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Selección de variantes de virus denguesensibles a la heparina en células BHK-21.

Argelia Celis1,2, Zoila Moros1, Marlene Gerder1, Francesca Pagano1, Esmeralda Vizzi1 y

Ferdinando Liprandi1.

1Laboratorio Biología de Virus, Centro de Microbiología y Biología Celular,Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC). Caracas, Venezuela.

2Facultad de Ciencias de la Salud, Departamento Clínico Integral,Escuela de Bioanálisis, Universidad de Carabobo. Sede Aragua, La Morita, Venezuela.

Palabras clave: virus dengue, adaptación viral, heparina, pases seriados, célulasBHK-21.

Resumen. Estudios previos han demostrado que la adaptación de diver-sos virus a crecer en líneas celulares de vertebrados, conduce a la selección devariantes virales que unen al heparán sulfato (HS) con alta afinidad. En el pre-sente trabajo se determinó la susceptibilidad de cepas del virus dengue(DENV) a la heparina hipersulfatada un análogo al HS, después de pases seria-dos en células BHK-21. A aislados de campo de los cuatro serotipos de DENV,se les realizaron ocho pases seriados en células BHK-21. La adaptación de losDENV al cultivo celular seleccionó variantes virales con una aumentada capa-cidad replicativa en células BHK-21 y una incrementada susceptibilidad a laheparina, en relación a las respectivas cepas no adaptadas, obteniéndose unainhibición de la infectividad más significativa en DENV-2 y DENV-4. Las cepasde DENV adaptadas presentaron cambios en la secuencia de aminoácidos dela proteína de envoltura (E), en particular una substitución K204R paraDENV-1, N67K para DENV-2, K308R y V452A para DENV-3 y E327G paraDENV-4. Estas sustituciones implicaron ganancia de residuos básicos que in-crementaron la carga neta positiva de la proteína. Los resultados sugieren,que la adaptación de cepas de DENV a células BHK-21 selecciona variantes vi-rales sensibles a la heparina y que la efectividad de este compuesto varía de-pendiendo de la cepa viral. Además sugieren que el HS puede jugar un papelimportante en la infectividad de las cepas de DENV adaptadas al cultivo celu-lar, a diferencia de los aislados de DENV no adaptados.

Invest Clin 55(2): 155 - 167, 2014

Autor de correspondencia: Argelia Celis. Facultad de Ciencias de la Salud, Departamento Clínico Integral, Escue-la de Bioanálisis, Universidad de Carabobo. Sede Aragua-Venezuela. Final Av. Leonardo Ruiz Pineda, La Morita II,estado Aragua. Telf: (058) 243-8726376, 0414-4566490. Correo electrónico: [email protected]

Selection of heparin-sensitive dengue virus variantsin BHK-21 cells.Invest Clin 2014; 55(2): 155 - 167

Keywords: dengue virus, viral adaptation, heparin, serial passages, BHK-21 cells.

Abstract. Several studies have shown that adaptation of various viruses togrow in certain cell lines of vertebrates, leads to the selection of virus variantsthat bind heparan sulfate (HS) with high affinity. In this study we investigatedthe susceptibility of strains of dengue virus (DENV) to oversulfated heparin ananalogue of HS after passages in BHK-21 cells. Field isolates of the fourserotypes of DENV with a limited number of passes in mosquito cellsC6/36HT were serially passaged eight times in BHK-21 cells. The adaptationof the DENV to the cell culture selected viral variants with an increasedreplicative capacity in BHK-21 cells and an increased susceptibility to heparincompared with the original not adapted strains, with a more significant inhi-bition of the infectivity in DENV-2 and DENV-4.The E protein of the adaptedstrains showed changes in the amino acid sequence, particularly at the posi-tion K204R to DENV-1, N67K to DENV-2, K308R and V452A for DENV-3 andE327G to DENV-4. These substitutions implicated a gain of basic residuesthat increased the net positive charge of the protein. These results suggestthat adaptation of DENV strains to BHK-21 cells implies changes in the enve-lope protein, changes associated to the protein reactivity with heparin, the in-hibitory effectiveness of this compound varying depending on the viral strain.In addition, these results suggest that the HS can play an important role inthe infectivity of the DENV strains adapted to vertebrate cell culture, but notin the infectivity of non-adapted DENV isolates.

