Bol. San. Veg. Plagas, 27: 355-362, 200i

Selección de olmos resistentes a la grafiosis.I. Influencia de la composición del inóculo infectivo

A. SOLLA, L. GIL

Para seleccionar olmos resistentes a la grafiosis es preciso inocularlos, previa-mente, con un inoculo capaz de producir sintomatologías elevadas. Sobre olmos ibé-ricos se pretendió observar la conveniencia de utilizar inóculos infectivos compues-tos por esporas de Ophiostoma ulmi, de O. novo-ulmi o de la combinación de ambasespecies. Se utilizaron 5 clones de olmos y 4 inóculos infectivos. A los 60 días deinocular, los inóculos con mayor proporción de esporas de O. ulmi originaron losmenores porcentajes de marchitamiento (P < 0,05). La presencia de O. ulmi en elinoculo compuesto por O. novo-ulmi: O. ulmi (1:4) indujo resistencia en los árbolesinoculados, luego se desaconseja el empleo de O. ulmi para obtener sintomatologías

A. SOLLA, L. GIL. Unidad de Anatomía, Fisiología y Mejora Genética. E.T.S.I. deMontes. Universidad Politécnica de Madrid. Paseo de las Moreras s/n. 28040-Madrid.Persona de contacto: Luis Gil (lgil@montes.upm.es).

Palabras clave: grafiosis, olmo, mejora genética, Ophiostoma ulmi, Ophiostomanovo-ulmi

INTRODUCCIÓN

Los hongos responsables de la grafiosisdel olmo pertenecen a las especies denomi-nadas Ophiostoma ulmi (Buisman) Nannf.[=Ceratostomella ulmi; =Ceratocystis ulmi]y O. novo-ulmi Brasier (BRASIER, 1991). Re-cientemente se ha descrito una tercera espe-cie, denominada O. himal-ulmi sp. nov.(BRASIER y MEHROTRA, 1995). O. novo-ulmise subdivide en dos biótipos, la raza nortea-mericana (NAN) y la raza euroasiática(EAN). Las dos primeras también se cono-cen como especie no agresiva y especieagresiva, respectivamente.

Las principales diferencias entre la espe-cie no agresiva y la agresiva estriban en quela primera presenta un micelio más algodo-noso pero un menor crecimiento y virulencia

que la segunda (Fig. 1 y 2) (GIBBS y BRA-SIER, 1973; SVALDI y ELGERSMA, 1982).También se diferencian en aspectos repro-ductivos (BRASIER, 1986b). En España, la es-pecie no agresiva se detecta a comienzos delos años treinta en olmos de Chamartín de laRosa, Madrid (MARTÍNEZ, 1932). La especieagresiva se aisla por primera vez en 1980, ensu forma NAN, a partir de muestras proce-dentes de San Sebastián y de Aracena (MU-ÑOZ y RUPÉREZ, 1980). En la actualidad O.novo-ulmi se encuentra presente en toda laPenínsula y Baleares (GARCÍA y ROMERO,1996), y reemplaza a O. ulmi en las olmedasinfectadas.

En los trabajos dedicados a la mejora delolmo frente a la grafiosis (HEYBROEK, 1993;SMALLEY y GURÍES, 1993; TOWNSEND ySANTAMOUR, 1993; SOLLA et al., 1999) se

Fig. 2.-Cepa agresiva de grafiosis(Ophiostoma novo-ulmi), raza NAN, cultivada 8 días

en MEA a 20 °C. Se observan líneas radiales,el borde no lobulado y un mayor crecimiento.

inoculan artificialmente las esporas de loshongos desde que se comprobó que estemétodo de evaluación produce efectos si-milares a las infecciones provocadas pormordeduras de escol ítidos. La metodologíade inoculación propuesta por TCHERNOFF(1965) se impuso por su idoneidad y es lacomúnmente utilizada hoy en día. Consisteen inyectar durante la primavera, y en elanillo del año, una suspensión de esporasde Ophiostoma ulmi u O. novo-ulmi a con-centraciones mayores de 103 conidios/ml.El marchitamiento foliar es el principal pa-rámetro utilizado para estimar la resistenciade un individuo (HEYBROEK, 1993; SMA-LLEY y GURÍES, 1993), dada su alta correla-ción con otras sintomatologías. Ahora bien,este marchitamiento depende de la especiedel hongo utilizado en el inoculo y de la vi-rulencia del mismo (GIBBS y BRASIER,1973).

