SERBEST OKSJEN RADKALLER VE ANTOKSDANLAR

Yaam iin oksijen (O2) Havasz yerde yaayamayz. Yaammz srdrmek iin havann molekler oksijenini (O2) tkettiimizi biliyoruz. Total oksijen tketimimizin %90'ndan fazlasndan elektron transport zinciri (solunum zinciri), %5-10'undan da dier oksijen gerektiren reaksiyonlar sorumludur. Elektron transport zincirinde molekler oksijen, yaktlardan (glukoz, ya asidi ve amino asitlerin karbon iskeleti) treyen NADH ve FADH2'den elektronlar alarak suya indirgenir. Bu yolda oksijen moleklnn kuvvetli oksitleyici gc, ATP'nin yksek enerjili fosfat ba haline dntrlr. Molekler oksijen gerektiren fakat ATP'nin oluumu reaksiyonuyla elemeyen dier reaksiyonlar, amino asitlerin katabolizmas, ilalarn detoksifikasyonu ve steroid hormonlarn sentezi gibi spesifik metabolik yollar iin nemlidirler. Bu reaksiyonlarda dier oksidazlar (oksijeni suya veya hidrojen perokside indirgeyen enzimler) ve oksijenazlar (oksijeni okside olan molekle balayan enzimler) grev alrlar.

Molekler oksijenin zellikleri Molekler oksijen (O2), paralel spin durumlu iki ortaklanmam (elememi) elektrona sahiptir.

Ortaklanmam (elememi) elektron ieren atom, atom grubu veya molekller serbest radikal olarak tanmlanrlar. Ancak Fe3+, Cu2+, Mn2+ ve Mo5+ gibi gei metalleri de ortaklanmam elektronlara sahip olduklar halde serbest radikal olarak kabul edilmezler, fakat serbest radikal oluumunda nemli rol oynarlar. Serbest radikaller pozitif ykl (katyon), negatif ykl (anyon) veya elektriksel olarak ntral olabilirler. Serbest radikal tanmna gre molekler oksijen, bir biradikal (diradikal) olarak deerlendirilir. Biradikal oksijen, radikal olmayan maddelerle yava reaksiyona girdii halde dier serbest radikallerle kolayca reaksiyona girer. Biradikal oksijenin elektronlarndan birinin enerji alarak kendi spininin ters ynnde olan baka bir orbitale yer deitirmesiyle singlet oksijen oluur. Singlet oksijen, elememi elektronu olmad iin radikal olmayan reaktif oksijen molekldr, delta ve sigma olmak zere iki ekli vardr.

Delta O2 Sigma O2

Organizmada gei metallerini (Fe2+ ve Cu+ gibi metaller) ieren enzimler vastasyla molekler oksijene tek elektronlarn transferi suretiyle oksidasyon reaksiyonlar meydana gelir. Molekler oksijen, biradikal doasnn bir sonucu olarak yksek derecede reaktif oksijen trleri (ROS) oluturma eilimindedir.

1

Reaktif oksijen trleri (ROS) Reaktif oksijen trleri (ROS), normal oksijen metabolizmas srasnda az miktarda oluan speroksit radikali (O2), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali (OH)'dir.

O2

Molekler oksijen

Speroksit radikali (speroksit anyonu)

H2O2

Hidrojen peroksit

H2O + OH

Hidroksil radikali

H2O

Su Reaktif oksijen trleri, eitli serbest radikallerin olutuu serbest radikal zincir reaksiyonlarn balatabilirler ve hcrede karbon merkezli organik radikaller (R), peroksit radikalleri (ROO), alkoksi radikalleri (RO), tiyil radikalleri (RS), slfenil radikalleri (RSO), tiyil peroksit radikalleri (RSO2) gibi eitli serbest radikallerin oluumuna neden olurlar.

Speroksit radikali (O2) Speroksit radikali (O2) hemen tm aerobik hcrelerde molekler oksijenin (O2) bir elektron alarak indirgenmesi sonucu oluur. ndirgenmi gei metallerinin otooksidasyonu speroksit radikali meydana getirebilir.

2

Speroksit radikali kendisi direkt olarak zarar vermez. Bu radikal anyonun asl nemi, hidrojen peroksit kayna olmas ve gei metalleri iyonlarnn indirgeyicisi olmasdr. Speroksit radikali dk pH deerlerinde daha reaktifdir, oksidan perhidroksi radikali (HO2) oluturmak zere protonlanr.

+H+

Speroksit radikali ile perhidroksi radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olur dieri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonunda molekler oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir.

Speroksit radikali hem oksitleyici hem indirgeyici zellie sahiptir. rnein ferrisitokrom c ya da nitroblue tetrazolium ile reaksiyonunda indirgeyici olarak davranarak bir elektron kaybeder ve molekler oksijene okside olur.

Speroksit radikali epinefrinin oksidasyonunda oksidan olarak davranarak bir elektron alr ve hidrojen perokside (H2O2) indirgenir. Speroksit radikalinin fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit (NO) ile birlemesi sonucu bir reaktif oksijen tr olan peroksinitrit (ONOO) meydana gelir. Peroksinitrit, nitrit (NO2) ve nitrat (NO3) oluturmak zere metabolize edilir. Peroksinitrit, azot dioksit (NO2), hidroksil radikali (OH), nitronyum iyonu (NO2+) gibi toksik rnlere dnebilir ki nitrik oksitin (NO) zararl etkilerinden peroksinitrit sorumludur.

Hidrojen peroksit (H2O2) Hidrojen peroksit (H2O2), speroksidin evresindeki molekllerden bir elektron almas veya molekler oksijenin evresindeki molekllerden iki elektron almas sonucu oluan peroksitin iki proton (H+) ile birlemesi sonucu meydana gelir.

3

Biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asl retimi, speroksidin (O2) dismutasyonu ile olur. ki speroksit molekl, speroksidin dismutasyonu reaksiyonunda iki proton alarak hidrojen peroksit ve molekler oksijeni olutururlar.

Bu reaksiyon, radikal olmayan rnler meydana geldiinden dismutasyon reaksiyonu olarak bilinir, ya spontan gerekleir ya da speroksit dismutaz (SOD) enzimi tarafndan katalizlenir. Spontan dismutasyon pH 4,8'de en hzldr, enzimatik dismutasyon ise spontan dismutasyonun nispeten yava olduu ntral ya da alkali pH'da daha belirgindir. Hidrojen peroksit bir serbest radikal olmad halde reaktif oksijen trleri (ROS) kapsamna girer ve serbest radikal biyokimyasnda nemli bir rol oynar. nk Fe2+ veya dier gei metallerinin varlnda Fenton reaksiyonu sonucu, speroksit radikalinin (O2) varlnda Haber-Weiss reaksiyonu sonucu en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali (OH) oluturur.

Speroksit radikalinin lipid solubilitesi snrl olduu halde hidrojen peroksit lipid solubldur. Bu nedenle hidrojen peroksit kendisinin olutuu yerden uzakta olan fakat Fe2+ ieren membranlarda hasar oluturabilir.

Hidroksil radikali (OH) Hidroksil radikali (OH), Fenton reaksiyonu ve Haber-Weiss reaksiyonu sonucu hidrojen peroksitten olumaktadr. Ayrca suyun yksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalmas sonucunda oluur. Hidroksil radikali son derece reaktif bir oksidan radikaldir, yarlanma mr ok ksadr. Hidroksil radikali olaslkla reaktif oksijen trlerinin (ROS) en glsdr. Olutuu yerde tiyoller ve ya asitleri gibi eitli molekllerden bir proton kopararak tiyil radikalleri (RS), karbon merkezli organik radikaller (R), organik peroksitler (RCOO) gibi yeni radikallerin olumasna ve sonuta byk hasara neden olur.

4

Hcrede reaktif oksijen trlerinin (ROS) kayna Hcrede normal metabolik yollardaki enzimatik reaksiyonlarda enzimlerin aktif yerinde ara rnler olarak devaml ekilde serbest radikaller oluabilir. Bazen bu serbest radikal ara rnler enzimlerin aktif yerinden szarlar, molekler oksijenle kazara etkileirler ve sonuta serbest oksijen radikalleri oluur. Normalde hcrelerde en byk serbest oksijen radikali kayna mitokondriyal elektron transport zincirinden szntdr. Mitokondri i zarnda yerlemi oksidatif fosforilasyon zinciri bileenleri byk oranda indirgendii zaman mitokondriyal speroksit radikal retimi artar.

