar la rentabilidad del cultivo de frijol
mediante estrategias que dirijan la agricultura de hoy en día a esquemas más
sostenibles. Una de estas estrategias es la utilización de microorganismos que
ayuden al buen desempeño de los cultivos, tales como bacterias antagonistas contra
enfermedades de plantas y/o bacterias promotoras de crecimiento.
Actualmente existe en el laboratorio de Ecología Molecular de la Rizósfera una
colección de 11,520 microorganismos de rizósfera de maíz aislados y en su mayoría
identificados molecularmente (Colección CIIDIR 003, Maldonado-Mendoza et al.,
2010). Esta colección fue creada con la idea de servir como una herramienta
biotecnológica para la búsqueda de aislados que puedan resultar útiles en diferentes
cultivos de la región.
2
El propósito del presente trabajo fue la selección de microorganismos de tal
colección con capacidad de promover el crecimiento en frijol. Para ello, los aislados
bacterianos fueron primeramente probados en cuanto a su capacidad para producir
ácido indolacético; la principal auxina con actividad biológica y posteriormente para
promover el crecimiento en frijol. Bacterias identificadas como solubilizadoras de
fosfatos en trabajos previos (Figueroa-López, 2011) fueron también probadas en
plantas de frijol como promotoras de crecimiento, con la finalidad de seleccionar
aislados que puedan ser la base para la generación de un producto biofertilizante
específico para frijol en esta región.
3
2. ANTECEDENTES
2.1 El frijol y su importancia en México y Sinaloa
El frijol es una de las leguminosas más ampliamente distribuidas y consumidas
en el mundo. En México, es un cultivo tradicional que se siembra en todas las
regiones agrícolas y representa el segundo producto agrícola alimenticio después del
maíz y uno de los alimentos básicos de la dieta en el medio rural, además por ser
una excelente fuente de proteínas y fibra, no contener colesterol, ser rico en vitamina
B, hierro, calcio, potasio, fósforo y por sus bajas cantidades de sodio (FAOSTAT,
2012) convirtiéndolo en un alimento muy importante en la nutrición del ser humano.
Se considera que el frijol es un producto estratégico para el desarrollo rural del país
debido a que cerca de 650,000 productores se dedican a este cultivo (FAOSTAT,
2012). Adicionalmente, presenta gran diversidad en cuanto a métodos de cultivo,
adaptabilidad a diversos ambientes, usos y variabilidad morfológica.
La mayor parte de la producción se obtiene en los estados de Zacatecas,
Nayarit, Chiapas, Sinaloa y Guanajuato, sin dejar de ser importante en el resto de los
estados donde se establece en pequeñas superficies. En México para el 2011 se
obtuvo una producción de 567,779.15 toneladas de frijol (SAGARPA, 2012). La
superficie sembrada de frijol en el país ha disminuido paulatinamente en los últimos
10 años (de 2.4 millones de ha que se sembraron en 1999 a 1.5 en el 2011). Por otro
lado, en la zona norte de México se consumen las variedades azufradas, que se
cultivan principalmente en Sinaloa y el norte del país mientras que una gran parte de
frijol negro se cultiva en Nayarit y Zacatecas, con una demanda mayormente
concentrada en las zonas centro y sur del país.
En Sinaloa en el ciclo agrícola otoño-invierno 2011 se sembraron 91,140.80
Ha a nivel nacional, a partir de este cultivo se obtuvo una ganancia monetaria de
$6’689,765.84 de los cuales $567,783.370 proceden del estado de Sinaloa
(SAGARPA, 2012).
4
Por su gran importancia económica y social, el frijol es un producto estratégico
dentro del desarrollo rural de México, ya que ocupa el segundo lugar en cuanto a
superficie sembrada nacional y representa además la segunda actividad agrícola
más importante en el país por el número de productores dedicados al cultivo. Es así,
que como generador de empleos es relevante dentro de la economía del sector rural.
Sin embargo, el cultivo del frijol en México presenta una compleja
problemática debido a las diversas condiciones bio-geográficas existentes en las
diferentes regiones en las que se produce, así como a las preferencias regionales de
consumo de los distintos tipos de frijol. Adicionalmente, el cultivo ha sido desplazado
a zonas de temporal cuyo principal problema es la disponibilidad de agua, suelos con
bajo contenido de materia orgánica, presencia de plagas y enfermedades y heladas
tempranas. Por otro lado, se tiene un bajo uso de variedades mejoradas, pese a la
amplia gama de variedades liberadas por el INIFAP.
El reto de los productores de frijol es sin duda mejorar su competitividad, lo
cual no podrá alcanzarse si no se incorpora el uso de tecnologías tradicionales y
modernas, con el objetivo de incrementar la producción y mejorar la productividad de
manera sostenible y eficiente. Dentro de los factores que limitan la productividad del
frijol se encuentran la presencia de organismos patógenos, deficiencias nutricionales
y la limitación de agua, entre otros factores abióticos. Adicionalmente a los factores
anteriormente expuestos, para mejorar la productividad del cultivo se debe
considerar las diversas regiones de cultivo, el sistema de producción y la variedad a
mejorar.
La utilización de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV) es una
estrategia que se está empleando en muchos lugares del mundo para beneficiar a
los cultivos y sustituir al mismo tiempo el uso de insumos químicos en la agricultura
(Ashrafuzzaman et al., 2009). Sin embargo, la utilización de microorganismos nativos
tiene mayor probabilidad de funcionar ya que estos organismos están adaptados a
los suelos y ambientes propios de cada región.
5
2.2 Rizósfera
La rizósfera es la zona del suelo que se encuentra rodeando a la raíz de la
planta y mide alrededor de 1 mm. En este pequeño lugar suceden intensos procesos
biológicos en los que intervienen compuestos químicos del suelo, y provenientes de
las secreciones de microorganismos y plantas, los cuales promueven o bloquean su
interacción (Lines-Kelly, 2005), siendo así una zona de interacción única y dinámica
entre raíces de plantas y microorganismos del suelo. Esta región especializada, está
caracterizada por el aumento de la biomasa microbiana y de su actividad. En la
rizósfera se generan una serie de interacciones complejas, debido a una actividad
biológica intensa y a una transferencia de agua y nutrientes desde el suelo hacia la
planta que puede estar mediada o no por la microbiota circundante a la raíz. Estas
interacciones pueden resultar benéficas o dañinas a las plantas (Honorato, 2000). En
la rizósfera existe una amplia gama de compuestos orgánicos, tales como exudados
de raíces de bajo peso molecular, secreciones (Morel et al., 1986) y lisados celulares
(Bowen, 1980); por lo tanto las raíces actúan como una fuente de carbono orgánico
para los microorganismos que crecen en la rizósfera. Por ello, la densidad de las
poblaciones de microorganismos es considerablemente más alta en la rizósfera que
en el suelo lejano a la raíz (Marschner, 1999).
Las comunidades en la rizósfera consisten en los siguientes grupos: de la
microbiota (bacterias, hongos y algas) y de la micro y mesofauna (protozoos,
nemátodos, insectos y ácaros). La micro y mesofauna contribuyen significativamente
en los procesos de descomposición en los ecosistemas auxiliando con el catabolismo
de sustancias nocivas en la rizósfera. Las dimensiones físicas y la actividad
microbiana en la rizósfera dependen de factores específicos del sitio y de la planta,
como por ejemplo los referidos a las especies, edad y vigor de las plantas. La
rizósfera provee de un microambiente complejo y dinámico, donde las bacterias y
hongos, en asociación con las raíces, forman comunidades únicas que tienen
considerable potencial para la detoxificación de compuestos orgánicos nocivos
(Brock, 1976; Walton et al, 1994).
6
Los microorganismos que colonizan la rizósfera se pueden clasificar de
acuerdo a los efectos que tienen sobre las plantas y a la manera en que interactúan
con las raíces; algunos microorganismos son patógenos de plantas mientras que
otros tienen efectos benéficos sobre éstas (Mantelin y Touraine, 2004; Matiru y
Dakora, 2004). En la rizósfera, las rizobacterias comúnmente se agrupan en
microcolonias.
Estos microorganismos se benefician al tomar las sustancias secretadas por
las plantas y en algunos casos pueden ocasionar una estimulación en el crecimiento
de las mismas (Bloemberg y Lugtenberg, 2001). En el grupo de rizobacterias
promotoras de crecimiento se incluyen algunos géneros como: Pseudomonas,
Burkholderia, Bacillus, Azospirillum, Herbaspirillum, Enterobacter y Azotobacter,
entre otros (Kennedy et al., 2004).
2.3 Bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV)
Las BPCV son microorganismos que causan el aumento en biomasa de toda
la planta o de algunos de sus órganos. Las BPCV han sido utilizadas en la agricultura
con el objetivo de aumentar el rendimiento de algunos cultivos y de ser una
alternativa al uso extendido de agroquímicos. Algunas de las ventajas que se han
descrito de su uso con respecto a la alternativa química son que: a) reducen tanto el
daño ambiental causado por la sobrefertilización química, así como el riesgo a la
salud humana sustituyendo o disminuyendo la necesidad de aplicación de
agroquímicos tóxicos; b) se multiplican, lo cual implica que una vez inoculado el
suelo, pueden mantener su presencia en el lote aplicado y c) su utilización es
compatible tanto en sistemas agrícolas convencionales como orgánicos (Berg, 2009).
Se han descrito varios mecanismos del efecto de las BPCV sobre las plantas,
entre estos se encuentran efectos directos o indirectos. Los efectos directos son
aquellos en los que se da una interacción entre los microbios benéficos y las plantas
huésped y consiste en: a) un aumento en la movilización de nutrimentos solubles,
7
seguido por el mejoramiento de absorción de las plantas, tales como solubilizadores
de fosfatos, productoras de sideróforos y bacterias fijadoras de N2. Se conoce un
gran número de bacterias de vida libre o asociativa que fijan N2, pero sólo algunas
destacan por su potencial como biofertilizantes o promotoras de crecimiento. Entre
los géneros más conocidos están Azotobacter, Beijerinckia, Derxia y Azospirillum,
dentro del grupo de aerobias; dentro de las aerobias facultativas se presentan
Enterobacter, Pseudomonas y Bacillus; y los géneros de bacteria anaerobia
Metanobacterium, Clostridium y Desulfovibrio (Beringer, 1984; Lifshitz et al., 1986;
Ferrera-Cerrato, 1995; Zhang et al., 1996; Rodríguez y Fraga, 1999). Otro de los
efectos directos es a través de la producción de fitohormonas (auxinas, giberelinas,
citocininas y etileno) (Schroth y Weinhold, 1986; Chanway, 1997). Los efectos
indirectos incluyen la actividad antagonista de microorganismos contra patógenos
vegetales. Varios mecanismos han sido descritos, entre los que se encuentran, a) la
producción de antibióticos (Hoffland et al., 1997), b) competencia por nutrientes, y c)
parasitismo. Otro efecto indirecto es la capacidad que tienen algunos
microorganismos que habitan la rizósfera para inducir resistencia sistémica inducida
a algunas enfermedades (Conrath et al., 2002; Van Loom, 2007).
Además, las BPCV pueden promover el desarrollo radical vegetativo que
puede reflejarse en el número de pelos absorbentes y raíces secundarias. Estas
bacterias pueden aplicarse en semilla, maceta, aspersión y riego por goteo. Las
bacterias poseen capacidades de adaptación a diferentes condiciones de pH,
temperatura y humedad, y se consideran como un producto orgánico natural, no
tóxico y cuyo uso reduciría los riesgos para la salud y el medio ambiente (Jiménez et
al., 2001).
Existen bastantes ejemplos de productos comerciales de inoculantes
microbianos, entre los que se encuentran especies de los géneros Azospirillum,
Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas y Streptomyces (Berg, 2009).
Los efectos de estos microorganismos pueden ir desde antagonismo contra
enfermedades como la cenicilla en especies como manzanas, cucurbitáceas y uvas
asi contra otros patógenos de suelo como otros hongos, bacterias y hasta
8
nemátodos. También se han descrito contra el daño por frío. En Berg (2009) se
enlistan 18 compañías que comercializan estos inoculantes de origen biológico que
ofrecen ventajas ya que permiten un control prolongado de enfermedades del suelo
producidas por diversos hongos como Rhizoctonia y Fusarium.
Las promesas de la biotecnología agrícola residen en aumentar la
productividad y reducir costos, generar innovaciones y mejoras en los alimentos y
conducir a prácticas agrícolas más ecológicas, en resumen, se pretende contribuir
una agricultura más sustentable (Jiménez et al., 2001).
2.4 Ventajas de la utilización de aislados nativos
La utilización de aislados nativos, al estar adaptados a las condiciones
ambientales locales, aumentan la probabilidad de que resulten más efectivos, sin la
necesidad de aclimatar yo probar los microorganismos provenientes de otras
regiones (Armenta et al., 2010).
Se ha demostrado que la aplicación de productos biológicos, a partir de cepas
nativas eficientes en la estimulación del crecimiento vegetal y biocontrol de
patógenos, pueden contribuir al mejoramiento de los cultivos disminuyendo el daño al
ecosistema (Hernández et al., 2003).
2.5 Auxinas y su influencia en el crecimiento vegetal
Las hormonas vegetales o fitohormonas son compuestos orgánicos
sintetizados en una parte de la misma y translocadas hacia otra, donde a muy bajas
concentraciones causa una respuesta yo cambio fisiológico (Salisbury et al., 1994).
Las auxinas son uno de los tipos de hormonas vegetales más importantes.
El término auxina se deriva de la palabra griega auxein, que significa crecer.
Las auxinas tienen la capacidad de inducir la elongación celular, aunque afectan
9
también otros procesos. Las auxinas promueven el desarrollo radical al estimular la
iniciación de la raíz en esquejes y su diferenciación, lo cual es evidente en su
aplicación exógena, donde la elongación de la raíz se ve disminuida cuando su
concentración es relativamente baja. Son reconocidas como estimulantes de la
producción de etileno en varios tejidos, incrementa el tamaño de los frutos al
estimular el crecimiento de las células, por lo que juega un papel fundamental en el
crecimiento de órganos y frutos (Mauseth, 1991; Cuervo, 1992; Cuervo, 1992;
Salisbury y Ross, 1992; Salisbury et al., 1994; Arteca, 1996).