Recibido: 27-06-2013. Aceptado: 30-04-2014

INTRODUCCIÓN

El dengue es una enfermedad febrilaguda, de etiología viral, transmitida alhombre por mosquitos del género Aedes,principalmente Aedes aegypti. Clínicamen-te, la enfermedad puede manifestarse comodengue no grave sin y con signos de alarmay de una forma más severa, la cual puedecursar con extravasación de plasma, hemo-rragia severa y compromiso grave de órga-nos (1). Se estima que a nivel mundial, ocu-rren anualmente entre 50 y 100 millones decasos de infecciones por dengue y hasta50.000 muertes cada año (2, 3).

El agente causal de la enfermedad esel virus dengue (DENV); éste pertenece a lafamilia Flaviviridae del género Flavivirus yposee un genoma de ARN de cadena senci-lla y polaridad positiva de aproximadamente11 Kb. El virión completo tiene un diáme-tro aproximado de 50 nm. Presenta una nu-cleocápside de naturaleza proteica, con si-metría icosaédrica de 30 nm de diámetro,que empaqueta al genoma viral. La nucleo-cápside esta revestida por una envoltura li-pídica de 10 nm de grosor, que contienedos proteínas asociadas, una de membrana(M) y otra de envoltura (E) que reposan pa-ralelamente sobre la superficie del vi-

Investigación Clínica 55(2): 2014

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rión (4). El grupo de DENV está representa-do por los serotipos: DENV-1, DENV-2,DENV-3, DENV-4 que están relacionados se-rológicamente pero con características an-tigénicas distintas (5, 6) y DENV-5 que re-cientemente fue descubierto (7).

La proteína E, constituye la proteínamás grande del virión (51-59 kD), es elcomponente principal de las proyeccionesde la superficie del mismo. Esta proteínapresenta tres dominios; el dominio I, es eldominio central que organiza la estructura;el dominio II es elongado, contiene el pépti-do de fusión (98 a 111 residuos) y el domi-nio III presenta una estructura parecida ainmunoglobulinas y contiene un sitio deunión al receptor (382-385 residuos) (8). Aligual que otros virus envueltos, esta proteí-na presentan dos sitios de glicosilación (9)y cumple un papel importante en un núme-ro de actividades biológicas incluyendo: en-samblaje viral, unión al receptor, fusión demembrana y es el principal blanco para an-ticuerpos neutralizantes (10).

Diferentes proteínas celulares han sidoidentificadas como receptores potencialespara los DENV; sin embargo, hasta el mo-mento no existe una evidencia directa delpapel que juegan éstos durante la entradaen células hospedadoras y algunos de los re-sultados son controversiales (11). Se ha de-mostrado que el heparán sulfato (HS) unglicosaminoglicano (GAG) altamente sulfa-tado está involucrado en la unión y entradade DENV en células susceptibles (12-16).Basándose en el papel del HS, como recep-tor putativo para DENV, diferentes investi-gadores han demostrado, que algunos com-puestos polianiónicos naturales y sintéticosque mimetizan al HS, pueden actuar comoinhibidores de la infectividad de DENV enciertas células de mamífero (13, 14, 16-20).

Recientemente en nuestro laboratoriose evaluó la actividad anti-DENV de dos

compuestos polianiónicos sulfatados: sura-mina y heparina hipersulfatada a diferentesconcentraciones (10, 30 y 100 µg/mL). Lasuramina demostró ser un inhibidor eficazde aislados de campo de los cuatro seroti-pos de DENV, mientras que la heparina hi-persulfatada no inhibió la infección de losDENV en células BHK-21 (21). Estos resul-tados sugieren, que DENV podría utilizarmoléculas receptoras distintas al HS paramediar la entrada a células BHK-21 o que lasusceptibilidad al compuesto sulfatado esdependiente de la cepa viral utilizada. Se hademostrado que la adaptación de virus acrecer en cultivos celulares genera cepasmutantes, que pueden ser usadas para eva-luar diferencias específicas en el uso del re-ceptor entre aislados originales y cepas delaboratorio (22). También se ha demostra-do, que la adaptación de diversos virus in-cluyendo Flavivirus, al multiplicarse enciertas líneas celulares de vertebrados, con-duce a la selección de variantes virales queunen al HS con alta afinidad (22-24). Un es-tudio realizado con el virus de la encefalitistransmitido por garrapatas (TBEV, por sussiglas en inglés) (25), demostró que los ais-lamientos originales, son menos HS depen-dientes que el virus obtenido luego de pasesseriados en células BHK-21. Estos virus pre-sentaron varias mutaciones en la superficiede la proteína E que crearon áreas nuevasde carga positiva, que probablemente reac-cionan con el HS. En la presente investiga-ción se planteó como objetivo, determinarla susceptibilidad de varias cepas de DENV,representativas de cuatro serotipos(DENV-1 a DENV-4), al efecto inhibitorio deun GAG soluble altamente sulfatado, antesy después de varios pases en células BHK-21e identificar las eventuales mutaciones enla proteína de envoltura asociadas al cam-bio de este fenotipo.

