BUNSEKI KAGAKU Vol. 54, No. 12, pp. 1189_1195（2005） 1189© 2005 The Japan Society for Analytical Chemistry

報　　文

1 緒　　　言

溶液中に存在する細胞や微生物を操作し選択的に特定の

細胞を分離・抽出する技術は生化学研究にとどまらず，医

療・食品・衛生検査まで幅広い分野で必要とされている重

要な基盤技術である．従来，微生物群からの目的微生物の

分離には選択培地を用いたコロニーカウント法が用いられ

ているが，選択培地上で微生物を培養する必要があり，時

間がかかる，培養できない微生物には適用できないなどの

問題点がある．そのため近年，免疫学的な手法，遺伝子的

な手法，微生物の大きさなどの物理的な違いを用いた手

法，微生物の電気的特性の相違を利用した手法など様々な

微生物分離法が開発されている．免疫学的な手法及び遺伝

子的な手法では，対象微生物に存在する抗原やアクセプタ，

DNAとそれらと特異的に反応する抗体，リガンド，DNA

の相互作用を用いて対象微生物を固相上に固定化し分離を

行っている．これらの生体高分子の特異性は極めて高く，

高純度な分離が可能である．しかし，これらの手法は対象

微生物のみが発現する生体高分子の存在を前提としてお

り，それと相補的な分子が必要であり，その分子の調整に

時間とコストを要する．微生物の大きさや質量で分ける手

法には対象微生物の大きさに適したメッシュを有する膜を

用いたフィルタレーションや質量の相違を利用した遠心分

離などがある．これらの手法は原理が容易で膜や遠心機な

1 東北大学大学院環境科学研究科環境科学専攻 : 980－8579 宮城県仙台市青葉区荒巻字青葉 6－6－11－604

誘電泳動法による微小流体中での微生物の生死分離

鈴木　雅登 1，安川　智之 1，珠 玖 仁 1，末永　智一 R○ 1

Separation of Live and Dead Microorganisms in a Micro-Fluidic Device by Dielectrophoresis

Masato SUZUKI1, Tomoyuki YASUKAWA

1, Hitoshi SHIKU1 and Tomokazu MATSUE

1

1 Graduate School of Environmental Studies, Tohoku University, 604, 6－6－11, Aramaki-Aoba, Aoba-Ku, Sendai-shi, Miyagi 980－8579

(Received 25 July 2005, Accepted 19 October 2005)

The dielectrophoretic separation of micro-organisms, based on cellular membrane damage, wascarried out using a microfabricated fluidic device. The fluidic device was composed of an indi-um-tin oxide electrode with castellated electrode patterns, an acrylic board with inlet and outletholes for micro-organisms suspension, and a silicone separator with a fluidic channel (width, 2mm ; length, 35 mm) between the electrode substrate and acrylic board. Dielectrophoretic sep-aration was demonstrated for a mixture of live and heat-treated Escherichia coli bacteria labeled byfluorescent stains. The mixture was injected into the fluidic device at a flow rate of 440 µm/sec.Both live and dead bacteria were collected around castellated electrode when an alternative(sinusoidal) electric field (frequency 100 kHz, voltage 20 Vpeak-to-peak) was applied to thecastellated electrode. The dielectrophoretic separation was found by changing the electric fieldfrequency from 100 kHz to 7 MHz. Only the heat-treated E. coli cells were flown out from thefluidic device, while the live E. coli cells remained being captured between the electrodes. Theresults demonstrated that the fluidic device equipped with a microelectrode array provides aconvenient way for the dielectrophoretic concentration and separation of targeted bio-particlesin biomedical applications.

Keywords : dielectrophoresis ; biological particles ; cell ; micro-organism ; dielectrophoretic sepa-ration.

