Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 33(4): 285-292 (2018)http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.4.285 ISSN 1225-7117 / eISSN 2288-8268

정향으로부터 세균성 질염 치료를 위한 항균성 물질의 분리 및 정제

장지은1, 강동희1, 윤재우2, 김현수1*

Separation and Purification of Antimicrobial Substance from Syzyg-

ium aromaticum Merrill et Perry for Treatment of Microbial Vaginosis

Jieun Jang1, Dong-Hee Kang1, Jaewoo Yoon2, and Hyun-Soo Kim1*

Received: 17 September 2018 / Revised: 22 November 2018 / Accepted: 29 November 2018

© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract: Syzygium aromaticum Merrill et Perry (SA) has

traditionally been used as a preventive agent and medicine

against labor pain and infection. This study was conducted to

isolate the antimicrobial substance from SA that is effective

against microbial vaginosis. While hot water and ethyl ace-

tate extracts from SA did not show any antimicrobial activity,

methanol extract at 50 mg/mL showed antimicrobial activity

against Chryseobacterium gleum KCTC 2904, Proteus mira-

bilis KCTC 2510, Sphingomonas paucimobilis KCTC 2834,

and Candida albicans ATCC 10231. Among 95 fractions

obtained by silica gel column chromatography, fraction No.

23 had the greatest antimicrobial activity and broad antimi-

crobial spectrum against C. gleum KCTC 2904, P. mirabilis

KCTC 2510, S. paucimobilis KCTC 2834, and C. albicans

ATCC 10231. Moreover, the Rf 0.85 spot produced by TLC of

fraction No. 23 showed antibacterial activity against C. gleum

KCTC 2904. Isolation and purification of the single peak at a

retention time (Rt) of 24.989 min was achieved by HPLC of

Rf 0.85 spot, and the peak at Rt 24.989 min showed antibacte-

rial activity against C. gleum KCTC 2904, P. mirabilis KCTC

2510, S. paucimobilis KCTC 2834, and C. albicans ATCC

10231.

Keywords: Syzygium aromaticum merrill et perry extract, bac-

terial vaginosis, antimicrobial substance, Candida albicans,

Chryseobacterium gleum

1. INTRODUCTION

현대의학의 추세는 자연에서 얻어지는 천연물 유래 약물에

주목하고 있다. 합성의약품은 질병을 치료하기도 하지만 항

생제 내성균과 같은 심각한 부작용을 일으키기도 한다 [1].

천연물의 성분연구에 관한 관심이 증가하여 황백, 유백피, 방

기 등의 한약재 추출물에 대한 항균활성 연구가 많이 보고되

고 있다 [2-4]. 천연물은 인체 내에서 식균작용을 활성화하고,

항체의 생성을 촉진시키며, 체내 생화학적 수치들을 정상화

하는 등 질병에 대한 방어력을 증가시켜 만성질환을 예방하

고 치료할 수 있도록 하며, 면역반응을 강화시키거나 저하된

면역기능을 정상화시킴으로써 치료에 사용되기도 한다 [5,6].

본 연구에 사용된 정향 (clove, Syzygium aromaticum Merrill

et Perry)은 정향나무과 (Myrtaceae)의 꽃봉오리로 열대 각지

에서 재배되는 상록교목으로 전체의 길이가 1~2 cm 정도의

짧은 막대기 모양이다. 정향은 영어로 ‘clove’라고 하는데 이

는 정향의 생김새가 못처럼 생겼다고 하여 붙여진 이름이며

프랑스어의 ‘클루 (clou: 못)’에서 유래하였다. 정향은 어두운

갈색~어두운 적색을 띠고 길이 10~18 mm의 조금 편평한 사

능주상 (四稜柱狀)의 화상과 그 위쪽에는 두꺼운 꽃받침 4매

및 4매의 막질화판이 있고 화판은 서로 겹쳐서 거의 구형을

이룬다. 화판으로 쌓인 속에는 많은 수술과 한 개의 화주가

있다. 정향에서 특이한 냄새가 강하고 맛은 강렬하며 나중에

혀를 약간 마비시킨다 [7]. 정향은 가장 널리 알려지고 사용

1계명대학교 자연과학대학 기초과학부 생명과학전공1Major in Biological Sciences, Faculty of Basic Sciences, College ofNatural Science, Keimyung University, Daegu 42601, KoreaTel: +82-53-580-5284, Fax: +82-53-580-5284e-mail: hskim@kmu.ac.kr

2계명대학교 약학대학2College of Pharmacy, Keimyung University, Daegu 42601, Korea

Research Paper

286 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 33(4): 285-292 (2018)

