Serial Regulation of Transcriptional Regulators in the Yeast Cell CycleCell, Vol 106, 697-708, September 2001

E2F integrates cell cycle progressionwith DNA repair, replication ,

and G2/M checkpointsGenes & Development, Vol 16, 245-256, 2002

ניתוח רשתות רגולטוריות - הקדמה

שני המאמרים עוסקים ביצירת תמונה ברורה ושלמה יותר של הרשת

הרגולטורית במחזור התא – בשמר ובאדם.

שניהם עושים זאת בעזרת שיטה שפותחה בכדי להפוך הישג זה

לאפשרי.

המגבלות של הכלים המחקריים

קיימות שתי שיטות לזיהוי השפעה של פקטור :שעתוק על גן מסויים

הגן כתוצאה מהוספת פקטור ניתוח השינוי בביטוי( 1) שעתוק מסויים

(microarray analysis .)

– האם זו השפעה ישירה של הפקטור ? הבעיה

של הפקטור לגן מסויים.מציאת אתרי קישור( 2)

- האם הפקטור אכן מבקר את הגן ?הבעיה

Genome-Wide Location Analysisהפתרון:

מציאת אתרי קישור השיטה משלבת בין ישירים בין הפקטורים לדנ"א תוך שימוש

, IP (chromatin immunoprecipitation) ב- DNAרמת ביטוי חלבונים )ע"י לבין

microarray analysis.)

שילוב השיטות מנטרל את החסרונות של שתיהן, ומאפשר בכך ניטור מדוייק יותר

של אינטרקציות בין דנ"א לחלבונים.

תיאור השיטה

formaldehydeקישור החלבונים לדנ"א בנוכחות )"קיבוע" הקישור בין החלבונים לדנ"א(.

שבירת התאים ע"י סוניקציה לצורך הפקת הדנ"א.

תיאור השיטה )המשך(

הפרדת מקטעי הדנ"א הרלוונטים )שנקשראליהם החלבון הנחקר( מכלל הדנ"א התאי ע"י

Immunoprecipitation העברת הדנ"א דרך( קולונה עם נוגדנים ספציפיים לחלבון(.

תיאור השיטה )המשך(הפרדת הנוגדנים והחלבונים מהדנ"א.

אמפליפיקציה וצביעה פלורוסנטית של מקטעי -LM )אדום(, ע"י Cy5הדנ"א שהופרדו ב –

PCR.

אמפליפיקציה וצביעה פלורוסנטית של מקטעי ( ב – IPדנ"א מדגימת ביקורת )שלא עברה

Cy3 ירוק(, ע"י( LM-PCR.

דנ"א שעבר IP

דנ"א ביקורת

תיאור השיטה )המשך(

היברידיזציה של מקטעי הדנ"א המסומנים בשני.microarrayהצבעים ל-

microarray

:לסיכום

עיבוד תוצאות ההיברידיזציה

הניסוי בוצע שלוש פעמים ובסופו של דבר התוצאות שוקללו כדי לחשב את מידת הקישור

היחסית של החלבון לכל אחד מהרצפים ב- microarray.

צביעה באדום משמעותה שמקטע הדנ"א מכיל אתר קישור microarrayהספציפי על ה-

לחלבון.

עיבוד תוצאות ההיברידיזציה )המשך(

microarrayכל נקודה בגרף מייצגת מקטע ב- והגרף משווה בין עוצמת הצביעה שלו באדום

לבין זו בירוק.

הם p-valueהמקטעים שיצוגם חורג מגבולות ה- מקטעים שעוצמת צביעתם באדום גדולה יותר

(.0.001)ההסתברות לקישור מקרי קטנה מ-

אימות ע"י השוואה לרמת ביטוי

Serial Regulation of Transcriptional Regulators in the Yeast Cell Cycle

:הקדמה

פקטורי שעתוק בשמר הקשורים 9עד כה זוהו לבקרת גנים במחזור התא, אולם אין מידע מלא

על קבוצת הגנים שכל אחד מהם מבקר.

