sem etiquetado implementando el etiquetado en montevideo

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Claudio Martínez Debat / Mailén ArleoLaTraMA ::: Laboratorio de Trazabilidad Molecular AlimentariaSeccion Bioquímica. Facultad de Ciencias. Comisión Directiva Espacio Interdisciplinario.Universidad de la República. Montevideo. [email protected]://www.facebook.com/claudio.martinez.debat

Transgenicidad en alimentos de consumo masivo.

ImplementaNdo el etiquetado en Montevideo

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Detección, Identificación y Cuantificación de OGMs

F Alfonso, M Arleo, J Correa, R Fernández, M Fernández,F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, C Martínez

Alimento transgénico

El término “alimento transgénico” hace referencia a aquel que contiene, está compuesto, o ha sido producido a partir de OGMs.

Un alimento puede ser “transgénico” porque:

está formado por materiales derivados de un OGM (harina de maíz GM),

en su fabricación se emplearon microorganismos GM (yogurt)

contiene ingredientes que provienen de OGM (aceites, aminoácidos, ácidos

orgánicos, enzimas)

Fuente: http://www.mgap.gub.uy/portal/hgxpp001.aspx?7,1,144,O,S,0,MNU;E;2;2;12;5;MNU

Situación legal de los OGMs en Uruguay:“Coexistencia Regulada”

Decreto 353/008: el etiquetado de los alimentos que contienen OGMs es “voluntario "GM" o "no GM", aplicable a aquellos alimentos en los que se pueda comprobar mediante análisis del producto final la presencia de ADN o proteínas genéticamente modificados”

Nuevo marco regulatorio referente a OGMs

…”los alimentos que han sido manipulados genéticamente o que contienen uno o más ingredientes provenientes de éstos que superen el 1% de los componentes individualmente considerados, deberán ser etiquetados”…

Alcance: Alimentos conformados por materiales derivados de OGMs

x Excluidos: Alimentos producidos a partir de microorganismos GM, o que contienen aditivos

producidos por OGM.

Umbral 1%: presencia accidental o técnicamente inevitable

de transgénicos (contaminación en la producción, transporte

o almacenamiento).

Decreto Departamental N° 34.901 (Montevideo)

TRAZABILIDAD MOLECULAR ALIMENTARIA

Donde hubo Vida… ADNS QUEDAN

LaTraMa ::: Laboratorio de Trazabilidad Molecular AlimentariaP Abete, M Amilibia, M Arleo, J Correa, R Fernández, M Fernández, A Miller, E Miquel, F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, Florencia Afonso, Luis Jurado, C Martínez DebatSección Bioquímica, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República. Montevideo. Uruguay.

Análisis de componentes animales en alimentosMeDeA ::: Método de Determinación de Especies Animales

Ejemplo: Detección de contaminaciones/adulteraciones de quesos de cabra con leche de vaca,

mediante técnicas moleculares

MeDeA

A Miller/ M Amilibia / J Correa

Descripción del problema• Adulteración con Manzana (Malus

domestica) en matrices alimentarias altamente procesadas. Ejemplo: Dulce de Membrillo (Cydonia oblonga).

Lic. Mailén Arleo/José Pereyra

DeVasDeterminación de Especies Vegetales

en Alimentos

Análisis de Transgenicidad en Alimentos de Consumo Masivo

LaTraMa ::: Laboratorio de Trazabilidad Molecular Alimentaria

M Arleo, J Correa, R Fernández, M Fernández, E Miquel, F San Martín, F Ruibal, J Pereyra, C Martínez

Sección Bioquímica, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de la República.

En colaboración con el Labo de Bromatología, Intendencia de Montevideo

el Labo de Genética Molecular, Desarrollo y Evolución de Plantas del Instituto de Ecología de la UNAM, México DF.