되는 향신료 중에 하나로 서양에서는 일반적으로 향신료와

방부제로 사용하였지만, 동양에서는 정향 또는 정향의 추출

물이 이뇨제, 치통, 건위제, 강심제 등의 한약재로도 사용되

어왔다 [8]. 정향 추출물은 Helicobacter pylori의 성장을 억제

한다고 보고되었으며 [7,10], 정향 에탄올 추출물은 penicillin

G에 내성을 보이는 포도상구균에 대하여 항균작용을 나타내

는 것으로 보고되었다 [11]. 정향의 성분은 정유가 15~20%이

며, 그중 eugenol이 70~85%이다. Eugenol은 phenylpropanoid

의 일종으로 Brucella균, 결핵균, 피부병원성 백선균, 황선균

(黃癬菌) 등에 대하여 항미생물작용을 나타내는 것으로 보고

되었다 [10]. 또한 eugenol은 건위작용 [12], 항바이러스작용

[13-15], 중추신경 억제작용 [7,11-13]도 알려져 있다. 정향유

는 pepsin의 분비를 증가시켜 건위작용을 나타내는 것으로

알려져 있다 [7,15]. 정향의 성분인 tellimagrandin은 tannin의

일종으로 바이러스가 세포에 융합되는 과정 (syncytia format-

ion)을 억제하는 것으로 보고되었다 [14]. 정향유는 강력한 혈

소판응집 저해작용을 가지고 있으며, 국소마취와 약한 진통

작용이 있어 치과에서 오래전부터 eugenol을 산화아연과 paste

상태 (ZOE)로 혼합하여 사용해왔으나 최근에는 잘 쓰이지

않는다 [7-9]. 식물성 약제는 현재 전 세계 인구의 약 80%가

안전하다고 간주되고 특정 질환의 치료에 효과적일 때 필요

성을 충족시키기 위해 약품으로서 의존하고 있다 [19,20].

본 연구에 사용된 균인 Chryseobacterium gleum KCTC

2904는 여성의 외음부와 질에 염증을 일으킨다. 근본 원인은

정상적으로 질 내에 존재하는 세균총의 변화, 소위 균 교대현

상과 이에 따른 혐기성 세균의 과도한 증식에 따른 것으로 알

려져 있으며, 생육저해를 위한 많은 연구가 수행되고 있다 [21-

26]. 특히 또 다른 질염균으로 잘 알려진 Candida albicans의

생육을 저해하는 연구가 수행되었다 [27,28]. 본 연구에서는

선행연구인 [29] 대황 추출물의 효과와 유사한 결과로서 한

약재로 쓰이고 있는 정향을 추출 및 정제하여, 질에 유용한

유산균은 억제하지 않으면서 다양한 질염유발균주에 대해

생육저해능을 보이는 유효물질의 분리를 수행한 결과를 보

고하고자 한다. 또한 본 연구자는 정향으로부터 새로운 항균

효과와 생리활성기능이 있는 신규물질의 탐색과 응용면을

확립하기 위하여, 다양한 균에 대한 항균효과의 결과를 보고

하고자 한다.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. 실험재료

2.1.1. 사용한 한약재

본 실험에 사용한 한약재는 Table 1에서 보는 바와 같이 원산

지가 인도네시아인 정향을 사용하였다. 정향은 (주)진우제약

에서 수입하고 ‘자연초’에서 판매하는 정향을 구입하여 실온

에서 보관하여 사용하였다.

2.1.2 균주배양 및 사용배지

본 실험에서 사용한 균주 (Table 2)는 생물자원센터 (KCTC)

로부터 분양을 받았으며, Lactobacillus sp.는 Lactobacilli

MRS broth (Difco Co., USA)에 Chryseobacterium sp.와 Pro-

teus sp.는 nutrient broth (Difco Co., USA), Sphingomonas sp.

는 R2A (Difco Co., USA)에 계대배양한 후 균체를 40% gly-

cerol이 포함된 보존용액에 넣어 보관하였으며, 실험에 사용

하기 전 계대배양하여 사용하였다. 고체배지는 agar 20 g/L

(Duksan Co., Korea)를 첨가하여 제조 후 사용하였다.

2.2. 한약재 추출

한약재의 추출은 ethyl acetate와 ethanol을 이용한 유기용매

추출과 열수 추출을 통해 수행하였다. 한약재의 유기용매 추

출은 한약재 무게의 10배량 (w/v)의 99% ethyl acetate, 95%

ethanol을 각각 첨가하여 28oC에서 24시간 동안 진탕하여 수

행하였으며, 한약재의 열수 추출은 한약재 무게의 10배량

(w/v)의 dH2O를 첨가하여 100oC에서 30분간 가열하여 수행

하였다. 각 추출액은 여과지 (HYUNDAI Micro Co., Korea)로

여과하여 50oC의 water bath (EYELA, Japan)와 rotary vacuum

evaporator (EYELA, Japan)를 이용하여 농축하였다. 농축물

은 dH2O, 99% ethyl acetate와 95% ethanol을 각각 사용하여

일정 농도로 용해한 후 15 mL tube에 넣어 냉장 보관하여 실

험에 사용하였다.