1190 B U N S E K I K A G A K U Vol. 54 （2005）

ど簡便な装置で分離可能である．しかし，分離精度が低く，

微生物の特性に起因した分離は困難である．

誘電泳動は不均一電場中で生じる双極子の作用により，

粒子に力が作用する現象である1)～3)．電気泳動とは異なり，

粒子が有する電荷に依存せず，荷電量がわずかな細胞や微

生物などを低電圧で制御することが可能である．粒子に作

用する力の方向は，粒子自身の導電率や誘電率に依存して

おり，粒子の種類，大きさ，表面特性の相違によりその方

向が変化する．これまで，誘電泳動現象を用いた様々な細

胞のソーティングデバイスが開発され4)～10)，著者らも誘

電泳動を利用した微粒子や細胞のパターニング法を開発

し11)～14)，誘電泳動現象が細胞や微生物のハンドリングツ

ールとして有用であることが示されてきた．そこで，本研

究では誘電泳動を利用した連続的な微生物の生死分離を目

的としたチップを開発した．ここでは，モデル微生物とし

て大腸菌（Escherichia coli）を用いた．マイクロ電極を有

したフローチャネルチップを作製し，熱処理し膜損傷を与

えた大腸菌サンプルと処理をしていないサンプルの誘電泳

動特性を評価した．その結果を基に，微生物の連続的な生

死分離を行った．

2 理　　　論

誘電泳動は電気動力学現象の一つであり，外部より印加

された不均一電場により誘起された粒子内の双極子モーメ

ントと外部電場の相互作用により粒子に力が作用す

る1)～3)．誘電泳動は電気泳動と異なり，粒子自体が有して

いる電荷に依存せず，印加周波数，印加電圧，溶媒・粒子

の導電性・誘電性及び微粒子の大きさに依存する．誘電流

体中に半径 r [m]である均一な完全球形粒子に働く時間平

均誘電泳動力 は

（ 1）

で与えられる．ここで，ε m [F/m]は懸濁溶媒の誘電率，

∇は演算子，E rms [V m－1]は RMS（root-mean-square）電

場を表している．また Re[K(ω)]は

（ 2）

で定義される Clausius-Mossotti Factor K─(ω) の実数部を示

す．ε─ m 及び ε─ p は，それぞれ溶媒及び粒子の複素誘電率を

表しており次式で定義される．

（ 3）

σ は導電率 [S/m]，ε は誘電率，ω は角周波数，f [Hz]