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MATERIALES Y MÉTODOS

CélulasCélulas BHK-21 (riñón de hámster lac-

tante, clon 21, ATCC), células Vero (riñónde mono verde africano ATCC) y las célulasC6/36HT provenientes de Aedes albopictus

(adaptadas a 32°C) se cultivaron en medio199 (Sigma-Aldrich St. Louis, Missouri,USA) suplementadas con 10% suero fetalbovino (SFB, Gibco New York, USA), 2,92%de L-glutamina (Sigma-Aldrich St. Louis,Missouri, USA), 0,24% de bicarbonato desodio (Merck, Darmstadt-Alemania),100.000 UI/L de penicilina sódica (PfizerVenezuela, S.A), 2,5 mg/L anfotericina B(Bristol-Meyers, Squibb, Venezuela) y80 mg/L gentamicina (Laboratorios Leti.S.A. Venezuela).

VirusSe utilizaron aislados de campo de los

cuatro serotipos de DENV que han circula-do en Venezuela en diferentes años. La cepaDENV-1 23668 fue cedida gentilmente porel LARDIDEV, Maracay-Venezuela; las cepasDENV-2 288085, DENV-3 220034 y DENV-4220244 fueron cedidas por el Instituto Na-cional de Higiene “Rafael Rangel”, Cara-cas-Venezuela. Todos los virus fueron recibi-

dos como un pase temprano (segundo o ter-cero a partir del plasma del paciente en cé-lulas C6/36HT). Posteriormente, virus decada serotipo fueron amplificados en célu-las C6/36HT (entre 4 y 10 pases) (26), has-ta la obtención de títulos virales adecuadospara ensayos de infectividad e iniciar pasesseriados en células BHK-21 (Tabla I).

Titulación viralLos títulos de los DENV fueron deter-

minados por ensayo de placa en célulasVero (27). Las células crecidas en platos de24 pozos, fueron infectadas con 0,2 mL dediluciones seriadas de virus, utilizandocomo diluyente medio 199 más 2% SFB.Cada dilución se inoculó por duplicado.Después de dos horas de incubación a 37°C,a cada pozo se añadió 1 mL de de carboxi-metilcelulosa (Sigma-Aldrich Co., St Louis,Missouri, EUA) al 1,5% en medio de cultivoMEM suplementado con 2,5% de SFB(CMC-MEM). Seguidamente los platos se in-cubaron a 37°C, entre siete y nueve días de-pendiendo de la cepa. Transcurrido esetiempo se procedió a la fijación de las pla-cas con p-formaldehído al 1% (1 g/L diluidoen alcohol técnico y p-formaldehído al 1%diluido en PBS) durante 15 min y tincióncon una solución de cristal violeta (Merck,


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TABLA IVIRUS DENGUE USADOS EN EL ESTUDIO

Virus Año aislamiento Tipo de célula No. de Pases Designación Título(UFC/mL)

DENV-1 cepa23668

2004 C6/36HTBHK-21

5*8

VD1p5VD1p5BHK8

1 × 106

8 × 107

DENV-2 cepa288085

2008 C6/36HTBHK-21

4*8

VD2p4VD2p4BHK8

6 × 105

5 × 108

DENV-3 cepa220034

2003 C6/36HTBHK-21

10*8

VD3p10VD3p10BHK8

2 × 106

4 × 107

DENV-4 cepa220244

2003 C6/36HTBHK-21

6*8

VD4p6VD4p6BHK8

5 × 105

2 × 108

*Nivel de pases en C6/36 HT del cual se iniciaron los pases en células BHK-21.