El ácido 3-indolacético (AIA) es la principal auxina producida por las plantas y
es derivado del triptófano (Figura 1).
Figura 1. Estructura química del ácido 3-indol acético.
Las auxinas pueden ser sintetizadas por microorganismos que se asocian a la
planta, de esta manera, estas bacterias pueden influenciar el balance hormonal de
las plantas y por lo tanto su crecimiento. Por otro lado, pequeñas concentraciones de
AIA disparan la resistencia sistémica inducida (Hartman et al., 2004), y ha sido
también involucrado en diversos procesos de señalización entre plantas y
microorganismos (Spaepen et al., 2007).
El movimiento de auxinas en las plantas es lento, aproximadamente de un
centímetro por hora; su movimiento es polar o unidireccional a través del xilema o
floema así como también en las células que se encuentran rodeando los tejidos
10
vasculares. Las auxinas producidas por las BPCV dentro de la zona de las raíces
estimulan la densidad y la longitud de los pelos radicales. El incremento en el área de
las raíces mejora la absorción de agua y nutrientes del suelo (Volkmar y Bremar,
1998). Vessey et al. (2009) reportaron que diferentes cepas ejercieron una actividad
promotora del crecimiento, debido a la influencia producida por fitohormonas.
2.6 Bacterias solubilizadoras de fosfatos
El fósforo es el segundo macronutriente más importante requerido por las
plantas para su desarrollo, después del nitrógeno. La mayor parte del fósforo se
encuentra en una forma insoluble, incluso en suelos ricos en este elemento, como
fosfatos de aluminio y hierro en suelos ácidos, y en forma de fosfatos de calcio en
suelos alcalinos. Solo una pequeña porción (0.1%) está disponible para las plantas
(Stevenson y Cole, 1999). Las bacterias que solubilizan fosfatos secretan ácidos
orgánicos y fosfatasas para convertir los fosfatos insolubles en iones de fosfato
monobásico (H2PO4-) y fosfato dibásico (HPO4
2-); este proceso de solubilización del
fosfato mineral y orgánico, permite un aumento en la disponibilidad y toma de fósforo
por plantas (Gyaneshwar et al., 2002).
Las bacterias que son capaces de solubilizar fosfatos son ubicuas
(Gyaneshwar et al., 2002). Especies pertenecientes a los géneros Bacillus,
Enterobacter, Erwinia y Pseudomonas spp. son consideradas como eficaces. Estas
bacterias se encuentran comúnmente en la rizósfera de algunas plantas de cultivo y
algunos ejemplos de estas asociaciones son Azotobacter chroococcum (Kumar y
Narula, 1999) y Bacillus circulans en trigo (Singh y Kapoor, 1998), Enterobacter
agglomerans en tomate (Kim et al., 1998) y P. chlororaphis ó P. putida en soya
(Cattelan et al., 1999).
11
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La agricultura en el estado de Sinaloa ha utilizado de manera intensiva
fertilizantes inorgánicos y agroquímicos en general con los subsecuentes problemas
adversos en el ambiente y en la salud humana. Tal estrategia debe ser
contrarrestada con alternativas que propicien a largo plazo una agricultura más
sustentable.
12
4. JUSTIFICACIÓN
El abuso de agroquímicos en el campo sinaloense ha motivado la exploración
de alternativas sustentables tal como el uso de microorganismos capaces de
promover el crecimiento vegetal. El frijol es una leguminosa de importancia
económica y cultural en el país por lo que mantener o aumentar su rentabilidad es
deseable. El uso de cepas de BPCV puede aplicarse en los sistemas agronómicos
tales como el frijol para hacerlos más eficientes y productivos.
13
5. HIPÓTESIS
Aislados bacterianos identificados como productores de auxinas y solubilizadores de
fosfato son capaces de promover el crecimiento vegetal en frijol.
14
6. OBJETIVOS
6.1 Objetivo general
Seleccionar bacterias con capacidad de producción de auxinas y solubilizadoras de
fosfatos para probar su efecto en la promoción de crecimiento vegetal en frijol a nivel
maceta.
6.2 Objetivos específicos
1. Seleccionar cepas capaces de producir auxinas con características no
hemolíticas a partir del monitoreo de 5,000 aislados bacterianos (Banco
CIIDIR 003).
2. Evaluar en plantas de frijol la capacidad promotora de crecimiento de los
aislados productores de auxinas.
3. Evaluar en plantas de frijol la capacidad promotora de crecimiento de
bacterias solubilizadoras de fosfato.
15
7. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1 Estrategia del trabajo
16
7.2 Reactivación de aislados bacterianos y determinación cualitativa de
auxinas
De un total de 11,520 aislados bacterianos del banco CIIDIR 003 fueron
probados 5,422 aislados, de los cuales 622 pertenecen al sub-banco con posibles
bacterias antagonistas a Fusarium realizado por Figueroa-López (2011), y las
restantes a las primeras 50 placas del banco CIIDIR 003. En un principio se
pretendía trabajar con 2,000 aislados pero debido al fácil manejo de la técnica se
probaron más aislados de los previstos en cuanto a su potencial de producción de
auxinas. Las cepas fueron crecidas en medio líquido LB suplementado con 0.005 M
de triptófano (Brick et al., 1990) a una temperatura de 25°C y 220 rpm por 24 h. 100
µL de reactivo de Salkowski (2 ml de 0.5M FeCl3 + 98 ml de HClO4 al 35%) fueron
colocados en cada una de las celdas de placas de 96 pozos y fueron adicionados
posteriormente con 100 µL del sobrenadante del cultivo bacteriano previamente
centrifugado a 5,900 rpm por 20 min. La mezcla fue homogenizada en cada celda y
la placa incubada a temperatura ambiente por 30 min en obscuridad, para
posteriormente ser fotodocumentada (Gallardo et al., 2008). Para la selección visual
se incluyó una curva estándar con diferentes concentraciones de 0.5 a 250 M AIA.
7.3 Pruebas de hemólisis
En el presente trabajo se llevaron a cabo pruebas de hemólisis a los aislados
bacterianos seleccionados como potenciales productores de auxinas (Banco CIIDIR
AUX) con el objetivo de descartar aquellas bacterias que presentaran hemólisis α y/o
β, dado que este tipo de actividad hemolítica se relaciona con patogenicidad
probable al humano.
La actividad hemolítica de cada aislado seleccionado se determinó de acuerdo
a la técnica seguida por Cowan y Seels (1993). Los aislados seleccionados por su
reacción positiva en la prueba de Salkowski se crecieron en medio de cultivo LB
líquido a 37 ºC por 16 h con agitación a 200 rpm en placas de 96 celdas. Se
17
centrifugaron a 5,900 rpm por 20 min. 100 µl del sobrenadante fue transferido a tubos
eppendorf de 1.5 ml y por segunda ocasión se centrifugaron a 12,000 rpm por 10
min. 50 μl del sobrenadante de la segunda centrifugación fueron colocados en placas
agar sangre en las cuales se realizaron orificios previamente con un horadador.
Como testigo se agregó a uno de los orificios agua destilada estéril en cada una de
las placas de agar sangre. Por último, las placas se incubaron a 37ºC por 24 h para
monitorear la apariencia del agar alrededor de los orificios.
La hemólisis α se manifestó como una zona parda o verdosa alrededor del
orificio conteniendo el sobrenadante bacteriano. En la hemólisis β se observó una
zona de lisis transparente en el agar que rodea los orificios probablemente debido a
hemolisinas secretadas por algunas de las bacterias probadas. Por otra parte,
cuando no se produjo ningún tipo de alteración en las células sanguíneas la
apariencia del agar-sangre no se modifica, lo cual fue considerado como una
hemólisis ɣ. Para finalmente reareglar y criopreservar las 35 cepas creándose el sub-
banco CIIDIR-AUX ɣ.
7.4 Cuantificación de AIA
Se llevó a cabo una curva estándar para la cuantificación de AIA utilizando
concentraciones conocidas de la auxina en un intervalo de 0 a 150 μM y midiendo
absorbancia a 530 nm (Glyckmann y Dessaux, 1994).
7.5 Cinética de crecimiento (aislados E9 y 5) y producción de auxinas (aislados
E9)
Partiendo de bacteria crecida en medio LB se inocularon matraces de 500 ml
con 200 ml de medio LB líquido. La inoculación se realizó tomando solamente con la
punta de un palillo estéril una muestra de bacteria de una colonia en medio sólido. El
cultivo bacteriano fue crecido a 25ºC y 220 rpm durante 24 h. Para conocer el perfil
18
de crecimiento de los aislados se midió la densidad óptica (DO) a 595 nm a lo largo
del tiempo de incubación. La toma de muestras se llevó a cabo cada dos h durante
18 h y una última toma de muestra a las 24 h para ambos aislados. Posteriormente,
se realizó la prueba de Salkowski a cada una de las muestras tomadas durante el
periodo de incubación del aislado E9 para conocer la cinética de producción de
auxinas.
7.6 Efecto de auxinas en arquitectura radical de Arabidopsis thaliana
Se realizó un bioensayo con la planta modelo Arabidopsis thaliana con el
objetivo de observar el efecto en la arquitectura radical de los exudados de algunos
de los aislados seleccionados como posibles productores de auxinas.
Para la realización del bioensayo las semillas fueron escarificadas y colocadas
en placas con medio MS, con una cantidad de 20 semillas por placa. Los aislados
previamente seleccionados como productores de auxinas E9 y H7 fueron crecidos
durante 48 h, centrifugados y al sobrenadante se le realizó la prueba de Salkowski
para cuantificar la concentración de AIA producido. Una vez conocida la
concentración de AIA, el sobrenadante fue filtrado y congelado y posteriormente se
utilizó para la preparación del medio MS. El filtrado fue diluido de tal manera de
alcanzar una concentración de 50 nM de AIA en el medio de cultivo MS en las cajas
de petri. Posteriormente se procedió a transferir a las cajas de petri con medio MS +
sobrenadante bacteriano plántulas de Arabidopsis previamente germinadas por 4
días. Cinco días después de haber transferido las plantas se cuantificó la longitud de
la raíz principal y el número de raíces secundarias de cada uno de los tratamientos y
el respectivo testigo, el cual consistió en medio MS sin sobrenadante bacteriano
(Cheng et al., 2003).
19
7.7 Pruebas en plantas de frijol
7.7.1 Experimento de aplicación de bacterias productoras de auxinas en
rizoconos
Este experimento fue iniciado el día 17 de octubre del 2011 coincidiendo con
la temporada óptima para la siembra de frijol en esta región norte del país. La
variedad utilizada fue Azufrado Higuera. Con la finalidad de distinguir diferencias
significativas entre los tratamientos, los resultados fueron analizados
estadísticamente usando el paquete “Statgraphics”, mediante una ANOVA y una
comparación de medias con la prueba de Tukey, con un nivel de significancia del
95%. El experimento fue realizado bajo un diseño completamente al azar con 15
repeticiones. Las semillas fueron desinfectadas en etanol al 70% durante 2 min,
hipoclorito de sodio al 0.5% durante 2 min y por último enjuagadas con agua
destilada estéril cuatro veces.
Para la aplicación de los aislados bacterianos seleccionados como
productores de auxinas (E9, H6 y H7), las bacterias fueron crecidas en medio LB
líquido por 24 h a 25 ºC con agitación a 220 rpm en una incubadora (Figura 2). Las
bacterias fueron centrifugadas para eliminar el sobrenadante y posteriormente
resuspendidas en 15 ml agua destilada estéril. Las semillas fueron embebidas en
cada una de las suspensiones bacterianas y tratamientos testigo (Cuadro 1) y
colocadas en rizoconos con sustrato previamente lavado y esterilizado (vermiculita-
arena 1:1 v/v) (Figura 3). Las plantas fueron germinadas y mantenidas en el
laboratorio por las primeras dos semanas posteriores a la siembra y luego
transferidas a maceteros cubiertos con mallas antivirus a la intemperie.
20
Figura 2. Aislados bacterianos seleccionados creciendo en incubadora con agitación
Figura 3. Siembra de semillas de frijol en rizoconos.
Los tratamientos aplicados fueron los siguientes:
Cuadro 1. Tratamientos aplicados en el experimento de rizoconos
Tratamiento Concentración
Tratamiento 1 1 µM AIA
21
Tratamiento 2 1 nM AIA
Tratamiento 3 1 pM AIA
Tratamiento 4 KOH 1
Tratamiento 5 KOH 2
Tratamiento 6 KOH 3
Tratamiento 7 Aislado 1 (E9)
Tratamiento 8 Aislado 2 (H6)
Tratamiento 9 Aislado 3 (H7)
Tratamiento 10 Agua
Los tratamientos 1, 2 y 3 correspondieron a diferentes concentraciones de
AIA. Ya que este compuesto es disuelto en KOH (hidróxido de potasio), se incluyeron
como testigos adicionales soluciones de KOH equivalentes a las usadas en los
tratamiento con AIA.
Las plantas fueron mantenidas por 35 días, regadas con agua y fertilizadas
con solución Hoagland dos veces por semana (Figura 4).
Los parámetros a evaluar fueron: 1) altura de la planta y 2) peso fresco y seco
de raíces.
Figura 4. Plantas de frijol cuyas semillas fueron tratadas con las cepas productoras de auxinas E9, H6 y H7.
22
7.7.2 Experimento de aplicación de bacterias productoras de auxinas en
macetas
El segundo bioensayo en planta se inició el 1 de diciembre del 2011 y culminó
con la cosecha el 24 de febrero del 2012. En este experimento se utilizaron macetas
de 1 L en sustitución de los rizoconos y el sustrato fue también modificado a turba
(peat moss):vermiculita (1:1 v/v). La manera de inoculación de las bacterias fue
modificada con el fin de asegurar el establecimiento bacteriano en la rizósfera de la
planta. Para esto se decidió agregar 1 ml de la suspensión bacteriana previamente
centrifugada y resuspendida en agua, tal como se describió para el experimento
anterior en rizocono (sección 7.7.1), agregando al día de la siembra sobre la semilla.