מי מבקר את המבקרים? כיצד עובדת הבקרה על פקטורי השעתוק עצמם?

רגולציה מתואמת על גנים בעלי פונקציונליות משותפת וספציפית לשלב מסויים.

מחזור התא בשמר

G1

SG2

M

שלב המפריד בין סוף המיטוזה לבין

התחלת הכפלת הדנ"א

הכפלת הדנ"א מפריד בין סוף והתחלת ההנצה

ההכפלה לתחילת המיטוזה

היפרדות הכרומוזומים לשני

תאי הבת וציטוקיניזה

G0

מהלך הניסוי

genome-wide location analysisשימוש בשיטת כפי שתוארה קודם, על מנת לזהות את אתרי

של כל אחד מתשעת פקטורי in vivoהקישור השעתוק.

גנים 800מתוך כלל הגנום של השמר, בודדו כ- שרמת הביטוי שלהם משתנה באופן מחזורי עם

התא.

שונים, p-valueאתרי הקישור שזוהו סווגו ע"י אתרים בעלי 213כאשר ההתמקדות היתה ב-

p<0.001 הגנים הנ"ל(.800 מ- 27% )מהווים

אימות התוצאות ע"י בדיקת רמות ביטוי.

מהלך הניסוי )המשך(

IPעם )ביקורת(IPבלי

תוצאות

שילוב פקטורי השעתוק בבקרה של מחזור התא:

לפני מחקר זה נבנה מודל כללי, על סמך מספרקטן יחסית של גנים. המחקר אישש מודל זה,

והרחיב אותו.

המודל הכללי שהיה קיים

MBF

SBF

בקרה על פקטורי השעתוק

תוצאות הניסוי איששו ואף הרחיבו את המידע לגבי מעורבותם של פקטורי שעתוק בבקרה על

פקטורים בשלב הבא במחזור התא.

התוצאות חשפו תמונה של מעגל רגולטורי שלם שיוצרים הפקטורים זה עם זה.

ידע קודם ידע שנוסף

Cyclin/CDKרגולציה על הגנים של

מעבר בין שלבים במחזור התא תלוי בשינויים .Cdc28-cyclinבפעילותם של קומפלקסי

הגילוי: פקטורי שעתוק המבקרים ציקלינים בשלב מסויים, מבקרים גם גנים המקודדים לרכיבי מפתח

המעורבים במעבר לשלב הבא במחזור התא.

מידע חדש זה מסייע בהבנת תרומתה של בקרת השעתוק להתקדמותו של מחזור התא.

)המשך(Cyclin/CDKרגולציה על הגנים של

רגולציה של פונקציות ספציפיות לשלב

,תוצאות הניסוי סייעו בהגדרת קבוצות גניםשכל אחת מהן אחראית על פונקציה

ספציפית במחזור התא, והתאימה לכל קבוצה כזו את פקטורי השעתוק שלה.

חפיפת בקרה בין פקטורי השעתוק

אינם Ndd1 או ב- Mcm1תאי שמר עם מוטציה ב- חיוניים, אולם מוטציה באחד משבעת הפקטורים

האחרים אינה פוגעת בחיוניות התא.

ההסבר ההגיוני - חפיפה בין קבוצות הגנים המבוקרות ע"י זוגות פקטורים שונים.

מחקר זה הראה כי חפיפה זו אינה נוצרת כתוצאה מהמוטציה בלבד, אלא כי חפיפה חלקית קיימת גם

בתאים נורמליים.

החפיפה החלקית מסבירה כיצד פקטור אחד יכול לחפות על דפקט בבן זוגו, אך עדיין לשמור על פונקציונליות יחודית ונבדלת מזו של בן הזוג.

חפיפת בקרה בין פקטורי השעתוק )המשך(

.A חפיפה בין אתרי המטרה של זוגות פקטוריםהומולוגים.

.B חפיפה בין אתרי המטרה של זוגות פקטוריםהמשתייכים לאותו הקומפלקס.