Darmstadt-Alemania) durante 1 h. Los títu-los virales fueron calculados y expresadosen unidades formadoras de placa por milili-tro (UFP/mL).

Adaptación de virus dengueen células BHK-21

Para la adaptación de los DENV se rea-lizaron pases seriados de cada serotipo encélulas BHK-21. Cepas virales de cada sero-tipo, que tenían un número limitado de pa-ses (entre 4 y 10) en células C6/36HT, semultiplicaron en monocapas de célulasBHK-21, inoculadas a una multiplicidad deinfección (m.o.i) de 0,1 UFP/célula, segui-do por incubación a 37°C por 2 h. Transcu-rrido el tiempo de adsorción, se agregó me-dio de mantenimiento 199 al 5 % SFB y fue-ron incubadas a 37°C hasta la aparición deefecto citopático. Posteriormente, las sus-pensiones virales se centrifugaron a 1000rpm durante 15 min. El sobrenadante obte-nido fue usado para una nueva infección enmonocapas de BHK-21 y así sucesivamentehasta alcanzar ocho pases (Tabla I). Comocontrol se utilizaron monocapas de célulasBHK-21 sin infectar. Una vez realizado el úl-timo pase se procedió a la cuantificación delos títulos virales correspondientes a cadauno de éstos, resultando una m.o.i. utiliza-da entre 0,1 y 8 UFP/célula.

Rendimiento de virus dengue antesy después de pases en células BHK-21

Monocapas de células BHK-21, fueroncultivadas en placas de seis pozos e infecta-das con los cuatro serotipos de DENV con ysin pases en células BHK-21 a un m.o.i. de1. Después de 2 h de incubación a 37°C, lascélulas fueron lavadas y cultivadas en 3 mLde medio 199 al 5% SFB a 37°C por 48 h.Después de este tiempo el sobrenadante fuecolectado y el título viral fue determinadopor ensayo de placa en células Vero. Los en-sayos fueron realizados por triplicado.

Ensayo de reducción de placasLa inhibición de la infectividad de

DENV por la heparina hipersulfatada (Neo-parin Inc. USA) fue estudiada incubando du-rante 1 h a 37°C, 100 UFP de los DENV cony sin pases en células BHK-21, en ausencia ypresencia del compuesto (100 µg/mL). Pos-teriormente, 300 µL de estas mezclas vira-les fueron añadidas a monocapas de célulasBHK-21 cultivadas en platos de 12 pozos yprocesadas para la obtención de placas. Losresultados se expresaron como porcentajede inhibición en el número de placas res-pecto a una muestra control de virus no in-cubada con el compuesto y calculado deacuerdo a la siguiente fórmula: 100 – (100X [número de placas formadas en presenciade la concentración del compuesto/númerode placas del control]). Los ensayos fueronrealizados por triplicados para al menos dosexperimentos independientes.

Análisis de secuenciasExtracción del ARN: El ARN viral se

extrajo a partir de alícuotas de 140 µL desobrenadante de cultivo de cada uno de losserotipos de DENV adaptado o no a célulasBHK-21, empleando el QIAamp® Viral RNAmini kit (Qiagen, Alemania), siguiendo lasinstrucciones del fabricante.

Transcripción reversa: Con el ARN vi-ral extraído se preparó una mezcla de reac-ción con la enzima Transcriptasa ReversaSuper Script II (Invitrogen) para generar unADNc. La mezcla de reacción incluyó: 20 µLde ARN, 0,5 mM de cada uno de los deoxinu-cleótidostrifosfato (dNTPs), 1 µg/µL de ra-dom primer (Invitrogen) y agua hasta com-pletar 30 µL de reacción. Esta mezcla se in-cubó a 65°C por 5 min, para luego enfriarsobre hielo. Finalmente se le agregó 0,01 MDTT, RNaseOUTtm (Invitrogen), 100U de5X first strand buffer (250 mM, Tris-HCl,375 mM KCl, 15 mM MgCl, Invitrogen) ob-teniéndose un volumen final de 50 µL de

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mezcla de reacción. Seguidamente la mez-cla fue incubada a 42°C durante 90 min yluego inactivada por calentamiento a 72°Cdurante 15 min.

