separaÇÃo de proteinas por cromatografia 1.princípio geral da cromatografia a.matriz sólida...
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SEPARAÇÃO DE PROTEINAS POR CROMATOGRAFIA
1. Princípio geral da cromatografia
a.matriz sólida capaz de reter a molécula alvob.passagem (forçada ou não) do fluido contendo
a molécula alvo através da matriz c.retenção da molécula alvo por certo tempod.eluição separada dos componentes do fluido
e, consequentemente da molécula alvo
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Cromatograma e algumas variáveis características
(trB – trA)
0,5 (WbA + WbB)RS =
Resolução cromatográfica:
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- Eficiência da purificação é avaliada pela resolução cromatográfica (RS).
RS = (trB – trA) / 0,5 (WbA + WbB)
RS < 1 => separação incompleta RS = 1 => curvas se tocam na base RS > 1 => separação completa
* Normalmente a matriz é empacotada numa coluna (leito fixo)
** Variante: adsorção em leito fluidizado. Neste caso há movimento da matriz
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2. Tipos de cromatografia (quanto à retenção e liberação da molécula, em leito fixo)
2.1 Troca iônica- retenção baseada na carga da superfície da proteina/molécula- mais comum, de grande aplicabilidade (resinas têm alta capacidade de adsorver proteínas)- Tem boa seletividade- Separa a proteina das impurezas- A molécula alvo é eluída com íons de mesma carga que esta, porém com maior força de interação com a fase estacionária
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- A capacidade total de um trocador é dada pela quantidade de grupos carregados na fase móvel que podem ser trocados por unidade de volume ou massa de matriz.
- Ampliação de escala: aumento do volume da coluna (normalmente pelo aumento do seu diâmetro). Critério: velocidade superficial da fase líquida (vazão/área da seção da coluna)Obs.: manter constantes todas as demais variáveis
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2.2 Gel filtração- Separação por tamanho (volume efetivo) da molécula- Moléculas com volume efetivo maior que o poro são expulsas da coluna no volume espacial (Ve)
- Moléculas menores penetram nos poros e em seguida são arrastadas pelo eluente- A separação obedece a sequência de volume efetivo
2.3 Cromatografia hidrofóbica- Retenção da molécula pela interação da sua região hidrofóbica com a matriz- A proteína é colocada num meio com alta concentração de sal
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- A eluição é feita com um eluente de baixa concentração de sal ou aumentando-se o conteúdo de solvente orgânico- O gel é mais caro que a resina de troca iônica porém mais barato que as matrizes de afinidade
2.4 Focalização isoelétrica - Retenção ocorre num tipo especial de resina de troca iônica que contem grupos químicos que conferem um gradiente de pH- A eluição é feita com um fluido que contem um anfólito especialmente formulado
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- Permite separar isoproteínas (excelente reso-lução)- Gel e eluente são caros
aplicação nos estágios finais da purificação de produtos de alto valor agregado
2.5 Afinidade- A matriz é formada por um ligante bioespecífico e seletivo
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- O complexo formado entre o ligante e a proteína tem que ser reversível
- A molécula alvo é retida e as impurezas são eliminadas- Finalmente a proteína é eluída e o ligante regenerado
2.6 Fase reversa- Compreende uma fase estacionária apolar e uma fase móvel de polaridade moderada.- Quanto mais apolar for a molécula alvo maior será o seu tempo de retenção (e vice-versa). - Alterando-se as forças de interação entre as fases móvel e estacionária, promove-se a eluição da molécula alvo. Isto possibilita também regular o seu tempo de retenção.
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3. Cromatografia em leito fluidizado- Baseia-se na movimentação da matriz- Útil para purificar proteínas de soluções
contendo ou não material particulado (células suspensas ou fragmentos), uma vez que permite integrar as etapas de clarificação e purificação
grande interesse
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- Ideal para os casos em que não se aplica o sistema de leito empacotado e para reduzir perda por ação de proteases (redução de tempo)
Por exemplo, proteínas heterólogas sintetizadas
por E. coli estão frequentemente num meio que apresenta elevada viscosidade e contem fragmentos da parede da bactéria, características que o tornam inadequado para uma centrifugação e cromatografia em leito empacotado.