Entre los diferentes programas de me-jora y para la selección de olmos resis-tentes no existe consenso a la hora de utili-zar una composición de inoculodeterminada. En un ensayo realizado conU. x hollandica se observó la conveniencia

de inocular únicamente O. novo-ulmi paraobtener sintomatologías máximas (SCHEF-FER et al., 1980). No obstante, son varioslos programas de mejora que siguen utili-zando suspensiones mixtas de conidios deO. novo-ulmi y O. ulmi (TOWNSEND y SAN-TAMOUR, 1993). Ello plantea la duda en elprograma español de mejora de qué com-posición de inoculo utilizar. El objetivodel presente trabajo es comprobar la con-veniencia de inocular suspensiones quecontengan esporas de O. ulmi, de O. novo-ulmi o de la combinación de ambas espe-cies.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se emplearon las cepas W9 y M-SF delas especies Ophiostoma ulmi y O. novo-ulmi, respectivamente. En el cuadro 1 seindica el origen y la fecha de aislamientoasí como sus crecimientos in vitro. Loshongos fueron conservados a 4 °C en pla-cas de Petri conteniendo agar extracto demalta (MEA) [Oxoid]. La semana antes delas inoculaciones se introdujeron tres pie-

Fig. l.-Cepa no agresiva de grafiosis(Ophiostoma ulmi) cultivada 10 días en MEA,

a 20 °C. Se observan círculos concéntricosy el borde lobulado.

zas de 2 x 2 mm de micelio, de cada hongopor separado, en frascos Erlenmeyer con-teniendo medio líquido de Tchernoff(TCHERNOFF, 1965). La composición delmedio fue 20 g de glucosa, 2 g de L-aspa-rragina, 1,5 g de KH2PO4, 1 g de MgSO4 .7 H2O, 20 mg de ZnSO4. 7 H2O, 10 mg deFeCl3, 1 mg de vitamina Bt (tiamina), y 1mg de vitamina B6 (piridoxina) en 1 1 deagua destilada esterilizada. Los frascos seagitaron durante tres días, a 125 rpm, y atemperatura del laboratorio (25 ± 5 °C)(Fig. 3).

Las esporas desarrolladas en el medio(Fig. 4) fueron filtradas con papel de altogramaje (73 g m2), centrifugadas e introdu-cidas en agua destilada esterilizada. Se pre-pararon cuatro suspensiones con proporcio-nes similares a las ensayadas por SCHEFFERet al. (1980): 1), Ophiostoma ulmi a 105 co-nidios/ml; 2), mezcla 4:1 de O. ulmi y O.novo-ulmi (105 : 0,25 x 105 conidios/ml);3), mezcla 1:4 de O. ulmi y O. novo-ulmi(0,25 x 105 : 105 conidios/ml), y 4), O.novo-ulmi a 105 conidios/ml. Las concen-traciones se ajustaron mediante una placaThomas (Fig. 5).

Las inoculaciones en los árboles se rea-lizaron el 24 de mayo de 1994 medianteuna pipeta de Pasteur (Fig. 6). Se practi-caron dos cortes transversales diametral-mente opuestos en el tronco principal delárbol, con una navaja, hasta llegar al ani-llo xilemático del año anterior. Los cortes

se hicieron a una altura aproximada de 10cm sobre el nivel del suelo. Sobre la hojade la navaja se vertió 0,1 mi de la suspen-sión, la cual fiie rápidamente absorbidapor el árbol.

Se utilizaron cuatro clones de la especieU. minor y un quinto clon híbrido entre U.minor y Ú. pumila, designados respectiva-mente como M-CC 1, M-DV 1, M-DV 2,TO-PB 1 y M-PZ 3 (Cuadro 2). La planta seobtuvo en 1991 a partir de estaquillas de raízy fue plantada en el Centro de Mejora Gené-tica Forestal "Puerta de Hierro", Madrid, aun marco de 0,5 x 1,0 m. Se emplearon almenos cinco réplicas por genotipo y porcomposición de inoculo. En el momento dela inoculación los árboles tenían cuatro sa-vias y alturas próximas a 1,5 m, a excepcióndel genotipo híbrido que rondaba los dosmetros.

La planta fue observada a diario hasta elprimer día en que mostró síntomas. La sus-ceptibilidad de los árboles a la grafiosis seevaluó a través de los porcentajes de mar-chitamiento foliar mostrados en la copa(GIBBS y BRASIER, 1973). Dichos porcenta-jes se registraron a los 8, 15, 30 y 60 díastras las inoculaciones y fueron normaliza-dos mediante la transformación arcsen(x/100)1/2. Se realizó un ANOVA multifac-torial considerándose como factores el clony la composición de inoculo, y para com-parar las medias se realizaron tests LSD (P< 0,05).