Endoplazmik retikulum ve nkleer membranda serbest radikal retimi, membrana bal sitokromlarn oksidasyonundan kaynaklanr. Birok enzimin katalitik dngs srasnda da serbest radikaller ortaya kar. Bu enzimlerden biri ksantin oksidazdr. Ksantin oksidaz hasarlanmam dokularda bir dehidrojenaz olarak vardr, prinlerin yklm yolunda hipoksantinden ksantin ve ksantinden rik asit oluumu basamaklarnda elektron akseptr olarak molekler oksijenden (O2) daha ok NAD+ kullanr. Oksijensizlie bal olarak ADP'nin ATP'ye fosforilasyonunun azald durumlarda (iskemi durumlarnda) ADP yklr ve prin baz, ksantin oksidazn bir oksidaz olarak etkili olmasyla hipoksantine dntrlr. Ksantin oksidazn oksidaz olarak aktivite gstermesi durumunda hipoksantin ksantine ve ksantin rik aside dnrken molekler oksijen kullanlmakta, molekler oksijen hidrojen perokside indirgenmektedir. skemi durumlarnda oksijen seviyesi dk olduundan nemli hasar olmaz. Ancak oksijen seviyesi reperfzyon srasnda normale dnnce iskemi yerinde ksantin oksidaz etkisiyle fazla miktarda hidrojen peroksit (H2O2) ve speroksit radikali (O2) oluur, bunlarn etkisiyle de iskemi/reperfzyon hasar denen durum ortaya kar. Ksantin oksidazn zellikle intestinal

5

mukoza hcrelerinde grlen iskemi/reperfzyon hasarnda nemli faktr olduu dnlmektedir. Aldehit oksidaz yap itibariyle ksantin oksidaza benzer, substratlarnn ou ayndr ve speroksit radikali (O2) retir. Dihidroorotat dehidrojenaz, flavoprotein dehidrojenaz, amino asit oksidaz ve triptofan dioksijenaz gibi enzimler de serbest radikal olumasna neden olurlar. Peroksizomlar ok nemli hcre ii hidrojen peroksit (H2O2) kaynadrlar. Peroksizomlardaki D-amino asit oksidaz, rat oksidaz, L-hidroksil asit oksidaz ve ya asidi ail-CoA oksidaz gibi oksidazlar, speroksit retmeden bol miktarda hidrojen peroksit (H2O2) retimine neden olurlar. Ancak peroksizomlarda, hidrojen peroksidin suya ayrmasn katalizleyen katalaz (CAT) enziminin aktivitesi de ok yksek olduundan peroksizomlardan sitozole ne kadar hidrojen peroksit (H2O2) getii bilinmemektedir. Hayvan hcrelerinde askorbik asit, tiyoller, adrenalin ve flavin koenzimleri gibi baz bileiklerin otooksidasyonu da speroksit radikalinin (O2) bir baka kaynadr. Araidonik asit metabolizmas da reaktif oksijen metabolitlerinin nemli bir kaynadr. Fagositik hcrelerin uyarlmas, fosfolipaz ve protein kinazn aktivasyonuna ve plazma membranndan araidonik asidin serbestlemesine yol aar. Araidonik asidin enzimatik oksidasyonuyla da eitli serbest radikal ara rnleri meydana gelirler.

Araidonik asit metabolizmas sonucu serbest radikal retimine "enzimatik lipid peroksidasyonu" denir. Serbest radikallerle prostaglandin metabolizmas birbiriyle yakndan ilikilidir. Reaktif oksijen metabolitleri, fosfolipaz aktivasyonu yoluyla prostaglandin E2, prostaglandin F2, 6-keto prostaglandin F1 ve tromboksan B2 sentezini salarlar. Prostaglandin E2 ve I2 (prostasiklin) de adenilat siklaz aktive ederek cAMP sentezini artrrlar. PGA, PGE1 ve PGE2'nin burun mukozas damarlarnda vazokonstriksiyona neden olduu bilinmektedir.

6

zellikle demir ve bakr olmak zere gei metalleri, fizyolojik artlarda elektron al verii eklinde gerekleen oksidoredksiyon reaksiyonlarnda grev alrlar. Gei metalleri bu zellikleri nedeniyle serbest radikal reaksiyonlarn hzlandran katalizr vazifesi grrler. Demir ve bakr, tiyollerden tiyil sentezini H2O2 ve O2 den OH sentezini katalizlerler.

Mn2+ nn O2 tarafndan oksidasyonu Mn3+ veya Mn-Oksijen kompleksinin oluumunu salar, bunlar da O2 den daha ok oksitleyicidirler. Metal iyonlarnn serbest radikal reaksiyonlarndaki asl nemi lipid peroksidasyonundaki etkileriyle ilgilidir. Gei metalleri lipid peroksidasyonunu balatmaktan ok, sentezlenmi olan lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) paralanmalarn ve lipid peroksidasyonunun zincir reaksiyonlarn katalize ederler. Bylece daha az zararl olan radikalleri daha zararl hale getirirler.

Aktive olmu makrofajlar, ntrofiller ve eozinofillerde fagositik solunumsal patlama srasnda da eitli serbest radikaller oluur.

Fagositik lkositler opsonize mikroorganizmalar, C5a kompleman faragman, lkotrien B4, bakteriyel orijinli N-formil oligopeptitler gibi partikler ya da znebilir bir uyarcyla uyarldklarnda lizozomal komponentleri darya vermeye balarlar ve reaktif oksijen

7

metabolitlerinin oluumuyla birlikte mitokondri dnda oksijen tketiminde bir patlama (solunumsal patlama) gsterirler. Fagosite edilmi bakteri, solunumsal patlama rnlerinin etkisiyle ldrlr. Ancak bu oksidan rnler hcrelerin antioksidan savunma glerini atnda normal konak hcrelere zarar verirler ve eitli hastalklarn patogenezinde rol oynarlar. Fagositlerin uyarlmas, heksoz monofosfat ant yoluyla glukozun oksidasyonunda arta yol aar. Solunumsal patlama srasnda elektron vericisi olarak NADPH kullanlr ve molekler oksijenin (O2) speroksit radikaline (O2) indirgenmesi sonucu NADP+ retimi artar ve heksoz monofosfat yolu aktive olur. Heksoz monofosfat yolunun aktivasyonuna neden olan NADP+ nin dier kayna hidrojen peroksidin (H2O2) detoksifikasyonundan sorumlu olan glutatyon peroksidaz-glutatyon redktaz sistemidir.

Ntrofiller ve monositlerin primer lizozomal granllerinde Fe-hem ieren miyeloperoksidaz enzimi bulunur. eitli uyarclarn etkisiyle fagositler miyeloperoksidaz ieren granllerini ekstraselller aralktaki fagositik vakuol iine boaltrlar. Miyeloperoksidaz, hidrojen peroksit (H2O2) varlnda klorr, iyodr ve bromrn oksidasyonunu katalizleyerek hipoklorik asit (HOCl), hipoiyodik asit (HOI) ve hipobromik asit (HOBr) oluturur. Bu bileikler ve bunlarn tuzlar gl oksidanlardr, biyolojik olarak nemli molekllerle reaksiyona girerek mikroorganizmay etkileyen toksik ajanlar meydana getirirler. Fagositin kendisi de reaktif oksidanlarn zarar vermelerine kar hassastr. Bununla birlikte kendilerini oksidanlarna kar koruyabilirler. Fagositlerin antioksidan sistemleri, speroksidi hidrojen perokside dntren speroksit dismutaz (SOD), hidrojen peroksidi suya indirgeyen katalaz (CAT), hidrojen peroksidi detoksifiye edici glutatyon peroksidaz-glutatyon redktaz sistemi, antioksidan vitaminlerden -tokoferol (vitamin E) ve askorbik asit (vitamin C) gibi antioksidanlardr. Ntrofillerden toksik ajanlarn sznts veya sekresyonu, yakn hcrelere ve solubl sistemlere zarar verir. Fagosit kaynakl oksidanlar ototoksik, immnosupresif ve mutajenik etkiler gsterirler. rnein romatoit artritli (RA) hastalarn diz eklemlerinde fazla miktarda ntrofil birikir ve bu ntrofillerden ortama salverilen serbest radikaller eklem hasarn hzlandrrlar. Baz yabanc toksik maddeler hcrede serbest radikal retimini artrrlar. Bu maddeler ya dorudan serbest radikal retirler ya da serbest radikallerin ortadan kaldrlmasn salayan antioksidan aktiviteyi drrler. Bu tip maddeler drt grupta toplanabilirler: 1) Toksinin kendisi bir serbest radikaldir. rnein kirli havann koyu rengini veren azot dioksit gaz (NO2) byle bir maddedir. Azot dioksit (NO2) etkili bir lipid peroksidasyonu balatcsdr.

2) Toksin bir serbest radikale metabolize olur. rnein kuru temizlemede kullanlan toksik bir madde olan karbon tetraklorr (CCl4), karacierde sitokrom p450 tarafndan triklorometil

8

serbest radikaline (CCl3) dntrlr. Triklorometil serbest radikali de molekler oksijenle (O2) etkileerek peroksil serbest radikali (CCl3O2) oluturur.

Triklorometil serbest radikali (CCl3) ve peroksil serbest radikali (CCl3O2) kuvvetli lipid peroksidasyonu balatcsdrlar. Bylece reaktif serbest radikal retimi karacierde antioksidan savunmalar aar, selller membranlarda oksidatif ykm ve ciddi doku hasar meydana gelir. 3) Toksinin metabolizmas sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir. rnein zellikle karacierde biriken paraquat bir serbest radikale indirgendikten sonra tekrar ykseltgenerek rejenere edilirken oksijen indirgenir ve bylece bol miktarda speroksit radikali (O2) retilmi olur. Diyabetik bir ajan olan alloksan da paraquat gibi etki eder. Antikanserojen bir madde olan doxorubicin de DNA replikasyonunu inhibe ederken olaslkla nemli miktarda speroksit radikali (O2) ve hidroksil radikali (OH) retimine neden olur. Birok endojen bileiin ve ksenobiyotiin hidroksilasyonunu, endoplazmik retikulum membrannda yerlemi iki niteden olumu bir hem proteini olan sitokrom P450 katalize eder.