2.3 정향 methanol 추출물 제조

정향은 10 g을 100 mL의 methanol에 첨가하여 24시간 진탕

하여 추출하였다. 추출액은 여과하여 rotary vacuum evapora-

tor (EYELA, Japan)를 이용하여 농축하였다. 정향 methanol

추출물을 농축한 후 methanol을 이용하여 각각 10 mg/mL과

50 mg/mL의 농도로 조정하여 실험에 사용하였다.

2.4. 항균활성 측정

추출물의 항균활성은 paper disc를 이용한 agar diffusion 방법

Table 1. List of Korean medicinal plants used for antimicrobial

experiments

Korean Scientific name Effective Part

정향 Syzygium aromaticum Flower bud

Table 2. Strains used for anti-microbial activity

Strains Oxygen preference Temperature (oC) SourceLactobacillus coleohominis KCTC 21007 Aerobic 37 Vagina of healthy woman

Candida albicans ATCC 10231 Aerobic 28 Man with bronchomycosisChryseobacterium gleum KCTC 2904 Aerobic 28 High vaginal swab, London U.K

Sphingomonas paucimobilis KCTC 2834 Aerobic 30 Vaginal swabProteus mirabilis KCTC 2510 Aerobic 37 Human vagina

정향으로부터 세균성 질염 치료를 위한 항균성 물질의 분리 및 정제 287

으로 확인하였으며 항균활성 측정을 위한 배지는 각 균주의

최적 생육배지로 혼합 평판법을 이용하여 제조하였다. 추출

물은 paper disc (∅= 6 mm, ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha,

Ltd., Japan)에 20 μL를 첨가하여 건조시킨 후 시험균주가 접

종된 평판배지 위에 얹은 다음, 추출물이 포함된 paper disc를

올린 배지는 시험 균주의 배양일수 및 배양온도에 따라 배양

하였다. 추출물의 항균활성은 생성된 inhibitory zone의 유무

및 크기를 통해 판단하였다.

2.5. Silica gel column chromatography

Silica gel column chromatography는 항균활성 물질의 분리를

위해 수행하였다. 정향의 methanol 추출물은 ethanol 추출물

과 ethyl acetate 및 열수 추출물보다 질염유발 균주에 높은 항

균활성을 나타내어 silica gel column chromatography의 시료

로 사용하였다. 정향의 methanol 추출물은 50 mg/mL의 농도

로 조정한 후 99% methylene chloride로 평형화시킨 silica gel

column (∅ = 4×30 cm)에 5 mL를 첨가하였으며, methylene

chloride : methanol를 9:1, 7:3, 5:5, 3:7 농도별로 조정 후 용매

로 용출하여 분획하였다. 분획은 rotary vacuum evaporator

(EYELA, Japan)를 이용하여 농축 후 methanol 100 µL에 용해

후 항균활성을 확인하였다.

2.6. Thin Layer Chromatography (TLC)

정향 methanol 추출물을 이용한 silica gel column chromatog-

raphy를 통해 분취한 분획은 농축 후 methanol를 첨가하여 50

mg/mL의 농도로 용해하였으며, 항균성 물질의 분리를 위해

분석용과 분취용 TLC를 수행하였다. 분석용 TLC는 TLC

plate (Silica gel 60 F254, Merck Co.)의 하단으로부터 1 cm 위

에 50 mg/mL의 정향 methanol 추출물을 5 μL 점적하였으며,

hexane : methylene chloride : ethyl acetate = 6:1.5:3의 비율로

혼합한 전개용매를 이용하여 수행하였다. 분취용 TLC는

TLC plate에 정향 methanol 추출물을 40 μL 점적하였으며,

hexane : methylene chloride : ethyl acetate = 6:1.5:6의 비율로

혼합한 전개용매를 이용하여 수행하였다. 전개한 분석용

TLC plate와 분취용 TLC plate는 UV lamp의 245 nm와 365

nm을 이용하여 spot을 확인하였다. TLC plate로 전개시킨 분

획의 각 spot은 Rf를 확인 후 다른 spot과 분리하고 회수하여

95% methanol 100 µL로 용출시킨 후 rotary vacuum evapora-

tor (EYELA, Japan)를 이용하여 농축하였다. 농축액은 50

mg/mL로 조정 후 항균활성을 확인하였다.

2.7. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

TLC를 통해 회수한 spot 중 항균활성을 나타내는 spot은

HPLC (Shimadzu LC 10-A, Japan)를 사용하여 분석하였다.

항균활성을 나타내는 분획은 methanol과 H2O를 6:4로 한 이

동상을 이용하여 유속을 0.7 mL/min로 조정한 HPLC에 10

μL를 주입하여 분석하였다. 주입 후 HPLC 분석은 UV-visible

detector (SPD-10A)를 사용하여 253 nm에서 측정하여 수행하

였다.

