selection et identification des souches telluriques
TRANSCRIPT
UNIVERSITE DâANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES
DOMAINE : SCIENCES ET TECHNOLOGIE MENTION : CHIMIE
DEPARTEMENT DE CHIMIE MINERALE ET CHIMIE PHYSIQUE
MEMOIRE DE FIN DâETUDE
En vue de lâobtention du diplĂŽme de
MASTER II
Parcours : GĂ©nie de lâEau et GĂ©nie de lâEnvironnement (2GE)
Présenté le 23 Juillet 2015 par :
RANDRIAMISAINA Kanto Aina Natacha
Devant la commission du Jury composée de :
Président : Monsieur Mahandrimanana ANDRIANAINARIVELO, Maßtre de
ConfĂ©rences Ă la FacultĂ© des Sciences de lâUniversitĂ© dâAntananarivo
Rapporteur : Monsieur Rado RASOLOMAMPIANINA, MaĂźtre de Recherches au
Laboratoire de Microbiologie de lâEnvironnement
Examinateur : Monsieur Pierre Hervé RAVELONANDRO, Professeur à la Faculté des
Sciences de lâUniversitĂ© dâAntananarivo
SELECTION ET IDENTIFICATION DES SOUCHES TELLURIQUES IMPLIQUEES DANS LA DEGRADATION DES
HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES (HAP)
Remerciements
REMERCIEMENTS
En premier lieu, J'adresse mes vifs remerciements et reconnaissances pour notre
Seigneur Tout Puissant Ă qui je dois la vie et la santĂ©. Sans lui, je nâaurai pu rĂ©aliser ce travail.
Gloire Ă DIEU !!
Le présent travail a été réalisé dans le Laboratoire de Physico-chimique et de
Microbiologie de lâEnvironnement du Centre National de Recherches sur lâEnvironnement
(CNRE), je tiens Ă remercier diffĂ©rents responsables de mâavoir accueillie dans leur Ă©quipe.
Jâexprime Ă©galement ma profonde gratitude aux personnes citĂ©es suivantes :
Monsieur Armand RenĂ© Panja RAMANOELINA, PrĂ©sident de lâUniversitĂ©
dâAntananarivo ;
Monsieur Marson RAHERIMANDIMBY, Doyen de la Faculté des Sciences ;
Monsieur Tinasoa RAMAMONJY, Maßtre de Conférences à la Faculté des Sciences de
lâUniversitĂ© dâAntananarivo, Chef du DĂ©partement de Chimie MinĂ©rale et de Chimie
Physique Ă la FacultĂ© des Sciences de lâUniversitĂ© dâAntananarivo ;
Madame Fienena Félicitée REJO, Professeur, Directeur du Centre National de
Recherches sur lâEnvironnement (CNRE) de mâavoir accueillie au sein de cette
institution ;
Monsieur Mahandrimanana ANDRIANAINARIVELO, Responsable de lâoption
Chimie des MarĂ©raiux et MaĂźtre de ConfĂ©rences Ă la FacultĂ© des Sciences de lâUniversitĂ©
dâAntananarivo qui a acceptĂ© de consacrer son temps prĂ©cieux afin de prĂ©sider ce
mémoire ;
Monsieur Pierre HervĂ© RAVELONANDRO, Responsable du Parcours GĂ©nie de lâEau
et GĂ©nie de lâEnvironnement (2GE) et Professeur Ă la FacultĂ© des Sciences de lâUniversitĂ©
dâAntananarivo pour tous les efforts que vous avez dĂ©ployĂ© en vue dâorienter notre
formation dans les louables voies et de bien voulu examiner et juger cet humble travail ;
Monsieur Rado RASOLOMAMPIANINA, MaĂźtre de recherches et Chef de
Laboratoire de Microbiologie de lâEnvironnement (LME), rapporteur de ce mĂ©moire, qui
a consacré son temps pour me diriger dans la progression de mon travail et nous a fait
bénéficier de ses expériences et précieux conseils malgré ses multiples activités.
Monsieur, les mots ne suffiront pas pour vous exprimer mes sincĂšres remerciements, vos
commentaires, vos encouragements et ainsi que votre patience mâont permis dâaccomplir
ce travail dans les meilleures conditions ;
Remerciements
Monsieur Yves MONG, MaĂźtre de Recherches et Chef de Laboratoire dâAnalyse
Environnemental et Qualité de la vie au Centre National de Recherches sur
lâEnvironnement (CNRE), pour les prĂ©cieux conseils que vous avez procurez lors de la
réalisation de ce travail ;
Messieurs Lala RAJOELISOA et Wega Leonard ASIMBOLARIMALALA,
Enseignants Chercheurs au Centre National de Recherches sur lâEnvironnement (CNRE)
pour leurs aides et leurs conseils lors de mes travaux de laboratoire ;
A toute lâĂ©quipe du Laboratoire de Microbiologie de lâEnvironnement (LME), en
particulier, Madame Onja ANDRIAMBELOSON, Monsieur Clet Marcellin
RABENAIVO et Mademoiselle Hanitrisoa Harimisa ANDRIAMAFANA pour leurs
aides et leurs conseils lors de mes travaux de laboratoire ;
A tous les membres de Jury, qui ont bien voulu juger mon travail, malgré leurs
nombreuses occupations ;
A tous les Enseignants de la FacultĂ© des Sciences de lâUniversitĂ© dâAntananarivo qui nous
ont fourni les connaissances indispensables à notre formation durant ces cinq années
dâĂ©tudes ;
A tous les membres de ma famille, mes ami (es) et collĂšgues pour leurs soutiens autant
moraux que financiers et sans quoi, je nâaurais pu terminer ce mĂ©moire.
Et enfin, je rĂ©itĂšre une reconnaissance particuliĂšre pour une personne trĂšs spĂ©ciale Ă
mes yeux, câest sa prĂ©sence pendant les pĂ©riodes difficiles dans lâĂ©laboration de ce travail qui
mâa toujours encouragĂ©e Ă continuer. JâespĂšre que tu apprĂ©cieras les fruits de tous les efforts
que jâai mis dans ce livre.
Bref, je ne peux tous assez-vous remercier par ces simples phrases. Câest Ă travers
lâĂ©laboration de ce mĂ©moire que jâai compris les intĂ©rĂȘts de la solidaritĂ©.
SincĂšres reconnaissances Ă tous !
Table des matiĂšres
TABLE DES MATIERES
GLOSSAIRE ................................................................................................................. i
ABREVIATIONS ............................................................................................................... iv
LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... vi
LISTE DES FIGURES ........................................................................................................... vii
LISTE DES PHOTOS ........................................................................................................... viii
INTRODUCTION ................................................................................................................ 1
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................... 3
I.1. LES MICROORGANISMES DANS LES SOLS ........................................................ 3
I.1.1. Activités microbiennes dans les sols ......................................................................... 4
I.1.2. Interactions entre microorganismes .......................................................................... 4
I.2. LES HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES â
GENERALITES ................................................................................................................... 4
I.2.1. DĂ©finition â classification ......................................................................................... 5
I.2.2. Propriétés physico-chimiques des HAP .................................................................... 6
I.2.2.1. Solubilité ..................................................................................................... 6
I.2.2.2. Coefficient de partage octanol/eau .............................................................. 6
I.2.2.3. Pression de vapeur ...................................................................................... 6
I.2.3. Origine des HAP ....................................................................................................... 8
I.2.4. Toxicité des HAP ...................................................................................................... 8
I.2.5. Distribution des HAP .............................................................................................. 10
I.2.6. HAP dans les sols .................................................................................................... 10
I.3. BIODEGRADATION DES HAP ............................................................................... 10
I.4. DIVERSITE DES GENRES BACTERIENS POUVANT DEGRADER LES HAP
.............................................................................................................................................. 11
I.5. LES DIFFERENTS TYPES DE VOIES DE DEGRADATION DES HAP ........... 12
Table des matiĂšres
I.6.FACTEURS INFLUENCANT LA DEGRADATION DES HAP ............................ 14
DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES
II.1. MATERIELS .............................................................................................................. 15
II.1.1.Site et Ă©chantillonnage de sol ................................................................................. 15
II.1.2. Milieu de culture .................................................................................................... 15
II.1.2.1. Milieu dâisolement et dâidentification ...................................................... 15
II.1.2.1.1.Milieu TSA (Tryptic Soy Agar) ............................................... 15
II.1.2.1.2. Milieu King B .......................................................................... 16
II.1.2.1.3. Milieu AS1 .............................................................................. 16
II.1.2.2. Milieux dâidentification de la souche de Bacillus ..................................... 16
II.1.2.2.1. Milieu Mannitol- Mobilité- Nitrate .......................................... 16
II.1.2.2.2. Milieu Hajna-Kligler (Lactose â Glucose â H2S) ................... 16
II.1.2.2.3. Milieu de SIMMONS (Citrate) ................................................. 16
II.1.2.2.4. Milieu Lysine-Fer ..................................................................... 16
II.1.2.2.5. Milieu Urée-Indole ................................................................... 17
II.1.2.2.6. Milieu Ă lâeau peptonĂ©e au rouge de phĂ©nol ............................. 17
I.1.2.3. Préparation des inoculums pour la pré-identification .................................. 17
II.1.2.3.1. ISP3 (International Streptomyces 3) ......................................... 17
II.1.2.4. Milieu dâidentification macroscopique ....................................................... 17
II.1.2.4.1. ISP2 (International Streptomyces 2) ......................................... 17
II.1.2.4.2. ISP4 (International Streptomyces 4) ......................................... 17
II.1.2.4.3. ISP5 (International Streptomyces 5) ......................................... 17
II.1.2.5. Milieu pour la détermination des pigments mélanoïdes et des pigments
diffusibles .............................................................................................. 17
II.1.2.5.1. ISP6 (International Streptomyces 6) .......................................... 17
II.1.2.5.2. ISP7 (International Streptomyces 7) .......................................... 18
II.1.2.6. Milieu pour la détermination des caractÚres biochimiques ........................ 18
Recherche de nitrate rĂ©ductase âŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠ 18
II.1.2.6.1. Bouillon nutritif ........................................................................... 18
II.1.2.7. Milieu pour la détermination des caractÚres physiologiques ...................... 18
DĂ©termination de la tempĂ©rature optimale de croissance âŠâŠâŠâŠâŠ18
II.1.2.7.1. Sporulation Agar (SA) .................................................................. 18
Table des matiĂšres
DĂ©termination du pH optimumâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠ18
II.1.2.7.2. CYD (Casamino Acids Yeast extracts D-glucose) ........................ 18
II.1.2.8. Milieu pour la détermination du type respiratoire ...................................... 18
II.1.2.8.1. Viande Foie (VF) ............................................................................ 18
II.1.2.9. Milieu pour la détermination de la mobilité ............................................... 18
II.1.2.9.1. MannitolâmobilitĂ© ................................................................................... 18
II.1.2.10. Milieu de dénombrement : Gélose nutritive ............................................. 18
II.1.3. Milieu pour le test de résistance des souches : bouillon nutritif ............................ 19
II.1.4. Appareil Chromatographique en Phase Gazeuse (CPG) ....................................... 19
II.2. METHODES ............................................................................................................... 20
II.2.1. Quantification du polluant étudié (HAP) ............................................................... 20
II.2.2. Isolement des souches microbiennes ..................................................................... 20
II.2.2.1. But .............................................................................................................. 20
II.2.2.2. Principe ........................................................................................................ 20
II.2.2.3. Mode opératoire ........................................................................................... 21
II.2.2.3.1. Isolement des souches de Pseudomonas fluorescents .................... 21
II.2.2.3.2. Isolement des souches dâactinomycĂštes ......................................... 21
a. Prétraitement des échantillons de sol................................................... 21
b. Préparation de la solution de dilution et ensemencement du milieu ... 21
II.2.2.3.3. Isolement de la flore totale cultivable ............................................. 22
II.2.3. Conservation des souches ...................................................................................... 22
II.2.4. Test de résistance des souches isolées ................................................................... 22
II.2.4.1. But .............................................................................................................. 22
II.2.4.2. Principe ....................................................................................................... 22
II.2.4.3. Mode opératoire .......................................................................................... 23
II.2.4.3.1. PrĂ©paration dâune solution mĂšre de HAP ......................................... 23
II.2.4.3.2. Criblages des souches résistantes ..................................................... 23
II.2.4.3.3. Dénombrement des bactéries ............................................................ 23
II.2.4.3.4. Méthode de dénombrement .............................................................. 23
II.2.5. Identification des souches sélectionnées ............................................................... 24
II.2.5.1. Identification de la flore totale cultivable ................................................... 24
II.2.5.1.1. Etude des caractĂšres culturaux.......................................................... 24
II.2.5.1.2. Etude des caractĂšres morphologiques et structuraux ........................ 24
Table des matiĂšres
II.2.5.1.3. Etude des caractĂšres physiologiques ................................................ 24
a. Mise en Ă©vidence des enzymes respiratoires ................................... 25
Test de catalase (SINGLETON, 1999; GASSER F, 1989)âŠâŠâŠâŠ..25
Test de peroxydase (Singleton, 1999;Gasser, 1989) âŠâŠâŠâŠâŠâŠ...25
b. Influence de la température (Singleton, 1999) ................................. 25
II.2.5.1.4. Etude des caractĂšres biochimiques .................................................. 25
Galerie LEMINOR âŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠ..25
II.2.5.2.Etude phĂ©notypique de la souche dâactinomycĂšte ....................................... 26
II.2.5.2.1. Etude des caractĂšres culturaux......................................................... 26
II.2.5.2.2.Etude des caractĂšres morphologiques ............................................... 27
Technique de culture sur lamelle (Cross, 1989) âŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠ..27
II.2.5.2.3. Etude des caractĂšres physiologiques ................................................ 27
II.2.5.2.4. Etude des caractĂšres biochimiques ................................................... 27
II.2.6. Dosage des HAP résiduels ..................................................................................... 28
II.2.6.1. Quantification des HAP résiduels ............................................................... 28
TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET DISCUSSIONS
III.1. TAUX DES HAP DANS LâECHANTILLON DU SOL CONTAMINE .............. 29
III.2. ISOLEMENT DES SOUCHES MICROBIENNES .............................................. 29
III.3. TEST DE RESISTANCE DES SOUCHES ISOLEES .......................................... 30
III.4. IDENTIFICATION DES SOUCHES SELECTIONNEES .................................. 31
II.4.1. Identification de la souche A1 ............................................................................... 31
III.4.2. Identification de la souche F2 .............................................................................. 33
III.5. RENDEMENT DâELIMINATION DE CHAQUE HAP ...................................... 34
DISCUSSIONSâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠ 37
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES .......................................................... 42
ANNEXES
Glossaire
i
GLOSSAIRE
Acclimatation : PĂ©riode pendant laquelle une population microbienne subit des
transformations phénotypiques et génétiques aprÚs avoir été mise en
présence de conditions nouvelles (par exemple, un apport d'éléments
nutritifs ou encore la mise en contact avec un composé xénobiotique, un
pesticide, un antibiotique, etc.âŠ). Souvent citĂ© sous le terme plus
général d'adaptation.
Adsorption : PhénomÚne de nature physique (forces de van der Wall) permettant
l'adhérence d'un composé sur des particules minérales (argiles).
Aérobie : Organisme utilisant l'oxygÚne pour son métabolisme.
Anaérobie : Organisme par qui l'oxygÚne n'est pas utilisé, ou pour qui il est létal.
Bioaccumulation : Incorporation et rétention d'un élément ou d'un composé toxique par un
organisme. Des bioaccumulations successives dans une chaĂźne
trophique (alimentaire) peuvent contribuer, dans les cellules du dernier
prédateur, dont l'homme, à des niveaux hautement toxiques.
Bioaugmentation : Souvent synonyme d'inoculation. Addition (dans un bioréacteur ou sur
un site pollué) de cultures bactériennes pour stimuler la biodégradation.
Bioconcentration : Augmentation cumulative de composés non biodégradables au cours de
leur transfert à travers les différents niveaux d'une chaßne trophique.
S'applique souvent aux métaux lourds, aux pesticides et aux composés
phosphorés.
Biodégradation : Décomposition partielle ou totale d'un produit par un agent biologique.
Le terme de biodégradation sous-entend l'élimination complÚte d'un
composé avec comme seuls rejets des produits simples tels que H2O,
CO2, CH4, H2, chlorure (pour un organochloré), ou encore de l'acétate,
des produits de fermentation. Elle est souvent mise en Ă©vidence par
l'emploi de molécules marquées par le 14C et la production de gaz
carbonique radioactif.