Reacción en cadena de la polimerasa(PCR): Para la amplificación del gen com-pleto de envoltura (E), se diseñaron ceba-dores específicos para cada serotipo usandoel programa DNAMAN versión 5.2.2(Lynnon Boiosoft, Quebec, Canada) (Ta-bla II). Así 6 µL de ADNc se añadieron auna mezcla de reacción de 50 µL que conte-nía 0,3 mM de cada dNTPs, 1 mM MgSO4,0,3 mM cada uno de los cebadores sentido yantisentido, buffer de amplificación provis-to por la casa comercial Invitrogen y2,5 U/µL Platinum® Pfx (Invitrogen). Lamezcla fue colocada en un termocicladormodelo PTC-200 (MJ Research, Inc., Walt-ham, Mass USA) y sometida a 35 ciclos dedesnaturalización (94°C × 30 s), hibridiza-ción o anillamiento (60°C × 90 s) y exten-sión (68°C × 2 min). Los productos de PCRfueron analizados por electroforesis en gelde agarosa al 1%, teñidos con bromuro deetidio (1 µg/µL, Sigma Sigma-Aldrich Co.,

St Louis, Missouri, EUA) y visualizados enun transluminador de luz UV (Bio-rad Labo-ratories, Richmond, California EUA).

Secuenciación: Los fragmentos deADN purificados fueron sometidos a unasecuenciación automatizada, utilizando elservicio comercial de secuenciación (Ma-crogen, Seúl, Corea). Las secuencias nu-cleotídicas fueron analizadas y editadasutilizando el programa DNAMAN versión5.2.2 (Lynnon Boiosoft, Quebec, Canada).Para la obtención de los alineamientos delas secuencias nucleotídicas y aminoacídi-cas se utilizó el programa de alineamientode múltiples secuencias CLUSTAL W (28),integrado en el programa MEGA versión4.0 (29).

Análisis estadísticoLos datos fueron expresados como me-

dias aritméticas ± desviación estándar. Lasdiferencias entre grupos fueron determina-das por la prueba t de Student usando elprograma Excel (Microsoft). Los valores dep<0,05 fueron considerados estadística-mente significativos.


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TABLA IILISTA DE CEBADORES DISEÑADOS Y UTILIZADOS PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN

DE LA PROTEÍNA DE ENVOLTURA (E) DE LOS VIRUS DENGUE

*Nombre delcebador

Secuencia (5’-3’) **Posición cebadoren el genoma (nt)

Tamaño delproducto (pb)

D1- 603-SD1-2600-AS

CGTTGACTGCTGGTGTAATGCCTGGCTGATCGAATTCCACAC

603-6252581-2600

1997

D2-614-SD2-2602-AS

GTCCACATGGGTAACTTATGTTACTGAGCGGATTCCACAGATGCC

614-6332578-2602

1988

D3-603-SD3-2576-AS

GCAACCTCACATCAACATGGCACTCCATTCTCCCAAGCG

603-6222558-2576

1973

D4-399-SD4-2519-AS

TCAACGATAACATTGCTGTGCTTGATTCCCTTTGTACTGTTCTGTCCAAGTGTGC

399-4282495-2519

2120

* Los nombres de los oligonucleótidos con una S indican orientación en el sentido del genoma y con AS indicanantisentido u orientación complementaria y reversa. ** Las posiciones de las regiones amplificadas están basa-das de acuerdo a las secuencias en GenBank de las cepas de DENV-1: EU482611.1, DENV-2: EU482608.1,DENV-3: EU529683.1, DENV-4: FJ882592.1

RESULTADOS

Rendimiento viral antes y despuésde pases en células BHK-21

En ensayos de crecimiento viral en cé-lulas BHK21, se compararon las cantidadesde virus producido por las cepas de los sero-tipos de DENV adaptadas y no adaptadas acélulas BHK-21. En las cepas adaptadas seobservó un incremento del rendimiento vi-ral, entre 10 y 1000 veces en relación a lacepa no adaptada (Fig. 1).