.C חפיפה בין אתרי המטרה של זוגות פקטורים שהקשרביניהם לא היה ידוע.

דיון בתוצאות המאמר

ע"י שילוב שלgenome-wide location analysis -ו expression analysis זוהו

פקטורי 9המטרות הגנומיות של כל השעתוק הידועים במחזור התא בשמר.

התוצאות הראו שרשת רגולטורית מקושרת ומעגלית מבקרת את מחזור התא ברמת

השעתוק.

דיון בתוצאות המאמר )המשך(

:נקודות עיקריות שעלו במחקר

רשת הבקרה על פקטורי השעתוק עצמם הינה 1(מעגלית – תופעה זו חשובה מכיוון שהיא

מעניקה הבנה נוספת על האופן בו התאים מבטיחים מעבר משלב לשלב, ומכיוון שהיא

מהווה פתח למחשבה שתופעות כדוגמתה קיימות גם ביצורים מפותחים יותר.

דיון בתוצאות המאמר )המשך(

:נקודות עיקריות שעלו במחקר )המשך(

חלק מהפקטורים מבקרים הן על כניסה לשלב 2( שלו(, והן על cyclinsמסויים )ע"י בקרה על ה-

היציאה ממנו )ע"י בקרה על המעבר לשלב הבא(.

תמונה שלמה יותר של מחזור התא מתקבלת 3(ע"י שילוב של מידע שהיה ידוע קודם לכן, עם

מידע שהתקבל במאמר.

דיון בתוצאות המאמר )המשך(

חשיבות המידע על אתרי קישור ישירים

בדיקת ביטוי הגנים לבדה אינה מספקת תמונה 1(מדוייקת על מערכת הבקרה.

מידע על אתרי קישור מאפשר זיהוי של רצפי 2(קונצנזוס באזורי בקרה:

המצאותו של רצף קונצנזוס בגן מסויים, אינה •מעידה בהכרח על קישור הפקטור לשם, לכן

לצורך הוכחה חותכת יש צורך במידע על אתר קישור ישיר.

יתכן מצב שבו פקטור נקשר לאתר שאינו מכיל את •רצף הקונצנזוס שזוהה עבורו - מידע על אתרי

קישור ישירים מספק הסבר לכך.

תרומה עתידית של המחקר

שילוב מידע על קישור ישיר וביטוי כפי שהוצג במאמר מהווה פתח לגישות חישוביות חדשות

שמטרתן זיהוי רשתות בקרה גנטיות.

לדוגמה:

שימוש במידע על קישור להצעת זוגות שונים, p-valuesפקטור-אתר מטרה עם

שיציבו מגבלות על המודלים האפשריים לרשתות בקרה.

מגבלות אלו יאפשרו חיפוש מונחה ולכן יעיל יותר של רשתות רגולטוריות על בסיס רמת

ביטוי גנים.

קהל נכבד,

באולם זה הושקעו מאמצים רבים לרווחתכם, אנא שמרו על תקינות

הציוד ועל שלמותו.

E2F integrates cell cycle progressionwith DNA repair, replication ,

and G2/M checkpoints

:מבוא

הינה בעלת תפקיד E2Fמשפחת פקטורי השעתוק מרכזי במהלך מחזור התא.

עד למחקר זה שיערו שהפקטורים ממשפחה זו .S ו- G1מאקטבים גנים בשלב

מבוא )המשך(

(, E2F1 – E2F6 פקטורים )6המשפחה מורכבת מ- ( E2F1 – E2F3המחולקים לאקטיבטורים )

( – יתכן שפקטורים אלה E2F4, E2F5ולרפרסורים )מאקטבים שעתוק בנסיבות מסויימות.

הוא גיוסם של חלבונים E2Fתפקיד חשוב של – tumor suppressor Retinoblastomaממשפחת ה-

pRB( p107 -ו p130.)