Glossaire
ii
Biotransformation: Transformation chimique d'un composé par un agent biologique. Cette
notion implique généralement un métabolisme incomplet du substrat et
non une véritable assimilation. Une oxydation, une hydrolyse, une
dĂ©halogĂ©nation, un mĂ©thylation, etcâŠ, sont des biotransformations
quand elles sont réalisées par un microorganisme.
ComĂ©tabolisme : MĂ©tabolisme bactĂ©rien par lequel le substrat peut ĂȘtre dĂ©gradĂ©, mais qui
ne peut subvenir seul Ă la croissance cellulaire (car il ne constitue pour
le microorganisme ni une source de carbone, ni une ressource
énergétique).
Humus: PolymÚres complexes, souvent mal définis, mais de nature phénolique
et quinonique, provenant de la dégradation et de l'oxydation de la
lignine. Ils sont généralement récalcitrants à toute attaque biologique.
Minéralisation: Biodégradation dans laquelle l'étape ultime est la formation de CO2.
Cette notion implique généralement qu'une partie du composé a été
assimilée par l'organisme concerné (et pour lequel il a constitué un
"substrat").
MycĂ©lium : appareil vĂ©gĂ©tatif du champignon et dâActinomycĂšte constituĂ© d'un
ensemble de filaments appelés hyphes
Ubiquitaire : se dit de substances, en particulier d'antigÚnes, présentes dans différents
milieux organiques.
Persistant : Un composé est qualifié de récalcitrant ou de persistant quand son
élimination par des voies biologiques est impossible (récalcitrant vrai),
ou trÚs lente ⊠ou encore qu'il n'a pas été possible de mesurer sa vitesse
de dégradation, tant elle est lente ! Ces termes s'appliquent le plus
souvent aux produits xénobiotiques, mais des composés naturels
peuvent aussi ĂȘtre rĂ©calcitrants (exemple, l'humine). La persistance d'un
composé est généralement estimée par le temps nécessaire pour que sa
concentration initiale diminue de 90%. Cette valeur est
approximativement Ă©gale Ă 3,5 fois la demi-vie.
Glossaire
iii
Xénobiotique: Traduit du grec : "étranger au monde vivant". Composé organique
résultant de l'activité humaine (non naturel, et absent des biotopes
naturels non pollués).
Abréviations
iv
ABREVIATIONS
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ARN: Acide RiboNucléique
AS1 : Antibiotic Selection One
CE : Cadre Européenne
CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse
CYD : Casamino acids Yeast extracts D-glucose
DAS : Daw Agro Sciences
EDS : Eau Distillé
EPA : Environmental Protection Agency
EPA-TSCA: Environmental Protection Agency-Toxic Substances Control Act
HAP : Hydrocarbure Aromatique Polycyclique
IARC : Centre International de Recherche sur le Cancer
ISP2 : International Streptomyces Two
KOW : coefficients de partage octanol/eau
LCPE : Loi Canadienne sur la Protection de l'Environnement
LDC : Lysine DĂ©Carboxylase
LDA : Lysine DĂ©sAminase
MO : MatiĂšre Organique
MEL: Marine Environment Laboratory
NPP : Nombre les Plus Probables
OMS : Organisation Mondial de la Santé
PBS : Phosphate Buffer Saline
SA : Sporulation Agar
Abréviations
v
TSA : Triptic Soy Agar
TDA : Tryptophane DĂ©sAminase
UFC : Unité Formant Colonie
UV : Ultraviolet
VF : Viande Foie
Liste des tableaux
vi
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1. Abondance des microorganismes dans les sols (Bonneau et Souchier,
1994). âŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠ..4
Tableau 2. Propriétés physico-chimiques des HAP .............................................................. 7
Tableau 3. Toxicité des HAP ............................................................................................... 9
Tableau 4. Conditions environnementales affectant la biodégradation (Vidali, 2001) ....... 14
Tableau 5. ModalitĂ© dâensemencement, de lecture et dâinterprĂ©tation de la galerie
LEMINORâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠ.26
Tableau 6. Les différents HAP présents dans le sol de Tsimororo .................................... 29
Tableau 7. Dénombrement de colonies de la souche A1 à chaque temps de prélÚvement
sur milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L.... .................... 31
Tableau 8. Dénombrement de colonies de la souche F2 à chaque temps de prélÚvement sur
milieu bouillon nutritif mĂ©langĂ© avec les HAP 1500 mg/LâŠâŠâŠâŠâŠâŠ......31
Tableau 9. CaractĂ©ristiques culturales de la souche dâactinomycĂšte A1 ............................ 32
Tableau 10. CaractĂšres morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche
A1âŠâŠâŠâŠâŠâŠ ............................................................................................. 32
Tableau 11. CaractĂšre culturaux, morphologiques et physiologiques de la souche F2 ....... 33
Tableau 12. CaractĂšre biochimiques de la souche F2 .......................................................... 33
Tableau 13. Rendement dâĂ©limination des HAP en pourcentage (%) pour chaque durĂ©e
dâĂ©limination âŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠâŠ....34
Liste des figures
vii
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Structure des 16 HAP de la liste EPA ................................................................ 5
Figure 2. Evolution d'un sol brun structuré en 3 horizons (A, B et C) remanié en
technosol.. ......................................................................................................... 10
Figure 3. Voie de dégradation bactérienne du phénanthrÚne (Pseudomonas sp. 47
p1,s7k5) d'aprÚs la base de données Biocatalysis/biodegradation .................... 13
Figure 4. Localisation de Tsimiroro ................................................................................ 15
Figure 5. SchĂ©ma de la description dâun ensemble chromatographique ......................... 19
Figure 6. Rendement dâĂ©limination de huit HAP en pourcentage (%) en fonction de
durĂ©e dâincubation pour lâespĂšce Streptomyces sp. .......................................... 35
Figure 7. Rendement dâĂ©limination de huit HAP en pourcentage (%) en fonction de
durĂ©e dâincubation pour lâespĂšce Bacillus simplex .......................................... 36
Liste des photos
viii
LISTE DES PHOTOS
Photo 1. Souches pures de Pseudomonas fluorescents sur le milieu King B ................. 30
Photo 2. VariĂ©tĂ©s des souches dâactinomycĂštes isolĂ©es sur milieu AS1 ........................ 30
Introduction
INTRODUCTION
Introduction
1
INTRODUCTION
Avec lâaccĂ©lĂ©ration du dĂ©veloppement Ă©conomique, lâhomme est de plus en plus
responsable de la pollution de lâenvironnement par ses activitĂ©s industrielles, Ă©conomiques et
sociales (comme l'industrialisation ainsi que d'autres exploitations), générant ainsi une
multitude de composés plus ou moins toxiques pour les organismes vivants.
Un des problĂšmes majeurs Ă Madagascar Ă©tant lâabsence de cadre lĂ©gal spĂ©cifique et
précis régissant la prise en charge ou la gestion des sites et sols pollués. TrÚs peu de systÚmes
de dĂ©pollution concrĂšte ont Ă©tĂ© appliquĂ©s durant ces dĂ©cennies dâactivitĂ©s industrielles
existantes, ce qui a laissĂ© un hĂ©ritage lourd en matiĂšre de pollution de lâenvironnement.
Actuellement, de nombreuses industries génératrices de boues huileuses (contaminées
par des hydrocarbures) sont également implantées au pays et cette situation nous laisse
prévoir encore à la détérioration progressive de la qualité environnementale suite à des
accumulations prévisibles des polluants toxiques tels que les « Hydrocarbures Aromatiques
Polycycliques » (HAP).
Les HAP sont parmi les polluants les plus dangereux pour les ĂȘtres vivants et pour
lâhomme en particulier dans la mesure oĂč ils ont des propriĂ©tĂ©s cancĂ©rigĂšnes et/ou mutagĂšnes.
Ce sont des composés ubiquitaires issus de la combustion incomplÚte de matiÚres organiques,
surtout gĂ©nĂ©rĂ©s dans lâexploitation des produits pĂ©troliers. Ils ont tendance Ă sâadsorber dans
les sols et les sédiments à cause de leur caractÚre hydrophobe et leur persistance dans les
écosystÚmes. Or, de nombreuses études ont montré que les sols constituaient le principal point
de fuite environnementale des HAP (LCPE, 1994) du fait de leur caractÚre rémanent et
toxique. Il serait donc nécessaire de surveiller et de limiter cette pollution.
C'est dans cette optique que ce travail de mémoire a été mené pour réduire les impacts
gĂ©nĂ©rĂ©s par lâomniprĂ©sence des hydrocarbures aromatiques polycycliques dans les sols et sur
la reprise de la bio-fonctionnalité du sol pollué, la technique de bioremédiation est désormais
la technologie de traitement fortement conseillée pour remédier les eaux ou les sols
contaminĂ©s par ces types de polluants (Ballerini et Vandecasteele, 1999). Elle a lâavantage de
ne pas utiliser des agents dépolluants agressifs, contrairement aux autres techniques, qui sont
susceptibles dâengendrer encore plus dâeffets dĂ©gradants sur le milieu Ă dĂ©polluer. Le principe
est basĂ© sur lâutilisation des microorganismes vivants pour assurer la dĂ©gradation des chaines
polluantes piégées dans les eaux/ sols à décontaminer.
Introduction
2
Lâutilisation de ces bactĂ©ries pour la bioremĂ©diation est aujourdâhui reconnue comme
une action complémentaire des voies chimiques et physiques pour la dégradation ultime des
polluants dans lâenvironnement et considĂ©rĂ©e comme un traitement efficace, Ă©conomique et
Ă©cologique, est largement mise en Ćuvre (Tarayre, 2012 ; Mi Jin et al., 2013).
De ce fait, lâobjectif principal de cette Ă©tude est de rechercher et de mettre au point un
procédé de bioremédiation des HAP dans les sols, en tenant compte des microorganismes
telluriques pouvant ĂȘtre optimisĂ©. Nos approches consistent, Ă sĂ©lectionner et Ă identifier les
souches telluriques résistantes à une gamme croissante de concentration de mélange HAP
étudiés dans des milieux de culture spécifique puis à suivre les cinétiques de dégradation des
polluants par ces microorganismes en Ă©valuant le taux dâhydrocarbures restants Ă chaque
expérience.
Ainsi, pour ce faire, ce mémoire a été divisé en trois parties, à savoir : la premiÚre
partie qui résumera les données bibliographiques, la deuxiÚme partie qui décrira les matériels
et méthodes utilisés et la troisiÚme partie qui exposera les résultats et discussions. La premiÚre
partie est précédée par une introduction générale et la derniÚre partie est terminée par la
conclusion ainsi que les perspectives.
SynthĂšse bibliographique
SYNTHESE
BIBLIOGRAPHIQUE
SynthĂšse bibliographique
3
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I.1. LES MICROORGANISMES DANS LES SOLS Le sol est un milieu vivant (Kilbertus, 1980). Il figure parmi les habitats les plus
diversifiĂ©s et renferme certains des assemblages les plus variĂ©s dâorganismes vivants comme
les bactéries, les actinomycÚtes, les champignons, les algues, les parties souterraines des
plantes, ainsi quâune faune trĂšs variĂ©e allant des protozoaires aux mammifĂšres essentiellement
les nématodes, les annélides et les arthropodes (Paul et Clark, 1989).
Les bactéries : sont les organismes les plus nombreux du sol, leur densité est de
lâordre de 109 par gramme de sol. Il existe plus de 200 genres bactĂ©riens diffĂ©rents. Parmi les
plus représentés dans le sol, on peut citer (Alexander, 1977) : les Arthrobacter, Gram
variables à croissance lente, qui peuvent représenter 5 à 60% des colonies, les Pseudomonas,
Gram négatif mobiles, représentant 3 à 20% des UFC (unités formant colonie), le genre
Bacillus, bĂątonnets sporulant Gram positif ou Gram variables, souvent mobiles, qui est
également bien représenté dans les sols: de 7 à 67%, les Clostridium, bactéries anaérobies
utilisées pour la production d'alcool et de solvants.
Les actinomycÚtes : ce sont des microorganismes hétérotrophes qui forment une
structure vĂ©gĂ©tative de type mycĂ©lien, ils peuvent atteindre jusquâĂ 107 unitĂ©s par gramme de
sol. Dans le sol, les genres les plus frĂ©quents sont les Streptomyces qui reprĂ©sentent jusqu'Ă
90% des genres identifiés, et les Nocardia.
Les champignons : bien que moins nombreux que les bactéries dans les
dénombrements sur boßte de Pétri, les organismes hétérotrophes eucaryotes que sont les
champignons sont les principaux responsables de la décomposition des résidus organiques
dans les sols.
Les algues et les protozoaires : la densitĂ© des algues est de lâordre de 105 par gramme
de sol et ce sont toutes des espÚces de Cholorophyceae, de Cyanophyceae et des Diatomées,
dont certaines sont fixatrices dâazote. Quant aux protozoaires, ce sont les moins nombreux
avec une densité de 103 par gramme de sol (Morel, 1996).
Le tableau 1 ci-dessous montre lâabondance des microorganismes dans les sols.
SynthĂšse bibliographique
4
Tableau 1. Abondance des microorganismes dans les sols (Bonneau et Souchier, 1994).
Lâensemble de ces organismes font partie intĂ©grante du systĂšme sol et participe par
leur activitĂ© Ă la formation et Ă lâĂ©volution des sols.
I.1.1. Activités microbiennes dans les sols
L'activité des microorganismes du sol ne se manifeste que si les conditions
énergétiques et nutritionnelles sont satisfaites. Les nutriments doivent répondre à 3 besoins :
- fournir de l'Ă©nergie pour la croissance cellulaire ;
- fournir des matériaux pour la synthÚse des constituants cellulaires ;
- ĂȘtre utilisables comme accepteurs des Ă©lectrons libĂ©rĂ©s au cours de la
production d'Ă©nergie.
I.1.2. Interactions entre microorganismes
De façon générale, les microorganismes du sol influencent diverses composantes liées
à la qualité du sol comme la matiÚre organique et la structure. Le sol ne peut dÚs lors plus se
concevoir comme une matrice homogÚne mais plutÎt comme un assemblage hétérogÚne
dâentitĂ©s physiques formĂ©es par lâactivitĂ© microbienne Ă la surface des matiĂšres organiques en
décomposition et qui sont en interaction avec les particules minérales du sol.
La croissance des microorganismes a été le plus souvent étudiée et modélisée dans des
conditions de culture pure (Slater et al., 1979) alors que dans les sols, ils se développent en
présence d'autres organismes (microorganismes, animaux, racines) et dans un systÚme poreux
oĂč ils sont le plus souvent fixĂ©s sur des constituants minĂ©raux, organiques et organo-
minéraux.
I.2. LES HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUESâGENERALITES Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) constituent une classe
importante de polluants issus de lâactivitĂ© industrielle. Ce sont des molĂ©cules ubiquistes,
ORGANISMES NOMBRE (UFC/g de sol sec)
Bactéries 108
ActinomycĂštes 105 Ă 106
Champignons 105
Algues 104 Ă 105
Protozoaires 104
SynthĂšse bibliographique
5
persistantes et toxiques qui figurent sur la liste des polluants prioritaires de lâAgence
Américaine de la Protection de l'Environnement (EPA) (Keith et Telliard, 1976). Ces
polluants récalcitrants sont aussi répertoriés comme des composés néfastes pour l'homme et
l'environnement par lâOrganisation Mondiale de la SantĂ© (OMS) et la CommunautĂ©
Européenne (CE).
I.2.1. DĂ©finition â classification
Les HAP sont des composĂ©s aromatiques hĂ©tĂ©rocycliques constituĂ©s dâatome de
carbone et dâhydrogĂšne. Ils sont constituĂ©s de cycles aromatiques accolĂ©s en nombre croissant
allant de deux (2) cycles (naphtalĂšne) jusquâĂ six (6) cycles (benzo(g,h,i)pĂ©rylĂšne). Les
structures des 16 HAP retenus comme polluants prioritaires par lâAmerican Environmental
Protection Agency (EPA) sont présentés dans la figure 1.
Figure 1. Structure des 16 HAP de la liste EPA
Ces HAP sont classés en deux groupes selon le nombre de cycle benzéniques qui les
compose et lâĂ©tat de condensation de ces noyaux de type phĂ©nol :
⹠les HAP légers (2 à 3 cycles) de masse molaire comprise entre 150 et 180 g/mol ;
⹠les HAP lourds (4 cycles ou plus) de masse molaire supérieure à 200 et 280 g/mol.
SynthĂšse bibliographique
6
I.2.2. Propriétés physico-chimiques des HAP
Les propriétés physico-chimiques des HAP varient selon la masse moléculaire, le
nombre et lâassemblage des cycles qui composent la molĂ©cule. La transformation et la
mobilitĂ© des HAP dans lâenvironnement sont principalement contrĂŽlĂ©es par leur faible
solubilité, leur hydrophobicité et leur pression de vapeur saturante.