Cuadro 1 .-Especie, origen y tasa de crecimiento relativo (MEA, 20 °C) de los hongos utilizados

Aislamiento Especie, raza Origen Autor, fecha CR(mm/día)

W9M-SF

O. ulmiO. novo-ulmi, NAN

HolandaPuente de San Fernando, Madrid

FRS, U.K, 1987ETSI Montes, 1992

2,85,8

Cuadro 2.-Material vegetal empleado para estudiar la influencia de la composición del inoculo infectivo en lamanifestación de síntomas por grafiosis

Clon Especie Procedencia Altitud(m) Entorno

Altura ± es

(cm)

M-CC 1M-DV 1M-DV 2TO-PB 1M-PZ 3

U. minorU. minorU. minorU. minor

U. minor x U. pumila

Casa de Campo, MadridDehesa de la Villa, MadridDehesa de la Villa, MadridPuebla de Montalbán, ToledoPezuela de Torres, Madrid

600660660500760

parque o jardínparque o jardínparque o jardínmasa natural

parque o jardín

123 ± 12162 ± 11142 ± 11155 ±9

210± 15

Fig. 3.-Agitador rotatorio con frascosErlenmeyer en los que se obtienen esporas

de los hongos de la grafiosis.

Fig. 5.-Conidios y micelio de una cepa de O. novo-ulmisobre la malla de una placa Thomas (0,05 x 0,05 mm).

Fig. 4.-Frasco de Erlenmeyer conteniendo mediolíquido de Tchernoff, a los tres días de agitación. En ellíquido se observan, en suspensión, conidios y micelio

de una cepa de grafiosis.

RESULTADOS

La figura 7 muestra los porcentajes demarchitamiento manifestados a los 60 díaspor cada clon y composición de inoculo in-fectivo. Los clones M-PZ 3 y M-DV 2 fueronlos más resistentes. El bajo marchitamientocausado por la mezcla 4:1 en M-CC 1 y losvalores no aditivos en M-PZ 3 hicieron signi-ficativa la interacción clon x composicióndel inoculo (P < 0,01) (Cuadro 3). En la partederecha de la figura 7 se representan los valo-res medios para los cinco clones. El inoculoinfectivo compuesto sólo por Ophiostomaulmi originó menores marchitamientos que elinoculo compuesto sólo por Ophiostomanovo-ulmi. La inoculación con la mezcla deambas especies dio lugar a sintomatologíasintermedias, aunque no se hallaron diferen-cias significativas entre las inoculaciones re-

Fig. 6.-Inoculación artificial de conidios sobre eltronco principal de un ejemplar de U. minor.

alizadas con O. novo-ulmi y las realizadascon la mezcla O. ulmi: O. novo-ulmi en laproporción 1:4 (P> 0,10).

Cuadro 3.-A NOVA multifactorial para la variable "marchitamiento a los 60 días"de cinco clones de olmos (n > 5) inoculados con cuatro composiciones de inoculo: 1), Ophiostoma ulmi;

2), mezcla 4:1 de O. ulmi: O. novo-ulmi; 3), mezcla 1:4 de O. ulmi: O. novo-ulmi y 4), O. novo-ulmi

La evolución del marchitamiento foliarfue diferente según la composición del ino-culo infectivo utilizado. Los primeros sínto-mas en respuesta a O. novo-ulmi y a susmezclas se presentaron a los siete días des-pués de inocular. El marchitamiento se man-tuvo constante a partir de los 30 días. Sinembargo, los primeros síntomas foliares delos ejemplares infectados con O. ulmi no seapreciaron hasta el décimo día y se mantu-vieron constantes a partir del día 15. En la fi-gura 8 se muestra la evolución del marchita-miento foliar manifestado por el clon mássusceptible. AI establecer regresiones sim-

ples entre los valores de los marchitamientosa los 8, 15, 30 y 60 días se obtienen coefi-cientes de regresión (r2) superiores a 0,5 (P <0,01).