Bu reaksiyonlarda oksijen kayna olarak molekler oksijen kullanld gibi peroksitler (ROOH) de kullanlabilir. Ancak, alkol ve asetonla indksiyonunda olduu gibi baz hallerde sitokrom P450 ar miktarda speroksit radikali (O2) reten bir izoenzime dnr. 4) Toksin antioksidan aktiviteyi drr. rnein parasetamoln karacierde sitokrom P450 tarafndan metabolizmas antioksidan aktivitede nemli yeri olan glutatyonla reaksiyona giren bir rn oluturarak sonuta glutatyonun miktarn azaltr.

Serbest oksijen radikallerinin etkileri Reaktif oksijen trlerinin (ROS) oluumu enflamasyon, radyasyon, yalanma, normalden yksek parsiyel oksijen basnc (pO2), ozon (O3) ve azot dioksit (NO2), kimyasal maddeler ve ilalar gibi baz uyarlarn etkisiyle artar.

9

Serbest radikaller hcrelerin lipid, protein, DNA, karbonhidrat ve enzim gibi tm nemli bileiklerine etki ederler. Speroksit radikali (O2) ve hidroksil radikali (OH) sitoplazma, mitokondri, nkleus ve endoplazmik retikulum membranlarnda lipid peroksidasyonunu balatr. Membranlarda lipid peroksidasyonu meydana gelmesi sonucu membran permeabilitesi artar. Serbest radikallerin etkisiyle proteinlerdeki sistein slfhidril gruplar ve dier amino asit kalntlar okside olarak yklr, nkleer ve mitokondriyal DNA okside olur.

Serbest oksijen radikallerinin tm bu etkilerinin sonucunda hcre hasar olur. Hcrede reaktif oksijen trlerinin (ROS) ve serbest radikallerin art hcre hasarnn nemli bir nedenidir. skemi sonrasnda reperfzyon da reaktif oksijen trlerinin (ROS) artna bal olarak iskeminin oluturduu hcre hasarn artrr.

10

Serbest oksijen radikallerinin neden olduu hcre hasarnn birok kronik hastaln komplikasyonlarna katkda bulunduu dnlmektedir. Aterogenez, amfizem/bronit, Parkinson hastal, Duchenne tipi muskler distrofi, gebelik preeklampsisi, serviks kanseri, alkolik karacier hastal, hemodiyaliz hastalar, diabetes mellitus, akut renal yetmezlik, Down sendromu, yalanma, retrolental fibroplazi, serebrovaskler bozukluklar, iskemi/reperfzyon injrisi gibi durumlarda serbest oksijen radikallerinin neden olduu hcre hasar sz konusudur.

Serbest radikallerin lipidlere etkileri Lipidler serbest radikallerin etkilerine kar en hassas olan biyomolekllerdir. Hcre membranlarndaki kolesterol ve ya asitlerinin doymam balar, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon rnleri olutururlar. Poliansatre ya asitlerinin oksidatif ykm lipid peroksidasyonu olarak bilinir. Lipid peroksidasyonu kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu eklinde ilerler ve olduka zararldr. Hcre membranlarnda lipid serbest radikalleri (L) ve lipid peroksit radikallerinin (LOO) olumas, reaktif oksijen trlerinin (ROS) neden olduu hcre hasarnn nemli bir zellii olarak kabul edilir. Serbest radikallerin sebep olduu lipid peroksidasyonuna "nonenzimatik lipid peroksidasyonu" denir. Hcre membranlarnda lipid peroksidasyonuna urayan balca ya asitleri poliansatre ya asitleridir. Lipid peroksidasyonu genellikle ya asitlerindeki konjuge ift balardan bir elektron ieren hidrojen atomlarnn karlmas ve bunun sonucunda ya asidi zincirinin bir lipid radikali nitelii kazanmasyla balar.

Lipid radikali (L) dayanksz bir bileiktir ve bir dizi deiiklie urar. Lipid radikallerinin (L) molekler oksijenle (O2) etkilemesi sonucu lipid peroksit radikalleri (LOO) oluur. Lipid peroksit radikalleri (LOO), membran yapsndaki dier poliansatre ya asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin oluumuna yol aarken kendileri de aa kan hidrojen atomlarn alarak lipidperoksitlerine (LOOH) dnrler ve bylece olay kendi kendini katalizleyerek devam eder.

11

Lipid peroksidasyonu sonucu oluan lipid peroksitlerinin (LOOH) yklm gei metalleri iyon katalizini gerektirir. Plazma membran ve subselller organel lipid peroksidasyonu serbest radikal kaynaklarnn hepsiyle uyarlabilir ve gei metallerinin varlnda artar. Lokal olarak hidrojen peroksitten (H2O2) Fenton reaksiyonu sonucu hidroksil radikali (OH) olumas zincir reaksiyonunu balatabilir. Lipid peroksitleri (LOOH) ykldnda ou biyolojik olarak aktif olan aldehitler oluur. Bu bileikler ya hcre dzeyinde metabolize edilirler veya balangtaki etki alanlarndan diffze olup hcrenin dier blmlerine hasar yayarlar. veya daha fazla ift ba ieren ya asitlerinin peroksidasyonunda malondialdehit (MDA) meydana gelir.

Malondialdehit (MDA)

Malondialdehit (MDA) kanda ve idrarda ortaya kar, ya asidi oksidasyonunun spesifik ya da kantitatif bir indikatr olmamakla beraber lipid peroksidasyonunun derecesiyle iyi korelasyon gsterir. Bu nedenle biyolojik materyalde malondialdehit (MDA) llmesi lipid peroksit seviyelerinin indikatr olarak kullanlr. Nonenzimatik lipid peroksidasyonu ok zararl bir zincir reaksiyonudur. Direkt olarak membran yapsna ve rettii reaktif aldehitlerle indirekt olarak dier hcre bileenlerine zarar verir. Bylece doku hasarna ve birok hastala neden olur.

Serbest radikallerin proteinlere etkileri Proteinler serbest radikallere kar poliansatre ya asitlerinden daha az hassastrlar. Proteinlerin serbest radikal harabiyetinden etkilenme derecesi amino asit kompozisyonlarna baldr. Doymam ba ve kkrt ieren triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi amino asitlere sahip proteinler serbest radikallerden kolaylkla etkilenirler. Bu etki sonucunda zellikle slfr radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluur. Serbest radikallerin etkileri sonunda, yaplarnda fazla sayda dislfit ba bulunan immnogloblin G (IgG) ve albmin gibi proteinlerin tersiyer yaplar bozulur, normal fonksiyonlarn yerine getiremezler. Prolin ve lizin reaktif oksijen trleri (ROS) reten reaksiyonlara maruz kaldklarnda nonenzimatik hidroksilasyona urayabilirler. Hemoglobin gibi hem proteinleri de serbest radikallerden nemli oranda zarar grrler. zellikle oksihemoglobinin speroksit radikali (O2) veya hidrojen peroksitle (H2O2) reaksiyonu methemoglobin oluumuna neden olur.

Serbest radikallerin nkleik asitler ve DNA'ya etkileri yonize edici radyasyonla oluan serbest radikaller DNA'y etkileyerek hcrede mutasyona ve lme yol aarlar. Hidroksil radikali (OH) deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer ve deiikliklere yol aar. Aktive olmu ntrofillerden kaynaklanan hidrojen peroksit (H2O2) membranlardan kolayca geerek ve hcre ekirdeine ulaarak DNA hasarna, hcre disfonksiyonuna ve hatta hcre lmne yol aabilir. Sperokside (O2) maruz kalan DNA moleklleri hayvanlara enjekte edildiklerinde daha fazla antijenik zellik gsterirler ki bu olduka nemli bir etkidir, nk otoimmn bir hastalk olan sistemik lupus eritematozusta (SLE) ve romatoit artritte (RA) dolamda anti-DNA antikorlar bulunur.

12

Serbest radikallerin karbonhidratlara etkileri Serbest radikallerin karbonhidratlara etkisiyle eitli rnler meydana gelir ve bunlar, eitli patolojik srelerde nemli rol oynarlar. Diyabet ve diyabet komplikasyonlarnn geliimi, koroner kalp hastal, hipertansiyon, psriyazis, romatoit artrit, Behet hastal, eitli deri ve gz hastalklar, kanser gibi birok hastalkta ve yallkta serbest radikal retiminin artt, antioksidan savunma mekanizmalarnn yetersiz olduu gsterilmitir. Ancak bu hallerde serbest radikal artnn sebep mi yoksa sonu mu olduu tam olarak bilinmemektedir.

Serbest radikallere kar hcresel savunma (antioksidan savunma sistemleri, antioksidanlar) Reaktif oksijen trlerinin (ROS) oluumunu ve bunlarn meydana getirdii hasar nlemek iin birok savunma mekanizmalar vardr. Bu mekanizmalar "antioksidan savunma sistemleri" veya ksaca "antioksidanlar" olarak bilinirler.

Antioksidanlar drt ayr ekilde etki ederler. 1) Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onlar tutma veya daha zayf yeni molekle evirme toplayc etkidir. Antioksidan enzimler, trakeobroniyal mukus ve kk molekller bu tip etki gsterirler. 2) Serbest oksijen radikalleriyle etkileip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif ekle dntrme bastrc etkidir. Vitaminler, flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler. 3) Serbest oksijen radikallerini balayarak zincirlerini krp fonksiyonlarn engelleyici etki zincir krc etkidir. Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir krc etki gsterirler. 4) Serbest radikallerin oluturduklar hasarn onarlmas onarc etkidir. Antioksidanlar, endojen kaynakl veya eksojen kaynakl olabilirler. Endojen antioksidanlar Endojen antioksidanlar, enzim ve enzim olmayanlar olmak zere iki snfa ayrlrlar. Enzim olan endojen antioksidanlar unlardr: 1) Speroksit dismutaz (SOD). 2) Glutatyon peroksidaz (GSH-Px). 3) Glutatyon S-Transferazlar (GST). 4) Katalaz (CAT). 5) Mitokondriyal sitokrom oksidaz sistemi. 6) Hidroperoksidaz.