Inhibición de la infección por heparinahipersulfatada en cepas de virus dengueadaptadas o no a células BHK-21

Para determinar si pases seriados delos DENV en células BHK-21, seleccionanvariantes virales cuya infectividad es depen-diente de la interacción con GAG altamen-te sulfatado, se utilizó la heparina hipersul-fatada, un GAG soluble, análogo estructuraldel HS, como un inhibidor potencial de lainfectividad de los DENV. Para ello, células

BHK-21, fueron infectadas con DENV en au-sencia y presencia de 100 µg/mL de hepari-na hipersulfatada. Los resultados mostraronque los cuatro serotipos de DENV adapta-dos a células BHK-21 tienden a ser más sus-ceptibles al compuesto que las cepas noadaptadas (Fig. 2). Un efecto inhibitorio al-tamente significativo se observó con los se-rotipos DENV-2 (p=0,00002) y DENV-4(p=0,001) que fueron inhibidos 12,3 veces(98,6%) y 4,9 veces (77,6%) más que las ce-pas no adaptadas (8 y 15,8%) respectiva-mente. Mientras los serotipos DENV-1 yDENV-3 fueron menos sensibles al efecto in-hibitorio de la heparina alcanzando una re-ducción de la infectividad de 68,6% y 45,5%respectivamente.

Mutaciones en la proteína de envolturade virus dengue resultantesde la adaptación en células BHK-21

Se determinaron los cambios nucleotí-dicos en el gen de la proteína E de las cepasde DENV adaptadas a cultivo celular. El

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0

1

2

3

4

5

6

7

8

Tít

ulo

vir

al(L

og

UF

P/m

L)

Fig. 1. Cambios en el rendimiento del virus dengue antes y después de pases en células BHK-21. Mo-nocapas de células BHK-21 fueron infectadas con los cuatro serotipos de DENV con y sin pasesen células BHK-21 a un m.o.i de 1. Después de incubarlos a 37°C por 48 h, el título viral fuedeterminado por ensayo de placa en células Vero. Los resultados se expresan como el logarit-mo del título viral. Cada valor representa el promedio de ensayos triplicados ± desviaciónestándar.

análisis de secuencia de la región genómicacorrespondiente al gen E de todos los DENVobtenidos después de ocho pases en célulasBHK-21, reveló la aparición de sustitucio-nes nucleotídicas, resultantes en uno o doscambios no conservativos de aminoácidosen los dominios II y III de la proteína E (Ta-bla III y Fig. 3). El serotipo 1 de DENV pre-sentó un cambio de lisina (K) por arginina(R) en la posición 204. La cepa DENV-2 se-leccionó una mutación asparagina (N) porK en la posición 67, mutación que implicóla pérdida de un sitio de glicosilación en eldominio II. DENV-3 seleccionó mutacionesK por R en la posición 308 y valina (V) poralanina (A) en posición 452. En los aisladosde DENV-4 sólo se seleccionó una mutaciónque implicó reemplazo de un residuo ácidopor uno básico [ácido glutámico (E) porglicina (G)] en la posición 327.

DISCUSIÓN

Se ha demostrado que los aislamientosoriginales de DENV son menos HS-depen-dientes que el virus obtenido luego de pasesseriados en células BHK-21 (25). En ensa-yos preliminares evaluamos la actividadanti-DENV de la heparina hipersulfatada,empleando diferentes concentraciones (10,30 y 100 µg/mL) del compuesto, el cual re-sultó no ser un inhibidor eficaz de la infec-tividad de aislados de campo de los cuatro


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0

20

40

60

80

100

120

P=0,000003

P=0,02

%In

hib

ició

n

Fig. 2. Efecto inhibitorio de la heparina hiper-sulfatada sobre la infectividad de cepasde virus dengue adaptadas o no a célu-las BHK-21. Aproximadamente100 UFPde cada uno de los cuatro serotipos deDENV con y sin pases en célulasBHK-21, fueron incubados durante 1 h a37°C, con 100 µg/mL de heparina hiper-sulfatada previo a la determinación deltítulo infeccioso por ensayo de placas encélulas BHK21. Los resultados se expre-san como porcentaje de inhibición delnúmero de placas observadas en cadacaso. Cada valor representa el promediode dos experimentos independientes portriplicado (n=6) ± desviación estándar.La prueba t de Student fue usada paracomparar valores entre grupos y un va-lor de p< 0,05 fue considerado estadís-ticamente significativo.