3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 정향 추출물의 항균활성

정향의 열수 및 유기용매 추출물은 Fig. 1에서 보는 바와 같이

질염 유발 균주인 C. gleum KCTC 2904, S. paucimobilis KCTC

2834과 C. albicans ATCC 10231, 건강한 여성의 질에서 분리

된 유용균주인 L. coleohominis KCTC 21007에 대한 항균활

성을 확인하였다. 정향 추출물의 C. gleum KCTC 2904에 대

한 항균활성은 열수 추출물의 경우 Fig. 1(A) a’에서 보는 것

과 같이 항균활성을 나타내지 않았으나, ethyl acetate 추출물,

ethanol 추출물과 methanol 추출물의 경우 Fig. 1(A) b’, c’와

d’에서 보는 것과 같이 각각 10 mm, 11 mm와 16mm의 inhib-

itory zone을 나타내었다.

정향 추출물의 S. paucimobilis KCTC 2834에 대한 항균활

성은 열수 추출물과 ethyl acetate 추출물의 경우 Fig. 1(B) a’

와 b’에서 보는 것과 같이 항균활성을 나타내지 않았으나,

ethanol 추출물과 methanol 추출물의 경우 Fig. 1(B) c’와 d’에

서 보는 것과 같이 각각 10 mm와 15 mm의 inhibitory zone을

나타내었다.

정향 추출물의 L. coleohominis KCTC 21007에 대한 항균활

성은 Fig. 1(C)에서 보는 것과 같이 열수 추출물, ethyl acetate

추출물, ethanol 추출물과 methanol 추출물을 50 mg/mL의 농

도로 조정하여 확인한 결과 모든 추출물에서 항균활성을 나

Fig. 1. Anti-microbial activity of extracts from Syzygium aromaticumMerrill et Perry (SA) against C. gleum KCTC 2904 (A), S. paucimo-bilis KCTC 2834 (B), L. coleohominis KCTC 21007 (C), and C.albicans ATCC 10231 (D). a: dH2O, b: ethyl acetate, c: ethanol, d:methanol, a’: dH2O extract from SA (50 mg/mL), b’: ethyl acetateextract from SA (50 mg/mL), c’: ethanol extract from SA (50 mg/mL), d’: methanol extract from SA (50 mg/mL).

288 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 33(4): 285-292 (2018)

타내지 않는 것으로 확인되어, 건강한 여성의 질에서 분리된

유용균주인 L. coleohominis KCTC 21007의 증식을 억제하지

않는 것으로 확인되었다.

정향 추출물의 C. albicans ATCC 10231에 대한 항균활성은

열수 추출물, ethyl acetate 추출물과 ethanol 추출물의 경우

Fig. 1(D) a’, b’와 c’에서 보는 것과 같이 항균활성을 나타내

지 않았으나, methanol 추출물의 경우 Fig. 1(D) d’에서 보는

것과 같이 각각 13 mm의 inhibitory zone을 나타내었다.

정향 methanol 추출물은 열수 추출물, ethyl acetate 추출물

과 ethanol 추출물에서보다 C. gleum KCTC 2904, S. pauci-

mobilis KCTC 2834와 C. albicans ATCC 10231에 높은 항균

활성을 나타내어, 항균활성 물질을 분리하기 위한 추출물로

사용하였다.

3.2. 정향 methanol 추출물의 항균활성 물질 분리

3.2.1 Silica gel column chromatography

정향의 methanol 추출물은 다른 추출물보다 C. gleum KCTC

2904, S. paucimobilis KCTC 2834와 C. albicans ATCC 10231

에 높은 항균활성을 나타내었으며, 다른 추출물과 달리 10

mg/mL의 농도로 C. gleum KCTC 2904에 처리하여도 항균활

성을 나타내어 항균활성 물질 분리를 위해 silica gel column

chromatography를 수행하였다. 정향의 methanol 추출물은

silica gel column에 주입 후 5가지 전개용매로 용출하여 15

mL씩 분획하여 총 95개를 분취하였다. 각 분획은 농축한 후

95%의 methanol을 첨가하여 5 mg/mL의 농도로 용해하여 각

분획의 최대 흡수 파장인 255 nm로 확인한 결과 Fig. 2에서

보는 바와 같이 21번, 22번, 23번과 24번의 분획에서 흡광도

가 높게 확인되었다. 50 mg/mL의 농도로 용해한 각 분획은

항균활성 및 TLC 분석을 위해 사용하였다.

3.2.2 항균활성 확인

1~95번 분획의 항균활성은 50 mg/mL의 농도로 조정하여 확

인한 결과 Fig. 3과 Table 3에서 보는 바와 같이 확인되었다.