13

Enzim olmayan endojen antioksidanlar unlardr: 1) Melatonin. 2) Seruloplazmin. 3) Transferrin. 4) Miyoglobin. 5) Hemoglobin. 6) Ferritin. 7) Bilirubin. 8) Glutatyon. 9) Sistein. 10) Metiyonin. 11) rat. 12) Laktoferrin. 13) Albmin. Eksojen antioksidanlar Eksojen antioksidanlar, vitaminler, ilalar ve gda antioksidanlar olmak zere snflandrlabilirler. Vitamin eksojen antioksidanlar unlardr: 1) -tokoferol (vitamin E). 2) -karoten. 3) Askorbik asit (vitamin C). 4)Folik asit (folat). la olarak kullanlan eksojen antioksidanlar unlardr: 1) Ksantin oksidaz inhibitrleri (alloprinol, oksiprinol, pterin aldehit, tungsten). 2) NADPH oksidaz inhibitrleri (adenozin, lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, nonsteroid antiinflamatuvar ilalar, diphenyline iodonium). 3) Rekombinant speroksit dismutaz. 4) Trolox-C (vitamin E analou). 5) Endojen antioksidan aktiviteyi artranlar (GSH-Px aktivitesini artran ebselen ve asetilsistein). 6) Nonenzimatik serbest radikal toplayclar (mannitol, albmin). 7) Demir redoks dngs inhibitrleri (desferroksamin). 8) Ntrofil adezyon inhibitrleri. 9) Sitokinler (TNF ve IL-1). 10) Barbitratlar. 11) Demir elatrleri. Gdalardaki eksojen antioksidanlar unlardr: 1) Butylated hydroxytoluene (BHT). 2) Butylated hydroxyanisole (BHA). 3) Sodium benzoate. 4) Ethoxyquin. 5) Propylgalate. 6) Fe-superoxyde dismutase.

Speroksit dismutaz (SOD) Speroksit dismutaz (EC 1.15.1.1, EC-SOD) speroksit serbest radikalinin (O2) hidrojen peroksit (H2O2) ve molekler oksijene (O2) dnmn katalizleyen antioksidan enzimdir.

nsanda speroksit dismutazn iki izomer tipi bulunmaktadr. Cu-Zn SOD sitozolde bulunur, Cu ve Zn ierir, dimerik yapdadr, siyanidle inhibe edilir. Mn SOD mitokondride bulunur, Mn ierir, tetramerik yapdadr, siyanidle inhibe olmaz. Genel olarak hcrede en bol bulunan izomer sitozolik Cu-Zn SOD'dr. SOD'n fizyolojik fonksiyonu oksijeni metabolize eden hcreleri speroksit serbest radikalinin (O2) lipid peroksidasyonu gibi zararl etkilerine kar korumaktr. SOD, fagosite edilmi bakterilerin intraselller ldrlmesinde de rol oynar. SOD aktivitesi,yksek oksijen kullanm olan dokularda fazladr ve doku pO2 artyla artar. SOD'n ekstraselller aktivitesi ok dktr. Cu-Zn SOD'n spesifik aktivitesi Down sendromlu hastalarn eritrositlerinde yksek, prematrelerin ve yallarn eritrositlerinde ve psriyazisli hastalarn lkositlerinde dk bulunmutur.

Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) sitozolde bulunur, 4 selenyum atomu ierir, tetramerik yapdadr. Glutatyon peroksidaz (glutatyon:H2O2 oksidoredktaz, EC 1.11.1.9), hidroperoksitlerin indirgenmesinden sorumlu enzimdir.

14

Fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz (PLGSH-Px) ad verilen bir enzim monomerik yapdadr ve esas olarak membran fosfolipid hidroperoksitlerini alkollere indirger.

Fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz (PLGSH-Px) membrana bal en nemli antioksidan olan vitamin E yetersiz olduunda membran peroksidasyona kar korur. GSH-Px'n fagositik hcrelerde de nemli fonksiyonlar vardr. Dier antioksidanlarla birlikte GSH-Px, solunum patlamas srasnda serbest radikal peroksidasyonu sonucu fagositik hcrelerin zarar grmesini nler. GSH-Px eritrositlerde oksidatif strese kar en etkili antioksidandr. Eritrosit GSH-Px aktivitesi yallarda ve Down sendromlu hastalarda yksek, prematrelerde dk bulunmutur. Lkosit GSH-Px aktivitesi yallarda ve hipertansiyonlu hastalarda yksek bulunmutur.

Glutatyon redktaz Glutatyon redktaz, GSH-Px vastasyla hidroperoksitlerin indirgenmesi sonucu oluan okside glutatyonun (GSSG) tekrar indirgenmi glutatyona (GSH) dnmn katalize eder.

15

Glutatyon S-Transferazlar (GST) Glutatyon S-transferazlar (GST), EC 2.5.1.18 kodlu ve her biri iki alt birimden olumu bir enzim ailesidir. Glutatyon S-transferazlar (GST), bata araidonik asit ve lineolat hidroperoksitleri olmak zere lipid peroksitlerine kar selenyum-bamsz GSH-Px aktivitesi gstererek bir antioksidan savunma mekanizmas olutururlar.

Glutatyon S-transferazlar (GST) katalitik ve katalitik olmayan ok sayda fonksiyona sahiptirler. Bunlar hem detoksifikasyon yaparlar hem de hcre ii balayc ve tayc rolleri vardr. GST'lar, karacierde sitokrom P450 enzim sistemi tarafndan reaktif ara rnlere dntrlen yabanc maddelerin daha az reaktif konjugatlara dnmn katalizlerler. Serum GST konsantrasyon tayininin aminotransferazlardan (AST ve ALT) daha duyarl bir hepatoselller hasar indeksi salad gsterilmitir.

Katalaz (CAT) Katalaz (H2O2:H2O2 oksidoredktaz, EC 1.11.1.6) yapsnda drt tane hem grubu bulunan bir hemoproteindir. Katalaz esas olarak peroksizomlarda daha az olarak sitozolde ve mikrozomal fraksiyonda bulunur. Katalaz hidrojen peroksidi (H2O2) suya ve oksijene paralar.

Granulomatz hcrelerde katalaz, hcreyi kendi solunumsal patlamasna kar koruma ilevini de grr. Hcrede oluan hidrojen peroksidi (H2O2) hidroksil serbest radikali (OH) oluumunu nlemek iin ortadan kaldrr.

Mitokondriyal sitokrom oksidaz Mitokondriyal sitokrom oksidaz solunum zincirinin son enzimidir ve speroksidi (O2) detoksifiye eder.

Bu reaksiyon fizyolojik artlarda srekli cereyan eden normal bir reaksiyondur, bu yolla yakt maddelerinin oksidasyonu tamamlanr ve bol miktarda enerji retimi (ATP) salanr. Ancak ou zaman speroksit (O2) retimi mitokondriyal sitokrom oksidaz enziminin kapasitesini aar ve bu durumda dier antioksidan enzimler devreye girerek speroksidin (O2) zararl etkilerine engel olurlar.

Vitamin C (askorbik asit) Vitamin C (askorbik asit) organizmada birok hidroksilasyon reaksiyonunda indirgeyici ajan olarak grev yapar Kollajen sentezinde lizin ve prolinin hidroksilasyonu iin gereklidir.

16

Tirozinden epinefrin sentezinin dopamin -hidroksilaz basamanda grev alr. Tirozin yklmnda p-hidroksi fenil pirvatn homogentizata oksidasyonunda rol alr. Safra asitlerinin sentezindeki 7--hidroksilaz balang basamanda rol alr. Lizinden karnitin sentezinde rol alr. Demirin emiliminde enzimatik olmayan bir yol ile indirgeyici olarak rol oynar, midede ferri demiri ferro demire indirger. mmnite ve yara iyilemesinde etkilidir. Askorbik asit, gl indirgeyici aktivitesinden dolay ayn zamanda gl bir antioksidandr. Speroksit radikali (O2) ve hidroksil radikali (OH) ile reaksiyona girerek onlar ortamdan temizler. Askorbik asit antioksidan etkisinin yannda oksidan etki de gsterir. Askorbik asit proteine bal ferri demiri uzaklatrarak ya da dorudan ferri demiri indirgeyerek Fenton reaksiyonunda hidrojen peroksit ile etkilemeye ve sonunda hidroksil radikali (OH) oluturmaya uygun ferro demire dntrr. Bu zelliinden dolay vitamin C, serbest radikal reaksiyonlarnn nemli bir katalisti veya bir prooksidan olarak deerlendirilir. Ancak bu tip etkisinin sadece dk konsantrasyonlarda grld, yksek konsantrasyonlarda gl bir antioksidan olarak etki ettii kaydedilmitir. Vitamin C'nin fagositoz iin de nemli olduu gsterilmitir.

Vitamin E (-tokoferol) Vitamin E (-tokoferol) ok gl bir antioksidandr, hcre membran fosfolipidlerinde bulunan poliansatre ya asitlerini serbest radikal etkisinden koruyan ilk savunma hattn oluturur. Vitamin E speroksit ve hidroksil radikallerini, singlet oksijeni, lipid peroksit radikallerini ve dier radikalleri indirger. Vitamin E zincir krc antioksidan olarak bilinir. Lipid peroksidasyonu zincir reaksiyonu, vitamin E vastasyla sonlandrlabilir.