I.2.2.1. Solubilité
La solubilitĂ© correspond Ă la concentration du produit en phase aqueuse Ă lâĂ©quilibre et
elle augmente avec la température. La plupart des HAP sont pratiquement insolubles dans
lâeau (Edwards, 1983), leur solubilitĂ© Ă©tant inversement proportionnelle au nombre de cycles
de la molécule (taille et angularité) (Haesseler, 1998) (tableau 2).
Leur solubilité en milieu aqueux est notable pour le naphtalÚne (30 mg/L) mais décroßt
ensuite trĂšs rapidement avec le nombre de cycles aromatiques (160 ÎŒg/L pour le pyrĂšne, 4
ÎŒg/L pour le benzo(a)pyrĂšne).
I.2.2.2. Coefficient de partage octanol/eau
Le coefficient de partage octanol/eau (log KOW) traduit la rĂ©partition dâune molĂ©cule
de soluté entre la phase lipophile (octanol) et la phase hydrophile (eau). Il évalue
lâhydrophobicitĂ© dâune molĂ©cule et son potentiel lipophile. Il permet de connaĂźtre la capacitĂ©
de la molĂ©cule organique (Fu et al., 1994) Ă sâaccumuler dans les ĂȘtres vivants au niveau des
tissus adipeux et des membranes phospholipidiques. Par sa détermination, il est possible
dâestimer lâadsorption du composĂ© au niveau des rĂ©gions hydrophobes du sol (matiĂšre
organique, cires, lipides, matiĂšres particulaires) (Weissenfels et al., 1992 ; Marschner, 1999)
qui se fait via des liaisons hydrophobes plus ou moins stables, lui permettant de persister dans
lâenvironnement (Bouwer et Zehnder, 1993 ; Hartmann, 1996 ; Van Brummelen et al., 1996).
Les log KOW des HAP sont relativement élevés, variant de 3,37 à 6,5 (Makay et al.,
1992), selon le nombre de noyaux aromatiques du composé (tableau 2), et indiquent ainsi la
nĂ©cessitĂ© dâutiliser des solvants organiques ou des tensioactifs pour leur extraction.
I.2.2.3. Pression de vapeur
La pression ou tension de vapeur permet de connaĂźtre la capacitĂ© dâun produit Ă passer
dâune phase gazeuse Ă une phase aqueuse. A partir de 105 kPa, les composĂ©s sont considĂ©rĂ©s
comme volatils. Les tensions de vapeur des HAP de deux (2) Ă trois (3) cycles indiquent que
SynthĂšse bibliographique
7
ces molécules sont volatiles, enrichissant ainsi relativement le milieu en HAP de fort poids
moléculaire (tableau 2).
Tableau 2. Propriétés physico-chimiques des HAP
Composés Formule
semi-développée a
Nombre de cycle
a
Formule brute a
Masse molaire
a (g/mol)
SolubilitĂ© dans lâeau
a 25 °C Sw (mg/L)
Coefficient de partage octanol/eau
a log KOW
Pression de vapeur saturante
a (Pa)
Temps de demi-vie b (j : jours, a : ans)
NaphtalĂšne
2 C8H10 128,2 31 3,4 36,8 16 j â 48 j
AcénaphtylÚne
3 C12H8 152,2 16,1 4,0 4,14 Non étudié
AcénaphtÚne
3 C12H10 154,2 3,8 3,9 1,52 Non étudié
FluorĂšne 3 C13H10 166,2 1,9 4,2 0,715 32 j â 60 j
PhénanthrÚne
3 C14H10 178,2 1,1 4,6 0,113 16 j â 200 j
AnthracĂšne 3 C14H10 178,2 0,05 4,5 0,0778 50 j â 1,3 a
FluoranthĂšne
4 C16H10 202,3 0,26 5,2 8,72.10-3 140 j â 1,2 a
PyrĂšne
4 C16H10 202,3 0,13 5,2 0,0119 210 j â 5,2 a
Benzo(a)anthracĂšne
4 C18H12 228,3 0,01 5,9 6,06.10-4 102 j â 1,9 a
ChrysĂšne
4 C18H12 228,3 0,002 5,6 8,4.10-7 1 a â 2,7 a
Benzo(b)fluoranthĂšne
5 C20H12 252,3 0,002 5,8 6,7.10-5 Non étudié
Benzo(k)fluoranthĂšne
5 C20H12 252,3 0,001 6,0 4,12.10-6 2,5 a â 2,9 a
Benzo(a)pyrĂšne
5 C20H12 252,3 0,004 6,0 2,13.10-5 Non étudié
Dibenzo(a,h)anthracĂšne
5 C22H14 278,4 0,0006 6,8 9,16.10-8 361 j â 2,6 a
Indénol(1,2,3,c,d)pyrÚne
6 C22H12 276,3 0,062 6,6 1,3.10-8 1,6 a â 2 a
Dibenzo(g,h,i)pérylÚne
6 C21H16 268,4 0,0003 6,5 2,25.10-5 0,25 a â 1,8 a
a : Makaya et al., 1992 ;b : IARC, 1997, 2000.
SynthĂšse bibliographique
8
I.2.3. Origine des HAP
Les HAP ont pour origine différents processus : la combustion incomplÚte de la
matiĂšre organique, la diagenĂšse, la biogenĂšse. Les sources naturelles dâĂ©mission de HAP dans
lâenvironnement sont les feux de forĂȘt, les Ă©ruptions volcaniques, mais aussi les rĂ©actions
biogĂšnes gĂ©nĂ©rĂ©es par les plantes et les microorganismes (formation de lâhumus et
minéralisation de la matiÚre organique) (Henner et al., 1997 ; Juhasz et Naïdu, 2000 ; Wilcke,
2000), ainsi que les réactions géologiques associées à la formation du fuel fossile (Wilson et
Jones, 1993).
La plus importante source de HAP dâorigine anthropique est lâactivitĂ© industrielle par
la combustion incomplĂšte des combustibles fossiles (Wilds et Jones, 1995 ; Vierle et al., 1999
; Samantha et al., 2002). Les mécanismes mis en jeu lors de leur formation font intervenir la
production de radicaux libres par pyrolyse Ă haute tempĂ©rature (â„500°C) de la matiĂšre fossile
(pĂ©trole, fuel, matiĂšres organiquesâŠ) dans des conditions dĂ©ficientes en oxygĂšne.
LâĂ©mission de HAP se produit notamment lors de lâextraction et du raffinage du
pĂ©trole (Hill et Goshal, 2002), de lâaluminerie, de la sidĂ©rurgie, de la cokĂ©faction (Menzie et
al., 1992 ; Arzayus et al., 2001; Hill et Goshal, 2002) et lors du stockage dâhydrocarbures de
goudron et de bitume (Colline, 2000).
I.2.4. Toxicité des HAP
Les HAP possĂšdent un fort pouvoir dâadsorption sur les particules Ă©lĂ©mentaires en
suspension dans lâair (mais aussi dans lâeau) ainsi quâun fort potentiel de bioconcentration
dans les organismes. En revanche, en raison de leurs structures, les HAP sont trĂšs
hydrophobes (Ă lâexception du naphtalĂšne). La toxicitĂ© des HAP varie fortement dâun
composĂ© Ă lâautre. Ainsi plusieurs HAP ont des effets mutagĂšnes et cancĂ©rogĂšnes. Dans
lâorganisme, les HAP deviennent toxiques aprĂšs oxydation enzymatique, laquelle conduit Ă la
formation des métabolites électrophiles solubles. Les métabolites, à leur tour, forment des
adduits sur les acides nucléiques ARN, ADN et sur les protéines et provoquent une
perturbation sur le mécanisme de division cellulaire et à la formation de tumeurs (Szeliga et
al. 1998).
Le tableau 3 suivant présente les principales données de toxicité des HAP suivant la
classification utilisĂ©e par le CIRC pour lâĂ©valuation des risques de cancĂ©rogĂ©nicitĂ© sur
lâhomme:
SynthĂšse bibliographique
9
âą Groupe 1 : Lâagent est cancĂ©rogĂšne pour lâhomme ;
âą Groupe 2A : Lâagent est probablement cancĂ©rogĂšne pour lâhomme ;
âą Groupe 2B : Lâagent est peut ĂȘtre cancĂ©rogĂšne pour lâhomme ;
âą Groupe 3 : Lâagent est inclassable quant Ă sa cancĂ©rogĂ©nicitĂ© pour lâhomme ;
âą Groupe 4 : Lâagent nâest probablement cancĂ©rogĂšne pour lâhomme.
Tableau 3. Toxicité des HAP
IARC : Centre International de Recherche sur le Cancer
EPA-TSCA: Environmental Protection Agency-Toxic Substances Control Act
Nom Toxicité Cancérogénicité MutagénÚse Rapporté dans
Benzo(a)pyrĂšne Toxique pour
lâhomme 1 ConstatĂ©e (Cavalieri et
al.,1988 ; CIRC, Health Canada)
Benzo(a)anthracĂšne Toxique pour
lâenvironnement 2B ConstatĂ©e EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
Benzo(b)fluoranthĂšne Toxique pour lâhomme 2B ConstatĂ©e
Amin et al.,1984; Emura et al.,
1980 ; Hermann, 1981 ; CIRC,
Health Canada Benzo(g,h,i)pérylÚne 3 Constatée CIRC
Benzo(k)fluoranthĂšne Toxique pour lâhomme 2B ConstatĂ©e
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
Benzo(j)fluoranthĂšne Toxique pour lâhomme 2B Health Canada
FluoranthĂšne Toxique pour lâenvironnement 3 ConstatĂ©e
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
IndĂ©no(1,2,3,c,d)pyrĂšne Toxique pour lâhomme 2B ConstatĂ©e
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
PyrĂšne Toxique pour lâenvironnement 3 ConstatĂ©e
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
AnthracĂšne Toxique pour lâenvironnement 3 ConstatĂ©e
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
PhĂ©nanthrĂšne Toxique pour lâenvironnement 3 ConstatĂ©e
EPA-TSCA, CIRC, Health
Canada
Dibenzo(a,h)anthracÚne Toxique 2A Constatée EPA-TSCA, CIRC
ChrysÚne 2B Constatée (JOCE, 2004), CIRC
SynthĂšse bibliographique
10
I.2.5. Distribution des HAP
Par leur nature hydrophobe, les HAP contenus dans les milieux aquatiques sont
principalement liĂ©s aux particules organiques et minĂ©rales en suspension dans lâeau (Herbes,
1977). Bien que la majoritĂ© des HAP soit Ă©mise dans lâatmosphĂšre (Wild et Jones, 1995), le
sol et les sédiments constituent le principal point de fuite environnemental de ces polluants
(Wilcke, 2000). Wild et Jones (1995) estiment que 90% des HAP Ă©mis dans lâenvironnement
sont stockés dans les sols, sans comptabiliser ceux des sites industriels. En effet, la
contamination des sols à proximité des sites industriels est importante.
I.2.6. HAP dans les sols
Le sol est un systĂšme hĂ©tĂ©rogĂšne et complexe Ă lâinterface entre la gĂ©osphĂšre,
lâatmosphĂšre et la biosphĂšre. Les HAP dans les sols peuvent interagir avec les constituants
minéraux, organiques, les organismes vivants, la phase gazeuse et la phase liquide. De par ses
caractéristiques physico-chimiques et biologiques, le sol est structuré en horizon.
Lors de lâinstallation de sites industriels et du remaniement des terres, les procĂ©dĂ©s
pédologiques intÚgrent les matiÚres anthropiques et créent de nouvelles associations organo-
minérales (Monserie et al., 2009). Ces technosols ne font plus apparaßtre de structure en
horizons des sols (figure 2).
Figure 2. Evolution d'un sol brun structuré en 3 horizons (A, B et C) remanié en
technosol
I.3. BIODEGRADATION DES HAP Actuellement, les techniques de traitement des sols pollués sont classées en quatre
grandes catégories : les procédés physico-chimiques, les procédés thermiques, les procédés
biologiques (ou bioremédiation), le confinement (Ballerini et al., 1998). Mais lors de cette
SynthĂšse bibliographique
11
étude, nous avons choisi les procédés biologiques pour la dégradation des HAP en prenant en
compte les raisons suivantes :
âą intĂ©rĂȘt environnemental : rĂ©duire les impacts environnementaux ;
âą intĂ©rĂȘt Ă©conomique : coĂ»ts de traitement rĂ©duits ;
âą intĂ©rĂȘts techniques : traitement dâune gamme diversifiĂ©e de polluants (organiques,
minéraux), possibilité de préparer des microorganismes spécialisés, capacité des
microorganismes Ă vivre dans des conditions extrĂȘmes (pH, oxygĂ©nation,
concentrations élevées de polluant, etc.), nombreux microorganismes identifiés et
caractérisés ;
âą tests en laboratoire concluants.
En réalité, la dégradation naturelle des matiÚres organiques polluantes est généralement
un processus lent et dépend certainement de la nature, de la toxicité, du taux de
nutriments disponibles dans le milieu ainsi que de la concentration des polluants piégés dans
le sol. Tout cela constitue un facteur ralentissant, voire mĂȘme inhibant, pour lâactivitĂ©
dĂ©gradante qui devrait y avoir lieu et ĂȘtre assurĂ©e par des microorganismes vivants dans le
sol. La bioremĂ©diation, qui est une mĂ©thode basĂ©e sur lâactivitĂ© de la capacitĂ© naturelle
que possÚdent de nombreux organismes, sont généralement soit des bactéries, des micros
algues ou des champignons dĂ©gradant les polluants en composĂ©s inertes, comme lâeau et
le gaz carbonique. Ces organismes peuvent ĂȘtre dĂ©jĂ prĂ©sents dans la zone polluĂ©e
(indigÚnes) ou ajoutés au milieu (exogÚne), ou encore prélevés sur le site contaminé,
cultivées au laboratoire puis réintroduits dans le sol. Elle se déroule généralement en
condition dâaĂ©robie ; toutefois, lâapplication des systĂšmes de bioremĂ©diation en condition
dâanaĂ©robie permet de dĂ©grader un certain nombre de molĂ©cules rĂ©calcitrantes (Chedly, 2006).
I.4. DIVERSITE DES GENRES BACTERIENS POUVANT DEGRADER LES HAP Divers microorganismes sont capables de dégrader les hydrocarbures comme les
bactéries et les champignons mais la culture de bactéries étant plus rapide, ajouté au fait que
les bactĂ©ries assimilent mieux certaines molĂ©cules donc, lâusage de ces derniers est prĂ©fĂ©rĂ©.
Dans cette optique, cette synthÚse traitera donc des bactéries dégradant les hydrocarbures.
Dans plusieurs expériences, les souches favorables à la bioremédiation sont celles isolées du
sol contaminé en question ou isolées à partir des points des rejets industriels à traiter (Dong et
al., 2008 ; Cordova-Rosa et al., 2009). Ces microorganismes appartiennent Ă des genres
SynthĂšse bibliographique
12
variés, les Pseudomonas ayant été particuliÚrement étudiées, isolées sur naphtalÚne (Grund
and Gunsalus, 1983; Kurkela et al., 1988; Simon et al., 1993; Yang et al., 1994).
Mahmoud et Rama Rao ,1993 ont quant à eux étudié l'abondance microbienne et la
dĂ©gradation dâHAP (anthracĂšne, phĂ©nanthrĂšne, chrysĂšne, pyrĂšne, fluoranthĂšne) dans des sols
pollués. Ils ont observé une attaque préférentielle de l'anthracÚne et du phénanthrÚne (le plus
rapidement dégradé). Les bactéries dominantes appartenaient aux genres Pseudomonas,
Agrobacterium et Bacillus subtilis.
Kastner et al., 1994 ont étudié l'existence de bactéries dégradant des HAP sur
différents sols pollués en utilisant la méthode développée par Kiyohara et al., 1982. Ils ont
mis en évidence des populations bactériennes capables de croßtre sur l'anthracÚne, le
phénanthrÚne, le fluoranthÚne ou le pyrÚne de 103 à l05 UFC/g de sol sec dans les sols pollués
par des HAP, mais n'ont pas trouvé d'isolat capable de croßtre sur le pérylÚne, le triphénylÚne,
le benzo(a)pyrĂšne ou le chrysĂšne. Les actinomycĂštes nocardioformes (Rhodococcus,
Nocardia, Mycobacterium) représentaient la majeure partie de la microflore du sol capable de
minéraliser complÚtement des HAP.
Les espÚces bactériennes capables de dégrader les HAP sont montrées en Annexe 4.