は印加した交流電圧の周波数をそれぞれ表している．式

（ 2），（ 3）から Re[K─(ω)]は周波数に依存するため粒子

に働く力も周波数により変化する．Re[K─(ω)]の値が正な

らば，正の誘電泳動（positive-DEP）が作用し粒子は最も

電場強度の強い方向に移動する．Re[K─(ω)]が負の場合，

負の誘電泳動（negative-DEP）が作用し，微粒子は電場強

度の強い領域から反発力を受け電場強度の弱い方向に移動

する．

3 実　　　験

3・1 試　薬

大腸菌 K-12株（ Escherichia coli K-12， IFO3301）は

NCIMB JAPANから提供を受けた．大腸菌を蛍光染色する

Live/Dead® BacklighTM bacterial viability kitsはMolecular

probesから購入した．このキットには SYTO® 9と propid-

ium iodide（PI）が含まれている．SYTO® 9は，微生物の

膜の損傷程度に依存せず，膜を通過して核と結合し緑色の

蛍光を示す．一方，PIは損傷のある細胞膜を透過して核

と結合して赤色の蛍光を示す．両方の蛍光色素が核に存在

すると PIは SYTO® 9の蛍光を褪色させる．以上より，生

きている微生物は SYTO® 9により染色され緑色の蛍光を示

し，膜に損傷を受けた微生物は PIにより染色され赤色の

蛍光を示す．これ以外のすべての試薬はWako Chemicals

から購入した．購入した試薬はそれ以上の精製を行わず，

そのまま使用した．

3・2 大腸菌の培養

大腸菌の培養は，蒸留水 1 l中にペプトン 15.0 g，ダイ

ズペプトン 5.0 g，塩化ナトリウム 5.0 g，寒天 15.0 g（pH

7.2）を含むトリプトソーヤ寒天培地で行った．この培地

に白金耳により大腸菌を接種し恒温インキュベーターで，

38℃，12時間培養した．大腸菌を寒天培地から回収し，

滅菌水に懸濁した．大腸菌懸濁液の一部を 80℃ のウォー

ターバスに 30分間浸せきし，熱処理した大腸菌サンプル

を準備した．両方のサンプルをそれぞれ 6000 rpmで 5分

間遠心分離を行い，200 mMスクロース水溶液（σ m＜2×

10－4 [S/m]）に置換した．菌数は 1.0×108 bacteria/mlと

した．それぞれのサンプルを Live/Dead蛍光染色した後，

再び遠心分離し，スクロース水溶液に再懸濁させ等量混合

し分離サンプルとした．

3・3 微生物分離チップの作製

微生物の生死分離を行うチップは，castel lated 型

Indium-tin-oxide（ITO）電極基板15)，流路の部分となる

シリコンスペーサ，入口と出口を備えたアクリル板から構

成されている（Fig. 1a）．castellated型アレイ電極は電極

ε ε σω

ε σπ

= − = −jf

j2

K p m

p m

ωε ε

ε ε( ) =

−+ 2

F R K EmDEP rms= ( )[ ]∇2 3 2πε ωRe

F DEP

報　文　 1191

幅，電極間隔 50 µm（Fig 1b），電極エリアは 4 mm×4

mmであり，以下の手順で作製した．ITO基板（35×25

mm2，Corning Japan Co.製，Japan）を，界面活性剤を含

む中性洗剤で洗浄し，蒸留水中で超音波洗浄した後，窒素

ブローにより水分を除去した．ITO基板にポジ型のフォ

トレジストである OFPR5000（東京応化工業製）を 3000

rpmで 20秒間スピンコートした後，90℃ で 30分間ベー

クした．この基板を castellated型電極のパターンを有す

るフォトマスクを通して紫外線ランプで露光し，現像液

NMW-25（東京応化工業製）で現像して castellated型電極

のレジストパターンを得た．この基板を ITOエッチャン

ト溶液｛HNO3 : HCl : water＝4 : 5 : 5（v/v）｝に 20分間

浸せきし，不必要な部分の ITO薄膜を溶出することによ

り，castellated電極を作製した．レーザー加工機（WIN-

LASER M-25, Scottsdale, Arizona, U.S.A.）を用いてシリコ

ンスペーサ（厚さ 300 µm）に直線状の流路パターン（幅

2 mm，長さ 30 mm）を作製した．レーザー加工機でアク

リル板に溶液の出入り口となる孔（直径 2 mm）を作製し，

リザーバを取り付けた．上記の，castellated型電極基板，

シリコンスペーサ，アクリル板を重ね合わせ微生物泳動分

離チップとした．入口側のリザーバに，テフロンチューブ

（外径 1.5 mm，内径 0.5 mm，GL Sciences Inc.製）を接

続し，サンプルを充填したシリンジ（容量 1 ml，NIPRO

製）と接続した．サンプル溶液の流量はシリンジポンプ

（KDS 200, Muromachi Kikai Co., LTD製）により調整し

た．

3・4 実験方法

微生物分離チップを蛍光顕微鏡下（ECLIPSE ME600，

Nikon Co.製）に設置し，流路内の大腸菌の挙動を，デジ

タルカメラ（Coolpix，Nikon Co.製）を介してモニター

（PVM-1444Q SONY Co. Japan製）に映し出しビデオ録画

で記録した．大腸菌サンプル溶液 1 mlをシリンジに充填

し，シリンジポンプを用いてサンプルをチップに導入し

た．大腸菌が流路内で十分に分散したことを確認した後，

交流電圧（正弦波）をファンクションジェネレータ

（Wave factory WF1945，NF Co.製）を用いて castellated

電極に印加した．印加電圧を 20 Vp-pに保持し，周波数を

変化させ（1 kHz～15 MHz），それに伴う，大腸菌の挙動

の変化を観察した．

3・5 蛍光画像処理

取得した蛍光画像から市販のソフトウエアを用いて，蛍

光強度を求めた．蛍光強度は castellated型電極の凸－凸間

の領域（50×50 µm2）の平均を使用した．castellated型

電極に印加する周波数を変化させる直前の蛍光強度を I 0

とし，周波数を変化させてから経過した時間 t [sec]にお

ける蛍光強度を I tとして，相対蛍光強度 I t/I 0×100 [％]