Tres semanas posteriores a la primera inoculación se realizó una segunda
inoculación en donde 1 ml de la suspensión bacteriana fue agregada directamente
sobre el sustrato en la zona de la raíz.
Las condiciones del experimento fueron en maceteros con malla antivirus a la
intemperie y bajo condiciones de luz y fotoperiodo naturales y propios del periodo de
cultivo de frijol.
7.7.3 Experimento de aplicación de bacterias solubilizadoras de PO4 en
macetas en condiciones de fosfato soluble
Un tercer experimento fue llevado a cabo en el que se probaron tres aislados
bacterianos (5, 13 y 25) seleccionados del banco CIIDIR 003 las cuales, además de
ser antagonistas al fitopatógeno Fusarium verticillioides, mostraron capacidad de
solubilización de fosfatos (Figueroa-López, 2011) y por ende con potencial capacidad
de promoción de crecimiento. Trabajo reciente en nuestro grupo demostró en campo
que las cepas 5 y 25 son capaces de mejorar en aproximadamente un 35% la
productividad en grano en cultivos de maíz respecto a un control patógeno y
disminuyen significativamente la severidad de la enfermedad causada por el
patógeno F. verticillioides (Lizárraga-Sánchez, tesis de doctorado en proceso, UAS).
23
El objetivo de este experimento fue la evaluación de estos aislados en cuanto a
promoción de crecimiento en plantas de frijol a nivel maceta.
Las plantas fueron crecidas en macetas de 1 L en turba (peat
moss):vermiculita (1:1 v/v) y fertilizadas con solución Hoagland una vez por semana
y regadas con agua dos veces por semana. Se agregó 1 ml de suspensión de
bacterias (crecidas por 24h a 25°C y 220 rpm en 200 ml de medio LB contenidas en
matraces de 500 ml y centrifugadas y resuspendidas en 15 ml de agua estéril) por
planta al momento de la siembra y a las tres semanas de desarrollo. Las plantas
fueron cosechadas a los 35 días. Los parámetros evaluados fueron: altura, peso
fresco y seco de parte aérea, peso fresco y seco de raíz. Este experimento se
mantuvo en maceteros cubiertos con mallas antivirus a la intemperie y bajo
condiciones de luz y fotoperiodo naturales y propios del periodo de cultivo de frijol.
7.7.4 Análisis de fosfato inorgánico libre (Pi) en raíces y hojas de frijol
Se pesaron 0.02 g de muestra de hojas y raíces secas previamente molidas
en un mortero. Se agregaron 300 μL de agua destilada, se homogenizaron las
muestras y se incubó a 42°C por 30 min. Se realizó una dilución 1:100 de las
muestras en agua y se agregaron 700 μl de la mezcla reactiva (esta consistió en una
mezcla 1:6 de ácido ascórbico al 10%: 0.42% de molibdato de amonio en H2SO4 1N)
y se incubó a 42°C durante 30 min. Se tomaron 900 μl de cada muestra para leer su
absorbancia en un espectrofotómetro a 820 nm antes de cumplir 1 h de incubación
(Ames, 1956). Se realizó una curva estándar con KH2PO4, utilizando concentraciones
de 1, 2.5, 5, 10, 25, 50 y 100 nmoles.
24
7.7.5 Experimento de aplicación de bacterias solubilizadoras de fosfato PO4 en
macetas en condiciones de fosfato insoluble
Se realizó un último experimento en planta en el que se probó la capacidad de
solubilizar fosfatos por el aislado 5 (Figueroa-López, 2011) proveniente del banco
CIIDIR 003, el cual resultó efectivo para la promoción de crecimiento radical en frijol
en el experimento anterior. El objetivo de este experimento fue evaluar el efecto de la
bacteria solubilizadora de fosfatos en el crecimiento de la planta en presencia de
fosfato insoluble. Las plantas fueron crecidas en macetas de 1 L en turba (peat
moss):vermiculita 1:1 (v/v) y fertilizadas con 100 ml de solución Hoagland dos veces
por semana. Los tratamientos consistieron en: 1) solución Hoagland normal con 200
µM de fosfato soluble (KH2PO4), 2) solución Hoagland en donde se sustituyó el 90%
del fosfato soluble por fosfato tricálcico Ca3 (PO4)2, el cual es insoluble y el 10% de
fosfato adicional fue fosfato soluble en la forma KH2PO4, y 3) solución Hoagland con
el 100% de fosfato adicionado en forma de fosfato insoluble (fosfato tricálcico).
La inoculación bacteriana se realizó aplicando 1 ml de suspensión de
bacterias crecidas por 24 h a 25°C y 220 rpm, centrifugadas y resuspendidas en 15
ml de agua estéril al momento de la siembra (5.7 x 107 UFC/ml) por planta y se
repitió la misma inoculación a las dos semanas sobre el sistema radical. Las
condiciones de este experimento fueron a 25°C y fotoperiodo de días cortos (18 h luz
y 6 h obscuridad).
El experimento fue cosechado a los 46 días. Los parámetros evaluados
fueron: altura, peso fresco y seco de parte aérea, peso fresco y seco de raíz y
número de estructuras reproductivas (flores y vainas).
7.7.6 Experimento de combinación de bacteria productora de auxinas y
solubilizadora de fosfatos.
Para realizar este apartado, la metodología llevada a cabo fue la misma que
los ensayos pasados sólo que aquí se agregó un volumen final de 2 ml de bacterias
25
(1 ml de E9 y 1 ml de 5 crecidas como fue explicado en la sección 7.7.5 (8.7 x 109
UFC/ml y 5.7 x 107 UFC/ml respectivamente). Las plantas fueron regadas y
fertilizadas de la misma manera que los experimentos pasados con Hoagland, bajo
condiciones controladas de temperatura y fotoperiodo de días cortos.
26
8. RESULTADOS
8.1 Selección de bacterias productoras de auxinas
Con la finalidad de poder aprovechar el banco el banco de microorganismos
de la rizósfera de maíz CIIDIR 003 en la búsqueda de microorganismos promotores
del crecimiento vegetal útiles para otros cultivos de interés agrícola además de maíz,
se consideró probarlas pero ahora en el cultivo de frijol.
El reactivo de Salkowski fue utilizado debido a su capacidad de detectar los
anillos indoles de las sustancias, esta prueba es útil en el escrutinio primario de
bacterias productoras de AIA (Rahman et al., 2011). 5,422 bacterias fueron
reactivadas y probadas con el ensayo de Salkowski para determinar cualitativamente
su capacidad para producir el compuesto colorido característico de la reacción de
Salkowski. La selección se realizó por estimación visual de las reacciones más
coloridas en los ensayos de Salkowski. Se usó como referencia una curva estándar
con concentraciones conocidas de AIA (Figura 5).
Figura 5. Ensayo de Salkowski. Curva de concentraciones conocidas de ácido indolacético (AIA).
Los 5,422 aislados bacterianos probados fueron crecidos en medio LB con
adición de triptófano para seleccionar los aislados productores de auxinas con base
en la coloración obtenida con el reactivo de Salkowski. El triptófano es el precursor
AIA (uM)
0 0.5 1.0 10 100 250
27
del AIA, debido a esto, la producción de AIA es favorecida por la presencia de este
aminoácido, de tal manera que es más evidente su capacidad de producción de la
auxina bajo estas condiciones. Una vez crecidas y evaluadas por el método de
Salkowski, se seleccionaron aquellas bacterias que mostraron coloración rosada
mediante estimación visual. De esta manera se seleccionaron 250 bacterias como
posibles productoras de compuestos tipo auxinas (Anexo 1).
8.2 Prueba de hemólisis
A los 250 aislados pertenecientes al sub-banco CIIDIR-AUX seleccionados por
su reacción colorida con el ensayo de Salkowski, se les realizó la prueba de
hemólisis para descartar aislados potencialmente nocivos para la salud humana
(Figura 6). A partir de este ensayo, 98 aislados resultaron α-hemolíticos, 117 fueron
β-hemolíticos y 35 aislados presentaron hemólisis ɣ-hemolíticos (no hemolíticos), los
cuales fueron rearreglados en un sub-banco criopreservado denominado CIIDIR-AUX
ɣ (Anexo 2).
Figura 6. Prueba de hemólisis de los aislados seleccionados. B10 es un ejemplo de
una cepa α-hemolítica (flecha negra); E8 es un ejemplo de una cepa -hemolítica
(flecha amarilla); D1 es un ejemplo de una cepa -hemolítica (flecha blanca).
Para corroborar los resultados de la prueba colorimétrica de Salkowski, las
bacterias fueron crecidas con y sin triptófano (Figura 7) con el objetivo de seleccionar
28
aquellos aislados que fueran capaces de desarrollar coloración en la prueba de
Salkowski sin necesidad de la adición del precursor triptófano. Siguiendo este
criterio se seleccionaron los aislados E9, H6 y H7 (referidos en el anexo 2 como
P01_E9, P01_H6 y P01_H7) (Figura 7). Estas pruebas se realizaron por duplicado en
placas independientes.
Figura 7. Prueba de Salkowski al sub-banco CIIDIR-AUX ɣ con 0.005 M de triptófano y sin triptófano.
8.3 Curva estándar de AIA y cuantificación
Soluciones de AIA a diferentes concentraciones fueron sometidas a la prueba de
Salkowski y posteriormente las mezclas de reacción fueron escaneadas a diferentes
longitudes de onda en un intervalo de 460 a 600 nm y sus absorbancias registradas.
Los resultados se presentan en la Figura 8 en donde se observa que el máximo de
absorbancia para el AIA es a 530 nm.
29
Figura 8. Perfil de absorbancia de soluciones de AIA a diferentes concentraciones en un intervalo de 460 a 600 nm. SALK= Salkowski
A los medios de cultivo en donde crecieron los aislados E9, H6 y H7 también
se les llevó a cabo perfiles de absorbancia de 460 y 600 nm (Figura 9), en donde se
muestra que en todos los casos, el máximo de absorbancia fue de 530 nm
coincidiendo con el máximo de absorbancia del AIA (Loper y Schroth, 1986), lo cual
sugiere que el compuesto producido por los aislados mencionados en realidad
corresponde a AIA.
30
Figura 9. Perfil espectrofotométrico de absorbancia del medio de cultivo de aislados bacterianos productores de auxinas crecidos con y sin triptófano adicionado al medio
TRP= triptófano.
Utilizando la curva estándar de AIA (Figura 10), se determinó que la
concentración de AIA del aislado E9 fue de 5 µM, el de H6 fue de 23 µM y el de H7
de 13 µM en medio sin triptófano. Al adicionar el precursor, la producción de AIA de
los aislados aumentó en general aproximadamente de 5 a 10 veces (Cuadro 2).
31
Figura 10. Curva estándar para concentraciones de AIA en los aislados, a una absorbancia de 530 nm.
Cuadro 2. Absorbancia y concentración de AIA de los aislados E9, H6 y H7 en medio LB con y sin triptófano.
8.4 Cinética de crecimiento y producción de auxinas de los aislados E9 y 5
Las cinéticas de crecimiento fueron realizadas para los dos aislados E9 y 5. La
cinética de producción de AIA fue llevada a cabo solamente para el aislado E9, ya
que el aislado 5 no es productor de AIA (Figueroa-López, 2011). La figura 11
y = 0.0062 x + 0.0747
R² = 0.99677
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Ab
so
rban
cia
(5
30 n
m)
µM de AIA
Aislado Abs 530 µM
E9 LB 0.106 5
H6 LB 0.220 23
H7 LB 0.152 13
E9 LB+TRP 0.442 59
H6 LB+TRP 0.736 107
H7 LB+TRP 0.360 45
32
presenta la densidad óptica (DO a 595 nm) del aislado 5 en función del tiempo. Esta
cinética tiene un perfil clásico de crecimiento bacteriano. Es decir, una fase de
latencia (ó fase lag), una fase exponencial (ó de aceleración) y una fase estacionaria.
La duración de cada fase fue variable, siendo 4 h aproximadamente para la fase de
latencia, 11 h para la fase exponencial, posteriormente una desaceleración del
crecimiento bacteriano, alcanzando una fase estacionaria alrededor de las 20 h de
iniciado el cultivo.
Figura 11. Cinética de crecimiento de aislado 5.
El aislado E9 presentó un crecimiento sigmoidal, observándose una fase de
adaptación durante las primeras 5 h de iniciado el cultivo, una fase exponencial de 5
h a 18 h de crecimiento y una disminución en el crecimiento bacteriano alrededor de
las 23 h (Figura 12). Las concentraciones de AIA durante el crecimiento bacteriano
fue también determinada, observándose que la producción y liberación de este
compuesto al medio de cultivo es paralelo a la curva de crecimiento bacteriano (línea
roja en la Figura 12) alcanzando una producción máxima a las 15 h de cultivo, que
corresponde aproximadamente al final de la fase exponencial.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0 5 10 15 20 25 30
DO
(59
5 n
m)
Tiempo de incubación (horas)
33
Figura 12. Cinética de crecimiento y concentraciones de auxinas de aislado E9. Línea azul (DO) y línea punteada roja (concentraciones de AIA)
8.5 Análisis de exudados de bacterias productoras de auxinas de aislados E9 y
H7 en arquitectura radical en Arabidopsis thaliana
Para evaluar el efecto de los exudados bacterianos en raíces, se utilizó a la
planta modelo Arabidopsis thaliana, la cual fue germinada en medio MS (Murashige y
Skoog, 1962) por 5 días y posteriormente transferida a medio MS adicionada con
medio con exudado de los aislados E9 y H7, así como un testigo con 50 nM de AIA y
uno de agua. Se registró un aumento al doble en el crecimiento de la raíz principal y
el aumento en el número de raíces laterales de 8 veces con respecto al testigo de
AIA a partir del quinto día de que las raíces fueron colocadas en el medio MS
suplementado con los medios de cultivo bacterianos. El AIA causó una inhibición en
el aumento en longitud de la raíz principal con respecto al testigo (Figuras 13,15A y
15D). La misma tendencia de una inhibición en la longitud de la raíz principal puede
observarse en el caso del medio de cultivo de las bacterias (Figuras 13, 15B y 15C),
lo cual podría indicar que los aislados bacterianos están produciendo AIA.