Fig. 3에서 보는 바와 같이 95개의 분획 중 질염유발 균주인

Fig. 2. Separation of antimicrobial substance from fractions number1~95 by silica gel colmun chromatography of methanol extracts fromSyzygium aromaticum Merrill et Perry against C. gleum KCTC 2904,P. mirabilis KCTC 2510, S. paucimobilis KCTC 2834, and C. albi-cans ATCC 10231.

Fig. 3. Anti-bacterial activity of fractions number 21~30 by silica gel column chromatography of methanol extracts from Syzygiumaromaticum Merrill et Perry against C. gleum KCTC 2904 (A), P. mirabilis KCTC 2510 (B), and S. paucimobilis KCTC 2834 (C).

Table 3. Antimicrobial activity of fraction by silica gel column chromatography of methanol extracts from Syzygium aromaticum Merrill

et Perry

FractionKCTC 2904 KCTC 2510 KCTC 2834 ATCC 10231 KCTC 21007

inhibitory zone(Ø, mm)No. 1~20 - - - - -

No. 21 11 8 10 8 -No. 22 14 10 11 11 -No. 23 20 12 17 13 -No. 24 17 10 12 13 -

No. 25~95 - - - - --: No inhibition

정향으로부터 세균성 질염 치료를 위한 항균성 물질의 분리 및 정제 289

C. gleum KCTC 2904, P. mirabilis KCTC 2510, S. paucimobilis

KCTC 2834, C. albicans ATCC 10231에 항균활성을 나타낸 분

획은 255 nm에서 흡광도가 높게 확인되었던 21번, 22번, 23

번과 24번으로 확인되었다. 50 mg/mL의 농도로 조정한 21번,

22번, 23번과 24번 분획의 항균활성은 Table 3에서 보는 바와

같이 C. gleum KCTC 2904에 각각 11 mm, 14 mm, 20 mm와

17 mm의 inhibitory zone으로 확인되었으며, P. mirabilis

KCTC 2510에 각각 8 mm, 10 mm, 12 mm와 10 mm, S. pauci-

mobilis KCTC 2834에 각각 10 mm, 11 mm, 17 mm와 12 mm

의 inhibitory zone으로 확인되었다. 진균인 C. albicans ATCC

10231에 대한 21번, 22번, 23번과 24번 분획의 항균활성은 각

각 8 mm, 11mm, 13 mm와 13 mm의 inhibitory zoned으로 확

인되었다. 21번, 22번, 23번과 24번 분획을 제외한 나머지 분

획은 Table 3에서 보는 바와 같이 C. gleum KCTC 2904을 포

함한 4가지 균주에서 항균활성을 나타내지 않았다.

3.2.3 TLC에 의한 분석

분석용 TLC는 silica gel column chromatography를 통해 분취

된 분획 중 항균활성이 확인된 21번, 22번, 23번과 24번 분획

을 대상으로 수행하였으며, 21번, 22번, 23번과 24번 분획의

물질 이동 양상을 확인하기 위해 25~30번 분획을 대상으로도

수행하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 C. gleum KCTC 2904

을 포함한 4가지 질염유발 균주에 높은 항균활성을 나타낸

22번과 23번 분획은 TLC를 수행하여 TLC plate를 365 nm의

UV lamp와 254 nm의 UV lamp로 조사하였을 때 여러 spot이

확인되었다. 21번 분획은 TLC를 수행하여 TLC plate를 254

nm의 UV lamp로 조사하였을 때 점적한 부위에서 이동한 한

개의 spot이 확인되었다. 분취용 TLC는 95개의 분획 중 질염

유발 균주인 C. gleum KCTC 2904, P. mirabilis KCTC 2510,

S. paucimobilis KCTC 2834, C. albicans ATCC 10231에 가장

높은 항균활성을 나타낸 23번 분획을 대상으로 수행하였다.

Fig. 5에서 보는 바와 같이 23번 분획을 50 mg/mL의 농도로

하여 40 μL를 점적한 분취용 TLC plate는 분석용 TLC plate에

서보다 더 많은 spot이 확인되었다. 23번 분획을 점적하여 전

개한 분취용 TLC plate는 1×10 cm로 자른 후 C. gleum KCTC

2904, P. mirabilis KCTC 2510, S. paucimobilis KCTC 2834, C.

albicans ATCC 10231이 접종된 평판배지에 얹어 10분 후에 제

Fig. 4. TLC analysis of fraction number 21~24 by silicagel columnchromatography of methanol extract from Syzygium aromaticumMerrill et Perry. Spotting; 5 μL, Developing solvent; hexane : methy-lene chloride : ethyl acetate = 6:1.5:3, A : 254 nm, B: 365 nm.

Fig. 5. Anti-microbial activity of spots by TLC analysis against S.paucimobilis KCTC 2834 (A), C. gleum KCTC 2904 (B), P. mira-bilis KCTC 2510 (C), and C. albicans ATCC 10231 (D).