を定義して，相対蛍光強度により大腸菌の挙動変化を解析

した．

4 実 験 結 果

4・1 大腸菌の誘電泳動特性の理論解析

大腸菌はグラム陰性菌であるため，導電性を有する細胞

質領域が脂質二分子膜により覆われ，電気的に不均一な構

造である．Fig. 2に 3層膜構造のグラム陰性菌の three-

shell model16）を示す．グラム陰性菌は細胞質，内膜，ペ

リプラズム．及び外膜で構成されており，それぞれの誘電

率は ε c，ε 2，ε 3，ε 4及びそれぞれの導電率は σ c，σ 2，σ 3，

鈴木，安川，珠玖，末永 : 誘電泳動法による微小流体中での微生物の生死分離

Fig. 1 (A) A schematic representation of side view ofthe device with three layers. Acrylic plate has an inletand outlet, at which fluids are pumped by pressure.Silicon rubber was partially cut out to compose chan-nels between acrylic plate and glass slide. (B)Microscopic image of ITO-castellated design electrode.

Fig. 2 Schematic image showing three-shell dielectricmodel of gram-negative bacteria

1192 B U N S E K I K A G A K U Vol. 54 （2005）

σ 4で表される．ここで菌が完全球形であると仮定し，等

価粒子の有効誘電率を ε eff4及び有効導電率を σ eff

4とする

と，この等価粒子の Clausius-Mossotti Factorは式（ 2）よ

り

（ 4）

と表される．更に有効誘電率 ε eff4は

（ 5）

（ 6）

ε 1＝ε c （ 7）

σ 1＝σ c （ 8）

と，表される16)．

Mathematica®を利用して Clausius-Mossotti Factorの実部

を計算し印加周波数に対してプロットすることにより，大

腸菌の誘電泳動スペクトル（Fig. 3）を得た．Table 1に，

大腸菌の電気的及び物理的な特性値を示す．これらの値は

Holzelらが電気回転法により同定した値17)を利用した．正

常な大腸菌の細胞質導電率は 0.44 [S/m]である．よって

Fig. 3の実線から Clausius-Mossotti Factorの実部がゼロに

なる周波数，すなわち正の誘電泳動と負の誘電泳動が切り

替わる周波数（交差周波数）は 34.8 MHzと分かる．また，

交差周波数より，低周波数領域では Clausius-Mossotti

Factorの実部が正であるため正の誘電泳動が，高周波数

領域では負の誘電泳動が作用すると推定できる．交差周波

数は大腸菌の細胞質内導電率が減少するに従い，低周波数

側にシフトし細胞質内導電率が 0.04 [S/m]のとき，交差

周波数は 3.78 MHzであると計算された．細胞質内の導電

率の相違により，大腸菌の誘電泳動特性が変化することが

示された．細胞質内の導電率変化は細胞膜損傷に伴う，細

胞外への細胞質成分の流出及び細胞質への細胞外液の流入

により引き起こされる．よって，細胞膜が損傷した大腸菌

と正常な大腸菌の誘電泳動特性の差の利用により正常な大

腸菌と損傷を有する大腸菌の分離が可能であることが示唆

された．

4・2 大腸菌の誘電泳動特性

200 mMスクロース溶液に懸濁した熱処理をしていない

大腸菌サンプルをシリンジポンプによりチップに導入し

た．大腸菌は流路内を 440 µm/sで流動した．大腸菌サン

プルを送液しながら周波数を変化（1 kHz～15 MHz）さ

せ誘電泳動特性を顕微鏡下で観察した．Fig. 4に，それぞ

れの周波数における大腸菌の光学及び蛍光顕微鏡写真を示

す．印加電圧は 20 Vppに固定した．周波数 100 kHzを印

加すると，大腸菌は castellated型電極の凸－凸間に濃縮さ

れた（Fig. 4a）．光学像と蛍光像を重ね合わせた結果，大

腸菌が濃縮された部分に緑色の蛍光が観察された（Fig.