DISCUSIÓN

La composición del inoculo infectivodetermina la intensidad de los síntomasmanifestados en el olmo. Inoculacionescon una cepa de la especie agresiva provo-can mayores marchitamientos que inocula-ciones con una cepa de la especie no agre-

Fig. 7.-Porcentajes de marchitamiento medio manifestados por cinco clones de tres savias, el 24 de julio de 1994, a los60 días de su inoculación (n > 5). A la derecha se dan los valores medios. Se utilizaron inoculas infectivos compuestos

por una cepa de O. ulmi, otra de O. novo-ulmi, y sus mezclas en las proporciones 4:1 y 1:4. Las barras verticalesrepresentan errores estándar y letras distintas indican diferencias significativas para cada clon (P < 0,05).

FACTORA: ClonB: Composición de inoculo

INTERACCIONESABERROR

TOTAL (corregido)

Fig. 8.-Evolución de síntomas manifestados por el clon TO-PB 1 tras la inoculación de réplicas (n > 5)con una cepa de O. ulmi, otra de O. novo-uimi, y sus mezclas en las proporciones 4:1 y 1:4.

Las barras verticales representan errores estándar y letras distintas indican diferencias significativasentre los valores para cada día (P < 0,05).

siva (GIBBS y BRASIER, 1973). En los resul-tados correspondientes a la figura 7 se ob-tiene lo mismo al considerar los marchita-mientos medios de cinco genotipos ibéricos.La evolución del marchitamiento foliar ob-servada coincide con la descrita anterior-mente para U. minor y U. x hollandica(HOLMES et al., 1972; BRASIER, 1986a).Los síntomas originados por las cepas noagresivas tardan más en manifestarse y semantienen constantes a los pocos días deaparecer. La menor producción de toxinasy de enzimas de degradación por parte dela especie no agresiva (TAKAY, 1980;SVALDI y ELGERSMA, 1982) ralentiza tal vezla aparición de síntomas y permite a laplanta controlar el daño con mayor facili-dad. En otras enfermedades, la mayor omenor producción de compuestos de altopeso molecular, tales como toxinas, ha sidorelacionada con la virulencia de las cepas(HUSAIN y KELMAN, 1958; SUTTON y W I -LLIAMS, 1968).

Las inoculaciones con la mezcla de especiesoriginaron sintomatologías intermedias, simila-res a las obtenidas por SCHEFFER et al. (1980) enU. x hollandica. En la figura 7 se observa quelos síntomas medios provocados por la mezclade cepas de O. ulmi: O. novo-ulmi en la relación4:1 difieren de los provocados por las inocula-ciones con O. novo-ulmi. Es posible que la pre-sencia de O. ulmi haya interaccionado con O.novo-ulmi induciendo resistencia en las plantas.Se concluye que inocular una mezcla de las es-pecies agresiva y no agresiva de la grafiosis nopermite observar sintomatologías máximas enejemplares ibéricos de olmos. Para este últimopropósito se recomienda utilizar una única cepaagresiva, de alta virulencia. Al evaluar la resis-tencia de la planta bastará con registrar los por-centajes de marchitamiento a los dos meses.Evaluar el marchitamiento después de 60 díasno resulta fácil pues a partir de este momentocomienzan a secarse los ramillos y a caerse lashojas, y los síntomas se pueden superponer conlos causados por el estrés hídrico estival.

AGRADECIMIENTOS

A Yolanda Menéndez y a Ma EugeniaGracia-Nieto por la colaboración técnica. ASalustiano Iglesias y a Manuel Tuero por su

continuo apoyo. Se agradece a Julio Diez larevisión del manuscrito. El trabajo se ha de-sarrollado en el marco de un convenio sus-crito entre la DGCONA (Ministerio de Me-dio Ambiente) y la ETSI de Montes (UPM).

ABSTRACT

SOLLA, A.; GIL, L. 2001. Selección de olmos resistentes. I. Influencia de la compo-sición del inoculo infectivo. Bol. San. Veg. Plagas. Vol. 27 (3): 355-362

In order to select trees that are resistant to Dutch elm disease, it is necessary to ino-culate them previously with an inoculum capable of producing strong symptoms. Ibe-rian elms were studied to assess the suitability of using infective inoculums with sporesof Ophiostoma ulmi, of O. novo-ulmi and spores of both species. Five elm clones andfour infective inoculums were used. Sixty days after inoculation, the lowest wilting per-centage was produced by those inoculums containing the most O. ulmi spores (P <0,05). Resistance was induced in the inoculated trees, due to the presence of O. ulmi inthe O. novo-ulmi: O. ulmi (1:4) inoculum, meaning it is therefore inadvisable to use O.ulmi to maximise symptoms.

Key words: Dutch elm disease, elm, breeding, Ophiostoma ulmi, Ophiostomanovo-ulmi.

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