I.5. LES DIFFERENTS TYPES DE VOIES DE DEGRADATION DES HAP Il y a plusieurs types de voies pour biodégrader les HAP :
âą Par voie abiotique : qui se fait par la volatilisation en phase gazeuse des polluants Ă
lâinterface eau-air dans les sols, avec dĂ©gazage vers lâatmosphĂšre et la transformation
oĂč la dĂ©gradation des HAP par voie chimique se fait soit par oxydation chimique, soit
par photo-oxydation sous lâaction des rayonnements ultraviolets (UV), de lâozone, du
peroxyde dâhydrogĂšne, du dioxygĂšne ou de radicaux âOH (Heitzer et Sayler , 1993 ;
Letho et al., 2003) ;
⹠Par voie biotique : ce mécanisme convertit une substance métabolisable en un
composĂ© plus simple qui peut ĂȘtre moins ou plutĂŽt toxique que le composĂ© dâorigine
(biotransformation) et aboutĂźt Ă un produit final qui est le dioxyde de carbone
(minĂ©ralisation). Lors de cette dĂ©gradation, le composĂ© peut servir ou non dâunique
source de carbone aux microorganismes (Grady, 1985 ; Lappin et al., 1985) ;
⹠Par voie bactérienne : le métabolisme bactérien est le processus majeur de
dĂ©gradation des HAP dans les sols (Cerniglia, 1997). Cette dĂ©gradation peut ĂȘtre plus
SynthĂšse bibliographique
13
ou moins partielle et met en jeu de nombreuses genres bactériens Gram positif et
Gram négatif : Pseudomonas, Acinobacter, Bacillus, Sphingomonas, Burkholderia, et
mycobactĂ©rium (Johnsen et al., 2005). LâĂ©tude de la biodĂ©gradation des HAP par des
souches bactĂ©riennes isolĂ©es Ă partir de sols contaminĂ©s a permis dâĂ©tablir des voies
mĂ©taboliques de dĂ©gradation, dâanalyser lâorganisation et la rĂ©gulation des gĂšnes qui
code les enzymes impliquées dans la dégradation (Saito et al., 2000) ;
Les voies de dégradation, comme le naphtalÚne et le phénanthrÚne, ont été largement
étudiées depuis de nombreuses années (Treccani et al,. 1954; Davis et Evans, 1964; Evans et
al,. 1965). A partir du phénanthrÚne et de la dihydroxylation du cycle aromatique par une
enzyme dioxygÚnase, il existe à l'intérieur de la bactérie une succession de réactions
cataboliques chacune synthétisée par une enzyme spécifique, lesquelles produisent de
nombreux métabolites dont le 1-hydroxy-2-naphtoate et le phtalate (Kiyohara et Nagao, 1978;
Seo et al,. 2006). La dégradation des composés aromatiques fournit des intermédiaires du
cycle de Krebs (pyruvate, succinate, etc.) et produit de l'énergie pour la bactérie (figure 3). Au
fur et à mesure des réactions, le nombre de carbone du polluant diminue, le déchet ultime est
le dioxyde de carbone lequel est rejeté à l'extérieur de la bactérie.
Figure 3. Voie de dégradation bactérienne du phénanthrÚne (Pseudomonas sp. 47
p1,s7k5) d'aprÚs la base de données Biocatalysis/biodegradation
SynthĂšse bibliographique
14
I.6. FACTEURS INFLUENCANT LA DEGRADATION DES HAP Plusieurs facteurs vont influencer la dégradation des polluants par les
microorganismes. Les conditions environnementales doivent ĂȘtre optimales pour obtenir une
croissance et une activitĂ© microbienne garantissant lâefficacitĂ© du procĂ©dĂ© de bioremĂ©diation.
Les nutriments doivent ĂȘtre prĂ©sents en quantitĂ© suffisante : les valeurs optimales du rapport C
: N : P doivent ĂȘtre Ă©gales Ă 100 :5 :1 et la prĂ©sence dâoligo-Ă©lĂ©ments est requise pour assurer
leur croissance.
LâefficacitĂ© du traitement par bioremĂ©diation peut ĂȘtre ainsi limitĂ©e par la permĂ©abilitĂ©
des sols, la teneur en silt et argile ne devant pas dépasser un certain seuil. Les sols à traiter ne
peuvent contenir de substances toxiques susceptibles dâempĂȘcher le dĂ©veloppement bactĂ©rien.
Le tableau 4 qui suit montre les conditions environnementales la biodégradation des
polluants par les microorganismes.
Tableau 4. Conditions environnementales affectant la biodégradation (Vidali, 2001)
Matériels et méthodes
MATERIELS ET METHODES
Matériels et méthodes
15
II.1. MATERIELS
II.1.1.Site et Ă©chantillonnage de sol
LâĂ©chantillon de sol utilisĂ© pour cette Ă©tude a Ă©tĂ© collectĂ© dans un site industriel dâun
grand gisement dâhuile lourde de Tsimiroro situĂ© au Nord-Ouest de Madagascar et
approximativement à 100 km Ouest de la cÎte de Madagascar, dans le bassin sédimentaire de
Morondava, au sud de Bemolanga et de Morafenobe (figure 4).
Source : Madagascar Oil, Etude dâImpact Environnemental de Tsimiroro, BD 500 FTM
Figure 4. Localisation de Tsimiroro
LâĂ©chantillon est prĂ©levĂ© Ă une profondeur situĂ©e entre 10cm et 20cm. Cette zone
correspond Ă la zone dâhyperactivitĂ© biologique au niveau du sol. Environ 1 kg de sol sont
prélevés avec une spatule stérile et conditionnés dans des sachets de prélÚvement. Les
Ă©chantillons sont conservĂ©s Ă la tempĂ©rature ambiante jusquâau laboratoire.
II.1.2. Milieu de culture
II.1.2.1. Milieu dâisolement et dâidentification
II.1.2.1.1.Milieu TSA (Tryptic Soy Agar)
Le milieu solide est habituellement employé pour la culture et dénombrement de la
flore totale cultivable.
Matériels et méthodes
16
II.1.2.1.2. Milieu King B
Le milieu King B est un milieu contenant comme source de carbone la polypeptone.
Ce milieu est habituellement utilisé pour isoler et conserver les souches de Pseudomonas
fluorescents Ă partir de lâĂ©chantillon de sol.
II.1.2.1.3. Milieu AS1
Le milieu AS1 est un milieu solide utilisĂ© pour lâisolement et la conservation des
souches dâactinomycĂštes.
Ce milieu est additionnĂ© de 3 antibiotiques pour lâisolement des actinomycĂštes :
⹠la triméthoprime (inhibiteur des champignons) ;
⹠le cycloheximide (inhibiteur des bactéries) ;
âą lâacide nalidixique (inhibiteur des bactĂ©ries Gram nĂ©gatif).
II.1.2.2. Milieux dâidentification de la souche de Bacillus
Ce sont des milieux qui permettent de mettre en Ă©vidence les caractĂšres biochimiques
des bactéries. Pour cela, le portoir de LEMINOR constitué par les milieux suivants a été
utilisé.
II.1.2.2.1. Milieu Mannitol- Mobilité- Nitrate
Il sâagit dâun milieu semi - mou permettant de mettre en Ă©vidence lâutilisation du
mannitol, la réduction du nitrate par les bactéries et leur mobilité à partir de la ligne
dâensemencement.
II.1.2.2.2. Milieu Hajna-Kligler (Lactose â Glucose â H2S)
Câest un milieu solide utilisĂ© pour la mise en Ă©vidence de la fermentation du glucose
et du lactose, de la production de sulfure dâhydrogĂšne (H2S), de la production de gaz et de la
recherche de Ăâ galactosidase.
II.1.2.2.3. Milieu de SIMMONS (Citrate)
Câest un milieu solide Ă©galement, contenant comme source de carbone le citrate. Ce
milieu permet de rechercher lâutilisation du citrate par les bactĂ©ries.
II.1.2.2.4. Milieu Lysine-Fer
Câest un milieu solide qui permet de mettre en Ă©vidence simultanĂ©ment la lysine
dĂ©carboxylase (LDC), la lysine dĂ©saminase (LDA), lâutilisation du glucose et la formation
dâ H2S.
Matériels et méthodes
17
II.1.2.2.5. Milieu Urée-Indole
Le milieu urĂ©e indole est un milieu liquide permettant de rechercher lâurĂ©ase, le
tryptophane dĂ©saminase (TDA) et la production dâindole par les bactĂ©ries.
Dâautres milieux sont aussi utilisĂ©s pour identifier les microorganismes des
saucissons, outre ceux cités dans le portoir de LEMINOR.
II.1.2.2.6. Milieu Ă lâeau peptonĂ©e au rouge de phĂ©nol
Câest un milieu liquide contenant comme milieu de base lâeau peptonĂ©e additionnĂ©e
dâun indicateur colorĂ© qui est le rouge de phĂ©nol. Il permet dâĂ©tudier lâutilisation par les
bactéries de certains composés glucidiques ajoutés stérilement dans le milieu.
II.1.2.3. Préparation des inoculums pour la pré-identification
II.1.2.3.1. ISP3 (International Streptomyces 3)
Câest un milieu solide contenant de la solution dâavoine. Il est utilisĂ© pour la
prĂ©paration des inoculums et pour la prĂ©-identification des souches dâactinomycĂštes.
II.1.2.4. Milieu dâidentification macroscopique
II.1.2.4.1. ISP2 (International Streptomyces 2)
Câest un milieu de culture solide contenant comme source de carbone le glucose. Ce
milieu est habituellement utilisĂ© pour lâidentification macroscopique des souches
dâactinomycĂštes.
II.1.2.4.2. ISP4 (International Streptomyces 4)
Câest un milieu solide contenant de lâamidon soluble. Il est employĂ© pour identifier
macroscopiquement les souches dâactinomycĂštes.
II.1.2.4.3. ISP5 (International Streptomyces 5)
Câest un milieu solide contenant du glycĂ©rol. Il est aussi utilisĂ© lors de lâidentification
macroscopique des souches dâactinomycĂštes.
II.1.2.5. Milieu pour la détermination des pigments mélanoïdes et des
pigments diffusibles
II.1.2.5.1. ISP6 (International Streptomyces 6)
Câest un milieu solide Ă base de peptone utilisĂ© pour dĂ©terminer la prĂ©sence de
pigments dans les souches dâActinomycĂštes.
Matériels et méthodes
18
II.1.2.5.2. ISP7 (International Streptomyces 7)
Câest un milieu solide contenant comme source de carbone le glycĂ©rol. Il est aussi
utilisĂ© pour dĂ©terminer la prĂ©sence de pigments dans les souches dâactinomycĂštes.
II.1.2.6. Milieu pour la détermination des caractÚres biochimiques
Recherche de nitrate réductase
II.1.2.6.1. Bouillon nutritif
Câest un milieu nutritif liquide dĂ©pourvu dâagar. Ce milieu est utilisĂ© pour revivifier
les souches de microorganismes et pour rechercher la prĂ©sence dâenzyme nitrate rĂ©ductase.
II.1.2.7. Milieu pour la détermination des caractÚres physiologiques
Détermination de la température optimale de croissance
II.1.2.7.1. Sporulation Agar (SA)
Câest un milieu solide contenant de lâextrait de levure et de lâextrait de viande, il est
utilisĂ© pour dĂ©terminer la tempĂ©rature de croissance optimale des souches dâactinomycĂštes.
DĂ©termination du pH optimum
II.1.2.7.2. CYD (Casamino Acids Yeast extracts D-glucose)
Câest un milieu solide mis au point par Crawford en 1993 pour dĂ©terminer le pH
optimum de croissance des souches dâactinomycĂštes.
II.1.2.8. Milieu pour la détermination du type respiratoire
II.1.2.8.1. Viande Foie (VF)
Câest un milieu de culture riche contenant un gradient de pression partielle en
dioxygĂšne, il est utilisĂ© pour lâĂ©tude du type respiratoire d'une bactĂ©rie.
II.1.2.9. Milieu pour la détermination de la mobilité
II.1.2.9.1. MannitolâmobilitĂ©
Câest un milieu semi-solide permettant de mettre en Ă©vidence la rĂ©duction du nitrate
par les bactĂ©ries et leur mobilitĂ© Ă partir de la ligne dâensemencement.
II.1.2.10. Milieu de dénombrement : Gélose nutritive
La gélose nutritive est habituellement employée pour la culture et le dénombrement
des microorganismes ; il permet de dĂ©tecter la puretĂ© des souches ainsi que dâassurer leur
conservation.
Matériels et méthodes
19
II.1.3. Milieu pour le test de résistance des souches : bouillon nutritif
Câest un milieu nutritif liquide dĂ©pourvu dâagar. Ce milieu est utilisĂ© pour le test
lâacclimatation des souches isolĂ©es. La composition de chaque milieu est prĂ©sentĂ©e en annexe
1.
II.1.4. Appareil Chromatographique en Phase Gazeuse (CPG)
La chromatographie en phase gazeuse est une méthode de séparation de composés
susceptibles dâĂȘtre vaporisĂ©s par chauffage (sans dĂ©composition).
La séparation se fait dans une colonne soit par partage soit par adsorption. Elle
permet :
⹠la microanalyse (de ”g au mg) ;
⹠la séparation de mélanges complexes ;
âą lâanalyse qualitative et quantitative aisĂ©e ;
âą des analyses dans de nombreux domaines dâapplication
La figure 5 montre le schĂ©ma de la description dâun ensemble chromatographique,
lâappareil CPG comprend schĂ©matiquement trois (3) modules spĂ©cifiques : un injecteur (1),
une colonne contenue dans une enceinte thermostatée (four) (2) et un détecteur (3) relié à un
intégrateur ou un ordinateur (4) sur lequel apparaßt le chromatogramme.
Figure 5. SchĂ©ma de la description dâun ensemble chromatographique
1
2
3
4
Matériels et méthodes
20
II.2. METHODES
II.2.1. Quantification du polluant étudié (HAP)
Le taux des HAP dans le sol contaminé de Tsimiroro a été évalué par la méthode
Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) élaboré par Marine Environment Laboratory
(MEL) International Atomic Energy Agency en 2007 ; les Ă©tapes de lâanalyse des HAP dans
le sol contaminĂ© a Ă©tĂ© comme suit : lâĂ©chantillon du sol de Tsimiroro a Ă©tĂ© mĂ©langĂ© avec du
sulfate de sodium anhydre (Na2SO4) et avec de lâĂ©talon interne ensuite conçu Ă lâextraction
par Soxhlet continu liquide - solide en utilisant lâhexane et le dichloromĂ©thane comme solvant
puis la solution ainsi obtenu a Ă©tĂ© purifiĂ© par colonne avec du gel de silice et de lâalumine et
enfin la solution concentrée de HAP a été injecté dans le CPG pour pouvoir quantifier les
HAP présents dans le sol.
Le protocole détaillé lors du dosage des HAP par CPG est présenté en annexe 3.
La concentration des HAP présents dans le sol de Tsimiroro a été calculée par la
formule suivante :
đ¶đ¶đđ,đžđžđžđžâ =đđđžđžđžđž Ă đđđžđžđžđž Ă đđđžđžđžđž
, Ă đđđžđžđžđžâđđđžđžđžđž Ă đđđžđžđžđž Ă đđđžđžđžđž
, Ă đđđžđžđžđžâĂ
100đđđđ
đ¶đ¶m,Ech R: Concentration massique de lâĂ©chantillon đđđžđžđžđž : Masse de lâĂ©talon ; đđđžđžđžđž
, : Surface de lâĂ©talon interne de lâĂ©chantillon đđđžđžđžđžâ : Surface de lâĂ©chantillon ; đđđžđžđžđž : Surface de lâĂ©chantillon aromatique đđđžđžđžđž : Surface de lâĂ©chantillon interne ; đđđžđžđžđž
, : Masse de lâĂ©talon interne dans lâĂ©chantillon đđđžđžđžđžâ : Masse brute de lâĂ©chantillon đđđđ : Masse sĂšche.
II.2.2. Isolement des souches microbiennes
II.2.2.1. But
Le but de cette Ă©tape est dâisoler et dâavoir le maximum de souches microbiennes
contenues dans lâĂ©chantillon de sol.
II.2.2.2. Principe
Cette mĂ©thode consiste Ă isoler les souches microbiennes Ă partir de lâĂ©chantillon de
sol contaminĂ© en utilisant des milieux spĂ©cifiques additionnĂ©s dâantibiotiques.
Matériels et méthodes
21
II.2.2.3. Mode opératoire
II.2.2.3.1. Isolement des souches de Pseudomonas fluorescents
Les Pseudomonas fluorescents sont isolés et dénombrés selon la technique décrite par
King et al., (1954). Cette technique est basĂ©e sur lâobservation sous lumiĂšre ultraviolette Ă
254 nm de la pyoverdine, un pigment fluorescent qui représente la majeure partie des
sidéphores produites par ces bactéries.