Vitamin E okside olduktan sonra ve paralanmadan nce askorbik asit ve glutatyon tarafndan yeniden indirgenebilmektedir. Vitamin E ve C verilmesinin, yal kiilerde ortalama kan lipid peroksit konsantrasyonlarnda bir azalma salad saptanmtr. Glutatyon peroksidaz ile vitamin E, serbest radikallere kar birbirlerini tamamlayc etki gsterirler. Glutatyon peroksidaz olumu peroksitleri ortadan kaldrrken vitamin E peroksitlerin sentezini engeller. Vitamin E selenyum metabolizmasnda da nemli rol oynar. Vitamin E selenyumun organizmadan kaybn nleyerek veya onu aktif ekilde tutarak selenyum ihtiyacn azaltr. Serbest radikallerin kanserin balamasnda rol ald ve vitamin E ile dier antioksidanlarn antikanserojen etki gstererek kanserin yaylmasn ve tmrn bymesini nledii kaydedilmitir.

Karotenoidler Vitamin A'nn n maddesi olan -karotenin singlet oksijeni bastrabildii, speroksit radikalini temizledii ve peroksit radikalleriyle direkt olarak etkileerek antioksidan grev grd saptanmtr.

Melatonin (MLT) Melatonin en zararl serbest radikal olan hidroksil serbest radikalini (OH) ortadan kaldran ok gl bir antioksidandr, gnmze kadar bilinen antioksidanlarn en gls olarak kabul edilmektedir.

17

Melatonin hidroksil serbest radikali (OH) ile reaksiyona girdikten sonra bir indolil katyon radikaline dnr ki bunun da ortamdaki speroksit radikalini (O2) tutarak antioksidan aktivite gsterdii kaydedilmitir. Melatoninin antioksidan olarak dier bir zellii lipofilik olmasdr, hcrenin hemen btn organallerine ve hcre ekirdeine ulaabilir ve bylece ok geni bir dalmda antioksidan aktivite gsterir. Serbest oksijen radikalleri oluturmak suretiyle kansere sebep olan safroln DNA zerine hasar oluturucu etkisinin, melatonin tarafndan ok etkili ekilde inhibe edildii gsterilmitir. Melatonin kanserin ilerleme ve gelime safhalarn geciktirir. Yalanma ile birlikte melatonin retimi de azalr ki bunun da yalanma ve yalanmaya bal hastalklarn patogenezinde nemli rol olabilecei kaydedilmitir.

Glutatyon (GSH) Glutatyon (GSH) karacierde genetik bilgiye ihtiya olmadan sentezlenebilen bir tripeptitdir. Glutatyon (GSH) ok nemli bir antioksidandr, serbest radikaller ve peroksitlerle reaksiyona girerek hcreleri oksidatif hasara kar korur. Hemoglobinin oksitlenerek methemoglobine dnmnn engellenmesinde rol alr. Ayrca proteinlerdeki slfhidril (-SH) gruplarn redkte halde tutar ve bu gruplar oksidasyona kar korur, bylece fonksiyonel proteinlerin ve enzimlerin inaktivasyonunu engeller. Glutatyon (GSH) yabanc bileiklerin detoksifikasyonu ve amino asitlerin membranlardan transportunu da salar. Glutatyon (GSH) eritrositleri, lkositleri ve gz lensini oksidatif strese kar korumada hayati neme sahiptir.

rat Normal plazma konsantrasyonunda rat, hidroksil, speroksit, peroksit radikalleri ve singlet oksijeni temizler. Fakat lipid radikalleri zerine etkisi yoktur. Ayrca vitamin C oksidasyonunu engelleyici etkisi vardr.

Bilirubin Bilirubin speroksit ve hidroksil radikali toplaycsdr.

Albmin Albmin LOOH ve HOCl toplaycsdr.

Seruloplazmin Seruloplazmin olaslkla SOD'a benzer mekanizmayla etki gsterir. Ferro demiri (Fe2+) ferri demire (Fe3+) ykseltgeyerek Fenton reaksiyonunu ve bylece hidroksil radikali oluumunu inhibe eder.

Transferrin ve Laktoferrin Transferrin ve laktoferrin dolamdaki serbest demiri balarlar.

Ferritin Ferritin dokudaki demiri balar.

Sistein Sistein speroksit ve hidroksil radikali toplaycsdr.

18

Ebselen Ebselen selenyumlu bir bileiktir. Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) aktivitesini glendirir ve lipoksijenaz yolunu inhibe eder.

Sitokinler Sitokinler bata katalaz olmak zere antioksidan enzimleri aktive ederler. Ancak proteolitik enzimleri aktive ettiklerinden dolay zararl da olabilirler.

Demir elatrleri Demir elatrleri hcre iine girerek serbest demiri balamak suretiyle onu etkisizletirirler, bylece Fenton reaksiyonunu ve sonuta hidroksil radikali oluumunu inhibe ederler. Bu zelliklerinden dolay reperfzyonda kullanlmalarnn faydal olduu kaydedilmitir.

Desferroksamin Desferroksamin serbest Fe3+ ' balar.

Oksiprinol Oksipranol alloprinoln metabolitidir, dorudan hidroksil radikali ve hipokloriti azaltc ynde etki eder.

Mannitol Mannitol hidroksil radikalini toplayc etki gsterir.

Probukol Probukol kan kolesteroln drmede kullanlr. Lipid peroksidasyonu zincir reaksiyonunu krc etkisi vardr.

Oksidatif stres Hcrede normal metabolik yollardaki enzimatik reaksiyonlarda enzimlerin aktif yerinde ara rnler olarak devaml ekilde serbest radikaller olutuunu biliyoruz. Bazen bu serbest radikal ara rnler enzimlerin aktif yerinden szmakta, molekler oksijenle kazara etkileerek serbest oksijen radikalleri oluturmaktadrlar. Hcrede oluan reaktif oksijen trleri (ROS), "antioksidan savunma sistemleri" veya ksaca "antioksidanlar" olarak bilinen mekanizmalarla ortadan kaldrlrlar. Ancak bazen hcresel savunma mekanizmas vastasyla ortadan kaldrlandan daha fazla reaktif oksijen trleri (ROS) oluabilir. Organizmada Hcresel savunma mekanizmas vastasyla ortadan kaldrlandan daha fazla reaktif oksijen trlerinin (ROS) meydana gelmesi oksidatif stres olarak tanmlanr.

19

Oksidatif stresin, serbest oksijen radikallerinin neden olduu hcre hasaryla birok kronik hastaln komplikasyonlarna katkda bulunduu dnlmektedir. Aterogenez, amfizem/bronit, Parkinson hastal, Duchenne tipi muskler distrofi, gebelik preeklampsisi, serviks kanseri, alkolik karacier hastal, hemodiyaliz hastalar, diabetes mellitus, akut renal yetmezlik, Down sendromu, yalanma, retrolental fibroplazi, serebrovaskler bozukluklar, iskemi/reperfzyon injrisi gibi durumlarn patogenezinde oksidatif stresin rolnden sz edilmektedir.

Oksidatif stres aratrmalar Oksidatif stresin hastalklarn patogenezinde rol anlaldka bu alandaki almalar da younlamtr. Oksitatif stres almalarnda serbest radikallerin art veya antioksidan savunma sistemlerinin yetersizlii aratrlmaktadr. Bunun iin plazma, serum, eritrosit, doku rnekleri gibi eitli materyallerde analiz yapmaya uygun yntemler gelitirilmitir. Serbest radikaller son derece reaktif ve ksa mrldrler. Bu yzden direkt olarak llmeleri zordur. Serbest radikalleri direkt olarak len tek analitik teknik spin rezonans spektrometrisidir. Spin rezonans spektrometrisi ileri teknik donanm gerektirir, ayrca ok duyarl olmamas ve mikromolar dzeyde sabit konsantrasyonlarda serbest radikaller gerektirmesi nedeniyle kullanm yaygn deildir. Serbest radikal retimi artnn belirlenmesi iin bunlarn lipidlerle, proteinlerle ve DNA ile reaksiyonlar sonucu oluan eitli rnlerin lm gibi indirekt yntemler kullanlr. Bu yntemler arasnda lipid peroksidasyonunun son rnlerinin lm en ok kullanlan yntemdir. Hidroksil serbest radikali (OH) reaksiyon rnlerinin lm ile tayin edilebilir. Hidroksil serbest radikali (OH) salisilik asitle reaksiyona girerek 2,3-dihidroksibenzoat (2,3-DHB) ve fenilalanin ile reaksiyona girerek o- ve m-tirozinleri oluturur. Organizma svlarnda 2,3-dihidroksibenzoat (2,3-DHB) veya o- ve m-tirozinlerin tespiti hidroksil serbest radikalinin (OH) artn gsterir. Ancak bu teknik uygulanmas zor ve sonular bakmndan pek gvenilir deildir.