DO(595nm)
Co
nce
ntra
ció
n d
e A
IA (µ
M)
Tiempo de incubación (horas)
34
Figura 13. Aumento de longitud de raíz por efecto de AIA y exudados de bacterias adicionadas al medio MS. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar. Experimento realizado una vez.
Por otro lado, el AIA causó un aumento en el número de raíces secundarias
con respecto al testigo (Figura 14, 15A y 15D). Aunque el aumento no fue tan
evidente como en el tratamiento con AIA (Figura 14), los exudados bacterianos
también causaron un aumento en el número de raíces secundarias con respecto al
testigo de medio MS (Figura 14,15B y 15C).
Figura 14. Número de raíces secundarias de Arabidopsis thaliana crecidas en medio MS con AIA y con exudados de los aislados E9 y H7. El testigo indica medio MS sin
AIA. Letras distintas muestran las diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar.
35
Figura 15. Efecto de la adición de AIA sobre el número de raíces laterales en Arabidopsis thaliana (panel D), exudado de bacteria E9 (panel B) y H7 (panel C) y
testigo en medio MS (panel A) en la longitud y número de raíces laterales de Arabidopsis thaliana.
8.6 Evaluación de la capacidad promotora de crecimiento de los aislados
productores de auxinas y solubilizadoras de fosfato en plantas de frijol a nivel
maceta
8.6.1 Experimento de aplicación de bacterias productoras de auxinas en
rizoconos.
Plantas de frijol de la variedad Azufrado Higuera fueron sembradas en
rizoconos utilizando arena y vermiculita en proporción 1:1 (v/v) como sustrato y
fertilizadas con 100 ml de solución Hoagland dos veces por semana (Figura 16). Al
momento de la siembra, las semillas de frijol fueron embebidas en soluciones de
cada una de las bacterias crecidas por 24 h a 25°C a 220 rpm e inmediatamente
sembradas en los rizoconos. De manera similar, se trataron semillas con tres
diferentes concentraciones de AIA y KOH a manera de testigos (sección 8.6.1 de
materiales y métodos).
A B
C D
36
Figura 16. Frijol de variedad Azufrado Higuera a los tres días de siembra en rizoconos.
La altura de las plantas fue medida al finalizar el ensayo como se indica en la Figura
17. No se observaron diferencias estadísticas entre los tratamientos.
Figura 17. Altura (cm) de las plantas de frijol crecidas en rizoconos cuyas semillas fueron embebidas en suspensiones bacterianas de los aislados E9, H6 y H7, así como en soluciones de 1 µM, 1 nM y 1 pM de AIA disuelto en KOH diluido, las
correspondientes concentraciones de KOH y agua como testigo. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar.
a a a a
a a a a
a
a
0
10
20
30
40
50
60
70
AIA 1µM AIA 1nM AIA 1pM KOH
1.25µM
KOH
1.25nM
KOH
1.25pM
E9 H6 H7 Testigo
Alt
ura
de
la p
lan
ta (
cm
)
37
En cuanto al crecimiento de raíz, el análisis mostró una disminución de
crecimiento de raíz en uno de los tratamientos con KOH de manera significativa en
cuanto a peso fresco (Figura 18). Sin embargo, lo que se considera relevante del
experimento es que ninguna de las concentraciones de AIA y ninguna de los
tratamientos con bacterias fueron diferentes al testigo con agua (Figura 18a). El peso
seco de raíz tampoco mostró diferencias entre los tratamientos (Figura 18b).
a)
b)
Figura 18. Crecimiento de raíz en plantas de frijol crecidas en rizoconos a) peso fresco (g) de raíz y b) peso seco (g) de raíz. Letras distintas indican diferencias
significativas. Las barras de error significan desviación estándar.
ab
a
ab
ab
ab
b
ab ab
ab ab
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
AIA 1µM AIA 1nM AIA 1pM KOH
1.25µM
KOH
1.25nM
KOH
1.25pM
E9 H6 H7 Testigo
Pe
so
fre
sc
o d
e r
aíz
(g
)
ab
ab
ab
b ab a
ab
ab ab
ab
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
AIA 1µM AIA 1nM AIA 1pM KOH
1.25µM
KOH
1.25nM
KOH
1.25pM
E9 H6 H7 Testigo
Peso
seco
de
raíz
(g
)
38
8.6.2 Experimento de aplicación de bacterias productoras de auxinas en
maceta
Debido a que en el experimento en rizoconos no se observaron diferencias en
el crecimiento de la raíz ni en la altura de las plantas ante los tratamientos con las
bacterias productoras de auxinas, se sospechó que quizás el método de inoculación
no había sido el adecuado y/o que el inóculo no fue suficiente para lograr el
establecimiento de las bacterias en el sistema radical de las plantas para promover el
crecimiento vegetal. Por lo tanto, se diseñó un segundo experimento, el cual fue
iniciado el 1 de diciembre del 2011 y cosechado el día 24 de febrero del 2012. Las
plantas fueron crecidas en macetas de 1 L, y 1 ml de bacteria crecida por 24 h a
25°C, centrifugada y resuspendida en 15 ml de agua se agregó por planta al día de la
siembra y a la segunda semana de crecimiento.
En este experimento, sólo se probaron las bacterias seleccionadas y no se
incluyeron los testigos de AIA y KOH debido a que un testigo sin bacteria era
suficiente para ser comparado. En la Figura 19 se presentan los resultados de altura
de las plantas, en el cual no se observaron diferencias significativas entre los
tratamientos.
Figura 19. Promedio de altura (cm) de las plantas de frijol tratadas con las bacterias productoras de auxinas E9, H6 y H7 y utilizando agua como testigo. Letras distintas
indican diferencias estadísticas significativas. Las barras significan desviación estándar.
39
En la Figura 20, se presentan los resultados del número de estructuras
reproductivas, las cuales fueron consideradas como la suma de vainas y flores al
momento de la cosecha del experimento. No se observaron diferencias en el número
de estructuras reproductivas en ninguno de los tratamientos.
Figura 20. Promedio de la suma del número de flores y vainas (estructuras reproductivas) de las plantas de frijol al momento de la cosecha tratadas con las
bacterias productoras de auxinas E9, H6 y H7 y con agua (plantas testigo). Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación
estándar.
El peso fresco y peso seco de la parte aérea también fue evaluado (Figura 21a
y 21b, respectivamente). Ninguno de estos parámetros mostró diferencias
significativas entre las plantas de frijol tratadas con las bacterias y el testigo con
agua.
40
a)
b)
Figura 21. Promedio en el crecimiento en peso fresco (a) y peso seco (b) de la parte aérea de las plantas de frijol tratadas. Letras distintas indican diferencias
significativas. Las barras significan desviación estándar.
El crecimiento también fue evaluado en la raíz, y los datos se muestran en la
Figura 22. Como se observa, en el caso de peso fresco (Figura 22a), la raíz de las
plantas de frijol tratadas con la bacteria E9 fue significativamente diferente con
41
respecto al testigo y a los tratamientos con las bacterias H6 y H7 mostrando un
aumento de alrededor de un 30% (Figuras 22a), E9 también mostró diferencias
significativas en peso seco con respecto al testigo y a la bacteria H7, sin embargo, no
fue diferente a la bacteria H6 (Figura 22 b).
a)
b)
Figura 22. Promedio en el crecimiento (g) de raíz de plantas de frijol tratadas con bacterias productoras de auxinas E9, H6 y H7 y con agua (testigo) a) peso fresco y b) peso seco. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error
significan desviación estándar.
42
8.6.3 Experimento de aplicación de bacterias solubilizadoras de fosfato
Con el objetivo de probar otras bacterias potencialmente promotoras de
crecimiento vegeta en plantas de frijol, se realizó un experimento en el que se
evaluaron tres cepas previamente identificadas como solubilizadoras de fosfatos
(Figueroa-López, 2011). Este experimento se llevó a cabo de manera similar al
experimento de bacterias productoras de auxinas en maceta (sección 8.6.2). Se
documentó el efecto de las bacterias sobre el crecimiento de la planta como altura,
producción de biomasa (peso seco y fresco) en la parte aérea y radical.
Con respecto a la altura de las plantas, no se observaron diferencias entre los
tratamientos al ser similares los promedios alrededor de 30 cm de longitud de cada
planta (Figura 23).
Figura 23. Promedio de la altura (cm) de plantas de frijol inoculadas con las bacterias solubilizadoras de fosfatos 5, 13 y 25 y control de agua (testigo). Letras
distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar.
En cuanto a crecimiento de la parte aérea, no se observaron diferencias
significativas de las plantas tratadas con los tres aislados bacterianos y el testigo de
alrededor de 10 g en peso fresco y 1 g en peso seco (Figura 24a y 24b).
43
a)
b)
Figura 24. Crecimiento de parte aérea de plantas de frijol inoculadas con las bacterias solubilizadoras de fosfatos 5, 13 y 25 y testigo con agua. a) peso fresco y b) peso seco. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error
significan desviación estándar.
De manera interesante, al evaluar el crecimiento radical (Figura 25), se
observó que el aislado 5 estimuló aproximadamente un 20% más en crecimiento en
peso fresco (Figura 25a) y 30% en peso seco (Figura 25b) ambos comparados con
las plantas testigo. Los aislados bacterianos 13 y 25, no mostraron diferencias
estadísticas con respecto al testigo.
44
a)
b)
Figura 25. Crecimiento de raíz en plantas de frijol con n días de edad e inoculadas con las bacterias solubilizadoras de fosfatos 5, 13 y 25 y el testigo. a) peso fresco y b) peso seco. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error
significan desviación estándar.
45
8.6.4 Experimento de aplicación de bacterias solubilizadoras de fosfato a
plantas de frijol fertilizadas con fosfato soluble-insoluble
Finalmente, se realizó un experimento con el objetivo de confirmar los
resultados en cuanto al efecto de la bacteria 5 en el crecimiento de raíz en frijol y su
efecto en el crecimiento bajo condiciones de limitación de fosfato (alta limitación con
100% fosfato insoluble: limitación intermedia con 90% fosfato insoluble; y sin
limitación de fosfato con 100% fosfato soluble). Este experimento se llevó a cabo de
manera similar al experimento de las bacterias solubilizadoras de fosfato en macetas
(sección 8.6.3) y se inició el día 26 de junio culminando el 10 de agosto del 2012.
Este experimento fue llevado a cabo en un cuarto de crecimiento a 25°C con control
de fotoperiodo de 8 h luz/16 h oscuridad.
Después de 45 días de crecimiento se evaluó la altura de las plantas, las
cuales crecieron en promedio 40 cm en todas las condiciones probadas con y sin el
aislado 5. El análisis estadístico no arrojó diferencias significativas entre los
tratamientos (Figura 26).
Figura 26. Altura de las plantas de frijol tratadas con la bacteria 5, la cual es capaz de solubilizar fosfatos y plantas no inoculadas (testigo) bajo tres diferentes
condiciones de disponibilidad de fosfato. El registro de los datos fue realizado usando
46
plantas con 42 días de edad. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar.
El número de estructuras reproductivas (flores y vainas) fueron también cuantificadas
y no se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (Figura 27).
Figura 27. Suma del número de flores y vainas de plantas de frijol tratadas con la bacteria 5, la cual es capaz de solubilizar fosfatos y plantas no inoculadas (testigo)
bajo tres diferentes condiciones de disponibilidad de fosfato. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar.
Por otro lado, en cuanto a peso fresco de follaje (Figura 28a), se observó que
el testigo fertilizado con 100% de fósforo insoluble (sin la adición del aislado
bacteriano 5) fue significativamente menor en un 30% menos respecto a los demás
tratamientos. Sin embargo, la adición de la bacteria 5 en estas mismas condiciones
de fertilización no fue significativamente diferente a las plantas crecidas en solución
Hoagland, es decir, en condiciones de 100% de fosfato soluble. Los tratamientos
testigo y con bacteria 5 bajo condiciones de 90% fosfato insoluble no fueron
diferentes con respecto a las plantas fertilizadas con Hoagland.
47
El peso seco de la parte aérea presentó este mismo comportamiento (Figura 28b).
a)
b)
Figura 28. Promedio de crecimiento (g) de la parte aérea de plantas de frijol tratadas con la bacteria 5, la cual es capaz de solubilizar fosfatos y plantas no inoculadas
(testigo) bajo tres diferentes condiciones de disponibilidad de fosfato. (a) peso fresco y (b) peso seco. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error
significan desviación estándar.
48
Los resultados de crecimiento de raíz en peso fresco y seco se muestran en
las Figura 29a y 29b. La raíz de las plantas testigo crecidas en 100% de fosfato
insoluble presentaron menor crecimiento en peso seco que plantas crecidas bajo las
mismas condiciones nutricionales pero adicionadas con la bacteria 5, y de manera
similar con lo observado en la parte aérea, la adición de la bacteria 5 aumentó el
crecimiento de las raíces en un 30% con un promedio de 0.6 g al mismo nivel que las
plantas crecidas en 100% de fosfato soluble, es decir en solución Hoagland normal
(Figura 29b). Las raíces de plantas crecidas en Hoagland con 90% fosfato insoluble,
no mostraron diferencias con las raíces de plantas crecidas en Hoagland normal
(100% fosfato soluble), independientemente si estaban inoculadas o no con la
bacteria 5. El peso fresco de la raíz no mostró diferencias significativas entre los
tratamientos. Sin embargo, la tendencia de los promedios fue similar a lo observado
en peso seco (Figura 29 a).
a)
49
b)
Figura 29. Promedio de crecimiento (g) de raíz de plantas de frijol tratadas con la bacteria 5, la cual es capaz de solubilizar fosfatos y plantas no inoculadas (testigo) bajo tres diferentes condiciones de disponibilidad de fosfato. (a) peso fresco y (b) peso seco. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error
significan desviación estándar.