Pour cela, 1 g de chaque échantillon de sol est donc pesé puis, des dilutions en cascade
(avec 9 ml de PBS) sont rĂ©alisĂ©es. Lâensemencement est effectuĂ© en surface. Les boĂźtes
ensemencĂ©es sont incubĂ©es Ă 30°C pour une durĂ©e dâincubation de 24 Ă 48 heures. Toutes les
colonies fluorescentes sont dĂ©nombrĂ©es et prĂ©levĂ©es Ă lâaide de « cure-dents » prĂ©alablement
stérilisées puis repiquées dans de nouvelles boßtes de Pétri contenant du milieu King B.
II.2.2.3.2. Isolement des souches dâactinomycĂštes
Les actinomycĂštes sont des microorganismes faciles Ă cultiver. Par ailleurs, leur
croissance lente et leur faible nombre dans les échantillons de sol sont souvent masqués par
les bactĂ©ries et les champignons Ă croissance rapide lors de lâisolement. Par consĂ©quent,
lâutilisation dâun milieu spĂ©cifique (AS1) additionnĂ© dâantibiotiques combinĂ© Ă des
traitements des Ă©chantillons de sol facilite lâisolement de ces groupes de microorganismes. Un
prĂ©traitement des Ă©chantillons de sol est entrepris avant lâisolement.
a. Prétraitement des échantillons de sol
Une semaine avant leur utilisation, les échantillons de sol sont distribués dans des
boßtes de Pétri stériles et laissés dans un dessiccateur sous vide contenant du silicagel qui
absorbe lâhumiditĂ©. Cette Ă©tape prĂ©liminaire permet de sĂ©lectionner les actinomycĂštes dans
lâĂ©chantillon de sol.
b. Préparation de la solution de dilution et ensemencement du milieu
Un (1) gramme de sol est diluĂ© dans 9 ml dâEDS puis agitĂ© au vortex deux fois
pendant 5 min ; cette suspension constitue la dilution 10-1.
Une sĂ©rie de dilutions dĂ©cimales (jusquâĂ 10-3) est effectuĂ©e pour chaque Ă©chantillon.
Le milieu est ensemencé en surface à raison de 0,1 ml par dilution par boßte de Pétri. Les
boßtes de Pétri sont incubées à 30°C et observées quotidiennement pendant une durée de 4
semaines.
Matériels et méthodes
22
Les colonies dâactinomycĂštes sont repĂ©rĂ©es par leur aspect macroscopique
caractéristique (colonies dures incrustées dans la gélose). La pureté des souches
dâactinomycĂštes est vĂ©rifiĂ©e par repiquages successifs sur de nouveaux milieux AS1 sans
antibiotiques.
II.2.2.3.3. Isolement de la flore totale cultivable
La flore totale est constituée, en grande partie, par des bactéries qui peuvent se
développer sur le milieu TSA (Triptic Soy Agar).
A lâaide dâune pipette stĂ©rile, 0,1 ml de chaque dilution dĂ©cimale 10-1 Ă 10-4 sont
ensemencĂ©s sur milieu TSA. La culture est incubĂ©e Ă lâobscuritĂ© Ă 28°C. La lecture est faite
aprĂšs 24 heures, 48 heures et 72 heures dâincubation et toutes les colonies formĂ©es sont
repiquées dans des boßtes de Pétri contenant du milieu TSA pour la purification.
II.2.3. Conservation des souches
Une colonie de chaque isolat est cultivée sur milieu King B liquide pour les
Pseudomonas, sur milieu TSA pour la flore totale cultivable et sur un milieu AS1 liquide pour
les ActinomycÚtes. Ces cultures en milieu liquide sont ensuite incubées à 30°C dans un bain
marie avec agitation pendant 24 heures pour les Pseudomonas et la flore totale cultivable et
pendant 4 Ă 7 jours pour les actinomycĂštes.
Un millilitre (1 ml) de chaque culture est prĂ©levĂ© par la suite Ă lâaide dâune
micropipette stérile et introduit dans un cryotube stérile contenant 1 ml de glycérol à 20%
(V/V) stĂ©rilisĂ©e Ă lâautoclave Ă la tempĂ©rature 121°C pendant 20 min et Ă une pression de 1,5
bar (Isik et al., 1999). Les cryotubes contenant la culture ont été conservés dans le congélateur
à -80°C.
II.2.4. Test de résistance des souches isolées
II.2.4.1. But
Le but de cette partie étant de sélectionner des souches jugées comme étant résistantes
et efficientes aprĂšs leur soumission volontaire dans une condition extrĂȘme de stress (milieux
de croissance dopés par des polluants).
II.2.4.2. Principe
Une quantité connue de population microbienne a été inoculée dans un milieu de
culture synthétique préalablement pollué par une quantité connue de mélange de HAP. Le
comportement des microorganismes à se développer dans de tel milieu est mis en évidence
Matériels et méthodes
23
ainsi que leur intĂ©rĂȘt Ă utiliser les carbones des polluants comme source dâĂ©nergie et de
carbone pour leur métabolisme.
II.2.4.3. Mode opératoire
II.2.4.3.1. PrĂ©paration dâune solution mĂšre de HAP
Des mélanges de 100 mg de chaque HAP (NaphtalÚne, AcénaphtÚne, FluorÚne,
PhénanthrÚne, AnthracÚne, FluoranthÚne, PyrÚne, Benzo(a) anthracÚne) sont dissous dans 25
ml de solvant acĂ©tone. La concentration en ÎŁ8HAP correspondante est ensuite calculĂ©e, câest-
Ă -dire : 800 mg dans 25 ml soit 32000 mg/L (ou 32000 ppm).
La concentration correspondante à chacun des HAP est donnée en annexe 2.
II.2.4.3.2. Criblages des souches résistantes
Différentes concentrations de solution de HAP (250 mg/L ; 500 mg/L ; 1000 mg/L ;
1500 mg/L) sont préparées à partir de la solution mÚre. Pour chaque concentration, un volume
de solution de HAP est versé dans des tubes préalablement stériles puis laissés pendant 12
heures sous hotte. Ceci permet lâĂ©vaporation complĂšte du solvant utilisĂ©. Dix millilitres (10
ml) de bouillon nutritif sont ensuite ajoutés et le mélange est vortexé pendant quelques
secondes. Une suspension microbienne de 100 ”l (qui correspond à 109 UFC/ml) est
additionnée et le mélange est incubé à 30°C sur un agitateur orbital à une vitesse de 150
rpm/s.
II.2.4.3.3. Dénombrement des bactéries
La croissance microbienne a été suivie pendant 10 à 65 jours selon la méthode de
Nombre les Plus Probables (NPP) (Rattanasomboon et al., 1999). A des intervalles de temps
qui dépendent de la croissance des souches, 1 ml de chaque culture ou de chaque dilution
décimale est ensemencé en profondeur sur milieu TSA avec trois répétitions. La culture est
incubée dans une étuve à 28°C pendant 24 à 48 heures et toutes les colonies formées sont
dénombrées.
II.2.4.3.4. Méthode de dénombrement
Le dénombrement consiste à compter les colonies présentes sur les boites en Unité
Formant Colonie (UFC). Le comptage se fait macroscopiquement. En tenant compte des
caractéristiques des colonies sur son milieu approprié, seules les boites ayant 30 à 300 UFC
sont retenues.
Matériels et méthodes
24
Le nombre dâUnitĂ© Formant Colonie est dĂ©terminĂ© selon la formule :
đ”đ” =đȘđȘđđ + đȘđȘđđ
đœđœ(đđđđ + đđ,đđđđđđ)đ đ
đ¶đ¶1 + đ¶đ¶2 : Somme de toutes les colonies apparues sur les deux boites retenues ;
đđ : Volume de lâinoculum appliquĂ© Ă chaque boite ;
đđ : Taux de dilution correspondant Ă la premiĂšre dilution retenue ;
đđ1 : Nombre de boĂźtes retenues Ă la premiĂšre dilution ;
đđ2 : Nombre de boĂźtes retenues Ă la deuxiĂšme dilution.
II.2.5. Identification des souches sélectionnées
II.2.5.1. Identification de la flore totale cultivable
Lâidentification des souches actives est effectuĂ©e avec une culture pure. Elle comporte
un certain nombre dâĂ©tapes suivant un ordre dĂ©terminĂ©. Câest ainsi que lâidentification des
bactéries comprend généralement :
âą lâĂ©tude des caractĂšres culturaux ;
âą lâĂ©tude des caractĂšres morphologiques et structuraux ;
âą lâĂ©tude des caractĂšres physiologiques ;
âą lâĂ©tude des caractĂšres biochimiques.
II.2.5.1.1. Etude des caractĂšres culturaux
LâĂ©tude des caractĂšres culturaux permet dâobserver macroscopiquement lâaspect des
colonies (forme, taille, couleur, âŠ) cultivĂ©es sur milieu solide TSA et lâaspect de la culture
cultivée sur milieu liquide (bouillon nutritif).
II.2.5.1.2. Etude des caractĂšres morphologiques et structuraux
Cette étude permet en général de différencier la morphologie, la mobilité, le mode de
groupement et éventuellement la mode de reproduction végétative de la souche bactérienne.
La mise en évidence de ces caractÚres est réalisée grùce à une étude microscopique des
bactĂ©ries qui comprend un examen Ă lâĂ©tat frais (Marchal, 1985) et un examen aprĂšs fixation
et coloration de frottis (Marchal, 1985 ; Singleton, 1999).
II.2.5.1.3. Etude des caractĂšres physiologiques
Cette étude permet de déterminer le comportement des bactéries vis-à -vis de certains
facteurs du milieu (tempĂ©rature, enzymes respiratoires,âŠ).
Matériels et méthodes
25
a. Mise en Ă©vidence des enzymes respiratoires
Test de catalase (SINGLETON, 1999; GASSER F, 1989)
Certaines bactĂ©ries peuvent dĂ©grader le peroxyde dâhydrogĂšne en eau et en oxygĂšne
molĂ©culaire par production dâun enzyme appelĂ© catalase selon la rĂ©action :
2H2O2 2H2O + O2
Peroxyde dâhydrogĂšne Eau oxygĂšne
moléculaire
Pour le mettre en Ă©vidence, la souche est mise en contact avec une solution fraĂźche de
peroxyde dâhydrogĂšne Ă 10 volumes. Un dĂ©gagement gazeux abondant sous forme de mousse
ou de bulles traduit la dĂ©composition de peroxyde dâhydrogĂšne sous lâaction de la catalase.
Test de peroxydase (Singleton, 1999; Gasser, 1989)
Ce test consiste Ă dĂ©terminer la prĂ©sence ou non dâun type de cytochrome dans la
chaĂźne respiratoire dâune bactĂ©rie. Pour cela, 1 ml de mĂ©lange Ă partie Ă©gale dâune solution de
benzidine Ă 1% dans lâacide acĂ©tique N et de lâeau oxygĂ©nĂ©e Ă 1% est ajoutĂ© dans une culture
bactérienne sur bouillon nutritif de 24 heures. Une coloration bleu-noir survenant
immédiatement traduit la présence de peroxydase dans le systÚme enzymatique du germe.
b. Influence de la température (Singleton, 1999)
Les microorganismes selon les espÚces peuvent se développer dans un large intervalle
de tempĂ©rature. LâĂ©tude consiste Ă incuber la souche Ă Ă©tudier Ă diffĂ©rentes tempĂ©ratures, les
autres paramĂštres Ă©tant maintenus constants. Les tempĂ©ratures dâincubation sont : 4°C â 8 °C
â 15 °C â 30 °C 37 °C et 45 °C. La croissance bactĂ©rienne apprĂ©ciĂ©e par la turbiditĂ© du milieu
est observée tous les jours.
II.2.5.1.4. Etude des caractĂšres biochimiques
Cette étude permet de distinguer différents genre ou espÚces bactériens en se basant
sur la différence de métabolisme.
Galerie LEMINOR
La galerie LEMINOR permet de :
âą dĂ©terminer lâĂ©quipement enzymatique du genre ;
⹠étudier la fermentation des sucres par les bactéries ;
⹠caractériser les réactions cataboliques.
Catalase
Matériels et méthodes
26
Elle est rĂ©alisĂ©e Ă partir dâune colonie bactĂ©rienne prĂ©levĂ©e Ă partir dâune culture pure.
Cette colonie est homogĂ©nĂ©isĂ©e dans un tube de 10 ml dâeau distillĂ©e stĂ©rile.
Les modalitĂ©s dâensemencement, de lecture et dâinterprĂ©tation de la galerie LEMINOR
sont résumées dans le tableau 5 qui suit.
Tableau 5. ModalitĂ© dâensemencement, de lecture et dâinterprĂ©tation de la galerie
LEMINOR
Milieu Ensemencement Lecture aprÚs incubation 24 heures à 30°C Réaction + Réaction -
Mannitol Mobilité Nitrate
Piqûre centrale
Virage au jaune Diffusion de la culture
Précipité rouge aprÚs ajout de réactif de Griess : nitrate +
Pas de virage Pas de diffusion de culture
Pas de précipité aprÚs ajout de réactif de Griess: nitrate -
Hajna Kligler
Pente en stries
ascendantes et piqûre centrale
Culot jaune : glucose + Pente jaune : lactose +
Présence de bulles : gaz + Présence de précipité noir :
bactérie H2S +
Culot rouge : glucose â Pente rouge : lactose â
Absence de bulles : gaz â Absence de prĂ©cipitĂ© noir :
bactérie H2S - Lysine
Fer
Pente en stries ascendantes et piqûre
centrale
Culot jaune : LDC â Pente jaune : LDA +
Culot violet : LDC + Pente violette : LDA -
Citrate de Simmons
Pente en stries ascendantes Virage au bleu Pas de virage
Urée
indole
Quelques gouttes de suspension
bactérienne dans 1 ml du milieu
Virage au rouge : urĂ©ase + Formation dâun anneau rouge Ă la surface aprĂšs ajout de rĂ©actif
de Kovacs : indole +
Pas de virage : urĂ©ase â Pas dâanneau aprĂšs ajout de
rĂ©actif de Kovacs : indole â
+ : positif LDC : lysine dĂ©carboxylase H2S:sulfure dâhydrogĂšne â: nĂ©gatif LDA : lysine dĂ©saminase
II.2.5.2. Etude phĂ©notypique de la souche dâactinomycĂšte
Lâidentification de la souche dâactinomycĂšte par Ă©tude phĂ©notypique nĂ©cessite lâĂ©tude
des différents caractÚres de la souche tels que les caractÚres culturaux, les caractÚres
morphologiques, les caractĂšres physiologiques et les caractĂšres biochimiques.
II.2.5.2.1. Etude des caractĂšres culturaux
Cette Ă©tude permet dâobserver macroscopiquement lâaspect des colonies sur milieu
solide. Les caractÚres culturaux sont déterminés sur des milieux de culture spécifiques : ISP2,
ISP4, ISP5 (Shriling et Gottlieb, 1966), le milieu AS1, le milieu Amidon-Caséine agar, le
milieu Nutrient agar, et le milieu sporulation agar. Lâinoculum prĂ©parĂ© prĂ©cĂ©demment est
ensemencĂ© en stries sur ces diffĂ©rents milieux. Lâimportance de la croissance, le
Matériels et méthodes
27
développement du mycélium de substrat et du mycélium aérien ainsi que la recherche de la
présence des pigments diffusibles dans la gélose autres que les pigments mélanoides, sur
chaque milieu sont notĂ©s aprĂšs 07, 14 et 21 jours dâincubation Ă 30°C.
II.2.5.2.2.Etude des caractĂšres morphologiques
Technique de culture sur lamelle (Cross, 1989)
Cette Ă©tude consiste en lâobservation microscopique de la morphologie des spores, du
mycĂ©lium de substrat et du mycĂ©lium aĂ©rien dâune culture de souches dâactinomycĂštes sur
lamelle. Une lamelle stérile est insérée délicatement dans un milieu gélosé (ISP2), de maniÚre
Ă former un angle dâenviron 45°. Une goutte de lâinoculum est dĂ©posĂ©e contre la lamelle en
contact avec le milieu. AprĂšs 14 jours dâincubation Ă 30°C, la lamelle est retirĂ©e
soigneusement de la gĂ©lose, dĂ©posĂ©e sur une lame et examinĂ©e au microscope Ă immersion Ă
lâobjectif x 100.