TABLA IIICAMBIOS EN LA PROTEÍNA DE ENVOLTURA (E) DE LOS VIRUS DENGUE RESULTANTES

DE LA ADAPTACIÓN A CÉLULAS BHK-21

Virus Designación * Cambio nucleótido(posición)

Cambio aminoácido(posición)

DENV-1 VD1p5 � VD1p5BHK8 A � G (611) K � R (204)

DENV-2 VD2p4 � VD2p4BHK8 C � A (201) N � K (67)

DENV-3 VD3p10 � VD3p10BHK8A � G (923)T � C (1355)

K � R (308)V � A (452)

DENV-4 VD4p6 � VD4p6BHK8 A � G (980) E � G (327)*P, BHK: número de pases en células C6/36HT (p) y BHK-21 (BHK).

serotipos de DENV en células BHK-21 (21).En este estudio se demostró que la adapta-ción de los cuatro serotipos de DENV a la lí-nea celular BHK-21, tiende a seleccionar va-riantes virales susceptibles a la heparina hi-persulfatada a diferencia de sus respectivascepas no adaptadas y dicha susceptibilidades dependiente del serotipo viral, siendoDENV-2 y DENV-4 significativamente mássusceptibles al compuesto que los serotiposDENV-1 y DENV-3. Este resultado se corres-ponde con datos publicados previamentesobre la inhibición diferencial de la infec-ción de los DENV por diversos polisacáridossulfatados, incluyendo heparina y diferentescarragenanos (30, 31).

El incremento observado en la suscep-tibilidad a la heparina hipersulfatada de losDENV podría estar asociado a la presenciade mutaciones en la proteína E, que incre-menten la carga neta positiva por gananciade aminoácidos básicos (R, K y H), lo cualpodría favorecer la interacción con la hepa-rina hipersulfatada. Al realizar el análisis dela proteína E (495 residuos aminoácidos)de las cepas de DENV adaptados a célulasBHK-21, se observó que cada una presentócambios en la secuencia de aminoácidos,observándose mutaciones tanto en el domi-nio II y III. Resultados previos por otros au-tores, han demostrado que las mutacionesen la proteína E obtenidas luego de la adap-

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Fig. 3. Localización de los cambios de aminoácidos en la proteína de envoltura de las variantes deDENV resultantes de la adaptación a células BHK-21. Las posiciones de las mutaciones de ami-noácidos de los DENV adaptados se muestran en círculos de color blanco en: (a) Dominios dela proteína E representados en: gris claro, dominio I; blanco, dominio II; gris oscuro, domi-nio III. (b) Vista superior de la estructura dimérica DENV-2, un modelo propuesto por Modis ycol. (39).

tación pueden variar entre los tres domi-nios. Por ejemplo, Lee y col. (32) demostra-ron que variantes de DENV-2 seleccionadasdespués de pases en células de adenocarci-noma humanas (SW-13) y en BHK-21 conte-nían un número de sustituciones en el do-minio II, pero ninguno en el dominio I o IIIde la proteína E. En variantes de virus TBEseleccionadas luego de pases en célulasBHK-21, Mandl y col. (25) demostraron quelas mutaciones adquiridas estuvieron pre-sentes en cada uno de los tres dominios dela proteína E.

La cepa DENV-1 exhibió una mutaciónde un aminoácido en la proteína E, dondehubo un reemplazo de un residuo básicopor otro básico (K204R). Esta misma muta-ción ha sido también descrita en una qui-mera de virus de fiebre amarilla que llevabael gen E de DENV-1 y ésta fue asociada conuna reducida virulencia en ratones y prima-tes (33). Por otra parte, la cepa DENV-3presentó dos sustituciones aminoacídicas(K308R, V452A), que no implicaron ganan-cia de carga positiva lo cual podría explicarla ausencia de un aumento significativo enla susceptibilidad a la heparina.

En las cepas de DENV-2 y DENV-4, seoriginaron sustituciones de aminoácidos enla proteína E (N67K para DENV-2 y E327Gpara DENV-4) que implicaron ganancia deresiduos básicos, lo cual explicaría en parteel aumento significativo en la susceptibili-dad a la heparina.