Resultado de detección e identificación de eventos transgénicos para 20 muestras de harina de maíz (código M1 – M20) que se encuentran en el mercado nacional. De las 20 muestras 18 arrojaron resultados positivos en cuanto a la presencia del promotor 35S indicando presencia de maíz GM. Estas 18 muestras son variables en cuanto al contenido de eventos particulares encontrándose todas las combinaciones posibles (solo Bt11, solo Mon810 o mezcla de ambas). Cabe destacar que las muestras que dieron resultado negativo para 35S se mantuvieron coherentes para el análisis de eventos.

PRODUCTO ORIGEN DECLARA PRESENCIA DE MAÍZ PRESENCIA DE TRANSGENICOS

EVENTO

Endógeno de maíz (HMGA)

35S t-NOS MON810 BT11 GA21 TC1507

Cheetos Torciditos México Maíz + + - + - - -Topitos queso México Maíz + - - - - - -

Tortillas naturales (tlayudas)

México Maíz + - - - - - -

Tortillas naturales (tlayudas)

México Maíz + - - - - - -

Doritos recargados México Maíz 100% natural + + + + + + +Crujitos queso y chile México Maíz + + - + - - -

Rancheritos México Maíz 100% natural + + + + + + +Fritos chile y limón México Maíz 100% natural + + + + + + +Doritos pizzerolas México Maíz 100% natural + + + + + + +

Doritos Francia Maíz + - - - - - -Tortillas chili Francia Maíz + - - - - - -

3D Francia Maíz + - - - - - -Tortillas de Maíz Francia Maíz + - - - - - -

Nachitas USA Maíz + + - + - - +3D barbacoa Argentina Maíz + + - + - - -

Fritos España Maíz + - - - - - -Mix Bugles 3D´s España Maíz + - - - - - -

Mix Cheetos España Maíz + - - - - - -Mix Doritos España Maíz + - - - - - -

Mix cheetos 2 España Maíz + - - - - - -

Resultado del rastreo del promotor 35S y t-Nos y de la identificación de los eventos Mon810, BT11, GA21, TC1507 para las 20 muestras de alimentos a base de maíz (snacks). El resultado se representa de la siguiente manera: - resultado negativo, + resultado positivo.

De las 20 muestras analizadas, ocho resultaron positivas para la presencia de transgénicos, con distinto perfil en el contenido de eventos.

Resultado del rastreo del promotor 35S y t-Nos y de la identificación del evento MON40-3-2 para las hamburguesas de carne (con presencia de soja), hamburguesas y milanesas de soja.

El resultado se representa de la siguiente manera: - resultado negativo, + resultado positivo.

PRODUCTO ORIGEN DECLARA PRESENCIA DE SOJA

PRESENCIA DE TRANSGÉNICOS

EVENTO

ENDOGENO DE SOJA

35S t-NOS MON40-3-2

Hamburguesa de carne (1)

Uruguay proteína vegetal + + + +Hamburguesa de carne

(3) s/declaración sin declaración + + + +


Uruguay proteína de soja + + + +Hamburguesa de carne

(6) Uruguay proteína de soja + - - -


Uruguay proteína de soja + + + +Hamburguesa de soja

(1) Uruguay soja certificada no

transgénica + + + +

Hamburguesa de soja (2)

s/declaración sin declaración + + + +Milanesa de soja (3) Uruguay soja certificada no

transgénica + - - -

Milanesa de soja (4) Argentina soja + + + +Milanesa de soja (5) s/declaración sin declaración + + + +

Tofu (6) s/declaración sin declaración + + + +Panchos de soja (7) Uruguay proteína de soja + - - -

Flujo Génico

2011-2013: “Flujo de Transgenes entre Cultivos Comerciales de Maíz en Uruguay”.

En 3 de 6 situaciones se detectó presencia del transgen en la progenie de cultivos no OGM.