8.6.5. Combinación de bacteria productora de auxinas y solubilizadora de
fosfatos.
La bacteria E9 y 5 fueron inoculadas simultáneamente a semillas de frijol a
concentraciones de 8.7 x 109 UFC/ml para aislado E9 y 5.7 x 107 UFC/ml para
aislado 5, por planta y re-inoculadas a la misma concentración dos semanas después
de sembradas. En este experimento no se observaron diferencias significativas en
altura (Figura 30) número de flores y vainas (Figura 31), crecimiento de parte aérea
(Figura 32) y crecimiento de raíz (Figura 33), de la combinación de bacterias con
respecto al testigo o a cada una de las bacterias aplicadas de manera individual
manteniéndose los promedios similares entre sí.
50
Figura 30. Promedio de altura (cm) de plantas de frijol crecidas en cuarto de crecimiento a 25°C e inoculadas con los aislados E9 y 5, así como una combinación de ambos y un testigo no inoculado. Letras distintas indican diferencias significativas.
Las barras de error significan desviación estándar.
Figura 31. Suma del número de flores y vainas de plantas de frijol crecidas en cuarto de crecimiento a 25°C e inoculadas con las bacterias E9 y 5, así como una
combinación de ambas y un testigo no inoculado. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar.
51
a)
b)
Figura 32. Promedio de crecimiento (g) de parte aérea de plantas de frijol crecidas en cuarto de crecimiento a 25°C e inoculadas con las bacterias E9 y 5, así como una combinación de ambas y un testigo no inoculado. Letras distintas indican diferencias
significativas. Las barras de error significan desviación estándar.
52
a)
b)
Figura 33. Promedio de crecimiento de raíz (g) de plantas de frijol crecidas en cuarto de crecimiento a 25°C e inoculadas con las bacterias E9 y 5, así como una
combinación de ambas y un testigo no inoculado. Letras distintas indican diferencias significativas. Las barras de error significan desviación estándar.
53
8.6.6 Análisis de fósforo inorgánico libre (Pi) en raíces y hojas de frijol
Los resultados obtenidos de fósforo inorgánico total en los tejidos de raíz y
hoja de plantas de frijol sometidas a distintas fertilizaciones y a la bacteria 5 indican
que, en el caso de las hojas de plantas crecidas con 100% de fosfato insoluble en la
solución nutritiva e inoculadas con la bacteria 5, contenían aproximadamente la mitad
de fósforo libre por gramo de peso seco que las plantas bajo el mismo régimen
nutricional sin inoculación (Figura 34). La misma tendencia se observó para las
plantas inoculadas y no inoculadas y fertilizadas con solución nutritiva con 90% de
fosfato insoluble y 10% soluble, aunque las diferencias no fueron significativas entre
estos tratamientos. Una tendencia contraria se observó en hojas de plantas
fertilizadas con solución nutritiva conteniendo el 100% de fosfato soluble, en donde
las hojas de las plantas no inoculadas mostraron contenidos de fósforo menores que
las inoculadas (Figura 34).
Figura 34. Cantidad total final de fósforo inorgánico en hojas de frijol.
54
En cuanto a la cuantificación de fósforo en raíces, se observó una tendencia
similar a lo observado en hoja en cuanto a que los promedios del contenido de
fósforo fueron menores en los tratamientos de plantas inoculadas con la bacteria 5
en los casos de 90% y 100% de fosfato insoluble, mientras que en el caso de la
solución nutritiva con fosfato soluble, el contenido de fósforo fue menor para las
plantas inoculadas (Figura 35).
Figura 35. Cantidad total final de fósforo inorgánico en raíz de frijol
55
9. DISCUSIÓN
La producción de fitoreguladores por bacterias asociadas a las plantas, son un
importante mecanismo que promueve el crecimiento y el desarrollo de las plantas
(Glick, 1995; Whipps, 2001). Actualmente se encuentran en el mercado diferentes
productos comerciales enfocados en promover el crecimiento de plantas, aunque
estos normalmente provienen de otras regiones del país o del mundo, lo cual podría
ponerlos en desventaja con las poblaciones nativas que se encuentran adaptadas a
las condiciones climáticas de esta región, arriesgando la efectividad del producto. Se
ha comprobado que los microorganismos nativos del suelo tienen mayor probabilidad
de establecerse y tener éxito en el control biológico en su región de origen (Van der
Heijden, et al., 1998).
En la zona norte de Sinaloa ya se han realizado estudios relacionados con las
comunidades bacterianas en diferentes cultivos de importancia económica como
tomate y maíz (Cordero-Ramírez, 2008; Cordero-Ramírez, et al., 2011). En estos
trabajos, bancos de microorganismos fueron creados con el objetivo de aislar y
seleccionar microorganismos promotores de crecimiento vegetal y con capacidad
antagónica a Fusarium oxysporum (tomate) y Fusarium verticillioides (maíz). En el
presente trabajo, al analizar aproximadamente la mitad del banco de germoplasma
de maíz encontramos que aproximadamente el 4.5%, es decir, 250 de 5422, de los
aislados resultaron productores de auxinas (Anexo 1). Con esto se sugiere que una
estrategia para seleccionar microorganismos con estas características puede ser la
creación de bancos masivos de microorganismos. En el estudio realizado por
Cordero-Ramírez (comunicación personal) donde identificó molecularmente los
aislados pertenecientes a este banco (CIIDIR 003), se encontró que la mayoría de
los aislados pertenecieron al género Bacillus. De manera consistente con este dato,
los dos aislados utilizados en este trabajo fueron identificados como pertenecientes a
dicho género. E9 (Bacillus spp.) y 5 (Bacillus circulans). El género Bacillus es uno de
los más estudiados entre otros microorganismos como es el caso de Pseudomonas,
siendo considerado uno de los géneros más ampliamente utilizados como
mejoradores en rendimiento y resistencia a patógenos (Bhattacharyya y Jha, 2011).
56
El presente estudio reveló que en los sub-bancos realizados el género Bacillus sp.
abundó en el sub-banco CIIDIR AUX con casi el 50% de frecuencia y del CIIDIR
AUXɣ con casi el 70% de los aislados, sobresaliendo las especies B. megaterium, B.
cereus, B. subtillis, B. pumillus, B. circulans, entre otros.
Los principales mecanismos de promoción de crecimiento incluyen la
producción de fitohormonas, solubilización y movilización de fosfatos, producción de
sideróforos y antibiosis. Además, no puede descartarse que algunas bacterias
tengan efectos benéficos como resultado de presentar dos ó más mecanismos de
acción (Kumar et al., 2011). Está reportado en la literatura que muchos de los
aislados que tienen la capacidad de producir compuestos tipo auxinas han
demostrado que promueven el crecimiento vegetal, y por otro lado hay autores que
sugieren que un 80% de las bacterias que pueden colonizar las raíces en la rizósfera
son capaces de producir AIA (Loper y Schroth, 1986; Khalid, et al., 2004; Ahmad, et
al., 2005).
También, en el presente trabajo se seleccionaron 250 aislados bacterianos
con capacidad de producir AIA a un nivel suficiente para ser detectado por la prueba
colorimétrica de Salkowski (Brick, et al., 1990). La adición de triptófano al medio de
cultivo de crecimiento de las bacterias permitió seleccionar aquellas bacterias con
capacidad de producción de AIA ya que el triptófano ha sido identificado como la
molécula precursora principal para la biosíntesis de AIA en las bacterias (Normanly,
et al., 1995; Aloni, et al., 2006). Sin embargo, es importante señalar que existen
microorganismos que presentan rutas de síntesis de AIA independientes de
triptófano (Spaepen, et al., 2007). La estrategia de la adición de triptófano se utilizó
para seleccionar aquellas bacterias con capacidad potencial para producir
AIA independientemente si sus pozas endógenas del precursor triptófano fueran muy
limitadas. La adición de triptófano ha sido utilizado por otros autores con el mismo fin
(Sergeeva, et al., 2007; Yuan, et al., 2010; Piromyou, et al., 2011). Una vez
seleccionados, estos aislados fueron probados en ausencia de triptófano para
seleccionar aquellos que pudieran producir AIA sin la adición exógena de triptófano,
con la idea de utilizar su característica de mantener pozas endógenas suficientes del
57
precursor para dirigir la síntesis de AIA, lo cual representaría una ventaja
biotecnológica pues podrían utilizarse sin necesidad de adicionarles triptófano.
Los 250 microorganismos seleccionados como productores de auxinas en la
prueba de Salkowski fueron evaluados por la prueba de hemólisis con el fin de
descartar aquellos microorganismos que tuvieran efectos nocivos en la salud del
humano, debido a que el uso de estos microorganismos está dirigido al cultivo de
frijol y finalmente al consumo humano. Esta prueba permitió hacer agrupación de los
aislados en los tres tipos de hemólisis α, β y ɣ. Utilizando esta prueba se descartaron
aquellos que fueron β-hemolíticos y α-hemolíticos dónde se observó un lisado total o
parcial (Figura 6), y se seleccionaron sólo los ɣ-hemolíticos (Anexo 2). Esta prueba le
da un valor agregado a los microorganismos seleccionados.
La similitud del perfil de absorbancia de los medios de cultivo de las bacterias
que dieron reacción colorida a la prueba de Salkowski (Figura 9) con el perfil de
absorbancia de AIA (Figura 8) sugieren que las bacterias están produciendo y
liberando esta auxina al medio de cultivo. Un criterio adicional que apoya que tales
bacterias producen AIA es el efecto que se observó en plantas de Arabidopsis
thaliana crecidas en medios adicionados con exudados de bacterias. En estos
experimentos se observaron respuestas similares de las plantas crecidas en medio
MS adicionado con AIA y con exudados de bacterias en cuanto a la disminución en el
crecimiento en longitud de las raíces (Figura 13) y al número de raíces laterales
(Figura 14), además de un aumento en el número de pelos radicales. Aunque las
respuestas no fueron exactamente iguales, sí lo fueron las tendencias. Se ha
demostrado que las auxinas y el etileno son reguladores que modulan el crecimiento
de la raíz y modifican su arquitectura, incluyendo cambios en la elongación de las
raíz primaria y la formación y elongación de los pelos radicales (Saleh y Glick, 2001;
Ghos, et al., 2003; Han, et al., 2005; Madhaiyan, et al., 2006; Bucio, et al., 2007;
Bucio, et al., 2009) Es posible que la razón por la que el efecto del medio de cultivo
bacteriano sobre Arabidopsis no fue idéntico al de AIA fue que en el medio de cultivo
seguramente hay otros componentes que pudieran también estar teniendo un efecto
en la arquitectura radical o inhibiendo el efecto de la auxina. Este bioensayo
58
representa una evidencia adicional que nos sugiere fuertemente que el compuesto
responsable de la actividad fisiológica observada es una auxina y posiblemente sea
AIA.
Cabe mencionar que el uso de Arabidopsis thaliana como planta modelo
permite fácilmente observar el efecto en la arquitectura radical por su tamaño
pequeño y su facilidad de manipulación en cajas de petri con respecto a plantas de
mayor tamaño como frijol. Sin embargo, los siguientes experimentos fueron
realizados en plantas de frijol hacia la cual se propone dirigir el uso de estos aislados
a nivel de cultivo
Primeramente se intentó utilizar el sistema de rizoconos ya que éstos son muy
adecuados para llevar a cabo experimentos en plantas porque ahorran espacio en
los cuartos o cámaras de crecimiento, además se decidió utilizar como método de
inoculación el humedecer (o embeber) las semillas en la suspensión bacteriana. Sin
embargo, no se observó ningún efecto de los tratamientos en las plantas de frijol
(Figura 17 y 18). Se sospechó que quizás el poco espacio del rizocono pudo haber
interferido con el desarrollo normal de la planta, particularmente el desarrollo radical.
Aunque el sistema de inoculación mediante la impregnación de las semillas con la
bacteria ha sido utilizado ampliamente, es posible que éste no haya sido efectivo
para inducir la colonización del sistema radical bajo las condiciones del experimento
y debido a que el inóculo queda principalmente en la testa de la semilla y
posiblemente no es suficiente para colonizar el sistema radical bajo las condiciones
del experimento. Por lo tanto, en un siguiente experimento se reconsideraron las
condiciones de crecimiento de las plantas y el modo de aplicación de la bacteria.
De esta manera se decidió llevar a cabo otro experimento sustituyendo los
rizoconos de volumen aproximado de 300 ml por macetas de 1 L. El sustrato utilizado
en los rizoconos (vermiculita/arena 1:1) fue sustituido por peatmoss/vermiculita 1:1)
para permitir mayor aireación, y finalmente el sistema de inoculación fue sustituido
por aplicación directa sobre la semilla de 1 ml de suspensión bacteriana (8.7 x 106
UFC/ml) en el momento de la siembra y 1 ml adicional de bacteria sobre el sustrato
dos semanas posteriores a la siembra. Bajo estas condiciones experimentales, se
59
observaron diferencias en el crecimiento en peso seco de raíz en el tratamiento con
la bacteria E9 (Figura 22). Aunque en este trabajo no se determinó la colonización de
las raíces por parte de los aislados adicionados, se puede inferir por los resultados
de promoción de crecimiento, que el aislado E9 fue capaz de colonizar el sistema
radical de frijol. Las otras variables medidas (altura, peso fresco y seco de parte
aérea y número de flores vainas) no mostraron diferencia significativas con el testigo.
Además de la proliferación de raíces laterales y pelos absorbentes, se ha
reportado el aumento en la biomasa del sistema radical por la utilización de bacterias
productoras de auxinas (Ribaudo et al., 2006; Shaharoona et al., 2006), lo cual
coincide con los resultados obtenidos en este trabajo. Es posible que el aumento de
biomasa de raíz involucra directamente el incremento de absorción de nutrientes y
agua, resultando así en plantas mejor desarrolladas y mayor tolerancia a sequía
(Pyromyou et al., 2001; Ribaudo, et al., 2006; Sergeeva, et al., 2007; Swain, et al.,
2007). El principal beneficio a la planta sería el aumento de la superficie de la raíz
mediada por AIA. En varios trabajos relacionados se han reportado beneficios en el
rendimiento de algunos cultivos como avena y tomate por el uso de bacterias
productoras de auxinas (Khalid, et al., 2004; Ahmed, et al., 2005, Ribaudo, et al.,
2006; Speapen, et al., 2007). En este experimento también se cuantificó el número
de vainas y flores con el fin de tener una idea del efecto de las bacterias en el
número de estructuras reproductivas como una estimación indirecta de rendimiento.