Es importante señalar, que la sustitu-ción de N67K en DENV-2 implicó ademásuna pérdida de un sitio de glicosilación. Laproteína E de los flavivirus, posee dos sitiosde glicosilación en el dominio II, asparagina67 y asparagina 153 (N67 y N153). Se hasugerido, que la glicosilación de las proteí-nas estructurales de los Flavivirus podríajugar un papel importante durante la mor-fogénesis viral, la infectividad y el tropismo(34, 35). Recientemente se demostró queel sitio de glicosilación N67 no tiene una

importancia crítica para el crecimiento deDENV-2, ya que dependiendo de la sustitu-ción aminoacídica que se introduzca paraabolir ese sitio de glicosilación en la proteí-na E, el crecimiento viral se puede ver afec-tado (36). Basándonos en el presente estu-dio, se pudiera pensar, que la sustitución deN por K en la posición 67 en DENV-2 tuvoun efecto compensatorio en ese sitio de gli-cosilación, favoreciendo el crecimiento viralluego de los ocho pases en células BHK-21,ya que el mismo se incrementó 100 vecescuando se comparó con la cepa no adapta-da. Además, el encontrar una mayor inhibi-ción en la infectividad de esta cepa por laheparina hipersulfatada con respecto a lacepa no adaptada, sugiere que la gananciade residuos básicos en la posición 67 de laproteína E, pudo favorecer un incrementode la carga neta positiva y/o alterar la con-formación general de la proteína E, quepermitiera la exposición de sitios de uniónal HS. A través de análisis estructurales deproteínas que se unen a GAG, Cardin yWeintraub (37) determinaron secuenciasconsenso de unión al HS, las cuales fuerondefinidas como XBBBXXBX o XBBXBX(donde B es un residuo básico y X cualquieraminoácido). Una posibilidad alternativa esque estas sustituciones modifiquen los si-tios de unión al HS en la proteína E, que-dando éstos expuestos de manera que fuesemás accesible a la heparina.

La pérdida de un residuo ácido(E327G) en la proteína E de DENV-4, luegode la adaptación en células BHK-21, podríaexplicar el aumento de la susceptibilidad ala heparina hipersulfatada, debido a un in-cremento de la carga neta positiva en la su-perficie de la proteína E, que mejoraría launión a este GAG soluble, cargado negati-vamente. Esta misma mutación también fuedescrita por Añez y col. (38) en DENV-4,luego de haber sido propagado en célulasde pulmón fetal de mono Rhesus para laproducción de vacunas, quien demostró que


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la mutación E327G en DENV-4 aportó unsitio de unión para una interacción de altaafinidad del virus a la heparina por incre-mento de la carga neta positiva en un árealocalizada en el borde lateral superior deldominio III de la glicoproteína E, la cual esaccesible a la superficie del virión.

Adicionalmente, en el presente estudiose demostró que los cuatro serotipos deDENV incrementaron su rendimiento viralluego de la adaptación a células BHK-21.Este hallazgo podría ser consecuencia delas mutaciones ocurridas en la proteína E,las cuales mejorarían la eficiencia de la re-plicación viral en las células de cultivo. Sinembargo, no se puede descartar la ocurren-cia de mutaciones en otros genes virales, noanalizados en el presente estudio, que afec-ten la eficiencia de la replicación.

Es importante resaltar, que el númerode pases realizados a los cuatro serotipos deDENV en células BHK-21, fue el resultadode la aparición de un efecto citopático mar-cado y reproducible, por lo que se conside-ró que ocho pases asegurarían una selec-ción de variantes virales mejor adaptadas encada caso. Hecho que se confirmó con losresultados presentados aquí, los cuales su-gieren que la adaptación de cepas de DENVa células BHK-21, se acompañan de muta-ciones en la proteína E, que incrementan lacarga neta positiva por ganancia de aminoá-cidos básicos, lo cual podría favorecer la in-teracción del virus con la heparina hipersul-fatada, resultando en una inhibición de lainfectividad en células BHK-21. Consideran-do que la heparina es un análogo estructu-ral del HS, estos datos apuntan que el HSpodría jugar un papel significativo en la in-fectividad de las cepas de DENV adaptadas aesta línea celular, a diferencia de los aisla-dos de DENV no adaptados, los cuales po-drían utilizar moléculas receptoras distin-tas al HS para mediar la entrada a célulasBHK-21, teniendo en cuenta que diferentesproteínas han sido identificadas como re-

ceptores potenciales para los DENV en dife-rentes tipos de células.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a la Oficina de Planifica-ción del Sector Universitario del ConsejoNacional de Universidades (OPSU-CNU),Programa de Formación de Doctores “AlmaMater”, y al programa LOCTI “Caracteriza-ción molecular de los virus del dengue cir-culantes en Venezuela” por el financiamien-to otorgado para el desarrollo del presentetrabajo.

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