4b）．この結果は，castellated型電極の凸－凸間の電場強

度が最も大きく，大腸菌に正の誘電泳動が作用したことを

示している．このような生菌サンプルの挙動は，10 kHz

～15 MHzの周波数領域で観察された．Fig. 4（c）に 7

γ nn

n

rr

=−1

,

ε εγ

ε εε ε

γε ε

ε ε

neff

n

nneff

n

neff

n

nneff

n

neff

n

=+

−+

−−+

−

−

−

−

3 1

1

3 1

1

22

2

K nneff

m

neff

mω ε ε

ε ε( ) =

−+

=2

4( )

Fig. 3 Real-part of Clausius-Mossotti factor versus fre-quency for 5 different cases following parameters intable 1

The plot shows how changing the cytoplasm conductiv-ity alerts the cross-over frequency.

Table 1 Basic parameters for the three-shell model of Escherichia coli

Parameter Value Parameter Value Parameter Value

Cytoplasm conductivity σ c 0.44 S m－1 Cytoplasm permittivity ε c 60 ε 0 Cell radius r 1 2×10－6 mInner membrane conductivity σ 2 1×10－4 S m－1 Inner membrane permittivity ε 2 3 ε 0 Cell radius r 2 2.05×10－6 mPeriplasm conductivity σ 3 6×10－3 S m－1 Periplasm permittivity ε 3 60 ε 0 Cell radius r 3 2.12×10－6 mOuter membrane conductivity σ 4 2.5×10－3 S m－1 Outer membrane permittivity ε 4 3 ε 0 Cell radius r 4 2.131×10－6 mMedium conductivity σm 5.4×10－6 S m－1 Medium permittivity εm 78 ε 0

報　文　 1193

MHzの周波数を印加した場合に電極間に捕捉そく

された大腸

菌の蛍光顕微鏡写真を示す．100 kHzを印加した場合に濃

縮された大腸菌の形はほぼ正方形であったが，7 MHzを

印加した場合では形が上下方向に約 1.15倍肥大化した．

更に 7 MHzの場合には凸－凸間に捕捉されず下流に流さ

れる大腸菌が観察された．5 MHz以上の周波数において

観察されたこの現象は，正の誘電泳動による捕捉力の減少

に起因する．10 kHz～15 MHzの周波数領域において，こ

の一連の現象は Fig. 3に示した理論曲線の傾向と類似し

ており，理論曲線から誘電泳動現象の予測が可能であるこ

とが示された．また，周波数 1～10 kHzを印加した場合，

大腸菌は交流電気浸透流18)～21)の影響を受け電極上でひし

形状に凝集した（Fig. 4d）．

次に熱処理した大腸菌サンプルの誘電泳動特性を評価し

た．熱処理したサンプルでは 7 MHz付近を境にしてその

挙動に明確な変化が表れた．1～10 kHzでは交流電気浸

透流の影響を受けダイヤモンド状に電極上に凝集し，10

kHz～1 MHzでは正の誘電泳動が作用し，大腸菌は電極

間に捕捉された．周波数を徐々に増加させ，5 MHzを印

加した場合，大腸菌は電極間における大腸菌の捕捉力は減

少し，捕捉が困難になった．更に，7 MHz以上を印加し

た場合，ほぼすべての大腸菌が電極間に捕捉されず流れに

従って流されていった．これは周波数，5～7 MHz付近を

境界にして正の誘電泳動と負の誘電泳動が切り替わったこ

とに起因すると考えられる．負の誘電泳動が大腸菌に作用

した場合，電場強度の大きな領域から反発させる力が働く

ため大腸菌は電極間に捕捉されず下流に流される．得られ

た交差周波数（f 0＝5～7 MHz）から，熱処理した大腸菌

の細胞質導電率は 0.05～0.09 [S/m]と算出された．以上

の結果から，本システムを用いて大腸菌の生死状態によ

り，その誘電特性が変化することを確認できた．

4・3 大腸菌の生死分離

Live/Dead蛍光染色した熱処理をしたサンプルとしてい

ないサンプルを等量混合し分離サンプルとし，このサンプ

ルを流量 440 µm/secで誘電泳動チップに導入した．この

際，大腸菌の最終濃度は 2.0×108 bacteria/mlに調整した．

Fig. 5に，大腸菌の生死分離の様子を連続撮影した蛍光顕

鈴木，安川，珠玖，末永 : 誘電泳動法による微小流体中での微生物の生死分離

Fig. 4 (a) An optical microscopic image showingdielectrophoretic behavior of live E. coli at 100 kHz,and fluorescent images at (b) 100 kHz, (c) 7 MHz, and(d) 1 kHz

A medium conductivity was＜ 2×10－4 [S/m], andelectric field strength 20 Vp-p.