El evento detectado corresponde al del presunto origen de contaminación

Se detectó interpolinización a distancias de 20, 100 y 330m

Construcciones génicas de distintos eventos de maíz aprobados en Uruguay

p-35S Intrón hsp70 cry 1 A (b)

t-Noscry 1 A (b) patp-35S p-35S intrón 1 adh t-Nosintrón 6 adh

p-1 ract intrón 1 ract CP4 EPSPS t-NosOTP

Maíz MON810

Maíz NK603

Maíz GA21

Maíz TC1507

p-ubiq mz intrón 1 ubq cry 1 F t-ORF 25 p-35S pat t-35Sexón 1 ubq

p-ract1 intrón 1 ract CTP2 CP4 EPSPS t-Nos intrón hsp70 CP4 EPSPS t-Nosp-35S CTP2

Maíz Bt11

Maíz Mon89034

p-e35S intrón 1 ractL-Cab Cry 1A.105 t-HSP17 intrón hsp70 Cry 2Ab2 t-Nosp-FMV TS-SSU

Maíz Mir162

p-ubiq mz T-35S p-ubiq mz pmi t-Nosvip 3Aa20 intrón 9 PEPC

Sistema de detección de OGMs

Detectar el DNA transgénico insertado.

Detectar la nueva proteína expresada.

Detectar el producto de una reacción enzimática.

Fin: Garantizar la trazabilidad de los productos GM y el cumplimiento de las normas de etiquetado.

Estrategia: Explotar las diferencias entre el organismo transgénico y la variedad no modificada.

Métodos cualitativosDeterminan la presencia o ausencia de material transgénico en

materias primas o alimentos procesados.

Detección de proteínas(Elisa, Strips)

Detección de ADN (PCR, microarreglos)

Técnicas InmunológicasTiras reactivas (Strip)ELISA

Rápidos, sencillos. Requieren poco equipamiento. Sirven únicamente como rastreo primario de OGMs, no son específicos de evento. No son apropiados para utilizar en alimentos con alto grado de procesamiento.

Microarreglos

Se basa en la hibridación del ADN de la muestra, sobre un gran número de sondas fluorescentes adheridas en una matriz sólida.

Permite el rastreo simultáneo de un gran número de fragmentos de ADN diferentes en una mezcla.

Incrementa la facilidad y velocidad del análisis. Actualmente en desarrollo.

PCR

La PCR es una técnica de amplificación enzimática in vitro que permite amplificar un fragmento específico de ADN, situado entre dos regiones de secuencia conocida.

Usa ciclos sucesivos de calentamiento y enfriamiento de las muestras para producir copias de la molécula de ADN blanco.

reacción de PCR1era etapa – Desnaturalización del ADN molde

Temperatura = 92- 97 ºC Temperatura = De acuerdo a la composición de las bases del par de cebadores (55-65°C)

2da etapa – Apareamiento de los cebador

5´

5´3´

3´

OHOH

ADN polADN pol

dNTPs

dNTPs

Temperatura = 68 - 72 ºC (depende de la enzima)

3era etapa – Extensión

Ciclado

Muy sensible, permite la detección de secuencias transgénicas a nivel de trazas.

Específica, capaz de detectar la secuencia blanco de ADN dentro de una mezcla compleja.

Apropiados para detectar e identificar eventos de transformación.

CICLADO – genera una amplificación exponencial

del fragmento de ADN deseado

PlantaPlanta PromotorPromotor PotenciadorPotenciador Gen de interésGen de interés TerminadorTerminador PlantaPlanta

Rastreo Rastreo

Específica de genEspecífica de gen

RastreoRastreo

Específica de construcción Específica de construcción

Estrategias de Detección e Identificación de transgenes por PCR

Existen cuatro niveles de especificidad para los análisis de transgénesis por PCR, dependiendo del blanco al cual estén dirigidos los cebadores. (De arriba hacia abajo va aumentando el nivel de especificidad).

Específica de eventoEspecífica de evento Específica de eventoEspecífica de evento

Normas Internacionales y protocolos validados

http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/

ISO 17025

Flujo de trabajoMedidas para evitar la contaminación

1. Organización física del laboratorio y flujo de trabajo

Control de la contaminación2. Buenas prácticas de laboratorio

Descontaminar el área de trabajo con hipoclorito 10%, EtOH 70% y H20mq.