Sin embargo, en este caso no se observaron diferencias significativas entre los
tratamientos. No se puede descartar, sin embargo, que el efecto de las bacterias
pueda manifestarse en etapas posteriores de desarrollo de fruto en otros beneficios
como un aumento en el llenado de grano. Esto tendría que evaluarse a nivel de
campo en experimentos posteriores. La selección del aislado E9 mediante
experimentos en maceta, hace razonable la idea de probar a esta bacteria en campo.
Además de evaluar bacterias productoras de auxinas como promotoras de
crecimiento vegetal en frijol, se decidió probar también tres aislados bacterianos
previamente seleccionados por su habilidad de solubilizar fosfatos (Figueroa-López,
2011) en un sistema experimental equivalente al usado para probar las bacterias
60
productoras de auxinas. En este sistema no se observaron diferencias significativas
en altura, peso fresco y peso seco de parte aérea entre los distintos tratamientos
(bacterias 5, 13 y 25) con respecto al testigo (Figuras 23 y 24). Sin embargo, sí se
observaron diferencias significativas en peso fresco y seco de raíz en el tratamiento
con la bacteria 5 con respecto al testigo (Figura 25). La aplicación de bacterias
solubilizadoras de fosfatos ha sido asociada a aumentos en el rendimiento en
diversos cultivos como papa, tomate, avena, rábano, cacahuate, maíz, soya y
manzano, entre otros. (Kumar y Narula, 1999; Babalola et al., 2003; Karlidag, et al.,
2007; Taurian, et al., 2009; Cattelan, et al., 2009). Esto posiblemente se debe a la
mejora de la nutrición fosfatada de la planta, la cual es esencial ya que el fósforo es
un elemento fundamental en la composición de moléculas tan importantes como
ácidos nucléicos, ATP y proteínas, entre otras. Uno de los mecanismos de
solubilización de fosfato por bacterias es la producción de ácidos orgánicos, los
cuales, al modificar el pH del suelo convierte el fósforo insoluble a formas solubles
(Hisinger, 2001; Gyaneshwar, et al., 2002).
Por otra parte, existe evidencia en la literatura que indica que combinaciones
de microorganismos pueden ser sinérgicos y tener mejores beneficios a las plantas
cuando se usan en conjunto que de manera individual (Rodríguez y Fraga, 2009;
Karlidag, et al., 2011). Con el objetivo de investigar si ambos aislados (E9 y 5)
pudieran actuar sinérgicamente, se llevó a cabo un experimento en el que se
realizaron inoculaciones tanto con la bacteria productora de auxinas E9, como con la
bacteria solubilizadora de fosfatos 5, las cuales promovieron el crecimiento de raíces
cuando fueron aplicadas de manera independiente. El sistema experimental utilizado
fue similar a los experimentos anteriores en maceta, sin embargo, ya que las
condiciones a la intemperie resultaban inadecuadas para el crecimiento de frijol por
las altas temperaturas y la extensión del fotoperiodo en la época de verano, el
experimento fue llevado a cabo en un cuarto de crecimiento con fotoperiodo
controlado de día corto (8 h luz/16 h oscuridad) a una temperatura uniforme de 25°C.
Bajo estas condiciones experimentales, no se observaron diferencias significativas
en cuanto a altura de planta, flores y vainas y peso seco y fresco de parte aérea
(Figuras 30, 31, 32 y 33), en los tratamientos de bacterias combinadas. Una posible
61
explicación pudiera ser que ambas bacterias compitieron entre ellas por la
colonización de las raíces, inhibiéndose mutuamente. No obstante, si esto hubiera
sido el caso, los tratamientos control con los aislados individuales deberían haber
repetido lo que se observó en los experimentos previamente descritos en donde las
bacterias promovieron el crecimiento de raíz, lo cual no se observó. Es por esto, que
se sospecha que fueron las condiciones de crecimiento en el cuarto de cultivo, las
que de alguna manera tuvieron influencia en los resultados. Este punto será discutido
de nuevo más adelante.
Un último experimento fue llevado a cabo con el objetivo de demostrar que el
efecto de la bacteria 5 (seleccionada in vitro por su capacidad solubilizadora de
fosfato; Figueroa-López, 2011) en el aumento de crecimiento de raíces fue debida
precisamente a su capacidad de solubilizar fosfatos in planta. Para ésto se diseñó un
experimento en el que plantas de frijol fueron fertilizadas con solución nutritiva
(Hoagland) en la que el fosfato adicionado normalmente en la solución, el cual
corresponde a la forma soluble K2HPO4, fue sustituida en 90% y 100% por fosfato
tricálcico, la cual es una forma insoluble. Un tratamiento testigo con plantas
fertilizadas con solución Hoagland fue también incluido. Este experimento fue llevado
a cabo en macetas de 1 L, con sustrato peatmoss/vermiculita (1:1), inoculación doble
(1 ml de bacteria en la siembra y 1 ml dos semanas posterior a la siembra) y en
cuarto de crecimiento a 25°C y fotoperiodo 8 h luz/16 h oscuridad.
De este experimento se pueden observar varios puntos:
Las plantas testigo (sin bacteria) fertilizadas con 100% de fosfato insoluble
tuvieron siempre menores promedios en cuanto a número de vainas y flores y
crecimiento de parte aérea y raíces con respecto a todos los demás tratamientos,
resultando significativo en el crecimiento de peso fresco y seco de parte aérea y peso
seco de raíz. Particularmente si se comparan las plantas testigo fertilizadas con
100% fosfato insoluble con las plantas testigo fertilizadas con Hoagland, se observa
que las plantas fertilizadas con fosfato insoluble sufrieron un estrés nutricional, el
cual se manifestó en un menor crecimiento (Figuras 28a, 28b y 29b). Sin embargo, la
adición de la bacteria 5 en la condición de fertilización 100% de fosfato insoluble
62
compensó el estrés nutricional ya que las plantas fueron capaces de crecer a los
niveles de las plantas fertilizadas con Hoagland (Figuras 28a, 28b y 29b). Esto apoya
la idea de que la bacteria 5 está actuando como promotora de crecimiento mediante
un mecanismo de solubilización de fosfatos haciendo disponible este nutriente a las
plantas. Estos resultados no descartan la posibilidad de que las bacterias también
estén ayudando a movilizar el fosfato soluble del suelo a la raíz, aunque esta
hipótesis necesita de experimentos adicionales para ser comprobada. Es interesante
notar que los resultados obtenidos en el tratamiento con 100% de fosfato insoluble,
no se observan en el tratamientos con 90% de fosfato insoluble. Dicho tratamiento
fue incluido ya que resultaba difícil predecir a priori si el tratamiento de 100% de
fosfato insoluble resultaría demasiado estresante para las plantas al punto de no
permitirles su desarrollo. Sin embargo no fue el caso, ya que aunque las plantas
presentaron menores crecimientos de raíz y parte aérea, el desarrollo de las mismas
sin la adición de bacteria, fue normal. Esto podría sugerir que las plantas de frijol
poseen mecanismos de solubilización de fosfatos muy eficientes y que son capaces
de prosperar en estas condiciones de estrés nutricional, particularmente de
limitaciones de fosfato soluble sin la asociación con microorganismos benéficos. Es
posible que 10% de fosfato soluble (del tratamiento de 90% de fosfato insoluble),
junto con la capacidad de las plantas de frijol por solubilizar fosfatos haya sido
suficiente para lograr un crecimiento similar al de las plantas fertilizadas con solución
Hoagland normal. En cuanto al tratamiento testigo (fertilización con solución
Hoagland) con y sin bacteria 5 del experimento de fertilización con fosfato insoluble
en el cuarto de crecimiento a 25°C (Figura 28 y 29), se observó que la inoculación
con la bacteria 5 no tuvo un efecto significativo en el crecimiento de parte aérea y
raíz como se esperaba, contradiciendo los resultados obtenidos en el experimento
con esta bacteria en macetas crecidas a la intemperie (Figura 25 a y b). Esto es
similar a lo que se observó con la bacteria productora de auxinas E9 en donde se
registró un efecto de promoción de crecimiento en plantas inoculadas con respecto a
las no inoculadas en el experimento de macetas a la intemperie, pero no se observó
tal efecto en el experimento en el cuarto de cultivo a 25°C. Sin embargo, para el caso
de la bacteria 5 en el experimento de fosfato insoluble (Figuras 28 y 29) sí se
63
observó una promoción de crecimiento en la condición de 100% fosfato insoluble
comparado con el testigo sin bacteria bajo la misma condición limitante de
fertilización. Estos resultados aparentemente contradictorios pueden tener sentido si
se considera que el efecto del microorganismos se pone en evidencia cuando las
condiciones de crecimiento son en cierta forma “estresantes”, mientras que bajo
condiciones más estables no se manifiesta tal beneficio. La diferencia en los
resultados de los experimentos a la intemperie vs en el cuarto de crecimiento,
podrían deberse a que a la intemperie las plantas, aunque no deliberadamente
estresadas, sí eran sometidas a fluctuaciones de temperatura y posiblemente de
estrés hídrico ligero comparadas con la condición estable de temperatura a 25°C del
cuarto de crecimiento. Existen ejemplos en la literatura en donde los ventajas de las
bacterias benéficas son evidenciadas cuando las plantas son sometidas a estreses
tales como: salino e hídrico (Mayak, et al., 2004; Behbahani, 2010;).
Por otro lado, se cuantificaron las pozas de fósforo inorgánico en las plantas
del experimento de fosfato insoluble. El fósforo medido por la técnica utilizada en
este trabajo estima la concentración de fósforo soluble, por lo tanto se excluye en la
medición el fósforo unido a moléculas orgánicas. La adición de la bacteria
solubilizadora de fosfato contribuyó al crecimiento de las plantas fertilizadas con
Hoagland con 100% de fosfato insoluble con respecto a las plantas no adicionadas
con la bacteria (Figuras 28 y 29). Por el contrario, las pozas de fosfato inorgánico
fueron significativamente menores en las plantas con la bacteria 5 con respecto a las
plantas sin bacteria. Esto también se observó en los tratamientos con y sin bacteria
de la condición con 90% de fosfato insoluble. Una posible explicación a esta
comportamiento aparentemente contrario entre crecimiento y pozas de fosfato
soluble es que el fosfato soluble traslocado del suelo hacia la raíz esté siendo
incorporado en moléculas orgánicas más eficientemente en las plantas con bacteria
con respecto a las sin bacteria de tal manera que el estado estable de la poza es
menor, aunque la cantidad de moléculas traslocadas sea mayor permitiendo así el
aumento en biomasa. De manera interesante, este comportamiento no se observó en
las plantas fertilizadas con solución Hoagland normal en donde la presencia de la
bacteria sí aumentó la poza de fosfato inorgánico (Figura 34), aunque esto no se vió
64
reflejado en una promoción de crecimiento (Figura 29). Una posible explicación a
estos resultados es que la presencia predominante de fosfato insoluble en el
sustrato, haya sido percibido por la planta y activado mecanismos mediante los
cuales el fosfato soluble traslocado a la planta se incorporara más eficientemente en
moléculas orgánicas, lo cual disminuiría las pozas de fosfatos soluble en las plantas
y aumentaría el crecimiento, mientras que la presencia predominante de fosfato
soluble, como sería el caso de los tratamientos con Hoagland normal, no dispararía
tales mecanismos. La determinación de fósforo total, no nada más fósforo inorgánico,
en los tejidos permitiría dar información al respecto para aceptar o desechar estas
hipótesis y deberá ser objeto de experimentos posteriores.
65
10. CONCLUSIONES
1. De los 5422 aislados bacterianos del banco CIIDIR 003, 250 de ellos (4.6%)
resultaron capaces de producir auxinas; mientras que 35 (0.65%) fueron
productores de auxinas y ɣ-hemolíticos.
2. El perfil espectrofotométrico de los medios de cultivo bacterianos de los
aislados E9, H6 y H7, así como su efecto en la disminución de la longitud de
la raíz y aumento en la densidad de raíces secundarias en Arabidopsis
thaliana, son consistentes con la idea de que estos aislados producen AIA.
3. El aislado E9 productor de auxinas, pero no los H6 y H7, indujo promoción de
crecimiento de raíces en frijol.
4. El efecto de promoción de crecimiento en raíces del aislado E9 no se
relaciona directamente con la cantidad de AIA producido en medio LB.
5. El aislado 5 con capacidad de solubilización de fosfatos tuvo un efecto en la
promoción de crecimiento de raíz en plantas de frijol bajo condiciones
limitantes de fosfato soluble.
6. Aislados bacterianos identificados como productores de auxinas (E9) y
solubilizadores de fosfato (5) fueron capaces de promover el crecimiento
vegetal en frijol bajo condiciones de laboratorio y candidatos para ser
probados como promotores de crecimiento bajo condiciones de campo.
66
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71
12. ANEXOS
ANEXO 1. Cuadro con los 250 microorganismos productores de auxinas, procedentes del banco de 622 (primeros 40 aislados del listado) microorganismos con antagonismo a Fusarium y del banco CIIDIR 003 (210 aislados restantes). P= número de placa, seguido de la posición del pozo.