Fig. 5 A series of fluorescent images showing dielectrophoretic Live/Dead separation of E.coli in flow rate 440 µm/sec

Firstly, applying 100 kHz, both live and heat-treated E. coli were collected between electrodesby p-DEP (a1) and (a2). Changing frequency from 100 kHz to 7 MHz, only heat-treated E.coli was subjected to n-DEP and flow downstream (b), (c) and (d1), while live E. coli kept col-lecting at the same position (d2).

1194 B U N S E K I K A G A K U Vol. 54 （2005）

微鏡写真を示す．サンプル導入直後，周波数を正の誘電泳

動が作用する 100 kHzに保持し，電極近傍を流動する大

腸菌を電極間に捕捉した（Fig. 5a1，a2）．蛍光観察を行

い，いずれのサンプルも十分電極間に捕捉されたことを確

認した後，周波数を 7 MHzに切り替えた．電極間に捕捉

されていた熱処理したサンプルが解放され，流れに従い流

動した（Fig. 5b，c）．ほぼすべての熱処理した大腸菌を

流出させるために約 30秒を要した（Fig. 5d）．一方，熱

処理をしていないサンプルは，電極間に捕捉されている菌

の凝集体の幅が広がり，一部菌が流出する様子が観察され

たが，ほとんどの菌は電極間への捕捉状態を保持した

（Fig. 5d2）．周波数を 100 kHzから 7 MHzへ変換後のそ

れぞれの大腸菌の蛍光強度変化を Fig. 6に示した．熱処

理したサンプルの蛍光強度は時間の経過に伴い減少し，

25秒後に初期蛍光強度（I 0）と比較して 30％に減少した．

一方，熱処理していないサンプルの蛍光強度は 80％ 程度

に減少しており，電極間に保持されていることが分かっ

た．以上の結果より，フローシステムに誘電泳動を組み込

むことにより，熱処理サンプルと未処理のサンプルを効果

的に分離することができた．

しかし，蛍光顕微鏡の焦点を流路上部に合わせると，誘

電泳動の影響を受けずに，移動する大腸菌が観察された．

これは，電極から遠ざかるにつれ誘電泳動力が急速に弱ま

り，大腸菌に誘電泳動力がおよばなかったためである．

5 結　　　言

本研究では，誘電泳動とフローシステムを組み合わせ

た，大腸菌の膜の損傷具合により分離可能なマイクロ電極

を有したチップを構築した．チップに熱処理及び未処理の

大腸菌サンプルを導入し，マイクロ電極に周波数 7 MHz

である交流電圧（正弦波，20 Vp-p）を印加すると，その

2つの分離が可能であった．この周波数では，未処理のサ

ンプルは，正の誘電泳動が作用し電極間に保持されたまま

であるが，熱処理したサンプルは正の誘電泳動による捕捉

力が弱まり，流れに従い流出した．蛍光顕微鏡観察によ

り，流路上部を移動する大腸菌は，捕捉されず流されるこ

とが分かった．これは下面に設置された電極対により形成

された誘電泳動力が流路上方まで十分作用しないことを示

している．流路デバイスの高さを規定するスペーサの厚さ

の薄層化及び電極デザインの最適化により，更なる高効率

な大腸菌の分離を目指したい．本チップの利用により，菌

を前処理する必要なく，容易な菌の生死分離が実現可能と

なった．微小流体チップ中における細胞のスクリーニング

やソーティングや，バイオリアクタ内における失活微生

物，細胞の除去などへの応用が期待できる．

文　　　献

1) H. Morgan, N. G. Green : “AC Electrokinetics : colloidsand nanoparticles”, A Research Studies Press Book,(2003), (Baldock, Hertfordshire, England).