Usar túnica y guantes sin talco.

Realizar alícuotas de los reactivos de PCR.

Usar materiales descartables.

Usar puntas con filtro para evitar dispersión de aerosoles.

3. Uso de medidas específicas para la descontaminación

Radiación Ultravioleta.

Procedimiento general para la detección de OGMs

Muestra de ADN

negativo

positivo

Si No

>1% GMRequiere etiquetado

< 1% GMNo requiere etiquetado

Detección / screening

Identificación Evento autorizado?

Cuantificación

Materia prima o alimento

HomogenizaciónExtracción ADNCuantificación

SiNo

Prueba de inhibiciónAmplificación de un gen endógeno de la especie

*

*

Muestreo

Toma de muestra en el campo

Manejo de la muestra

Homogenización

Toma de sub-muestra

Extracción de ADN

Amplificación por PCR

DETECCIÓN

Toma de sub-muestraComo asegurar la certeza de los resultados:

Obtener muestras representativas y homogéneas del

material para realizar la detección.

Optimizar los métodos de extracción de ADN.

Optimizar los protocolos de amplificación por PCR.

Establecer y optimizar los límites de detección.

Extracción de ADN

Protocolos validados

1.Lisis en presencia de detergentes y sales (CTAB, NaCl, EDTA, temperaturas elevadas)

2. Separación de proteínas y lípidos (Extracción con solventes orgánicos, centrifugación)

3. Precipitación del ADN (etanol 100%)

4. Lavado del ADN (EtOH 70%)

5. Disolución (H20mq)

Kits comerciales

Basados en la absorción de ADN a matrices de sílica

Doyle J. J., and Doyle J. L. (1987). A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19: 11–15.

Cuantificación del ADN extraído

Análisis espectrofotométrico del ADN (Absorbancia a 260nm)

Espectrofotometría de miscrovolúmenes (Nanodrop)

100ng ADNg. PCR convencional

50ng ADNg. qPCR

Amplificación por PCREs necesario utilizar controles en todos los análisis:

Control Interno positivo (CIP): Este control permite verificar que se ha extraído correctamente el ADN de la muestra y que no hubo inhibición. Generalmente se utiliza un gen endógeno de la especie.

Control positivo GM: Consiste en una muestra (o control) que contiene la secuencia diana buscada. Confirma que la PCR funcionó correctamente.

Control negativo de PCR : Consiste en un tubo que contiene H20 en lugar de muestra. Permite detectar la presencia de contaminantes en los reactivos.

Control Negativo (no-GM): Reacción que se lleva a cabo sobre ADN extraído de un organismo vegetal, no GM. Permite detectar la existencia de falsos positivos. Utilizado generalmente como control de contaminación de la extracción de ADN.

Análisis de la PCR - Electroforesis

Muestra

Gen en

dógeno

Control –

Control +

Muestra

Gen en

dógeno

Control –

Control +

POSITIVO NEGATIVO

Muestra C – (PCR) C + GM CIP C (no-GM) Resultado

+ - + + - Positivo

- - + + - Negativo

+ - + + + Inconcluso

- - + - - Inhibición

- - - - - Inconcluso

Variantes de la PCR utilizadas para la detección de OGMsPCR Multiplex

Detección simultánea de varias secuencias diana (utilizado para detectar varios eventos de transformación a la vez).

Utiliza múltiples pares de cebadores - Tm similar entre todos los pares

- Muy específicos

- No deben formar dímeros entre sí

Los segmentos de ADN a amplificar, deben diferir en tamaño para poder ser resueltos mediante electroforesis. (PCR convencional)

PCR en Tiempo Real

Métodos CuantitativosDeterminan la cantidad de material transgénico presente en

materias primas o alimentos procesados.

PCR en Tiempo Real o qPCR

El fundamento de la Real Time PCR es el mismo que el de la PCR convencional.