Lipid peroksidasyon rnlerinin llmesi Oksitatif stres almalarnda, organizmada serbest radikal retimi artnn belirlenmesi iin eitli biyolojik materyalde lipid peroksidasyonunun eitli rnlerinin konsantrasyonlar sklkla llmektedir. Serbest oksijen radikallerin balatt lipid peroksidasyon zincir reaksiyonu sonucunda lipid hidroperoksitleri (LOOH) ve konjuge dienler oluur. Lipid hidroperoksitleri (LOOH) ve konjuge dienler de daha sonra alkan aldehitler, alken aldehitler, hidroksialken aldehitler, malondialdehit (MDA) ve uucu hidrokarbonlar oluturmak zere paralanrlar. Serbest radikal retimi artnn belirlenmesi iin lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) lm, konjuge dienlerin lm, MDA dndaki aldehitlerin lm, uucu hidrokarbonlarn lm, lipid peroksidasyonu fluoresan rnlerinin lm ve malondialdehit (MDA) lm yaplabilir. Her bir tekniin kendine gre zorluklar vardr ve hibir metodun lipid peroksidasyonunu tam bir dorulukta lt sylenemez. Ayrca, oluan rnlerin miktar eitli faktrlerden etkilenebildiinden bir tek rn yerine birden fazla rn lmek idealdir. Lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) lm eitli tekniklerle plazmada yaplr. Bu tekniklerden biri, hassas olmakla birlikte pahal bir teknik olan gaz kromatografisi-ktle spektrometrisi (GC-MS) tekniidir. Plazma lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) lm ticari olarak mevcut kitlerle de yaplabilir. Ancak bu lmlerin sonular dier metotlarn sonularyla iyi bir korelasyon gstermemektedir.

20

Konjuge dienlerin lm biyolojik materyallerde hem proteinleri gibi baz maddelerin varlndan dolay zordur. Ayrca normalde insan plazmasnda mevcut olan dk dzeylerdeki konjuge dienler de lm zorlatrrlar. MDA dndaki aldehitlerin lm genellikle zaman alc, pahal ve rutin olarak kullanlmaya uygun olmayan metotlar gerektirir. Uucu hidrokarbonlarn lm flame iyonizasyon dedektrl gaz kromatografisi yntemiyle, dar verilen solunum havasnda yaplr. Yntem olduka hassastr ve olgulardan tekrar tekrar numune alnabilme avantaj vardr, fakat zaman alc ve pahaldr. Ayrca sigara duman ve egzoz gaz gibi eksojen kaynaklardan hidrokarbon kontaminasyonu riski vardr. Lipid peroksidasyonu fluoresan rnlerinin lm peroksidasyonun ge aamasn yanstr ve her laboratuvarda uygulanmas zordur. Malondialdehit (MDA) lm lipid peroksidasyonunun derecesinin belirlenmesi iin en sk bavurulan testtir. MDA lm en yaygn olarak tiyobarbitrik asit (TBA) yntemiyle yaplr. Baz deneysel sistemlerde TBA ynteminin esas olarak MDA'nn kendisini lt gsterilmitir. Ancak ou sistemde bu test MDA iin spesifik olmadndan tiyobarbitrik asit ile reaksiyon veren maddelerin (TBARS) lm eklinde ifade edilir. Saf lipidlerle yaplan almalar ve hayvanlar zerinde yaplan denemeler, TBARS lm ile lipid peroksidasyonunu len dier metotlar arasnda iyi bir korelasyon olduunu gstermitir. TBARS lm ok basit ve hzl olmakla birlikte biyolojik materyallere uygulanmasnda eitli problemler vardr. Numunede mevcut ya da reaksiyon srasnda aa kan pigmentler kolorimetrik lm interfere edebilirler. Ayrca MDA dndaki aldehitler de tiyobarbitrik asitle (TBA) renkli kompleks oluturmak zere reaksiyona girebilirler. Serbest MDA'nn direkt tayini en gvenilir ekilde yksek performans likit kromatografisi (HPLC) yntemiyle yaplr. HPLC ok hassas ve hzl bir metottur ve az numune gerektirir. Fakat teknik ok dikkatli numune hazrl gerektirir.

Antioksidan aktivitenin llmesi Oksitatif stres almalarnda, organizmada antioksidan savunma sistemlerinin yetersizliini aratrmak iin eitli biyolojik materyalde eitli antioksidanlarn aktiviteleri veya konsantrasyonlar sklkla llmektedir. Enzim olan ve enzim olmayan birok antioksidan eitli yntemlerle llmektedir. Rede glutatyon (GSH) lm eritrositlerde, kolorimetrik yntemle yaplr. Bunun iin EDTA'l veya heparinli tam kan alnr. Tam kan, 4 oC'de 1 gn stabildir. Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) aktivitesi lm eritrositlerde, UV yntemle yaplr. Bunun iin EDTA'l tam kan alnr. Tam kan, 4 oC'de 20 gn stabildir. Glutatyon redktaz aktivitesi lm eritrositlerde, kolorimetrik yntemle yaplr. Bunun iin EDTA'l veya heparinli tam kan alnr. Tam kan, 4 oC'de 20 gn stabildir. Glutatyon S-tansferaz aktivitesi lm iin eitli yntemler kullanlmaktadr. Speroksit dismutaz (SOD) aktivitesi lm eritrositlerde, kolorimetrik yntemle yaplr. Bunun iin EDTA'l veya heparinli tam kan alnr. Katalaz aktivitesi lm eritrositlerde, titrimetrik yntemle yaplr. Bunun iin EDTA'l veya heparinli tam kan alnr. - karoten lm serumda, HPLC ile yaplr. Iktan korunmaldr ve serum hemolizli olmamaldr. 70 oC'de yllarca stabildir. Vitamin C (askorbik asit) lm oksalatl, EDTA'l veya heparinli plazmada, serumda, lkositlerde kolorimetrik yntemle ve HPLC ile yaplabilir. Plazma ve serum hemolizli olmamal, lkositler eritrositlerle kontamine olmamaldr. Vitamin E (-tokoferol) lm serum veya heparinli plazmada, HPLC ile yaplr. Numune alk faznda alnmal ve ktan korunmaldr.

21

Melatonin lm son zamanlarda gncellemi grnmektedir.

Nitrik oksit (NO) Nitrik oksit (NO) hem fizyolojik hem patofizyolojik srelerde nemli bir role sahip serbest radikaldir. NO sentezi baz hcrelerde bir reseptre bir stimlatrn balanmasna veya nronlarda bir sinir uyarsna yant olarak meydana gelir. Nitrik oksit (NO) muskarinik veya histamin reseptrleri gibi eitli reseptrlerin aktivasyonu sonucu L-arjinin ve oksijenden, nitrik oksit sentaz (NOS, EC 1.14.13.39) etkisiyle sentezlenir.

Nitrik oksit (NO) sentezinin insanda vaskler tonsn dzenlenmesinde nemli rol oynad, kan basnc ve bbrek fonksiyonunun kontrolnde kesin bir role sahip olduu bilinmektedir. Nitrik oksit (NO) vaskler endoteliyal hcrelerde oluturulan nemli bir vazodilatatrdr. NO dz kas hcrelerine girer ve 3',5'-siklik GMP (cGMP) oluturmak zere solubl guanilat siklaz stimle eder. Bylece hcrede cGMP konsantrasyonu artar. Dz kas hcrelerinde cGMP, bir veya daha fazla protein kinaz cAMP gibi aktive eder. Aktive olan protein kinazlar dz kasn relaksasyonu ve ardndan damarlarn dilatasyonundan sorumludurlar.

22

Nitrik oksit (NO) korpus kavernosumu kan ile doldurmak iin dz kas relaksasyonunu uyaran bir nrotransmitter olarak etki ederek penil eraksiyonu uyarr Nitrik oksit sentaz (NOS) sinir dokuda, vaskler endotelde, trombositlerde ve dier dokularda bulunur. Nitrik oksit sentazn (NOS), nronal NOS (tip I, nNOS), endoteliyal NOS (tip III, eNOS) ve indklenebilir NOS (tip II, iNOS) olmak zere farkl lokalizasyon ve dzenlenmeye sahip izoenzimi vardr. Nronal NOS (tip I, nNOS) ve endoteliyal NOS (tip III, eNOS), Ca2+ ve kalmodulin baml esas izoformlardr. Nronal NOS (tip I, nNOS), nral iletide foksiyon grr. Endoteliyal NOS (tip III, eNOS) bbreklerde bulunur. Endoteliyal NOS (tip III, eNOS) vastasyla oluturulan nitrik oksit (NO), vaskler dz kas hcrelerinin relaksasyonu iin en nemli sinyaldir. ndklenebilir NOS (tip II, iNOS) normal artlar altnda bulunmaz. nflamasyon veya enfeksiyon durumlarnda sitokinler veya endotoksinler tarafndan indklenir ve uzun dnemde bol miktarda retilir. iNOS hepatositler, makrofajlar, ntrofiller, dz kas hcreleri, kondrositler gibi birok hcre tipinde indklenebilir. iNOS vastasyla oluturulan NO, antimikrobiyal aktiviteye sahiptir ve bu nedenle nonspesifik konak savunma sisteminin nemli bir parasdr. Sepsis, astm, romatoit artrit, aterosklerotik lezyonlar, tberkloz, inflamatuvar barsak hastal, Helicobacter pylori'nin yol at gastrit, allogreft rejeksiyonu, Alzheimer hastal ve multipl skleroz gibi geni bir hastalk grubunda iNOS'un artt saptanmtr. NO un devaml ve ar retilmesinin, bu hastalklarn semptomlarnn bir ksmndan sorumlu olduu dnlmektedir.