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Os ligantes clássicosSP – sulfapropil, DEAE – dietil aminoetil – e IDA –
ácido iminodiacético - para adsorção por troca iônica,
IgG - para adsorção por afinidade eStreamline Phenyl - para adsorção por
hidrofobicidade,são acoplados ao suporte das partículas adsorventes
(agarose-quartzo ou agarose-metal) elevando sua densidade, e viabilizando a expansão do leito
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Tipos de reatores contendo o meio adsorvente suspenso:
Reator agitado (mais simples)Processo clássico é o CARE (“Continuous Adsorption Recycle Extraction”)
Reator expandido
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Características dos fluidos• F1 (sup.) = solução tampão contendo a molécula
alvo, sob condições favoráveis à adsorção• F1 (inf.) = descarte - fase líquida rica em conta-
minantes e pobre em molécula alvo
•F3 (dir.) = suspensão do adsorvente, rico em molécula alvo, que alimenta o segundo reator •F3 (esq.) = suspensão do adsorvente reciclado do segundo reator
•F2 (sup.) = alimentação do tampão de eluição
•F2 (inf.) = solução rica em molécula alvo
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Reator expandido
O material adsorvente (sólido) tem uma densidade maior que a do líquido (eluente) que, por ser aplicado a uma velocidade superficial adequada, faz com que o leito sofra expansão
Analisar F1, F2 e F3 sob ponto de vista de vazão
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Reator expandido
O material adsorvente (sólido) tem uma densidade maior que a do líquido (eluente) que, por ser aplicado a uma velocidade superficial adequada, faz com que o leito sofra expansão
Analisar F1, F2 e F3 sob ponto de vista de vazão
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Esquema ilustrativo das etapas da adsorção em leito expandido.
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Variáveis importantes (para Leito expandido)
A expansão do leito e os fatores a ela associados interferem na ligação proteína-adsorvente
•Velocidade superficial do fluido (U), velocidade terminal da partícula (UT), porosidade () e índice de expansão (n) do leito
n
TUU
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n é função do número de Reynolds
• A velocidade superficial do fluido (U), também chamada de velocidade linear, é definida por:
•
Onde Q é a vazão de alimentação do leito (m3/h) e A é a área da seção transversal da coluna (m2).
AQU
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A velocidade linear varia entre 100 e 300 cm/h nas operações de expansão, aplicação do meio e lavagem. Na operação de eluição a velocidade linear é reduzida para cerca de 100 cm/h, o que eleva a concentração da molécula alvo no eluído.
Outras variáveis:- Grau de expansão do leito (GE = H/Ho)
H: altura do leito expandidoHo: altura do leito em repouso
valores típicos de GE: 2 a 3- Número de pratos teóricos- Distribuição do tempo de residência
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Dimensionamento para Cromatografia convencional
• Variáveis envolvidas:Número de colunas (Nco)Produção diária (Q)Capacidade da coluna por ciclo (Md)Número de ciclos por dia (Nci)
Q Nco =
Md . Nci
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Onde D é o diâmetro da coluna, V é a velocidade do fluido na saída e P é a concentração de proteína no eluído.
Considerando algumas situações limitantes do processo, pode-se chegar à expressão:
53050 . Q Nco =
D2 . V . P
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Purificação de pro-insulina por cromatografia de afinidade
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Cromatograma e algumas variáveis características
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Reator agitado Solução com molécula alvo
Fase rica em contaminantes
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Reator agitado Solução com molécula alvo
Tampão de eluição
Fase rica em molécula alvo
Fase rica em contaminantes
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Reator agitado Solução com molécula alvo
Tampão de eluição
Fase rica em molécula alvo
Fase rica em contaminantes
Adsorvente sem molécula alvo
Adsorvente com molécula alvo