290 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 33(4): 285-292 (2018)

거하였다. TLC plate를 제거한 배지는 균의 최적생육 온도인

28oC와 35oC에서 배양하여 항균활성을 확인하였다. 그 결과

Fig. 5에서 보는 바와 같이 UV lamp의 365 nm에서 조사하여

확인된 Rf 0.85와 Rf 0.80의 spot이 C. gleum KCTC 2904, P.

mirabilis KCTC 2510, S. paucimobilis KCTC 2834와 C. albi-

cans ATCC 10231에서 항균활성을 나타내는 것으로 확인되었

다. C. gleum KCTC 2904, P. mirabilis KCTC 2510, S. pauci-

mobilis KCTC 2834와 C. albicans ATCC 10231에 항균활성

을 나타내는 spot을 확인하기 위해 Rf 0.59, Rf 0.65, Rf 0.73, Rf

0.77, Rf 0.85와 Rf 0.90은 회수하였으며, 회수한 각 spot은 95%

의 methanol을 첨가하여 추출 후 농축하여 항균활성을 확인

하였다. 그 결과 Fig. 6A에서 보는 바와 같이 Rf 0.85의 spot이

S. paucimobilis KCTC 2834에서 12 mm의 항균활성을 나타내

었고, Fig. 6B에서 보는 바와 같이 Rf 0.85의 spot이 C. gleum

KCTC 2904에 11 mm의 항균활성을 나타내었다.

3.2.4 HPLC에 의한 분석

C. gleum KCTC 2904에 항균활성을 나타낸 23번 분획의 Rf

0.85인 spot은 회수를 하여 99%의 methanol을 사용해 20 mg/

mL의 농도로 용해시킨 후 이동상을 methanol과 H2O를 6:4로

하여 유속을 0.7 mL/min로 조정한 HPLC에 10 μL를 주입하여

분석하였다. 그 결과 Fig. 7에서 보는 바와 같이 23번 분획의

Rf 0.85인 spot은 retention time (Rt) 24.989분에 높은 peak가

확인되었으며, Rt 24.989분의 peak는 HPLC의 peak 면적에 대

한 백분율로 확인하였을 때 97.722%로 확인되었다. Rt 24.989

분의 peak 물질은 분취 후 농축하여 99%의 methanol을 사용

해 50 mg/mL의 농도로 용해시켰으며, C. gleum KCTC 2904

에 항균활성을 확인하였다. 그 결과 Rt 24.989분의 peak에서

분취한 물질의 항균활성은 Fig. 8A에서 보는 바와 같이 C.

gleum KCTC 2904에서 12 mm, Fig. 8B에서 보는 바와 같이 P.

mirabilis KCTC 2510에서 9 mm, Fig. 8C에서 보는 바와 같이

S. paucimobilis KCTC 2834에서 11 mm로 확인되었다, Rt

24.989분의 peak에서 분취한 물질의 질내유용 유산균주인 L.

coleohominis KCTC 21007에 대한 항균활성은 Fig. 8D에서

보는 바와 같이 확인되지 않았다.

4. CONCLUSION

본 연구에서는 여성들이 흔히 걸리는 질병 중 하나인 세균성

질염은 질 내 유용 유산균 수가 줄어들면서 다른 세균 종들이

많이 자라는 것이 원인이 된다. 유용 유산균과 유해세균을 모

두 죽이기만 하는 항생제로는 재발이 쉽고, 반복하여 항생제

를 사용하게 되면 내성이 생길 확률이 높다. 따라서 질 내 유

Fig. 6. Anti-bacterial activity of spots bt TLC analysis against S.paucimobilis KCTC 2834 (A) and C. gleum KCTC 2904 (B). a~e:spots named by Rf. a: 0.95, b: 0.90, c: 0.85, d: 0.77, e: 0.73.

Fig. 7. HPLC analysis of active fraction (Rf 0.85 spot from fractionnumber 23) by silica gel column chromatography and TLC analysis.Column; HAIsil C18 5 micron, 250×4.6 mm, Mobile phase; metha-nol : H2O = 6:4, Flow rate; 0.7 mL/min, Detection; 253 nm, Injec-tion; 10 μL.

Fig. 8. Anti-bacterial activity of extracts from Syzygium aromaticumMerrill et Perry (SA) against C. gleum KCTC 2904 (A), P. mirabilisKCTC 2510 (B), S. paucimobilis KCTC 2834 (C), and L. coleoho-minis KCTC 21007 (D). a: methanol, b: methanol extract from SA(50 mg/mL), c: fractions by silica gel column chromatography No.23, d: spots by TLC analysis Rf 0.85, e: fraction of Rt 24.989 byHPLC.