II.2.5.2.3. Etude des caractĂšres physiologiques
LâĂ©tude des caractĂšres physiologiques permet de dĂ©celer le comportement des
bactĂ©ries vis-Ă -vis de certains facteurs de milieu (tempĂ©rature, pH, tolĂ©rance en sel,âŠ). Pour
la détermination de la température optimale, la croissance est estimée aprÚs 21 jours
dâincubation Ă 5°C, 15°C, 20°C, 30°C, 37°C, 45°C et 55°C. Le pH optimum de croissance a
été étudié sur milieu CYD tamponné à différents pH (Crawford et al., 1993). La tolérance
maximale au Na Cl est réalisée sur milieu AS1 (Tresner et al., 1968). Le type respiratoire se
fait sur milieu viande-foie (VF) selon la méthode décrite par Guiraud en 1998. La
détermination de la mobilité des actinomycÚtes a été réalisée sur milieu mannitol-mobilité
(Guiraud, 1998). La mise en évidence des pigments mélanoides produits par les souches
représentatives est réalisée sur les milieux ISP6 et ISP7 en gélose inclinée (Shirling et
Gottlieb, 1966 ; Mochevaetal.,2002).
II.2.5.2.4. Etude des caractĂšres biochimiques
Cette Ă©tude permet de distinguer diffĂ©rents genres ou espĂšces dâactinomycĂštes en se
basant sur la diffĂ©rence de mĂ©tabolisme. Elle est basĂ©e sur la recherche de lâenzyme la
catalase, la recherche de lâurĂ©ase et de la production dâindole, lâhydrolyse de la casĂ©ine
(Williams et Cross, 1971 ; Gordon et Smith, 1953) et lâhydrolyse de lâamidon (Gordon et
Smith, 1953) et la fermentation des différentes sucres selon la méthode décrite par Pridham et
Gottlieb en 1948.
Matériels et méthodes
28
II.2.6. Dosage des HAP résiduels
II.2.6.1. Quantification des HAP résiduels
Dans cette étape, seules les souches résistantes à la solution des HAP à la
concentration de 1500 mg/L sont Ă considĂ©rer. Pour cela, le mĂȘme protocole que dans la
deuxiÚme étape est appliqué. Un milieu liquide propre sans HAP et sans microorganismes est
réservé pour servir de témoin négatif.
A chaque prélÚvement, la suspension bactérienne (ainsi que le blanc) est filtrée en
utilisant du papier filtre en fibre de verre. Le filtrat ainsi obtenu est ensuite utilisé pour
lâextraction des HAP rĂ©siduels.
Cette extraction se déroule en 2 étapes :
⹠Extraction des HAP résiduel : le filtrat additionné de trois volumes égaux de solvant
dâextraction (acĂ©tate dâĂ©thyle) sont versĂ©s dans une ampoule Ă dĂ©canter de 100 ml et
agités vigoureusement pendant au moins 5 min puis laisser décanter pendant 15 min.
La phase organique est récupérée dans un ballon à fond rond de 100 ml.
âą PrĂ©-concentration : Lâextrait est Ă©vaporĂ© Ă lâaide dâun Ă©vaporateur rotatif jusquâĂ
obtenir un volume de 2 ml environ. Puis lâextrait est Ă©vaporĂ© de nouveau avec un flux
dâazote pour obtenir exactement un volume final de 0,5 ml. Lâextrait final est transfĂ©rĂ©
Ă lâaide dâune micro-seringue en verre dans un tube de 1,5 ml de contenance puis
passé à la GC et quantifié, il est ensuite conservé au congélateur.
RĂ©sultats
RESULTATS
RĂ©sultats
29
III.1. TAUX DES HAP DANS LâECHANTILLON DU SOL CONTAMINE Lâanalyse chromatographique en phase gazeuse (CPG) de lâĂ©chantillon de sol de
Tsimiroro a permis de mettre en évidence la présence de quatorze (14) HAP composé de
naphtalÚne, acénaphtylÚne, acénaphtÚne, fluorÚne, phénanthrÚne, anthracÚne, fluoranthÚne,
pyrĂšne, benzo[a]anthracĂšne, chrysĂšne benzo[b]fluoranthĂšne, benzo[k]fluoranthĂšne, benzo[a]
pyrĂšne, dibenzo[a,h]anthracĂšne.
Le tableau 6 suivant montre les différents HAP et leurs concentrations présentes dans
lâĂ©chantillon de sol de Tsimiroro aprĂšs le dosage chromatographique :
Tableau 6. Les différents HAP présents dans le sol de Tsimororo
N° Noms des composés Formule brute
Nombre de cycle
Concentration (mg/kg)
1 NaphtalÚne C10H8 2 2,985 2 AcénaphtylÚne C12H8 3 1,436 3 AcénaphtÚne C10H10 3 0,002 4 FluorÚne C13H10 3 0,765 5 PhénanthrÚne C14H10 3 0,374 6 AnthracÚne C14H10 3 0,418 7 FluoranthÚne C16H10 4 0,105 8 PyrÚne C16H10 4 0,247 9 Benzo[a]anthracÚne C18H12 4 0,156
10 ChrysĂšne C18H12 4 3,805 11 Benzo[b]fluoranthĂšne C20H12 5 0,649 12 Benzo[k]fluoranthĂšne C20H12 5 1,755 13 Benzo[a] pyrĂšne C20H12 5 0,983 14 Dibenzo[a,h]anthracĂšne C22H14 5 0,251
III.2. ISOLEMENT DES SOUCHES MICROBIENNES Vingt-six (26) souches microbiennes ont été isolées à partir de sol pollué par les
hydrocarbures dans un site industriel dâun grand gisement dâhuile lourde de Tsimiroro dont
quatre (4) Pseudomonas fluorescents (numérotées de P1 à P4), dix (10) actinomycÚtes
(numĂ©rotĂ©es dâA1 Ă A10) et douze (12) flores totales cultivables (numĂ©rotĂ©es de F1 Ă F12).
Les isolats de Pseudomonas fluorescents sont reconnaissables par le reflet dâun
pigment fluorescent sous la lumiĂšre ultraviolette de longueur dâonde 254 nm (photo 1).
RĂ©sultats
30
Photo 1. Souches pures de Pseudomonas fluorescents sur le milieu King B
Les souches dâactinomycĂštes isolĂ©es sont morphologiquement identiques câest-Ă -dire les
colonies sont opaques, de forme arrondie, de petite taille, à bords irréguliers et incrustées dans
le milieu de culture. Les souches se différencient par la couleur du mycélium aérien et celle
du mycélium végétatif, leurs tailles et la production de pigments (photo 2).
Souche dâactinomycĂšte Souche pure dâactinomycĂšte Souches dâactinomycĂštes produisant des pigments sur milieu AS1 de diffĂ©rents couleurs
Photo 2. VariĂ©tĂ©s des souches dâactinomycĂštes isolĂ©es sur milieu AS1
III.3. TEST DE RESISTANCE DES SOUCHES ISOLEES Les résultats des tests de résistance ont montré que parmi les 26 souches, seulement
deux souches (codĂ©es A1 et F2) sont rĂ©sistantes au milieu hautement contaminĂ©. Câest-Ă -dire
que ces souches ont de la capacité de se développer en milieu contaminé par les HAP
(ÎŁ8HAP) Ă une teneur de 1500 mg/L. Les dĂ©nombrements des colonies sâeffectuent
réguliÚrement; le temps de prélÚvement dépend de la croissance de chaque souche étudiée.
Les résultats ont montré que la population microbienne augmente au cours de
lâexpĂ©rience. Pour la souche F2, il y a augmentation rapide de la population microbienne du
dĂ©but de lâexpĂ©rience jusquâĂ 12Ăšme jours dâincubation. La croissance se stabilise au 20Ăšme jour
jusquâĂ 45Ăšme jour. Par contre, la souche A1 croit progressivement au cours de test. Les
RĂ©sultats
31
tableaux ci-dessous présentent les résultats de dénombrement de la souche A1 et de la souche
F2 pour chaque temps de prélÚvement en milieu contaminé par les HAP 1500 mg/L.
Tableau 7. Dénombrement de colonies de la souche A1 à chaque temps de prélÚvement sur
milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L
DurĂ©e dâincubation (en jours)
DĂ©nombrement 1j 7j 15j 27j 34j 48j 55j 62j
A1 (UFC/ml) 4,2.108 8,9.108 2,6.109 3,5.109 5,3.109 8.108 4,5.108 4,7.107
Tableau 8. Dénombrement de colonies de la souche F2 à chaque temps de prélÚvement sur
milieu bouillon nutritif mélangé avec les HAP 1500 mg/L
DurĂ©e dâincubation (en jours)
DĂ©nombrement 1 j 4 j 7 j 12 j 20 j 25 j 32 j 39 j 45 j
F2 (UFC/ml) 1,4.108 9,1.109 5,3.1010 6,1.1010 7,6.109 7,6.109 109 6,8.108 2,5.108
III.4. IDENTIFICATION DES SOUCHES SELECTIONNEES Ces deux souches ont fait lâobjet dâune identification culturales, morphologiques,
physiologiques et biochimiques.
II.4.1. Identification de la souche A1
Lâensemble des caractĂšres culturaux, morphologiques ainsi que les caractĂšres
physiologiques et biochimiques étudiées de la souche A1 a permis de classer les souches dans
le genre Streptomyces. En se rĂ©fĂ©rant Ă la 9Ăšme Ă©dition du Manuel de Bergey, lâisolat A1 se
rapproche Ă lâespĂšce Streptomyces sp.
Les caractĂšres culturaux, morphologiques, physiologiques et biochimiques de cette
souche sont donnés dans les tableaux ci- aprÚs.
RĂ©sultats
32
Tableau 9. CaractĂ©ristiques culturales de la souche dâactinomycĂšte A1
ISOLAT A1 :
Milieux Croissance Sporulation Mycelium de substrat
Mycelium aérien
Pigment diffusible
ISP2 ++ + brunĂątre blanc - ISP4 ++ + brunĂątre blanc - ISP5 ++ + brunĂątre blanc -
Nutrient agar - - - - - AS1 +++ + Brun blanc - SCA +++ + Blanc blanc -
Sporulation agar ++ + Brun blanc -
Tableau 10. CaractĂšres morphologiques, physiologiques et biochimiques de la souche A1
Caractéristiques Isolat
Caractéristiques Isolat
A1 A1 Production de pigment
mélanoïde : Température de croissance:
ISP6 - 4°C - ISP7 + 15°C ++
ActivitĂ© enzymatique : 20°C +++ Hydrolyse de lâamidon + 30°C +++ Hydrolyse de casĂ©ine + 37°C ++
Catalase + 44°C - Uréase - Croissance à pH:
Coagulation du lait écrémé + 3,3 - Peptonisation du lait écrémé - 5,3 ++
Production dâindole - 7,3 +++
Type respiratoire AĂ©robie
strict 9,3 +++
Mobilité - 12,3 - Tolérance en NaCl: Source de carbone:
0% + Mannitol - 1% +++ Glucose + 3% ++ Galactose + 5% - Tréhalose - 7% - Maltose + 9% - Arabinose -
10% - Dulcitol + Saccharose + Rhamnose -
- : négatif, inhibition de la croissance / + : positif, croissance faible / ++ : croissance
modérée +++ : croissance abondante
RĂ©sultats
33
III.4.2. Identification de la souche F2
LâĂ©tude des caractĂ©ristiques culturales, morphologiques, physiologiques et biochimiques a
permis de rapprocher la souche F2 Ă lâespĂšce Bacillus simplex. Les caractĂšres culturaux,
morphologiques, physiologiques et biochimiques de ces trois souches sont donnés dans les
tableaux ci- aprĂšs.
Tableau 11. CaractĂšre culturaux, morphologiques et physiologiques de la souche F2
Souches Test F2
CaractĂšres culturaux
Croissance : rapide Couleur : crĂšme
Surface et texture : brillante Contour : irrégulier
Hauteur: lĂ©gĂšrement surĂ©levĂ© DiamĂštre: 3- 6 m aprĂšs 2 jours dâincubation
CaractĂšres morphologiques
Gram + Bacille
0,7 -0,9 ”m de diamÚtre Mobile
CaractÚre physiologiques Influence de la Température
4 °C - 8 °C +
20 °C ++ 30 °C +++ 37 °C ++ 45 °C -
pH 7 Enzymes respiratoires Catalase +
- : négatif + : croissance faible ++ : croissance moyenne+++ : croissance abondante
Tableau 12. CaractĂšre biochimiques de la souche F2
Souches Milieu F2
Utilisation des sucres :
L-arabinose + Fructose +
Milieu urée indole
Uréase - Xylose + Indole - Raffinose +
SIMMONS Citrate perméase + Ribose +
Mannitol mobilité nitrate
Mannitol + Sucrose + Mobilité Mobile Trehalose + Nitrate
réductase + Sorbitol +
Lysine -fer LDA - D-xylose - LDC - Rahmnose -
Hajna-Kligler
Glucose + D-manose - Lactose + D-arabinose -
H2S - Cellulose - Gaz +
- : réaction négative / + : réaction positive
RĂ©sultats
34
III.5. RENDEMENT DâELIMINATION DE CHAQUE HAP Les genres Streptomyces sp. et Bacillus qui ont Ă©tĂ© identifiĂ©es, sont utilisĂ©s pour le
dosage des HAP résiduels dans le milieu de culture mélangé avec les HAP à la concentration
de 1500 mg/L. Chaque souche est étudiée séparément. Les suivis des concentrations
sâeffectuent rĂ©guliĂšrement, le temps de prĂ©lĂšvement dĂ©pend de lâĂ©tat dâĂ©volution de
concentration en HAP dans le milieu lors de lâincubation. Si la dĂ©gradation est rapide, les
prĂ©lĂšvements ont Ă©tĂ© effectuĂ©s Ă des intervalles de temps courts et Ă lâinverse, si la
dégradation est modeste, les prélÚvements sont effectués toutes les semaines ou tous les dix
jours. Le tableau ci-dessous prĂ©sente les rendements dâĂ©limination de chaque HAP pour
chaque temps de prélÚvement. Pour mieux visualiser les résultats, ces données sont présentées
en forme de graphe (figure 6 et figure 7).
Tableau 13. Rendement dâĂ©limination des HAP en pourcentage (%) pour chaque durĂ©e
dâĂ©limination
Pourcentage dâĂ©limination (%) des HAP en fonction de leur durĂ©e dâincubation (en jours)
Streptomyces sp. (A1)
HAP 0j 1j 7j 18j 28j 45j 51j 58j 62j 75j
NaphtalĂšne 0 23,74 50,33 62,24 75,32 73,15 69,12 80,32 83,79 85,38
AcénaphtÚne 0 13,50 34,55 46,23 68,29 71,44 70,43 77,65 80,10 82,36
FluorĂšne 0 19,11 41,18 45,66 52,73 57,26 48,32 65,25 68,51 73,27
PhénanthrÚne 0 21,42 49,31 53,60 69,99 73,22 68,45 70,95 74,98 76,19
AnthracĂšne 0 15,33 29,61 50,33 55,91 61,22 51,47 61,26 66,59 71,86
FluoranthĂšne 0 0 3,76 17,33 31,44 34,15 33,23 36,17 38,55 40,17
PyrĂšne 0 0 2,79 15,12 32,75 30,41 29,36 42,13 47,56 50,28
Benzo(a)anthracĂšne 0 0 1,32 10,24 27,40 29,12 26,48 27,68 30,31 32,42
Bacillus simplex (F2)
HAP 0j 1j 7j 15j 25j 46j 53j 59j 63j 72j
NaphtalĂšne (2) 0 0 6,45 68,59 74,41 78,74 82,15 86,35 91,63 95,32
AcénaphtÚne (3) 0 0 4,21 39,20 48,61 60,32 64,26 70,13 74,29 78,41
FluorĂšne (3) 0 0 5,22 47,76 61 ,02 65,44 72,09 78,56 80,63 83,45
PhénanthrÚne (3) 0 0 8,73 55,39 72,52 81,11 85,90 89,31 88,30 86,66
AnthracĂšne (3) 0 0 7,22 72,31 76,22 79,16 82,19 84,72 86,1 89,31
FluoranthĂšne (4) 0 0 2,30 26,22 32,44 47,31 50,88 51,25 52,38 54,22
PyrĂšne (4) 0 0 3,71 31,66 40,21 50,23 52,16 54,19 56,33 58,37
Benzo(a)anthracĂšne 0 0 1,97 12,65 19,95 24,63 31,44 36,79 40,36 45,21
RĂ©sultats
35
La figure 6 prĂ©sente lâĂ©volution de rendement dâĂ©limination des 8 HAP par le
Streptomyces sp. en fonction de la durĂ©e dâincubation. Le rendement dâĂ©limination augmente
linĂ©airement au dĂ©but de lâexpĂ©rience jusquâĂ 28Ăšme jours dâincubation pour les 8 HAP puis la
dégradation semble moins vite, la courbe semble atteint le plateau au bout de 75 jours
dâincubation. Cette espĂšce dĂ©grade plus efficacement et plus rapidement les HAP lĂ©gers : le
naphtalĂšne, lâacĂ©naphtĂšne, le fluorĂšne, le phĂ©nanthrĂšne et lâanthracĂšne (cycles aromatiques â€
3) que les HAP lourds (le fluoranthÚne, le pyrÚne et le benzo(a)anthracÚne). Ces résultats
montrent que Streptomyces sp. est une espĂšce potentielle pour Ă©liminer les HAP dans le
milieu de culture.