Se basa en la detección del producto amplificado ciclo a ciclo.

La PCR se acopla a la detección de un

reportero fluorescente, cuya señal aumenta

en proporción a la cantidad de producto de

PCR generado en cada ciclo.

Fundamento de la qPCR

A medida que progresa la reacción, se recogen los datos de fluorescencia (Rn) y se construye un gráfico, respecto al tiempo de reacción (n° ciclos).

La cuantificación se realiza en la fase exponencial, donde la eficiencia es constante y existe buena correlación entre el producto amplificado y la concentración inicial de moléculas diana.

Cinética de amplificación

Cuanto más bajo es el valor de Ct, mayor es la cantidad inicial de ADN genómico en la muestra

Ciclo umbral (Ct)n° de ciclo en el cual la intensidad de fluorescencia se eleva por encima del ruido de la técnica y es proporcional al número de copias iniciales de la reacción.

Eficiencia de amplificación del 100%

Ct

Ventajas de la qPCR frente a la PCR convencional

Mayor precisión, y resolución.

Mayor especificidad.

Mayor sensibilidad (LOD =0.01% GM ~ 2-10 copias de ADN ).

Se pueden realizar ensayos cualitativos y cuantitativos.

No se requiere ningún proceso post-PCR

Se ahorra tiempo y se minimiza la contaminación.

Sistemas de detección de fluorescencia:

• Agentes intercalantes (SYBR Green)

• Sondas específicas marcadas con fluorocromos (TaqMan)

Agente intercalante SYBR Green

El colorante se une al surco menor del ADN bicatenario.

Como consecuencia de esta unión, se produce un

incremento de la señal fluorescente. A medida que

aumenta la cantidad de ADN sintetizado tras cada ciclo

del PCR, aumenta el número de moléculas de ADNdh y

así la emisión de fluorescencia.

Desventaja: No es específico de secuencia. Debe recurrirse al análisis de la curva de disociación

Análisis de la curva de disociación

Melting curve.

Se traza la primera derivada negativa (-

d(Rn)/dt) de la intensidad de fluorescencia

frente a la temperatura de reacción. Se genera

un pico característico a cada amplicón,

conocido como temperatura de disociación

(Tm). Mediante la comparación de Tm de los

productos de PCR, se puede detectar la

presencia de la secuencia de ADN buscada, y

discriminarla de la presencia de un amplicón no

objetivo adicional.

Características del SYBR Green

Ventajas:Versátil Bajo costo Alta sensibilidad Ideal para ensayos de presencia-ausencia GM

(screening, identificación de eventos)

Desventajas: Fluorescencia inespecífica Ajustar muy bien el sistema de amplificaciónEvitar fragmentos inespecíficos y dímeros de

cebadores.

Sondas de hidrólisis (TaqMan)

La sonda de hidrólisis es un

oligonucleótido de 20 bases de longitud,

que contiene un colorante fluorescente

en el extremo 5´, y un colorante

inhibidor (quencher) en el 3´. La

actividad nucleasa de la enzima ADN

polimerasa, cliva a la sonda de hidrólisis

durante la etapa de extensión del

amplicón, lo que produce una emisión

de fluorescencia en cada ciclo de PCR.

Esta emisión es proporcional a la

cantidad de producto formado.

Ventajas de la utilización de sondas TaqManDetección de productos de

manera específica.No requieren el análisis de

la curva de melting.

Diseño de sondas para cada sistema de análisis.

Detección simultanea de múltiples productos de amplificación (multiplex).

Límite de detección y cuantificación

Límite de detección (LOD): Menor concentración de ADN GM que puede ser detectada en 95% de las determinaciones (LOD Relativo en % m/m, LOD absoluto en n° de copias)

Técnica de qPCR: LOD Absoluto 2-10 copias GM

LOD Relativo 0,01% material GM

Límite de cuantificación (LOQ): Menor concentración de ADN GM que puede detectarse cuantitativamente con un nivel aceptable de precisión y exactitud.