정향으로부터 세균성 질염 치료를 위한 항균성 물질의 분리 및 정제 291

용 유산균은 죽이지 않으면서 질염균을 억제시킬 수 있는 항

균성 물질을 천연물질에서 확인 후 분리하고자 하였다.

한약재 methanol 추출물 중 정향 추출물은 50 mg/mL로 처

리하였을 때 C. gleum KCTC 2904, P. mirabilis KCTC 2510,

S. paucimobilis KCTC 2834, C. albicans ATCC 10231에 항균

활성을 나타내었으며, 질 내 유용 유산균인 L. coleohominis

KCTC 21007에 항균활성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

따라서 정향의 methanol 추출물 중 본 연구의 목적에 적합한

물질의 존재가 추정되었고, 항균활성이 크게 확인되어 정향

methanol 추출물 중 항균활성 물질을 분리하고자 하였다. 정

향 추출물은 유기용매추출법으로 항균활성 물질을 분리하

였으며, 그 추출물들 중 정향의 methanol 추출물이 C. gleum

KCTC 2904에 대한 항균활성이 가장 높게 확인되었다. 정향

의 methanol 추출물은 다른 분획물과 달리 10 mg/mL의 농도

로 C. gleum KCTC 2904에 처리하여도 항균활성을 나타내어

항균활성 물질 분리를 위해 silica gel column chromatography

를 수행하여 분획하였다. 총 95개의 분획 중 C. gleum KCTC

2904에 항균활성을 보였던 분획은 21번, 22번, 23번과 24번

분획으로 확인되었으며, 분획 중에서 23번 분획의 항균활성

이 높았다. TLC를 이용하여 23번 분획은 전개 후 항균활성

물질로 추정되는 spot을 각각 분리하여 회수하였으며, Rf 0.85

의 spot이 C. gleum KCTC 2904에 11 mm의 항균활성을 나타

내었다. 23번 분획의 Rf 0.85인 spot은 HPLC를 이용해 분석한

결과 retention time (Rt) 24.989분에 높은 peak가 확인되었으

며, Rt 24.989분의 peak는 HPLC의 peak 면적에 대한 백분율

로 확인하였을 때 98.722%로 확인되었다.

Rt 24.989분의 peak 물질의 항균활성은 분취 후 농축하여

확인한 결과 C. gleum KCTC 2904에서 12 mm, P. mirabilis

KCTC 2510에서 9 mm, S. paucimobilis KCTC 2834에서 11

mm로 확인되었다, 이러한 결과로 정향 추출물로부터 분리한

물질은 질의 유해균주인 C. gleum KCTC 2904에 항균활성을

나타내며, 질 내 유용균주인 L. coleohominis KCTC 21007에

항균활성을 나타내지 않아 질염 개선 소재로서의 개발 가능

성을 확인하였다.

Acknowledgements

이 논문은 2018년도 정부 (교육부)의 재원으로 한국연구재단

의 지원을 받아 수행된 기초연구사업입니다 (NRF-2017R1D

1A1B03036147).

REFERENCES

1. Song B. K. (1997) Effects of several herbs on the immune res-

ponses. J. Korean Med. Sci. 18: 43-57.

2. Park U. V., D. S. Chang, and H. R. Cho (1992) Antimicrobial eff-

ect of lithospermi radix (Lithosperum erythrorhizon) extract. Kor.

J. Soc. Food Nutr. 21: 97-100.

3. Park U. Y, D. S. Chang, and H. R. Cho (1992) Screening of anti-

microbial activity for medicinal herb extracts. Kor. J. Soc. Food

Nutr. 21: 91-96.

4. Lee H. Y, C. K. Kim, T. K. Sun, T. K. Mun, and C. J. Lim (1992)

Antibacterial activity of Ulmus pimila L. extract. Kor. J. Micro-

bial. Biotechnol. 20: 1-5.

5. Burns J. J., L. Zhao, E. W. Taylor, and K. Spelman (2010) The

influence of traditional herbal formulas on cytokine activity. Toxi-

col. 278: 140-159.

6. Kim N. Y., H. J. Kim, J. H. Lee, E. K. Lee, O. H. Kang, et al.

(2011) Comparison of the anti-inflammatory effects of water fer-

mented and ethanol fermented extracts from Rhei Radix et Rhi-

zoma. Kor. J. Herbol. 25: 227-233.

7. Kim. H. J., J. S. Lee, E. R. Woo, M. K. Kim, B. S. Yang, et al.

(2001) Isolation of virus-cell fusion inhibitory components from

Eugenia caryophyllata. Planta Med. 67: 277-279.

8. Leuschner R. G. K. and J. Zamparini (2002) Effects of spices on

growth and survival of Escherichia coli O157 and Salmonella ent-

erica serovar Enteritidis in broth model systems and mayonnaise.

Food Control 13: 399-404.

9. Menon. K. V., and S. R. Garg (2004) Inhibitory effect of clove oil

on Listeria monocytogenes in meat and cheese. Food Microbiol.