Nitrik oksidin (NO) oksidatif etkileri Nitrik oksit (NO) Fe-S proteinlerinden demiri kararak yerine kendisi balanr, bylece Fenton reaksiyonunu stimle eder ve bu mekanizma ile karsinogeneziste rol oynar. Nitrik oksitin speroksit dismutaz (SOD) enzimiyle yarmaya girmesi ve speroksit (O2) radikaliyle etkilemesi sonucu peroksinitrit (ONOO) oluur. Bylece nitrik oksitin fizyolojik etkisi inhibe edilir, oksidatif etkisi ortaya kar. Vaskler tonsn dzenlenmesi iin speroksit (O2) ve nitrik oksit (NO) arasndaki fizyolojik dengenin nemli olduu ileri srlmektedir. Peroksinitrit, nitrik oksit toksisitesinin balca sorumlusudur. Peroksinitritin proteinlere dorudan zararl etkileri vardr ve azot dioksit (NO2), hidroksil radikali (OH), nitronyum iyonu (NO2+) gibi toksik rnlere dnr.

23

Peroksinitrit, nitrit (NO2) ve nitrat (NO3) oluturmak zere metabolize edilir. NO radikalinin stabil son rnlerin nitrit ve nitrattr. Plazma gibi ou vcut svsnda nitritin ou nitrata dnmtr.

Organizmada nitrik oksit (NO) artn aratrma almalar Organizmada nitrik oksit(NO) artnn belirlenmesi iin birok NO veya metabolitlerini lm yntemi gelitirilmitir. Gerek zamana dayanan NO retiminin tayini biopsi rnekleri veya lkositler gibi canl biyolojik rneklerde yaplabilir, ancak kompleks teknikleri gerektirir. NO radikalinin stabil son rnleri olan nitrit ve nitratn tayini iin gelitirilen metotlar, hem taze hem saklanm plazma, serum, idrar, safra, sinovyal sv, balgam, tkrk, serebrospinal sv gibi vcut svlarna uygulanabilir. KAYNAKLAR 1. Dawn BM, Allan DM, Colleen MS. Basic Medical Biochemistry a Clinical

Approach.Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, Maryland.(1996). 2. Akku . Serbest Radikaller ve Fizyopatolojik Etkileri. Mimoza Yaynlar. Konya. (1995). 3. Tietz NW. Clinical Guide to Laboratory Tests. W.B. Saunders Company. Philadelphia,

Pennsylvania. (1995). 4. Burtis CA, Ashwood ER. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. W.B. Saunders

Company. Philadelphia, Pennsylvania. (1999).

24

EKLER

Ann Otol Rhinol Laryngol 1999 Jun;108(6):564-8

Lipid peroxides in middle ear fluid after acute otitis media in guinea pigs. Takoudes TG, Haddad J Jr Division of Pediatric Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Columbia-Presbyterian Medical Center, Babies and Children's Hospital, New York, New York 10032, USA. Oxygen free radical damage has been demonstrated in the middle ear mucosa of a guinea pig model of acute otitis media (AOM). Potential sources of free radicals include both neutrophils responding to infection and Streptococcus pneumoniae, a common AOM pathogen. This project was conducted to examine the middle ear fluid in a guinea pig model of AOM for evidence of elevated lipid peroxide (LPO) as a marker of free radical damage. Twenty-one guinea pigs were injected transtympanically with bacteria into the left (infected) middle ear cavity and sterile saline into the right (control) middle ear. Middle ear fluid was recovered on postoperative day 5. The fluid was weighed and analyzed for quantity of LPO. Results indicated an increased absolute level of LPO, as well as an increased level of LPO divided by the weight of the fluid recovered. Histologic examination confirmed leukocyte infiltration and mucosal edema that were consistent with mucosal damage. While free radical damage to the middle ear mucosa in a guinea pig model of AOM is well documented, this is the first study to demonstrate evidence of free radical damage in middle ear fluid. These results are relevant because they correlate mucosal damage with lipoperoxidation in fluid. Additionally, this serves as an important precursor to human studies, since middle ear fluid is readily available in patients with otitis media.

Otolaryngol Head Neck Surg 1999 May;120(5):638-42

Evidence of oxygen free radical damage in human otitis media. Takoudes TG, Haddad J Jr Division of Pediatric Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Babies & Children's Hospital of New York, Columbia-Presbyterian Medical Center, New York 10032, USA. Recent work with a guinea pig model of otitis media has demonstrated evidence of oxygen free radical damage to the middle ear mucosa. However, the relevance of an animal model to

25

human disease is uncertain. Accordingly, the following pilot study was conducted to examine human middle ear fluid for lipid hydroperoxides as evidence of free radical damage. Thirty-five specimens of middle ear fluid from children with chronic otitis media were collected and described as mucoid (n = 19), purulent (n = 10), or serous (n = 6); specimens were weighed and analyzed for lipid hydroperoxide content. The results demonstrated the presence of lipid hydroperoxide in all 3 types of middle ear fluid. Additionally, there was a statistically significant elevation of total lipid hydroperoxide content in mucoid effusions compared with serous effusions, as well as a significant elevation of lipid hydroperoxide divided by weight of purulent effusions compared with serous effusions. This is the first study to document free radical damage in human otitis media.

Laryngoscope 1998 Apr;108(4 Pt 1):524-30

Lipoperoxidation as a measure of free radical injury in otitis media. Haddad J Jr Division of Pediatric Otolaryngology, Columbia-Presbyterian Hospital, New York, New York 10032, USA. Free radical damage, as evidenced by lipoperoxidation, has previously been demonstrated to contribute to the inflammatory changes associated with acute otitis media. The present study was undertaken to evaluate whether lipoperoxidation continues to be present for a period of time after middle ear infection. Eighty-two 300- to 400-g guinea pigs were injected with Streptococcus pneumoniae in the left ear and sterile saline in the right ear as a control. Animals were examined and sacrificed on day 5, 10, 20, or 30; middle ear mucosa was harvested and assayed for lipid hydroperoxide content. A statistically significant increase in lipoperoxidation was seen at each time point studied, compared with controls. Lipoperoxidation was highest at days 5 and 10; a significant decrease was seen at days 20 and 30. Histologic sections of middle ear mucosa of two animals per group were prepared and evaluated for inflammation. These results demonstrate that lipoperoxidation may contribute to middle ear inflammation for a significant period of time after acute infection; the findings are discussed in light of other work on the role of free radicals in otitis media.

Evidence of oxygen radical injury in experimental otitis media. Parks RR, Huang CC, Haddad J Jr Department of Otolaryngology, Columbia Presbyterian Medical Center, New York, N.Y. 10032. Free radicals have been implicated in the pathogenesis of an increasing number of diseases and inflammatory states. They may cause tissue damage by their chemical modification of proteins, carbohydrates, nucleotides, and lipids. Lipid peroxidation occurs as a consequence of free radicals acting on the polyunsaturated fatty acids of cellular membranes. To determine if free radicals play a role in the pathogenesis of otitis media, lipid peroxides and their by-products were assayed in the mucosa of a guinea pig model of otitis media. Both lipid hydroperoxide (LPO) and malondialdehyde (MDA) were measured in the tissues of the middle ear mucosa. Comparisons were made between an infected and a control group. Both LPO and MDA were found to be significantly elevated (P < .01 and P < .05, respectively) in the infected mucosa. Correlation of the biochemical data was made with histologic studies.

26

The significance of these findings as well as suggestions for future experimentation are addressed.

Laryngoscope 1997 Feb;107(2):206-10

Hydrogen peroxide in acute otitis media in guinea pigs. Takoudes TG, Haddad J Jr Division of Pediatric Otolaryngology--Head and Neck Surgery, Babies and Children's Hospital of New York, New York, 10032, USA. Evidence has emerged that oxygen free radicals contribute to middle-ear mucosa damage in acute otitis media (AOM). Streptococcus pneumoniae is the most common pathogen in AOM and produces hydrogen peroxide, a free radical intermediate, as it grows. To better characterize the mechanism of free radical damage in AOM, an experiment was conducted to examine the production of hydrogen peroxide. Thirty-two guinea pigs were injected transtympanically with bacteria in the left (infected) middle ear and sterile saline into the right (control) middle ear. Middle-ear fluid was removed and analyzed for quantity of hydrogen peroxide. Results indicated significantly greater hydrogen peroxide levels in infected versus control middle-ear fluid at 6, 12, and 24 h. Likely sources of hydrogen peroxide include both the neutrophil response to infection and pneumococcal growth and death.

Middle ear catalase distribution in an animal model of otitis media. Parks RR, Huang CC, Haddad J Jr Department of Otolaryngology, Columbia Presbyterian Medical Center, New York, NY 10032, USA. Increasing evidence implicates free radicals in the pathogenesis of inflammatory disease, including otitis media. The anti-oxidant enzymes catalase, glutathione peroxidase and superoxide dismutase protect tissues from the destructive effects of free radicals. Our previous work has shown depressed levels of superoxide dismutase in the infected middle ears of a guinea pig model of otitis media in comparison with normal control ears. We studied the distribution and relative abundance of catalase in the middle ear of this animal model in an effort to elucidate the role free radicals play in the pathogenesis of otitis media. Catalase distribution was mapped immunohistochemically in the middle ears of guinea pigs with induced streptococcus otitis media, and compared with normal control ears. In the control ears, catalase was localized to the epithelium of the middle ear mucosa, with scant distribution in the submucosa. The infected ears demonstrated inflammatory cell invasion with hyperemia and submucosal edema. Catalase was localized to the epithelium and had scant distribution in the submucosa. This distribution was similar to that found previously with superoxide dismutase. Enzyme-linked immunosorbent assay of catalase demonstrated a mean value of 1.00 +/- 0.06 microgram/mg protein in the control ears, and 1.06 +/- 0.12 microgram/mg in the infected ears, but these two values were not statistically different.