Figure 6. Rendement dâĂ©limination de huit HAP en pourcentage (%) en fonction de
durĂ©e dâincubation pour lâespĂšce Streptomyces sp.
La figure 7 ci-dessous prĂ©sente le pourcentage dâĂ©limination des 8 HAP par Bacillus
simplex en fonction de la durĂ©e dâincubation. Des rĂ©sultats similaires que prĂ©cĂ©demment ont
été observés. Cette espÚce de Bacillus simplex élimine plus facilement les HAP composés de
cycles aromatiques †3 que les HAP lourds. Cependant, le Bacillus simplex dégrade le
naphtalĂšne et lâanthracĂšne plus rapidement que les autres HAP.
En Ă©gard aux rĂ©sultats obtenus, lâespĂšce de Bacillus simplex semble pouvoir dĂ©grader
ces HAP plus vite que lâespĂšce de Streptomyces sp.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 1 7 18 28 45 51 58 62 75
Pour
cent
age
d'Ă©l
imin
atio
n (%
)
Durée d'incubation (jours)
NaphtalĂšne
AcénaphtÚne
FluorĂšne
PhénanthrÚne
AntrhacĂšne
FluorenthĂšne
PyrĂšne
Benzo(a)anthracĂšne
RĂ©sultats
36
Figure 7. Rendement dâĂ©limination de huit HAP en pourcentage (%) en fonction de
durĂ©e dâincubation pour lâespĂšce Bacillus simplex
0
20
40
60
80
100
120
0 1 7 15 25 46 53 59 63 72
Pour
cent
age d
'Ă©lim
inat
ion
(%)
Durée d'incubation (jours)
NaphtalĂšne
AcénaphtÚne
FluorĂšne
PhénanthrÚne
AntrhacĂšne
FluorenthĂšne
PyrĂšne
Benzo(a)anthracĂšne
Discussions
DISCUSSIONS
Discussions
37
DISCUSSIONS
Lâobjectif de cette Ă©tude Ă©tait (i) de sĂ©lectionner les souches rĂ©sistantes Ă une gamme
croissante de concentration de mélange HAP étudiés dans des milieux de culture spécifique et
(ii) de suivre la cinĂ©tique de dĂ©gradation des polluants en mettant en Ćuvre diffĂ©rents
microorganismes sélectionnés.
Dans la premiĂšre partie de lâĂ©tude dont les activitĂ©s visent principalement Ă
sélectionner des souches jugées comme étant résistantes et efficientes aprÚs leur soumission
volontaire Ă une condition extrĂȘme de stress (milieux de croissance dopĂ©s par des polluants).
Pour y parvenir, plusieurs étapes de travaux ont été poursuivies.
Diverses espÚces de microorganismes (bactéries, champignons) ont été identifiées
comme Ă©tant capable de dĂ©grader ces composĂ©s mais dâune façon limitĂ©e. Dans notre Ă©tude,
trois (3) groupes de microorganismes (le genre Pseudomonas, les actinomycĂštes et la flore
totale cultivable) ont été isolés à partir de sol pollué par les hydrocarbures. Ces trois types de
microorganismes ont déjà été rapportés comme étant capables de dégrader les HAP dans le
sol (Kurkela et al., 1988; Simon et al., 1993; Mahmoud et Rama, 1993 ; Yang et al., 1994).
Lâisolement des microorganismes rhizosphĂ©riques nĂ©cessite des techniques permettant
dâobtenir un nombre considĂ©rable des isolats Ă partir de sol polluĂ© par les hydrocarbures. A
cette fin, lâutilisation des mĂ©thodes dâisolement sĂ©lectives a Ă©tĂ© une Ă©tape cruciale.
Lâisolement sĂ©lectif des microorganismes nâest pas exactement facile pour les souches
dâactinomycĂštes. Les substrats apportĂ©s par les produits utilisĂ©s pour le milieu favorisent non
seulement la croissance des actinomycĂštes mais aussi dâautres bactĂ©ries Ă croissance rapide et
des champignons. De ce fait, la prĂ©sence de ces derniers empĂȘche un isolement facile des
actinomycÚtes qui ont un temps de génération relativement long (Williams et al., 1982;
Crawford et al.,1993). Lâutilisation de milieu contenant de la chitine, de lâamidon, de
lâarginine, de lâasparagine, de la casĂ©ine conduit Ă un isolement sĂ©lectif des actinomycĂštes
alors que la croissance des bactéries et des champignons est faible (Williams et Davies, 1965).
Ce qui explique le choix du milieu AS1 pour lâisolement, ce milieu contient de
lâamidon, de lâarginine et de lâasparagine. LâAS1 est surtout utilisĂ© pour lâisolement des
souches dâActinomycĂštes telluriques. Il a Ă©tĂ© utilisĂ© par le Laboratoire de Daw Agro Sciences
(DAS) pour lâisolement des souches dâactinomycĂštes Ă partir du sol.
Les techniques dâisolement utilisĂ©es consistent en un prĂ©traitement par la chaleur de
lââĂ©chantillon et Ă lâaddition dans le milieu dâisolement, dâantibiotiques inhibant la croissance
Discussions
38
de germes envahisseurs (Larpent et Sanglier, 1989; Ouhdouche et al., 2001; Hilali et al.,
2002 ; Jung Yeoplee, 2002). Cependant, lâutilisation dâantibiotiques lors de lâisolement est un
sujet controversé. Certains auteurs pensent que les antibiotiques inhibent beaucoup
dâactinomycĂštes (Porter et al., 1960) et dâautres au contraire suggĂšrent lâemploi dâun mĂ©lange
antifongique et antibactérien (Dulaney et al.,1955 ; Williams et Davies ,1965).
Dans cette Ă©tude, trois (3) antibiotiques ont Ă©tĂ© utilisĂ©s : lâacide nalidixique qui permet
lâĂ©limination des bactĂ©ries Ă Gram nĂ©gatif selon Suzuki et al. (1999). Les actinomycĂštes
peuvent rĂ©sister Ă lâacide nalidixique jusquâĂ une concentration de 10 ÎŒg/ml. La
triméthoprime quant à elle, inhibe les bactéries à croissance rapide (Labeda et Shearer, 1990).
Et la cycloheximide qui est un inhibiteur utilisĂ© pour lâisolement des actinomycĂštes (Wang et
al., 1999).
Lâajout dâantibiotiques dans le milieu dâisolement nâa pas empĂȘchĂ© la croissance de
quelques petites colonies de champignons mais ce sont surtout les bactéries à Gram positif qui
posent problĂšme : elles ne peuvent pas ĂȘtre Ă©liminĂ©es et envahissent la gĂ©lose, gĂȘnant ainsi la
croissance des actinomycĂštes.
Pour les Pseudomonas fluorescents, lâisolement a Ă©tĂ© effectuĂ© sur milieu de culture
King B (King et al., 1954). Cette technique est basĂ©e sur lâobservation sous lumiĂšre
ultraviolette à 254 nm de la pyoverdine, un pigment fluorescent qui représente la majeure
partie des sidĂ©phores produites par ces bactĂ©ries. Connus pour ĂȘtre abondants dans les sols
rhizosphériques (Kragelund et Nybroe, 1996), les Pseudomonas fluorescents ont une densité
dépendant beaucoup de son statut symbiotique et de la nature de la plante (Founoune et
Duponnois, 2002). Ces derniers auteurs ont confirmé que ce groupe de bactéries est
particuliÚrement abondant autour des racines mycorhizées.
Les flores totales sont des microorganismes faciles à cultiver. Elles sont constituées,
en grande partie, par des bactéries à croissance rapide qui peuvent se développer sur le milieu
TSA. Par consĂ©quent, lâutilisation dâun milieu Ă base de peptone sans antibiotiques permet
facilement lâisolement de ces groupes de microorganismes.
Ces différentes méthodes ont été utilisées afin de récupérer un maximum de
microbiennes viables et cultivables. Le protocole adoptĂ© sâest ainsi avĂ©rĂ© efficace. En effet,
vingt-six (26) souches microbiennes ont été isolées et purifiées. Douze (12) souches des flores
totales cultivables, dix (10) souches dâactinomycĂštes et quatre (4) souches de Pseudomonas
fluorescents proviennent dâun Ă©chantillon de sol contaminĂ© par les hydrocarbures. Dâune
Discussions
39
maniÚre générale, le nombre des souches isolés à partir de sol contaminé par les
hydrocarbures est largement Ă©levĂ© pour effectuer de test dâacclimatation et la suivi cinĂ©tique
de la dĂ©gradation des molĂ©cules des HAP. La prĂ©sence dâun nombre moins Ă©levĂ© de souche de
Pseudomonas fluorescent dans le sol indique que la croissance de ce genre de bactérie est
inhibée à un certain seuil de HAP dans le sol. Il est possible également que le taux de
nutriments dans le sol est épuisé et influence cette inhibition en présence de toxicité élevée de
HAP.
En ce qui concerne lâeffet des polluants sur la biomasse, nos rĂ©sultats montrent
clairement la capacité de certaines souches isolées à résister et à se développer en milieu
contaminé par une gamme croissante de concentration de mélange HAP. Les populations
microbiennes indigĂšnes dâun Ă©cosystĂšme polluĂ© ne prĂ©sentent pas tous les outils mĂ©taboliques
permettant de rĂ©aliser une dĂ©gradation complĂšte des polluants dans le cadre dâune attĂ©nuation
naturelle. Lâacclimatation (ou bio-stimulation) est une mĂ©thode utilisĂ©e pour amĂ©liorer ce
processus de biodégradation en modifiant les conditions environnementales par adjonction de
surfactants, de nutriments, dâeau, de donneurs ou dâaccepteurs dâĂ©lectrons. Les conditions
favorables pour la croissance des microorganismes sont tout de mĂȘme fournies au maximum
afin dâassurer leur viabilitĂ©.
Lors de cette acclimatation, la survie de la souche A1 (actinomycĂšte) et la souche F2
(flore totale cultivable), en prĂ©sence de concentration Ă©levĂ©e de HAP (1500 mg/L), rĂ©vĂšle dĂ©jĂ
leur rĂ©sistance ainsi que leur efficacitĂ© dans le processus de biodĂ©gradation. Elles sâadaptent
facilement à ce type d'environnement tant du point physiologique et que génétique. Le fait
que le taux de population microbienne augmente au cours cette expérience démontre la
capacité de ces deux souches à utiliser les carbones des polluants comme source de carbone et
dâĂ©nergie.
Ces deux (2) souches ont fait lâobjet dâune identification phĂ©notypique. La souche F2
a été identifiée par plusieurs caractÚres tels que les caractÚres culturaux, les caractÚres
morphologiques, les caractĂšres physiologiques et les caractĂšres biochimiques. En
lâoccurrence, lâensemble de ces caractĂšres a permis de rapprocher la souche F2 Ă lâespĂšce de
Bacillus simplex. Câest une espĂšce particuliĂšre que lâon retrouve dans les endroits chauds tels
quâen Afrique. Leur croissance bactĂ©rienne peuvent avoir lieu jusquâĂ 43°C (Sikorski et
Nevo, 2007).
Discussions
40
Pour la souche dâactinomycĂšte A1, lâidentification a Ă©tĂ© effectuĂ©e au niveau de
lâespĂšce selon la mĂ©thode prĂ©conisĂ©e par lâInternational Streptomyces Project, par des
analyses phĂ©notypique. LâĂ©tude macroscopique et microscopique des isolats sur diffĂ©rents
milieux de culture, permet de suivre le dĂ©veloppement et lâarrangement des mycĂ©liums de
substrat et aĂ©rien ainsi que la formation des spores, elle permet aussi dâobserver la forme et
lâaspect des colonies. L'ensemble des caractĂšres culturaux, morphologiques ainsi que les
caractÚres physiologiques et biochimiques étudiés, a permis de classer cette souche dans
lâespĂšce Streptomyces p. Dâautant plus, les rĂ©sultats obtenus seront utiles pour optimiser les
conditions de culture afin dâaugmenter la capacitĂ© de cette souche Ă rĂ©sister et Ă se dĂ©velopper
dans de milieu hautement contaminé par les HAP.
Pour cette étude, les informations apportées par les études phénotypiques ne sont pas
suffisantes pour lâidentification au niveau de lâespĂšce. Dâautres techniques sont ainsi
suggĂ©rĂ©es pour lâidentification de ces deux genre bactĂ©riens, Ă savoir les sĂ©quences
intergéniques répétitives d'ADN (rep-PCR) (Sadowsky et al., 1996), PCR- RFLP du gÚne
codant la protéine du choc thermique 65-kDa (Steingrube et al., 1997), ou le séquençage du
gĂšne rpoB codant la sous unitĂ© ÎČ de lâARN polymĂ©rase (Kim et al., 2004).
Dans la deuxiĂšme partie de lâĂ©tude, lâobjectif Ă©tait de suivre la cinĂ©tique de
dégradation des polluants par les souches sélectionnées de Streptomyces sp. et de Bacillus
simplex.
Les genres ActinomycÚtes et Bacillus sont connus pour leur capacité à dégrader les
molécules HAP dans le sol. Nos résultats montrent que ces deux espÚces de bactéries ont des
forts potentiels dans lâĂ©limination de HAP dans le milieu. Les deux souches dĂ©gradent plus
efficacement et plus rapidement les HAP légers (cycles aromatiques †3) par rapport aux HAP
composés de quatre (4) cycles aromatiques. Les deux souches sélectionnées ont pu utiliser les
carbones de naphtalĂšne, dâacĂ©naphtĂšne, de fluorĂšne, de phĂ©nanthrĂšne et dâanthracĂšne comme
source de carbone et dâĂ©nergie. Les rĂ©sultats lors de cette Ă©tude sont conformes Ă ceux trouvĂ©s
dans la littĂ©rature qui ont indiquĂ© que les souches dâactinomycĂštes et de Bacillus telluriques
dégradent facilement les HAP composés de deux (2) et trois (3) cycles aromatiques (Das and
Mukhjee, 2007 ; Jacques et al., 2008).
Quant au HAP composĂ©s de quatre (4) cycles aromatiques, la capacitĂ© de ces isolats Ă
minéraliser, décomposer ou transformer les HAP en substances moins nocives est réduite.
Discussions
41
Cela est surement dĂ» Ă lâhydrophobicitĂ© Ă©levĂ©e de HAP (fluoranthĂšne, le pyrĂšne et le
benzo(a)anthracĂšne). Ainsi, ils ne sont pas bio-disponibles pour ces deux souches.
Selon la littérature, les HAP lourds sont difficilement dégradés si des bactéries
individuelles sont mises en en Ćuvre. De nombreuses Ă©tudes ont montrĂ© que lâemploi de
consortium de bactérie est plus efficace pour la dégradation des matiÚres polluantes (Ghazali
et al., 2004 ; Goux et al., 2003) et que la combinaison avec une phytoremédiation augmente
le pourcentage de dégradation (Jingchant Tang et al., 2010). Jacques et al., (2008) ont
déjà évalué la capacité de consortium de six (6) souches (Mycobacterium fortuitum,
Bacillus cereus, Mycrobactérium sp., Gordonia polyisoprenivorans, Microbacteriaceae
bactĂ©rium et Fusarium oxysporum) et qui ont pu dĂ©grader et minĂ©raliser lâanthracĂšne, le
phénanthrÚne et le pyrÚne dans le sol avec un taux de dégradation allant de 96% à 99% au
bout de 70 jours. Une liste de type de microorganismes sélectionnés pour des essais de
bioaugmentation des sols contaminés par les composés aromatiques est détaillée dans le
travail de Agnieszka Mrozik et al., 2010.
Conclusion générale et perspectives
CONCLUSION GENERALE ET
PERSPECTIVES
Conclusion générale et perspectives
42
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Le présent travail portant sur « Sélection et identification des souches telluriques
impliquées dans la dégradation des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques», nous a
permis de :
de maitriser les techniques usuelles en microbiologie et en physico-chimique,
dâapporter des informations sur lâabondance des souches microbiennes dans le
sol pollué par les hydrocarbures,
de mettre en place une banque de souches microbiennes utilisable dans les
recherches Ă venir,
dâapporter des informations sur la potentialitĂ© des microorganismes telluriques
à résister et à dégrader les HAP,
de mettre en évidence la diversité phénotypique des souches sélectionnées.