21: 647-650.

10. Mytle. N., G. L. Anderson, M. P. Doyle, and M. A. Smith (2006)

Antimicrobial activity of clove (Syzgium aromaticum) oil in inhib-

iting Listeria monocytogenes on chicken frankfurters. Food Con-

trol 17: 102-107.

11. Sharma. M., G. P. Rauniar, and B. P. Das (2012) Experimental

study of various central nervous system effects of eugenol in mice

and rats. Sharma. M. 10: 208-214.

12. Said. M. M. and M. M. Rabo (2017) Neuroprotective effects of

eugenol against aluminiuminduced toxicity in the rat brain. Arh

Hig Rada Toksikol. 68: 27-37.

13. Yoshifumi. I. (2006) Effects of eugenol on the central nervous sys-

tem: Its possible application to treatment of Alzheimer’s disease,

depression, and Parkinson’s disease. Curr. Bioactive Compound 2:

57-66.

14. Solmaz. M. N., Ö. Hilal, and B. Nurşen (2017) Pharmacological

and toxicological properties of Eugenol. Turk. J. Pharm. Sci. 14:

201-206.

15. Kumar. S. S. and L. Veerakumari (2017) Effect of ethanol extract

of syzygium aromaticum on fumarate reductase and succinate

dehydrogenase of haemonchus contortus Veerakumari. J. Global

Trends. Pharm. Sci. 8: 4648–4655.

16. Orhan, I. E., B. Özçelik, M. Kartal, and Y. Kan (2012) Antimicro-

bial and antiviral effects of essential oils from selected Umbellif-

erae and Labiatae plants and individual essential oil components.

Turk. J. Biol. 36: 239-246.

17. Gavanji S., S. S. Sayedipour, B. Larki, and A. Bakhtari (2015)

Antiviral activity of some plant oils against herpes simplex virus

type 1 in Vero cell culture. J. Acute Medicine. 5: 62-68.

18. Benencia. F. and M. C. Courreges (2000) In vitro and in vivo activ-

ity of eugenol on human herpesvirus. Phytother. Res. 14: 495-500.

19. Mora. S. L. and K. K. Nair (1994) Pollution of streams and conser-

292 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 33(4): 285-292 (2018)

vation of fisheries. J. Environ. Biol. 10: 147-166.

20. Joe, M. M., J. Jayachitra, and M. Vijayapriya (2009) Antimicrobial

activity of some common spices against certain human pathogens.

J. Med. Plants Res. 3: 1134-1136.

21. Kim K. K., H. K. Yoon, and H. C. Woo (1981) Analysis of Lacto-

bacillus species isolated from the vagina of Korean women. J. Kor.

Soc. Microbiol. 10: 35-38.

22. Park M. Y., H. M. Park, J. S. So, and S. C. Kim (2004) Microbio-

logic and molecular genetic analysis of Lactobacillus spp. isolated

from vagina of korean women and a pilot clinical study on the

treatment of vaginitis using the best Lactobacillus strain KLB 46.

Obstet. Gynecol. Sci. 47: 1154-1155.

23. Kim K. T. (2003) Treatment and diagnosis of bacterial vaginosis.

J. Womens Med. 32: 132-136.

24. Joe S. N. (2004) Vaginal infections. Obstet. Gynecol. Sci. 33: 77-

85.

25. Paek N. S., Y. Y. Lee, S. H. Han, C. H. Kang, and J. S. So (2016)

Characterization and inhibitory activity of Lactobacillus planta-

rum MG989 and Lactobacillus fermentum MG901 isolated from

vaginal microbiota of Korean women against Gardnerella vagina-

lis and Candida albicans. KSBB J. 31: 40-45.

26. Oh C. R. and H. B. Cho (2012) Rapid detection of Lactobacillus

genus inhabiting in vagina of 20's healthy women using multiplex

PCR. Kor. J. Microbiol. 48: 309-310.

27. Garg A, S. Singh (2011) Enhancement in antifungal activity of

eugenol in immunosuppressed rats through lipid nanocarriers. Col-

loids. Surf. B. 87: 280-288.

28. Cortés-Rojas. D. F., C. R. Fernandes de Souza, and W. P. Oliveira

(2014) Clove (Syzygium aromaticum): A precious spice. Asian Pac.

J. Trop. Biomed. 4: 90-96.

29. Jang. J., D. H. Kang, J. Yoon, and H. S. Kim (2017) Isolation and

characterization of an antibacterial substance from Rheum palma-

tum for treatment of bacterial vaginosis. KSBB J. 32: 133-139.

정향으로부터 세균성 질염 치료를 위한 항균성 물질의 분리 및 정제Abstract1. INTRODUCTION2. MATERIALS AND METHODS3. RESULTS AND DISCUSSION4. CONCLUSIONREFERENCES