Eur Arch Otorhinolaryngol 1995;252(3):153-8

Superoxide dismutase in an animal model of otitis media. Parks RR, Huang CC, Haddad J Jr Department of Otolaryngology, Columbia Presbyterian Medical Center, Babies Hospital North, New York, NY 10032, USA.

27

Cu, Zn superoxide dismutase (SOD) is a metalloprotein that catalyzes the dismutation of the superoxide anion into O2- and H2O2, and therefore functions to maintain a low intracellular concentration of an otherwise toxic metabolite of oxygen. SOD protects living tissue from the destructive effects of free radicals. Increasing evidence implicates free radicals, including the superoxide radical (O2-), in the pathogenesis of disease, including otitis media. In an effort to elucidate the role free radicals play in the pathogenesis of otitis media, SOD was localized immunocytochemically to determine its cellular distribution in specimens of guinea pig middle ear. In normal ears, SOD was found concentrated in the epithelium of the middle ear mucosa. Low quantities were characteristic of connective tissue, bone, and cartilage. In streptococcus-infected ears, SOD localized similarly, concentrating in the epithelium. The infected ears had extensive submucosal edema which stained poorly and appeared to have less SOD than did normal ears. This was confirmed by an assay using laser densitometry of Western blots to quantify the amount of SOD in the mucosa of normal versus infected middle ears. This demonstrated a value of SOD in normal mucosa of 1.77 +/- 0.48 micrograms/mg of protein compared with 1.02 +/- 0.28 micrograms/mg in the infected mucosa. The two groups were significantly different at P < 0.05. These findings are discussed, and suggestions for future experimentation addressed.

Am J Physiol 1999 Dec;277(6 Pt 1):L1089-95

Superoxide anion impairs Ca(2+) mobilization in cultured human nasal epithelial cells. Koyama T, Oike M, Komiyama S, Ito Y Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Kyushu University, Fukuoka 812-8582, Japan. We examined the effects of superoxide anion (O(-2)) on the intracellular Ca(2+) concentration in cultured human nasal epithelial cells. The cells were exposed to O(-2) by pretreatment with xanthine (X) and xanthine oxidase (XO); control cells were treated with X alone. When Ca(2+)-containing Krebs solution was reperfused in the thapsigargin-treated, store-depleted cells, reapplication-induced intracellular Ca(2+) concentration elevation was significantly smaller in X/XO-treated cells than in the control cells, suggesting that O(-2) impairs Ca(2+) release-activated Ca(2+) entry (CRAC). Bath application of ATP induced a steep Ca(2+) transient in both control and X/XO-treated cells. However, the concentration-response curve of the ATP-induced Ca(2+) transient was shifted to a higher concentration in X/XO-treated cells. The impairments of CRAC and ATP-induced Ca(2+) transient induced by X/XO were reversed by superoxide dismutase. Furthermore, all these X/XO-induced effects were also observed in cells pretreated with pyrogallol, also an O(-2) donor. These results indicate that O(-2) impairs at least two mechanisms involved in Ca(2+) mobilization in human nasal epithelial cells, i.e., CRAC and ATP-induced Ca(2+) release.

Auris Nasus Larynx 1999 Apr;26(2):159-63

Effects of free radicals on ciliary movement in the human nasal epithelial cells. Min YG, Ohyama M, Lee KS, Rhee CS, Oh SH, Sung MW, Yun JB, Jung IH Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, Seoul National University College of Medicine, South Korea. OBJECTIVE: There have been few reports on the effects of free oxygen radicals on ciliary mobility of nasal respiratory epithelial cells. The aim of this study was to determine the effects of free radicals and antioxidants on human nasal epithelial cells (HNECs) using video-

28

computerized analysis. METHODS: Human nasal epithelial cells were obtained from the nasal cavity of normal volunteers. Ciliary beat frequency (CBF) was calculated as the mean value of ten randomly selected cells. The proportion of the area with normal CBF (above 8 Hz) was calculated from 10 randomly selected sites per specimen. Free radicals were produced by xanthine-xanthine oxidase enzymatic system. The generation of free radicals was confirmed by chemoilluminometer. CBF and the proportion of the area with normal CBF were measured at every 5 min for 30 min after the addition of enzyme. For the evaluation of the antioxidant effects on free radical-mediated ciliary slowing in HNECs, cells were incubated in superoxide dismutase solution (300 unit/ml) for 30 min and 3-aminobenzamide (5 mM). RESULTS: Superoxide produced by 0.4 mM xanthine and 400 miliunit/ml xanthine oxidase decreased CBF (7.71 +/- 1.91 Hz). A total of 2 min later, ciliary slowing was evident (3.87 +/- 1.10 Hz). Regarding the changes in proportion of epithelial area that showed normal CBF experimental group showed a significant decrease in percentage of epithelial area with normal CBF over time. Superoxide dismutase prevented ciliary slowing (8.76 +/- 0.99 Hz). Moreover, 3-aminobenzamide, an inhibitor of the DNA repair enzyme poly-ADP ribose polymerase, prevented inhibition of CBF (8.32 +/- 0.61 Hz). CONCLUSIONS: These results suggest that oxygen-mediated damage to DNA may be the mechanism of the deterioration effects of oxygen radicals on the ciliated respiratory nasal epithelium.

Nitric Oxide 1999 Jun;3(3):235-43 Nitric oxide, superoxide, and hydrogen peroxide production in brain mitochondria after haloperidol treatment. Arnaiz SL, Coronel MF, Boveris A

School of Pharmacy and Biochemistry, University of Buenos Aires, Argentina. slarnaiz@ffyb.uba.ar Inhibition of mitochondrial respiration and free radical induction have been suggested to be involved in haloperidol neurotoxicity. In this study, mice were injected i.p. with haloperidol, according to two different treatments: (a) a single injection (1 mg/kg), sacrificed 1 h after the injection (single-dose model); and (b) two injections (1 mg/kg each), sacrificed 24 h after the first dose (double-dose model). Determinations of oxygen consumption and hydrogen peroxide (H2O2) production rate were carried out in isolated brain mitochondria. Nitric oxide (NO) and superoxide (O2-) production rates were measured in submitochondrial particles (SMP). Single-dose haloperidol treatment produced a 33% inhibition in malate-glutamate-dependent respiration, while no significant changes were found after double-dose treatment. NO production was inhibited by 39 and 54% in SMP from haloperidol-treated mice (single- and double-dose treatments, respectively) (control value: 1.6 +/- 0.2 nmol/min mg protein). NO steady-state concentration was estimated at about 16.5 nM and was decreased by 40% by haloperidol treatment. Increases of 105 and 54% were found in succinate-supported O2- and H2O2 production rates, respectively, after haloperidol single-dose treatment. Haloperidol treatment generated a 248% increase in SMP O2- production rate when measured in the presence of NADH plus rotenone. Our results suggest that haloperidol neurotoxicity would be mediated by a decreased mitochondrial NO production, a decreased intramitochondrial NO steady-state concentration, and by an inhibition of mitochondrial electron transfer with enhancement of O2- and H2O2 production. This inhibition does not seem to be caused by increased NO or ONOO- formation.

29

Am J Respir Crit Care Med 1999 Apr;159(4 Pt 1):1284-8 Exhaled nitric oxide concentrations during treatment of wheezing exacerbation in infants and young children. Baraldi E, Dario C, Ongaro R, Scollo M, Azzolin NM, Panza N, Paganini N, Zacchello F

Departments of Pediatrics and Anesthesia and Intensive Care, University of Padova, School of Medicine, Padova, Italy. eugi@child.pedi.unipd.it While it is known that exhaled nitric oxide (ENO) is increased in adults and school children with asthma exacerbation probably as an expression of disease activity, no studies have investigated whether this phenomenon also occurs in infants and young children with recurrent wheeze exacerbation. We measured ENO in 13 young children (mean age 20.2 mo) with recurrent wheeze (Group 1) during an acute episode and after 5 d of oral prednisone therapy. ENO was measured also in nine healthy control subjects (Group 2) (mean age 16.9 mo) and in six children with a first-time viral wheezy episode (Group 3) (mean age 11 mo). To measure ENO, infants inhaled NO-free air via a face mask from a reservoir and, through a nonrebreathing valve, exhaled in a collecting bag that was analyzed by chemiluminescence. To address the question of whether the levels of ENO collected in the bag are a reflection of the pulmonary airway, ENO determinations were performed in two healthy infants before and after tracheal intubation for elective surgery. During the acute episode of wheezing the mean (+/- SEM) value of ENO in children with recurrent wheeze (Group 1) was 14.1 +/- 1.8 ppb, almost threefold higher than in healthy control subjects (5.6 +/- 0.5 ppb, p < 0.001). After steroid therapy we found a mean fall of 52% in ENO (5.9 +/- 0.7 ppb, p < 0.01) compared with baseline values. ENO values measured before and after intubation in two infants were 6 ppb and 5 ppb in one child and 7 ppb and 6 ppb in the other one. The mean value of ENO of children with first-time wheeze (Group 3) was 8.3 +/- 1.3 ppb, significantly lower (p < 0.05) than the value of children with recurrent wheeze (Group 1). In conclusion, we describe a method to measure ENO in young children and show that infants with recurrent wheeze have elevated levels of ENO during exacerbation that rapidly decrease after steroid therapy. This suggests that, in these children, airway inflammation could be present at a very early stage.

30