2) H. A. Pohl : “Dielectrophoresis”, (1978), (CambridgeUniversity Press, Cambridge).

3) T. B. Jones : “Electromechanics of particles”, (1995),(Cambridge University Press, New York).

4) F. F. Becker, X-B. Wang, Y. Huang, R. Pethig, J.Vykoukal, P. R. C. Gascoyne : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 92, 860 (1995).

5) G. H. Markx, P. A. Dyda, R. Pethig : J. Biotechnol., 51,175, (1996).

6) X-B. Wang, J. Yang, Y. Huang, J. Vykoukal, F. F.Becker, P. R. C. Gascoyne : Anal. Chem., 72, 832(2000).

7) H. B. Li, R. Bashir : Sensor. actuat. B-chem., 4322, 1(2002).

8) J. Suehiro, R. Hamada, D. Noutomi, M. Shutou, M.Hara : J. Electrostat., 57, 157 (2003).

9) J. Suehiro, G. Zhou, M. Imamura, M. Hara : IEEE T.Ind. Appl., 39, 1514 (2003).

10) B. H. Lapizco-Encinas, B. A. Simmons, E. B.Cummings, Y. Fintschenko : Anal. Chem., 76, 1571(2004).

11) N. Matsumoto, T. Matsue, I. Uchida : Bioelectroch.Bioener., 34, 199 (1994).

12) T. Matsue, N. Matsumoto, I. Uchida : Electrochim.Acta, 42, 3251 (1997).

13) S. Ogata, T. Yasukawa, T. Matsue : Bioelectrochemistry,54, 33 (2001).

14) M. Suzuki, T. Yasukawa, Y. Mase, H. Shiku, T.Matsue : Langmuir, 20, 11005 (2004).

15) J. A. R. Price, J. P. H. Burt, R. Pethig : Biochim.Biophys. Acta, 964, 221 (1988).

16) Y. Huang, R. Holzel, R. Pethig, X-B. Wang : Phys.Med. Biol., 37, 1499 (1992).

17) R. Holzel : Biochim. Biophys. Acta, 1450, 53 (1999).18) A. Ramos, H. Morgan, N. G. Green, A. Castellanos :

J. Colloid Int. Sci., 217, 420 (1999).19) N. G. Green, A. Ramos, A. Gonzalez, H. Morgan, A.

Castellanos : Phys. Rev. E, 61, 4011 (2000).

Fig. 6 Relationship between relative fluorescentintensity and time at which the frequency was changedto 7 MHz, for heat-treated and live E. coli

報　文　 1195

20) A. Gonzalez, A. Ramos, N. G. Green, A. Castellanos,H. Morgan : Phys. Rev. E, 61, 4019 (2000).

21) N. G. Green, A. Ramos, A. Gonzalez, H. Morgan, A.Castellanos : Phys. Rev. E, 66, 026305-1 (2002).

鈴木，安川，珠玖，末永 : 誘電泳動法による微小流体中での微生物の生死分離

要　　　旨

微生物の膜損傷に起因した生死状態に基づき分離が可能なチップデバイスを作製した．微生物に作用する

誘電泳動力の差を利用し，生菌の捕捉そく

と膜損傷を与えた菌の排出を行った．微生物分離チップは凹凸を有す

るバンドを配列させた castellated型の透明電極（ITO）基板，直線流路パターン（幅 2 mm，長さ 35 mm）

を有したシリコンスペーサ，入口と出口を備えたアクリル板から構成されている．無処理の大腸菌と熱処理

した大腸菌を Live/Dead蛍光染色し，200 mMスクロース水溶液中に混合させた．大腸菌を流量 440 µm/s

でチップへ導入し，挙動を蛍光顕微鏡で観察した．ITO基板に正弦波（100 kHz，20 Vpeak-peak）を印加

すると，大腸菌に正の誘電泳動が作用し電極間に捕捉された．周波数を 7 MHzに切り替えると，死んでい

る大腸菌への正の誘電泳動力が弱まり，電極から解放されチップから排出された．このチップを利用すると

簡便で迅速な大腸菌の生死分離ができる．