Nous avons mis en Ă©vidence lâactivitĂ© dĂ©gradante des microorganismes telluriques
sélectionnés de milieu pollué par une quantité connue de mélange de HAP aussi bien les HAP
légers composés de deux (2) et trois (3) cycles aromatiques que les HAP lourds composés de
quatre (4) cycles aromatiques. Cependant, cette Ă©tude est loin dâĂȘtre finie. A lâavenir, nous
envisagerons dâentreprendre les travaux de recherche sur :
la caractérisation moléculaire des souches sélectionnées par PCR des gÚnes
16S ribosomal,
lâexpĂ©rimentation de dĂ©contamination de sols polluĂ©s (expĂ©riences en
microcosmes) et suivi de cinétique de dégradation de polluants en utilisant les
souches sélectionnées (utilisé en consortium),
le dĂ©veloppement et optimisation des mĂ©thodes dâextraction et de
quantification de HAP,
lâisolement dâautres groupes de microorganismes (bactĂ©ries, champignons)
identifiés comme étant capable de dégrader les molécules des HAP dans le
sol,
la sélection des consortiums microbiens efficaces et le suivi de la dynamique
des souches dâintĂ©rĂȘts utilisĂ©es.
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Annexes
ANNEXES
Annexes
ANNEXE I : COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE
1- MILIEU DâISOLEMENT
âą Milieu dâisolement de Pseudomonas fluorescent
King B
Polypeptone.......................................................................... 20 g
Glycérol ............................................................................. 10 ml
Phosphate bipotassique anhydre ........................................ 1,5 g
Sulfate de magnésium ........................................................ 1,5 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
Agar ..................................................................................... 15 g
pH = 7,2±0,2
âą Milieu dâisolement des souches dâactinomycĂštes
AS1 (Antibiotic Selection One)
Bacto Yeast Extract................................................................ 1 g
Arginine ............................................................................. 0,2 g
Alanine ............................................................................... 0,2 g
Asparagine monohydrate ................................................... 0,5 g
Difco soluble starch ............................................................... 5 g
NaCl .................................................................................... 2,5 g
Sulfate de sodium ................................................................. 10 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
Agar ..................................................................................... 15 g
pH=7,0
Les antibiotiques
Pour 1 L de milieu AS1, on ajoute :
- 10 ml de Cycloheximide (0,02g dilué dans 10ml de DMSO) ;
- 10ml de TrimĂ©thoprime (0,05g diluĂ© dans 10ml dâED) ;
- 10 ml dâAcide nalidixique (0,05 g diluĂ© dans 10 ml dâED) ;
âą Milieu dâisolement pour la flore totale cultivable
TSA (Tryptic Soy Agar)
Peptone de caséine ............................................................... 15 g
Annexes
Peptone de soja ...................................................................... 5 g
NaCl ....................................................................................... 5 g
CaCl2, 2H2O ...................................................................... 0,04 g
Agar...................................................................................... 15 g
Eau distillée .................................................................... 1000 ml
pH=7,2
⹠Milieu pour le test de résistance des souches
BN (Bouillon nutritif)
Extrait de levure .................................................................... 5 g
Peptone ................................................................................ 15 g
NaCl ..................................................................................... 15 g
Agar...................................................................................... 13 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH=7,3
2- MILIEU DE DENOMBREMENT
GĂ©lose nutritive
Extrait de viande .................................................................... 3 g
Peptone .................................................................................. 5 g
NaCl ...................................................................................... 15g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH=7,3
3- MILIEU DâIDENTIFICATION DES SOUCHES
Eau peptonnée au rouge de phénol
Peptone ................................................................................ 10 g
NaCl ....................................................................................... 5 g
Eau peptonnée
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
NaOH ................................................................................. 80 ml
Indicateur coloré
Rouge de phénol .................................................................... 2 g
Annexes
Eau distillé stérile ............................................................. 950 ml
Eau peptonnée au rouge de phénol
Eau peptonnée ................................................................ 1000 ml
Rouge de phénol ................................................................ 12 ml
pH=7,5±0,2
⹠Milieu urée indole
L-tryptophane ...................................................................... 0,3 g
Phosphate monopotassique ................................................. 0,1 g
Phosphate dipotassique ....................................................... 0,1 g
Na Cl ...................................................................................... 5 g
Urée ........................................................................................ 2 g
Alcool 90° ....................................................................... 0,25 ml
Rouge de phénol 1% ....................................................... 0,25 ml
Eau distillée stérile ........................................................... 950 ml
pH=7,4±0,2
âą Milieu de Simmons
Sulfate de magnésium ......................................................... 0,2 g
Phosphate monoammoniaque ................................................ 1 g
Phosphate bipotassique .......................................................... 1 g
Na Cl ...................................................................................... 5 g
Citrate de sodium ................................................................... 1 g
Bleu de bromothymol ........................................................ 0,08g
Agar...................................................................................... 15 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH=7,1±0,2
⹠Milieu mannitol-mobilité-nitrate
Hydrolysat trypsique de caséine .......................................... 10 g
Nitrate de potassium .............................................................. 1 g
Mannitol .............................................................................. 7,5 g
Rouge de phénol 10% ....................................................... 0,04 g
Agar..................................................................................... 3,5 g
Annexes
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH=7,6±0,2
âą Milieu lysine fer
Peptone bactériologique ......................................................... 5 g
Extrait de levure ..................................................................... 3 g
Glucose .................................................................................. 1 g
L-lysine ................................................................................ 10 g
Citrate de fer ammoniacal ................................................... 0,5 g
Thiosulfate de sodium ....................................................... 0,04 g
Pourpre de bromocrésol .................................................... 0,02 g
GĂ©lose ............................................................................... 14,5 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH= 6,7 ±0,2
âą Milieu Hajna-Kligler
Peptone ................................................................................. 15 g
Extrait de viande .................................................................... 3 g
Extrait de levure ..................................................................... 3 g
Peptone pepsique de viande ................................................... 5 g
Na Cl ...................................................................................... 5 g
Sulfate ferreux ..................................................................... 0,2 g
Thiosulfate de sodium ......................................................... 0,3 g
Lactose ................................................................................. 10 g
Glucose ................................................................................... 1g
Rouge de phénol .............................................................. 0,24ml
Agar...................................................................................... 11 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH= 7,5±0,2
âą Milieu ISP2
Extrait de levure ..................................................................... 4 g
Extrait de Malt ..................................................................... 10 g
D glucose ............................................................................... 4 g
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH = 7,3
Annexes
âą Milieu ISP4
Amidon soluble .................................................................... 10 g
K2HPO4 .................................................................................. 1 g
Mg SO4, 7H2O ....................................................................... 4 g
(NH4)2SO4 .............................................................................. 2 g
Na Cl ....................................................................................... 1g
CaCO3 .................................................................................... 2 g
Solution saline 1 ................................................................... 1 ml
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH = 7,0
âą Milieu ISP5
Glycérol................................................................................ 10 g
L-aspargine ............................................................................ 1 g
K2HPO4 .................................................................................. 1 g
(NH4)2SO4 .............................................................................. 2 g
Na Cl ....................................................................................... 1g
Solution saline 1 ................................................................... 1 ml
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH = 7,0
âą Milieu Starch Casein agar
Amidon soluble .................................................................... 10 g
Caséine ................................................................................... 1 g
K2HPO4 ............................................................................... 0,5 g
Agar...................................................................................... 15 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH = 7,0
âą Milieu Sporulation agar
Extrait de levure ..................................................................... 1 g
Extrait de viande .................................................................... 1 g
Annexes
Trypose .................................................................................. 2 g
Glucose ................................................................................ 10 g
Agar...................................................................................... 15 g
Eau distillée ................................................................... 1000 ml
pH = 7,2
âą Milieu ISP6
Peptone ................................................................................. 15 g
Protéose peptone ................................................................... 5 g
Cittrate de fer ammoniacal .................................................. 0,5 g
Thiosulfate de sodium ....................................................... 0,08 g
Extrait de levure ...................................................................... 1g
K2HPO4 .................................................................................. 1 g
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH = 7,0
âą Milieu ISP7
Glycérol................................................................................ 15 g
L-aspargine ............................................................................ 1 g
K2HPO4 ............................................................................... 0,5 g
Na Cl .................................................................................... 0,5g
Fe2SO4 ............................................................................... 0,01 g
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH = 7,2
âą Milieu ISP9
(NH4)2SO4 ......................................................................... 2,64 g
K2HPO4 ............................................................................. 2,38 g
K2HPO4 ............................................................................. 5,65 g
Mg SO4.................................................................................... 1g
Solution saline 2 ................................................................... 1 ml
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH= 6,8
Annexes
âą Milieu CYD
Casamino acids ................................................................... 0,5 g
Extrait de levure ................................................................. 0,3 g
D-glucose ............................................................................ 0,4 g
K2HPO4 .................................................................................. 2 g
Mg SO4................................................................................... 1 g
Solution saline 2 ................................................................... 1 ml
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH= 7,2
âą Milieu de viande foie
Extrait de viande .................................................................. 10 g
Peptone ................................................................................. 20 g
Extrait de levure .................................................................. 10 g
Glucose .................................................................................. 2 g
Solution saline 2 ................................................................... 1 ml
Agar...................................................................................... 20 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH= 7,6
⹠Milieu mannitol-mobilité
Peptone ................................................................................. 20 g
Nitrate de potassium .............................................................. 1 g
Mannitol ................................................................................. 2 g
Rouge de phénol .............................................................. 40 mg
Agar........................................................................................ 4 g
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
pH= 8,1
âą PBF (Phosphate Buffer Saline)
Na Cl ...................................................................................... 8 g
K Cl ..................................................................................... 0,2 g
Na2HPO4, 12H20 ............................................................... 1,44 g
K2HPO4 .......................................................................... 0,24 mg
Eau distillée stérile ........................................................ 1000 ml
Annexes
ANNEXE II : CONCENTRATION CORRESPONDANTE A CHACUN DES HAP
HAP Masse HAP (mg) Volume solvant (ml) Concentration
(mg/L) NaphtalĂšne 100 25 4000
AcénaphtÚne 100 25 4000
FluorĂšne 100 25 4000
PhénanthrÚne 100 25 4000
AnthracĂšne 100 25 4000
FluoranthĂšne 100 25 4000
PyrĂšne 100 25 4000 Benzo(a) anthracĂšne 100 25 4000
[ÎŁ8HAP] (mg/L ou ppm) 32 000
Annexes
ANNEXE III : PROTOCOLE DETAILLEE DE LâANALYSE DES HAP DU SOL DE
TSIMIRORO PAR CPG
Etape 1 : Préparation du sol
MĂ©langer lâĂ©chantillon du sol avec du Na2SO4 et avec de lâĂ©talon interne.
Etape 2 : Extraction du solvant par Soxhlet
Extraire Ă lâaide dâun ballon de 200 ml le mĂ©lange dâhexane/dichloromĂ©thane (50/50)
par la mĂ©thode Soxhlet, une prise dâessai environ 2 g et attendre 8heures.
Extraction par Soxhlet
Etape 3 : Evaporation
Transvase le solvant dans un ballon de 250 ml en vue dâĂ©vaporation (30°C jusquâĂ
environ 10 ml).
Etape 4 : Chromatographie sur colonne
Glisser un petit coton jusqu'à l'extrémité d'une colonne de purification. Remplir la
colonne de purification avec de lâalumine et de silicagel puis avec 1 cm de sulfate de sodium
anhydre. dĂ©poser 2 ml de la solution ainsi obtenue en Ă©luant avec 30 ml dâhexane afin
dâobtenir la fraction aliphatique. La 2Ăšme fraction sâobtient avec 40 ml de
hexane/dichlorométhane (90/10) pour la fraction aromatiques.
Annexes
Purification par colonne
Etape 5 : Concentration finale par soufflage Ă lâAzote
Souffler le tube contenant la fraction aromatique par N2 jusquâĂ 0,5 ml.
Etape 6 : Injection sur la chromatographie en phase gazeuse
RĂ©gler lâappareil CPG puis injecter la solution concentrĂ©e afin de voir le
chromatogramme correspondant aux HAP.
Injection par CPG
Annexes
ANNEXE IV : DIVERSITE DES ESPECES BACTERIENNES CAPABLES DE DEGRADER
LES HAP
Titre : Sélection et identification des souches telluriques impliquées dans la
dégradation des Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP)
Nom et Prénoms : RANDRIAMISAINA Kanto Aina Natacha Adresse : LOT IVY 245 Ilanivato Ampasika Tel : +261 33 18 540 39 E-mail : [email protected] Nombre de page : 49 ; Nombre des tableaux : 13 ; Nombres des figures : 7 ; Nombres des photos : 2
RESUME Une collection de vingt-six (26) souches microbiennes ont été isolées à partir des sols pollués
par les hydrocarbures dans un site industriel dâun grand gisement dâhuile lourde de Tsimiroro dont quatre (4) Pseudomonas fluorescents, dix (10) actinomycĂštes et douze (12) flores totales cultivables. Ces souches ont Ă©tĂ© testĂ©es pour leurs capacitĂ©s Ă dĂ©velopper en milieu de culture synthĂ©tique prĂ©alablement polluĂ© par une quantitĂ© connue de mĂ©lange de HAP (ÎŁ8HAP) Ă diffĂ©rentes concentrations (250 mg/L ; 500 mg/L ; 1000 mg/L ; 1500 mg/L). La croissance microbienne a Ă©tĂ© suivie pendant soixante-cinq (65) jours selon la mĂ©thode de Nombre les Plus Probables (NPP). Parmi toutes les souches, seulement deux isolats A1 et F2 ont la capacitĂ© Ă rĂ©sister et Ă dĂ©velopper en milieu contaminĂ© par les HAP dâintĂ©rĂȘt Ă une teneur de 1500 mg/L. Une augmentation de la population microbienne a Ă©tĂ© observĂ©e au cours de cette expĂ©rience. LâĂ©tude des caractĂ©ristiques culturales, morphologiques, physiologiques et biochimiques de ces deux souches ont permis de rapprocher lâisolat A1 Ă lâespĂšce Streptomyces sp. et lâisolat F2 Ă lâespĂšce Bacillus simplex. Le dosage des HAP rĂ©siduels dans le milieu de culture mĂ©langĂ© avec les HAP Ă la concentration de 1500 mg/L a montrĂ© que ces deux souches peuvent dĂ©grader assez rapidement les HAP lĂ©gers composĂ©s de deux (2) et trois (3) cycles aromatiques (naphtalĂšne, lâacĂ©naphtĂšne, le fluorĂšne, le phĂ©nanthrĂšne et lâantrhacĂšne) que les trois HAP lourds de quatre (4) cycles aromatiques : le fluoranthĂšne, le pyrĂšne et le benzo(a)anthracĂšne.
Mots-clés : Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques, Microorganismes telluriques, Bioremédiation, Identification.
ABSTRACT
A collection of twenty-six (26) microbial strains were isolated from polluted soil by the hydrocarbons in an industrial site of a large heavy oil gisement of Tsimiroro including four (4) fluorescent Pseudomonas, ten (10) actinomycetes and twelve (12) total cultivable strains. These strains were tested for their ability to grow in synthetic culture media previously contaminated by a mixture of PAH (ÎŁ8PAH) with different concentrations (250 mg/L; 500 mg/L; 1000 mg/L 1500 mg/L). The microbial growth was evaluated during sixty five (65) days according to the More Probable Number Method (MPN). Among all strains, only two isolates A1 and F2 were resistant and developed on media contaminated by the interest PAH at 1500 mg/L. An increase of microbial population was observed during this experiment. Cultural, morphological, physiological and biochemical characteristics of the two strains indicated that the isolate A1 was closely related to Streptomyces sp. and the isolate F2 to Bacillus simplex. The quantification of residual PAH in the culture media with PAH at 1500 mg/l showed that these two strains may degrade quite rapidly lighter PAHs compounds two (2) and three (3) aromatic cycles (naphtalene, acenaphtene, fluorene, phenanthrene and anthracene) than the three PAH compounds four (4) aromatic cycles : fluoranthene, pyrene and benzo(a)anthracene.
Key words : Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, Telluric microorganisms, Bioremediation, Identification.
Encadreur : Monsieur Rado RASOLOMAMPIANINA, MaĂźtre de Recherches et Chef de Laboratoire de Microbiologie de lâEnvironnement (LME)