# Posición original en el banco CIIDIR 003
Banco al que pertenecen
Posición sub-banco (Fusarium y/o CIIDIR 003)
Posición Sub-banco CIIDIR AUX
Tipo de Hemólisis
Especie
1 P01_H10 Fusarium P01_A10 P01_A1 α Enterobacter cloacae
2 P02_A2 Fusarium P01_A11 P01_A2 β Bacillus megaterium
3 P06_C8 Fusarium P01_D9 P01_A3 β Bacillus cereus
4 P06_D9 Fusarium P01_D10 P01_A4 β Bacillus subtilis
5 P06_E9 Fusarium P01_D11 P01_A5 α Bacillus anthracis strain Q23 16S ribosomal RNA gene
6 P06_F5 Fusarium P01_D12 P01_A6 β Bacillus thuringiensis isolate PGBw1 16S ribosomal RNA gene
7 P29_C8 Fusarium P02_H11 P01_A7 β Bacillus flexus strain IK-MB14-518F 16S ribosomal RNA gene
8 P29_G6 Fusarium P02_H12 P01_A8 β Bacillus megaterium strain LCR108 16S ribosomal RNA gene
9 P36_D6 Fusarium P03_D10 P01_A9 β Bacillus megaterium (99%)
10 P36_D7 Fusarium P03_D11 P01_A10 β Bacillus megaterium strain RKJ 600 16S ribosomal RNA gene
11 P37_D10 Fusarium P03_E10 P01_A11 β No identificada
12 P37_D12 Fusarium P03_E11 P01_A12 β No identificada
13 P41_C8 Fusarium P04_A11 P01_B1 α No identificada
72
14 P45_G9 Fusarium P04_D3 P01_B2 β Enterobacter cloacae (99%)
15 P48_H9 Fusarium P04_D12 P01_B3 β Bacillus megaterium
16 P53_G8 Fusarium P04_F1 P01_B4 α Bacillus megaterium
17 P60_D1 Fusarium P04_H8 P01_B5 β No identificada
18 P61_A8 Fusarium P04_H9 P01_B6 α Enterobacter asburiae
19 P61_B5 Fusarium P04_H10 P01_B7 β Bacillus pumilus strain IK-MB12-518F 16S ribosomal RNA gene
20 P61_C5 Fusarium P04_H11 P01_B8 β Enterobacter hormaechei
21 P62_A2 Fusarium P05_A3 P01_B9 β Enterobacter cloacae
22 P62_A12 Fusarium P05_A4 P01_B10 β Enterobacter hormaechei
23 P62_G10 Fusarium P05_A5 P01_B11 α Enterobacter cloacae isolate HQ040619-1 16S ribosomal RNA gene
24 P62_G11 Fusarium P05_A6 P01_B12 α Enterobacter asburiae
25 P63_D6 Fusarium P05_A7 P01_C1 β Enterobacter asburiae
26 P63_B10 Fusarium P05_A8 P01_C2 β Enterobacter hormaechei
27 P63_B11 Fusarium P05_A9 P01_C3 β Enterobacter hormaechei
28 P63_G11 Fusarium P05_A10 P01_C4 β Enterobacter hormaechei
29 P64_B3 Fusarium P05_A12 P01_C5 α Enterobacter hormaechei
30 P65_B5 Fusarium P05_B3 P01_C6 α Enterobacter hormaechei (96%)
31 P65_D2 Fusarium P05_B4 P01_C7 α Enterobacter asburiae
32 P65_H5 Fusarium P05_B5 P01_C8 α Enterobacter asburiae
33 P66_A5 Fusarium P05_B6 P01_C9 α Enterobacter aerogenes (99%)
34 P66_D7 Fusarium P05_B7 P01_C10 α Enterobacter hormaechei
73
35 P67_B4 Fusarium P05_B10 P01_C11 α Bacillus pumilus strain IK-MB12-518F 16S ribosomal RNA gene
36 P68_A4 Fusarium P05_C1 P01_C12 β Agrobacterium tumefaciens (99%)
37 P68_E10 Fusarium P05_C6 P01_D1 β No identificada
38 P68_G12 Fusarium P05_C11 P01_D2 β Brevibacillus brevis
39 P69_A8 Fusarium P05_C12 P01_D3 β Bacillus drentensis
40 P77_D1 Fusarium P05_H8 P01_D4 β No identificada
41 P01_B5 CIIDIR 003 P01_D5 α Bacillus megaterium; AsK08; GQ503320
42 P01_C6 CIIDIR 003 P01_D6 α Bacillus subtilis subsp. subtilis; GQ482980
43 P01_D6 CIIDIR 003 P01_D7 α Bacillus sp. BCL13-1; EF026993
44 P01_F10 CIIDIR 003 P01_D8 β Bacillus sp. PN13; DQ523735
45 P01_H1 CIIDIR 003 P01_D9 β Enterobacteriales
46 P02_A11 CIIDIR 003 P01_D10 α No identificada
47 P02_B6 CIIDIR 003 P01_D11 β Bacillus sp. PaH3.15; GQ406780
48 P02_B11 CIIDIR 003 P01_D12 β No identificada
49 P02_C11 CIIDIR 003 P01_E1 β No identificada
50 P02_D11 CIIDIR 003 P01_E2 β No identificada
51 P02_E11 CIIDIR 003 P01_E3 β No identificada
52 P02_F11 CIIDIR 003 P01_E4 β No identificada
53 P02_G5 CIIDIR 003 P01_E5 α Bacillus sp. BCL13-1; EF026993
54 P02_G11 CIIDIR 003 P01_E6 α No identificada
55 P02_H7 CIIDIR 003 P01_E7 α Bacillus cereus; KCd1; FJ613630
56 P02_H11 CIIDIR 003 P01_E8 α No identificada
57 P03_A2 CIIDIR 003 P01_E9 α Bacillus subtilis subsp. subtilis; GQ482980
58 P03_E12 CIIDIR 003 P01_E10 α Bacillus megaterium;
74
L3; GQ412711
59 P03_F7 CIIDIR 003 P01_E11 β Bacillus sp. BCL13-1; EF026993
60 P03_F9 CIIDIR 003 P01_E12 β Bacillus sp.
61 P03_H10 CIIDIR 003 P01_F1 α Bacillus megaterium; IARI-CS-34; JF343134
62 P03_H12 CIIDIR 003 P01_F2 β No identificada
63 P04_B6 CIIDIR 003 P01_F3 α Bacillus sp. DU87(2010); HM567144
64 P04_B10 CIIDIR 003 P01_F4 β No identificada
65 P04_G2 CIIDIR 003 P01_F5 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
66 P05_B4 CIIDIR 003 P01_F6 α Bacillus sp. xm-3; FJ584306
67 P05_C2 CIIDIR 003 P01_F7 α Bacillus sp. EK-6; EU910226
68 P05_E5 CIIDIR 003 P01_F8 α Bacillus sp. BCL13-1; EF026993
69 P05_H5 CIIDIR 003 P01_F9 α Bacillus thuringiensis; WS 261; Z84584
70 P06_C8 CIIDIR 003 P01_F10 α Bacillus sp. enrichment culture clone SYW19; FJ601649
71 P07_C1 CIIDIR 003 P01_F11 β Bacillus cereus; EK-15; EU910235
72 P07_D1 CIIDIR 003 P01_F12 β Bacillus endophyticus; JMC-UBL 13; HM451436
73 P07_F9 CIIDIR 003 P01_G1 α Bacillus sp. CCBAU 13246; EF377306
74 P08_C10 CIIDIR 003 P01_G2 β Bacillus sp. BCL13-1; EF026993
75 P08_F3 CIIDIR 003 P01_G3 β Enterobacter sp. BMC3; JN053269
76 P08_G11 CIIDIR 003 P01_G4 α Bacillus megaterium; DS8; EU835733
77 P08_H3 CIIDIR 003 P01_G5 α Bacillus sp. m2-3;
75
HM587903
78 P09_B1 CIIDIR 003 P01_G6 α No identificada
79 P09_B3 CIIDIR 003 P01_G7 α Pantoea sp. M1R3; FJ560465
80 P09_D9 CIIDIR 003 P01_G8 α Bacillus licheniformis; GQ482981
81 P09_D10 CIIDIR 003 P01_G9 α Bacillus cereus; MBG27; JF280127
82 P09_G3 CIIDIR 003 P01_G10 α Bacillus circulans; SB1; DQ981456
83 P09_G11 CIIDIR 003 P01_G11 β No identificada
84 P10_A11 CIIDIR 003 P01_G12 β No identificada
85 P10_B1 CIIDIR 003 P01_H1 α Oceanobacillus picturae; OS-221.b; AM237397
86 P10_E1 CIIDIR 003 P01_H2 β Xanthomonas sp. KD2009-18; FN645733
87 P10_E8 CIIDIR 003 P01_H3 β Pseudomonas putida; AN2; AB108691
88 P10_F1 CIIDIR 003 P01_H4 β Stenotrophomonas maltophilia; LMG 957; AJ131114
89 P10_G1 CIIDIR 003 P01_H5 α Paenibacillus lautus; TSWCSN3; GQ284373
90 P10_H11 CIIDIR 003 P01_H6 β No identificada
91 P11_A1 CIIDIR 003 P01_H7 α No identificada
92 P11_A12 CIIDIR 003 P01_H8 α No identificada
93 P11_D9 CIIDIR 003 P01_H9 α Bacillus sp. BCL13-1; EF026993
94 P11_E6 CIIDIR 003 P01_H10 β Bacillus sp. PN13; DQ523735
95 P11_F1 CIIDIR 003 P01_H11 β Enterobacter sp.
96 P11_C1 CIIDIR 003 P01_H12 β Bacillus endophyticus; b2; EU434558
97 P12_C6 CIIDIR 003 P02_A1 ɣ Enterobacter sp. enrichment culture clone HSL83A;
76
HM461212
98 P12_C12 CIIDIR 003 P02_A2 ɣ Pseudomonas plecoglossicida (T); FPC951; AB009457
99 P12_D10 CIIDIR 003 P02_A3 α Bacillus subtilis subsp. subtilis; NB-17; HQ222830
100 P12_E5 CIIDIR 003 P02_A4 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
101 P12_E10 CIIDIR 003 P02_A5 α Pseudomonas putida; 24; FN645735
102 P12_F7 CIIDIR 003 P02_A6 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
103 P12_F12 CIIDIR 003 P02_A7 α Pseudomonas plecoglossicida (T); FPC951; AB009457
104 P12_G3 CIIDIR 003 P02_A8 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
105 P13_A1 CIIDIR 003 P02_A9 ɣ Bacillus megaterium; SUF4,; AJ880767
106 P13_A6 CIIDIR 003 P02_A10 β No identificada
107 P13_A11 CIIDIR 003 P02_A11 β No identificada
108 P13_B3 CIIDIR 003 P02_A12 ɣ Bacillus sp. No.61; AB066338
109 P13_B4 CIIDIR 003 P02_B1 ɣ Bacillus sp. No.61; AB066338
110 P13_B9 CIIDIR 003 P02_B2 α Bacillus megaterium; IARI-CS-34; JF343134
111 P13_C1 CIIDIR 003 P02_B3 α Bacillus sp.
112 P13_C9 CIIDIR 003 P02_B4 ɣ Bacillus megaterium; LM 58; EU571105
113 P13_E10 CIIDIR 003 P02_B5 ɣ Bacillus sp. BCL13-1; EF026993
114 P13_H7 CIIDIR 003 P02_B6 ɣ Bacillus sp.
115 P14_E7 CIIDIR 003 P02_B7 β Bacillus benzoevorans; AY043085
116 P14_F5 CIIDIR 003 P02_B8 β Bacillus benzoevorans;
77
AY043085
117 P14_F9 CIIDIR 003 P02_B9 ɣ Bacillus circulans (T); ATCC 4513; NCTC 2610; NCDO1775; AY724690
118 P14_G2 CIIDIR 003 P02_B10 β No identificada
119 P14_G9 CIIDIR 003 P02_B11 ɣ Bacillus sp.
120 P15_A4 CIIDIR 003 P02_B12 α Bacillus megaterium; IARI-CS-54; JF343148
121 P15_A6 CIIDIR 003 P02_C1 β Bacillus sp. 8S4; AM237091
122 P15_B9 CIIDIR 003 P02_C2 β Stenotrophomonas maltophilia; LMG 957; AJ131114
123 P15_G9 CIIDIR 003 P02_C3 β Bacillus pumilus; EI-26-5; AJ494729
124 P15_H7 CIIDIR 003 P02_C4 ɣ Arthrobacter pascens; T10-5; JF798389
125 P16_C4 CIIDIR 003 P02_C5 ɣ Bacillus sp
126 P16_C10 CIIDIR 003 P02_C6 ɣ Bacillus circulans; BS_T; EU835741
127 P16_E3 CIIDIR 003 P02_C7 β Bacillus circulans; BS_T; EU835741
128 P16_H11 CIIDIR 003 P02_C8 β Pseudomonas fluorescens; FPH00796; AB478394
129 P17_A9 CIIDIR 003 P02_C9 β Pseudomonas fluorescens; FPH00796; AB478394
130 P17_C10 CIIDIR 003 P02_C10 β Bacillus sp.
131 P17_D10 CIIDIR 003 P02_C11 ɣ Bacillus circulans; BS_T; EU835741
132 P17_D11 CIIDIR 003 P02_C12 α Bacillus circulans; BS_T; EU835741
133 P17_E11 CIIDIR 003 P02_D1 ɣ Bacillus sp.
134 P17_H10 CIIDIR 003 P02_D2 ɣ Bacillus sp. V5DMK; JF975601
135 P18_C1 CIIDIR 003 P02_D3 β Stenotrophomonas sp.
78
136 P18_G2 CIIDIR 003 P02_D4 β Stenotrophomonas maltophilia; CAI4; DQ103763
137 P18_H1 CIIDIR 003 P02_D5 α Stenotrophomonas sp. KBS-36; DQ847325
138 P20_C4 CIIDIR 003 P02_D6 α Pseudomonas monteilii; PCWCW13; GQ284481
139 P23_B3 CIIDIR 003 P02_D7 β Lysinibacillus sphaericus; S33; AB116123