Técnica de qPCR: LOQ Absoluto 100 copias GM

LOQ Relativo 0,1% material GM

El contenido relativo de OGM (porcentaje) se determina normalizando la cantidad de secuencias específicas del OGM con respecto a la cantidad de un gen específico de la planta.

Se realizan dos curvas patrón para realizar la cuantificación relativa:

Gen endógeno:

• Específico de la especie a analizar

• Presente en todas las variedades

• Copia única por genoma haploide

Secuencia transgénica

• Región común a distintas variedades (P-35S)

• Región específica (evento específico)

Cálculo del porcentaje:

Cuantificación Relativa de OGMs

% GM = ADN GM x 100 ADN Referencia

Soja: LectinaMaíz: Zeína, invertasa, hmga

Materiales de Referencia Certificados (MRC)Herramienta indispensable para asegurar la calidad de los métodos de

análisis.

Elementos con propiedades estables y uniformes autenticadas por una

institución reconocida especializada.

Cada uno se certifica en relación a la fracción másica o la cantidad de

copias de ADN de un evento específico (expresado en porcentaje GM).

Material homogéneo con cigosidad conocida.

Interpretación y reporte de resultadosExpresión de un resultado negativo:

x Nunca debe expresarse como …. “la muestra no contiene OGM”…Puede aparecer en el reporte …..”no se detectó la presencia la secuencia x” “no se detectó el evento x”

Expresión de un resultado positivo:

…”Se detectó la presencia de la secuencia x”…….”Se detectó la presencia del evento x”…

Cuantificación del contenido GM:

El contenido de OGM (especificar el OGM) según lo determinado por la detección de (especificar la secuencia diana buscada) derivado de (especificar especie) es X ± incertidumbre%. "(Especificar unidad utilizada.)

Etiquetado de alimentos

Alimento que contiene <1% material GM: No se etiqueta

Alimento que contiene >1% material GM: Se etiqueta

…..”Alimento genéticamente modificado”

…..”alimento producido a partir de (nombre de la especie) genéticamente modificado”

Monitoreo de productos comercializados en Uruguay

Fueron muestreados varios productos a base de maíz, tales como:

Tortillas de maíz – 12 muestrasProductos de copetín (snacks) – 19 muestrasCereales de maíz – 19 muestras

Screening de OGMs: Promotor 35S, Terminados nos Identificación de eventos: Mon810, Bt11, Ga21, TC1507 y Bt176. Cuantificación: CAMVP-35S

Resultadosn° muestras analizadas

presencia de CAMVP-35S y T-nos

Contenido GM> 1%

tortillas 12 8 4

snacks 19 16 10

cereales 19 8 4

Total 50 32 18

porcentaje 100% 64% 36%

Bt 11 Mon810 Ga21 TC1507 Bt176

positivos 24/32 21/32 10/32 4/32 0/32

porcentaje 75% 65,6% 31,2% 12,5% 0%

Formación de un Núcleo Interdisciplinario

UdelaR Agronomía, Química, Ciencias, Medicina, Nutrición, Abogacía, Sociología, RETEMA, …

MSP Ministerio Salud PúblicaMTVOT-DINAMA Dirección Medio AmbienteCNFR Comisión Nacional de Fomento RuralRed de Semillas Criollas ONGs Slow Food, Redes Amigos de la Tierra

etc ..

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Agradecimientos: SB-FC, UdelaR; LB-IM; Beatriz Paulino (BePé); Andrés Carrasco (RIP); Elena Álvarez-Buylla (UNAM)

Muchas gracias por vuestra atención

Claudio Martínez Debat, QF, PhD

LaTraMA ::: Laboratorio de Trazabilidad Molecular AlimentariaSección Bioquímica. Facultad de Ciencias.

Universidad de la República. Montevideo. Uruguay.

[email protected]

https://www.facebook.com/claudio.martinez.debat