sequenciamento de nova geração...
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Sequenciamento de Nova Geração (NGS)
Msc. Frederico Schmitt Kremer // doutorando PPGB
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Nos episódios anteriores ...
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Sequenciamento “Clássico”
Engloba os métodos desenvolvidos por Sanger et al (1977) e Maxam & Gilbert (1977).
Frederick Sanger
Walter Gilbert
Por questões de praticidade, o método de Sanger acabou se tornando o padrão ouro para sequenciamento até os anos 2000.
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Sequenciamento “Clássico”
Engloba os métodos desenvolvidos por Sanger et al (1977) e Maxam & Gilbert (1977).
Frederick Sanger
Walter Gilbert
Por questões de praticidade, o método de Sanger acabou se tornando o padrão ouro para sequenciamento até os anos 2000.
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Sequenciamento capilar
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Vantagens do método de Sanger
Alta confiabilidade.
Possibilidade de leituras com até 1 Kb.
Baixo custo / amostra.
Ideal para estudo de genes específicos.
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mas ...
Baixo throughput.
Grande dificuldade para sequenciar genomas, transcriptomas e metagenomas.
No máximo 96 amostras por vez.
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Plataformas de NGS
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Roche 454Segunda Geração
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454
Primeira plataforma de Next Generation Sequencing (NGS).
Lançado em 2004 pela empresa Roche.
Utiliza como como base o piro-sequenciamento.
Leituras relativamente menores que as obtidas pelo método de Sanger (~700 bp).
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454: Vantagens
Tamanho de leitura comparável ao obtido pelo método de Sanger.
Alto throughput.
Disponibilidade de vários tipos de bibliotecas (single-end, paired-end e mate-pair).
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454: Desvantagens
Problema em regiões homopoliméricas.
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Illumina (Solexa)Segunda Geração
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Illumina
Atualmente o padrão-ouro para muitas das análises de NGS.
Utiliza como como base o sequenciamento por síntese (SBS).
Três linhas de equipamentos: MiSeq, NextSeq e HiSeq.
Metodologia extremamente versátil e barata.
Leituras de 30 bp nas primeiras versões, e agora de 120x2 em HiSeq e 250x2 em MiSeq.
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Illumina
Illumina MiSeq.
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Illumina
Illumina Lane.
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Illumina: Vantagens
Alto throughput (principalmente nas versões HiSeq).
Extremamente versátil.
Grande variedade de protocolos para sequenciamento e análise de dados.
Padrão da indústria.
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Serviço de sequenciamento NGS
Centros de pesquisa
Empresas nacionais
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454: Desvantagens
Problema em regiões com extremo de conteúdo GC (GC%).
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SOLiDSegunda Geração
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SOLiD
Plataforma de sequenciamento de ultra-high throughput.
Baseado em hibridização e ligação.
Permite o sequenciamento de genomas e transcriptomas com alta confiabilidade e cobertura (depth / coverage).
Trabalha com leituras extremamente curtas (30 - 50 bp).
Suporte à leituras mate-pair.
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ABI SOLiD
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Sequenciamento por ligação
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Sequenciamento por ligação
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Vantagens
Alta cobertura.
Excelente para identificação de SNPs e INDELs.
Alta acurácia.
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Desvantagem
Problemático para para montagem de novo de genomas devido ao tamanho das leituras.
Grande volume de dados exige grande capacidade computacional.
O equipamento e reagentes são caros se comparado às tecnologias Illumina Ion Torrent.
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Ion TorrentSegunda Geração
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Ion Torrent
Plataforma de sequenciamento atualmente distribuída pela Thermo Fisher (antiga life technologies).
Baseada em sequenciamento semicondutor (por pH).
Plataforma focada em velocidade e praticidade (é considerada a mais rápida para sequenciamento de genomas).
Baixo custo.
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Ion Torrent
Ion Torrent PGM Ion Torrent S5
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Sequenciamento semicondutor
Ion Torrent Chip (316) Ion Torrent Chip (estrutura)
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Sequenciamento semicondutor
Ion Torrent Chip loading
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Vantagem
Equipamento e reagentes são baratos.
Menos de 1 dia para se preparar o DNA e obter os dados do sequenciamento.
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Desvantagem
Problema com sequências homopoliméricas (da mesma forma que o 454).
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PacBioTerceira Geração
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PacBio
Primeira tecnologia comercial de terceira geração.
Possibilita a geração de reads com até 20 Kb.
Baseada em sequenciamento de molécula individual em tempo real, e análise se cinética da polimerase.
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Vantagens
Leituras longas facilitam o processo de montagem de genomas e transcriptomas.
Análise de cinética enzimática possibilita a identificação de modificações em bases, incluindo modificações epigenética.
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Desvantagens
As primeiras versões apresentavam uma alta taxa de erro (~10% da bases).
Problemas com reads quiméricas que são formadas durante o preparo do DNA.
Custo elevado do equipamento e dos reagentes.
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Oxford NanoporeTerceira Geração
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Oxford Nanopore
Sequenciamento baseado na análise do sinal elétrico gerado pela passagem de um fragmento de DNA por um poro proteico transmembrânico.
Tecnologia extremamente portátil.
Sequenciador descartável.
Leituras > 20 Kb.
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Oxford Nanopore
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Oxford Nanopore
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Oxford Nanopore
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Vantagens
Leituras longas equiparáveis às da PacBio.
Equipamento barato (mas descartável) (~1000 dólares).
Portabilidade permite o uso do sequenciamento de nova geração em pesquisas de campo.
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Desvantagem
Alta taxa de erros.
Ainda em estágio beta.
Poucos protocolos disponíveis.
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Bibliotecas de NGS
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Single-end
Sequenciamento de apenas uma das extremidades dos fragmentos da amostra.
Forma mais simples (e barata) de biblioteca.
Também denominada “biblioteca de fragmento”.
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Paired-end
Sequenciamento de ambas as extremidades dos fragmentos da amostra.
Sequências podem ser sobreponíveis ou espaçadas.
Disponível para 454 e Illumina, sendo hoje o padrão de facto.
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Paired-end
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Mate-pair
Similar ao sequenciamento paired-end, mas com um espaçamento maior entre as leituras.
Mais cara, e com maior taxa de erros (false-mates).
Também denominada “jump library”.
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Mate-pair
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Aplicações
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Whole-Genome Shotgun (WGS)
“Democratizada” pelo NGS.
Sequenciamento, montagem e anotação de genomas.
Genomas rascunho e finalizados.
Resultou em um crescimento exponencial no número de genomas disponíveis em banco de dados públicos.
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Whole-Genome Shotgun (WGS)
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WGS: Pangenoma
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RNA-Seq
Sequenciamento de mRNA e miRNAs através do cDNA.
Análise pode ser de novo ou guiada por um genoma de referência.
Pode ser utilizada para comparar o efeito de diferentes condições na expressão gênica.
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RNA-Seq: expressão diferencial
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Análise de Variantes
Identificação de regiões mutadas ou divergentes em relação à uma sequência de referência.
INDELs, SNPs e CNVs são as mais analisadas.
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Sequenciamento de Exoma
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Metagenômica
Sequenciamento do total DNA de uma amostra.
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Single-cell sequencing
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Dúvidas?
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Obrigado! ^^