140 P23_B5 CIIDIR 003 P02_D8 α Pseudomonas plecoglossicida (T); FPC951; AB009457
141 P23_D3 CIIDIR 003 P02_D9 α Bacillus sp. BCL13-1; EF026993
142 P23_F12 CIIDIR 003 P02_D10 β Bacillus subtilis subsp. subtilis; NBAII-25; HQ162493
143 P24_A12 CIIDIR 003 P02_D11 β Lysinibacillus sphaericus; S33; AB116123
144 P24_B9 CIIDIR 003 P02_D12 α No identificada
145 P24_H12 CIIDIR 003 P02_E1 β Bacillus vallismortis; qd53; EF473133
146 P25_H2 CIIDIR 003 P02_E2 β Lysinibacillus sphaericus; S33; AB116123
147 P26_F9 CIIDIR 003 P02_E3 β Lysinibacillus sp.
148 P26_G7 CIIDIR 003 P02_E4 β Lysinibacillus sp.
149 P26_H4 CIIDIR 003 P02_E5 β Lysinibacillus sphaericus; S33; AB116123
150 P26_H7 CIIDIR 003 P02_E6 β Lysinibacillus sphaericus; S33; AB116123
151 P27_A10 CIIDIR 003 P02_E7 ɣ Bacillus benzoevorans; AY043085
152 P30_D5 CIIDIR 003 P02_E8 α No identificada
153 P31_B9 CIIDIR 003 P02_E9 β Bacillus sp. PN13; DQ523735
79
154 P31_C1 CIIDIR 003 P02_E10 α Bacillus sp. AS6; HQ844260
155 P31_C2 CIIDIR 003 P02_E11 α No identificada
156 P31_C7 CIIDIR 003 P02_E12 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
157 P31_C12 CIIDIR 003 P02_F1 ɣ Bacillus sp. PN13; DQ523735
158 P31_G6 CIIDIR 003 P02_F2 ɣ Bacillus sp. PN13; DQ523735
159 P31_H1 CIIDIR 003 P02_F3 β Pseudomonas sp.
160 P31_H5 CIIDIR 003 P02_F4 ɣ Bacillus sp. PN13; DQ523735
161 P31_H6 CIIDIR 003 P02_F5 β Bacillus sp. PN13; DQ523735
162 P32_A11 CIIDIR 003 P02_F6 ɣ No identificada
163 P32_B2 CIIDIR 003 P02_F7 β No identificada
164 P32_B4 CIIDIR 003 P02_F8 α No identificada
165 P32_B5 CIIDIR 003 P02_F9 α No identificada
166 P32_B11 CIIDIR 003 P02_F10 β No identificada
167 P32_B12 CIIDIR 003 P02_F11 α No identificada
168 P32_C11 CIIDIR 003 P02_F12 ɣ No identificada
169 P32_D12 CIIDIR 003 P02_G1 ɣ No identificada
170 P32_E12 CIIDIR 003 P02_G2 ɣ No identificada
171 P32_F12 CIIDIR 003 P02_G3 ɣ No identificada
172 P32_G4 CIIDIR 003 P02_G4 ɣ No identificada
173 P32_H3 CIIDIR 003 P02_G5 β No identificada
174 P32_H8 CIIDIR 003 P02_G6 α No identificada
175 P32_H9 CIIDIR 003 P02_G7 α No identificada
176 P33_A1 CIIDIR 003 P02_G8 β Arthrobacter nitroguajacolicus; Rue61a; AJ785758
177 P33_A9 CIIDIR 003 P02_G9 ɣ Bacillus subtilis subsp. subtilis; rif200823; FJ527660
80
178 P33_B1 CIIDIR 003 P02_G10 α Bacillus sp.
179 P33_B2 CIIDIR 003 P02_G11 α Bacillus pumilus; CSMCRI-12; HQ318731
180 P33_B4 CIIDIR 003 P02_G12 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
181 P33_B5 CIIDIR 003 P02_H1 α Bacillus sp
182 P33_B12 CIIDIR 003 P02_H2 ɣ Bacillus subtilis subsp. subtilis; RP24; EF154418
183 P33_C1 CIIDIR 003 P02_H3 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
184 P33_D1 CIIDIR 003 P02_H4 α No identificada
185 P33_D9 CIIDIR 003 P02_H5 α Bacillus sp. BCL13-1; EF026993
186 P33_D12 CIIDIR 003 P02_H6 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
187 P33_F9 CIIDIR 003 P02_H7 α Acinetobacter calcoaceticus; type strain: DSM 30006; AJ633632
188 P33_G4 CIIDIR 003 P02_H8 β Bacillus cereus; RG-08/06; EF195169
189 P33_G12 CIIDIR 003 P02_H9 α Bacillus sp. BY103(B)Ydz-dh; EU070365
190 P33_H9 CIIDIR 003 P02_H10 ɣ Bacillus sp. EK-6; EU910226
191 P34_B5 CIIDIR 003 P02_H11 ɣ Bacillus sp.
192 P34_D7 CIIDIR 003 P02_H12 β Bacillus macroides; LMG 18474; AJ628749
193 P34_G9 CIIDIR 003 P03_A1 ɣ Bacillus megaterium; WR38; JF700411
194 P35_A1 CIIDIR 003 P03_A2 α Bacillus megaterium; SUF4,; AJ880767
195 P35_B2 CIIDIR 003 P03_A3 α No identificada
196 P35_B10 CIIDIR 003 P03_A4 α Bacillus sp. EK-24; EU910244
81
197 P35_C10 CIIDIR 003 P03_A5 α Bacillus sp. AS6; HQ844260
198 P35_E10 CIIDIR 003 P03_A6 β Bacillus subtilis subsp. subtilis; CICC9011; AY879290
199 P35_F10 CIIDIR 003 P03_A7 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
200 P35_G3 CIIDIR 003 P03_A8 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
201 P35_G11 CIIDIR 003 P03_A9 α Bacillus sp. TBM352; EF612720
202 P35_G12 CIIDIR 003 P03_A10 α Bacillus sp. PN13; DQ523735
203 P35_H1 CIIDIR 003 P03_A11 α No identificada
204 P36_A4 CIIDIR 003 P03_A12 α Enterobacter sp.
205 P36_F1 CIIDIR 003 P03_B1 α Bacillus sp. No.61; AB066338
206 P36_F4 CIIDIR 003 P03_B2 β Bacillus cereus; EK-15; EU910235
207 P36_H10 CIIDIR 003 P03_B3 α Bacillus sp. CCBAU 13246; EF377306
208 P37_B4 CIIDIR 003 P03_B4 α No identificada
209 P37_C10 CIIDIR 003 P03_B5 α No identificada
210 P37_C11 CIIDIR 003 P03_B6 α No identificada
211 P37_D2 CIIDIR 003 P03_B7 α No identificada
212 P37_D10 CIIDIR 003 P03_B8 α No identificada
213 P37_D11 CIIDIR 003 P03_B9 α No identificada
214 P37_D12 CIIDIR 003 P03_B10 α No identificada
215 P37_E3 CIIDIR 003 P03_B11 ɣ No identificada
216 P37_E9 CIIDIR 003 P03_B12 α No identificada
217 P37_F10 CIIDIR 003 P03_C1 α No identificada
218 P37_F11 CIIDIR 003 P03_C2 α No identificada
219 P37_G11 CIIDIR 003 P03_C3 α No identificada
220 P38_B8 CIIDIR 003 P03_C4 β Bacillus circulans; SB1; DQ981456
82
221 P38_B10 CIIDIR 003 P03_C5 β Bacillus sp.
222 P39_B4 CIIDIR 003 P03_C6 β No identificada
223 P39_C4 CIIDIR 003 P03_C7 β No identificada
224 P39_C7 CIIDIR 003 P03_C8 β No identificada
225 P39_E9 CIIDIR 003 P03_C9 α No identificada
226 P39_F4 CIIDIR 003 P03_C10 α No identificada
227 P40_B1 CIIDIR 003 P03_C11 α No identificada
228 P40_E2 CIIDIR 003 P03_C12 α No identificada
229 P40_E5 CIIDIR 003 P03_D1 ɣ No identificada
230 P43_B2 CIIDIR 003 P03_D2 β Enterobacter sp. CTSP22; EU855203
231 P43_B6 CIIDIR 003 P03_D3 β Enterobacter sp.
232 P43_C2 CIIDIR 003 P03_D4 α Bacillus megaterium; 108; AB334764
233 P43_D5 CIIDIR 003 P03_D5 α Enterobacter sp.
234 P43_G10 CIIDIR 003 P03_D6 α Enterobacter sp. CTSP22; EU855203
235 P44_B11 CIIDIR 003 P03_D7 β Enterobacter sp.
236 P44_H8 CIIDIR 003 P03_D8 α Bacillus sp. C-H-TSA2; HM755470
237 P44_H9 CIIDIR 003 P03_D9 α Enterobacter sp.
238 P45_A3 CIIDIR 003 P03_D10 α Enterobacter sp.
239 P45_C1 CIIDIR 003 P03_D11 α Enterobacter sp.
240 P45_D5 CIIDIR 003 P03_D12 β Enterobacter aerogenes; HC050612-1; EU047701
241 P45_G9 CIIDIR 003 P03_E1 α Enterobacter sp.
242 P45_H5 CIIDIR 003 P03_E2 β Enterobacter sp. CTSP22; EU855203
243 P45_H6 CIIDIR 003 P03_E3 α Enterobacter aerogenes; HC050612-1; EU047701
244 P45_H11 CIIDIR 003 P03_E4 β Enterobacter aerogenes; HC050612-1; EU047701
83
245 P46_A12 CIIDIR 003 P03_E5 α No identificada
246 P46_G10 CIIDIR 003 P03_E6 β No identificada
247 P47_E12 CIIDIR 003 P03_E7 ɣ Bacillus circulans; BS_T; EU835741
248 P47_G3 CIIDIR 003 P03_E8 ɣ Bacillus circulans; 080702F1; AF540984
249 P47_H2 CIIDIR 003 P03_E9 α Bacillus sp.
250 P49_E7 CIIDIR 003 P03_E10 α Pseudomonas sp.
84
ANEXO 2. Cuadro con los 35 microorganismos con hemólisis ɣ y del sub-banco CIIDIR AUX, rearreglados y criopreservados. Este sub-banco fue denominado CIIDIR AUX ɣ.
# Nombre del banco
Posición CIIDIR 003
Posición en el sub-banco CIIDIR AUX
Posición en el Sub-banco CIIDIR AUX ɣ
Especie
1 CIIDIR-AUX P12_C6 P02_A1 P01_E1 Enterobacter sp. enrichment culture clone HSL83A; HM461212
2 CIIDIR-AUX P12_C12 P02_A2 P01_E2 Pseudomonas plecoglossicida (T); FPC951; AB009457
3 CIIDIR-AUX P13_A1 P02_A9 P01_E3 Bacillus megaterium; SUF4,; AJ880767
4 CIIDIR-AUX P13_B3 P02_A12 P01_E4 Bacillus sp. No.61; AB066338
5 CIIDIR-AUX P13_B4 P02_B1 P01_E5 Bacillus sp. No.61; AB066338
6 CIIDIR-AUX P13_C9 P02_B4 P01_E6 Bacillus megaterium; LM 58; EU571105
7 CIIDIR-AUX P13_E10 P02_B5 P01_E7 Bacillus sp. BCL13-1; EF026993
8 CIIDIR-AUX P13_H7 P02_B6 P01_E8 Bacillus sp.
9 CIIDIR-AUX P14_F9 P02_B9 P01_E9 Bacillus circulans (T); ATCC 4513; NCTC 2610; NCDO1775; AY724690
10 CIIDIR-AUX P14_G9 P02_B11 P01_F1 Bacillus sp.
11 CIIDIR-AUX P15_H7 P02_C4 P01_F2 Arthrobacter pascens; T10-5; JF798389
12 CIIDIR-AUX P16_C4 P02_C5 P01_F3 Bacillus sp
85
13 CIIDIR-AUX P16_C10 P02_C6 P01_F4 Bacillus circulans; BS_T; EU835741
14 CIIDIR-AUX P17_D10 P02_C11 P01_F5 Bacillus sp.
15 CIIDIR-AUX P17_E11 P02_D1 P01_F6 Bacillus sp.
16 CIIDIR-AUX P17_H10 P02_D2 P01_F7 Bacillus sp. V5DMK; JF975601
17 CIIDIR-AUX P27_A10 P02_E7 P01_F8 Bacillus benzoevorans; AY043085
18 CIIDIR-AUX P31_C12 P02_F1 P01_F9 Bacillus sp. PN13; DQ523735
19 CIIDIR-AUX P31_G6 P02_F2 P01_G1 Bacillus sp. PN13; DQ523735
20 CIIDIR-AUX P31_H5 P02_F4 P01_G2 Bacillus sp. PN13; DQ523735
21 CIIDIR-AUX P32_A11 P02_F6 P01_G3 No identificada
22 CIIDIR-AUX P32_C11 P02_F12 P01_G4 No identificada
23 CIIDIR-AUX P32_D12 P02_G1 P01_G5 No identificada
24 CIIDIR-AUX P32_E12 P02_G2 P01_G6 No identificada
25 CIIDIR-AUX P32_F12 P02_G3 P01_G7 No identificada
26 CIIDIR-AUX P32_G4 P02_G4 P01_G8 No identificada
27 CIIDIR-AUX P33_A9 P02_G9 P01_G9 Bacillus subtilis subsp. subtilis; rif200823; FJ527660
28 CIIDIR-AUX P33_B12 P02_H2 P01_H1 Bacillus subtilis subsp. subtilis; RP24; EF154418
29 CIIDIR-AUX P33_H9 P02_H10 P01_H2 Bacillus sp. EK-6; EU910226
30 CIIDIR-AUX P34_B5 P02_H11 P01_H3 Bacillus sp.
31 CIIDIR-AUX P34_G9 P03_A1 P01_H4 Bacillus megaterium; WR38; JF700411
32 CIIDIR-AUX P37_E9 P03_B11 P01_H5 No identificada
33 CIIDIR-AUX P40_E5 P03_D1 P01_H6 No identificada
86
34 CIIDIR-AUX P47_E12 P03_E7 P01_H7 Bacillus circulans; BS_T; EU835741
35 CIIDIR-AUX P47_G3 P03_E8 P01_H8 Bacillus circulans; 080702F1; AF540984