Late G1

Cdk2-cyclin A

Rb

E2F P+

Active E2F

Late M

Inactive complex

Genome

Enzymes for DNA synthesis

G1 S

כיצד התבצע המחקר עד כה ?השיטות ששימשו עד כה לגילוי אתרי המטרהשל

E2F -ו pRB.מתבססות על ניתוח של ביטוי גנים

למרות ששיטות אלו השיגו התקדמות משמעותית, יש להן מספר חסרונות:

קשה לקשר בודאות בין שינויים החלים בעקבות ביטוי מוגבר של הפקטורים, לבין

קישורם לפרומוטורים של הגנים הרלוונטיים.

גורם להתקדמות במחזור E2Fביטוי מוגבר של התא ולשינויים משניים המקשים איתור ודאי

של גנים המושפעים ממנו ישירות.

IP : שיטות המשלבות הפתרון

שיטות כאלה כפי שראינו במאמר הקודם, פותחו עבור מחקר דומה בשמר, אולם השיטות

הללו אינן מותאמות למחקר בתאי אדם:

לא ברור האם השיטות שעבדו איתן בשמר יפיקו תוצאות נקיות מספיק מרעש בגנומים

מורכבים יותר.

הגנום האנושי רּוצף, אך עדיין לא מופו כל microarrayאתרי הבקרה – לא ניתן לייצר

הכולל את כל אתרי הפרומוטורים בגנום.

IP : שיטות המשלבות הפתרון)המשך(

המאמר מציע גרסה מותאמת יותר של השיטה, שמאפשרת זיהוי של פרומוטורים הנקשרים ע"י

פקטורי שעתוק ספציפיים בתאי אדם.

אתרי 1200 ובכ- E2Fהמחקר התמקד בפקטורי proximal promoters של גנים אשר ביטויים תלוי

. microarrayבמחזור התא, מהם נבנה ה-

תפקיד לא רק במעבר E2Fהמחקר העלה כי ל- , אלא מעורב בנקודות ביקורת רבות S ל- G1 מ-

במהלך מחזור התא.

:תיאור הניסוי

לפרומוטורים ב- E2F4בדיקת מידת ההקשרות של G0 בכדי לאמת ממצאים קודמים לפיהם הפקטור ,

לצורך דיכוי גנים ביציאה ממחזור p130מגייס את התא.

הניסוי בוצע על תאים "מושתקים" )ביציאה ממחזור דומה genome-wide location analysisהתא(, בשיטת

לזו ששימשה בשמר, עם המודיפיקציות הבאות:על מנת להתגבר על מורכבות הדנ"א האנושי

קבעו תנאים מגבילים להיברידיזציה על ה- microarray.

רצפי גנים 1444 חדש שמכיל microarrayבניית )הרצפים נבחרו על פי ידע מוקדם אודות אופי

(E2Fאתרי הקישור של

microarrayבחירת הרצפים לבניית ה-

תוצאות הניסוי

≥ p-value עם E2F4 גנים זוהו כמטרות של 1270.002 .

אימות התוצאותרבים מהגנים שהיו מוכרים כאתרי מטרה של

E2F.אכן זוהו בניסוי כאתרי מטרה

אימות זיהוי הפרומוטורים כאתרי מטרה של E2F נעשה בשיטת ChIP.הקונבנציונלית

מול E2Fהעשרה משמעותית במטרות של העשרה זניחה ביתר הגנים.

נוגדן לא ספציפיE2F4 ל-

גן בקרה

םשי

חד

לקבוצותE2F4חלוקת גני המטרה של

רגולציתמחזורהתא

G2/M Check-points

סידורכרומוזומים

מיטוזה

תיקון דנ"א

שכפול דנ"א

E2F4

E2F4 ו- E2F1חפיפה בין גני המטרה של

נקשר לגנים E2F1ידע קודם מצביע על כך ש- , ולפיכך ניסוי דומה התבצע על G1/Sבמעבר

.Sהפקטור בתאים בתחילת שלב

תוצאות הניסוי הצביעו על חפיפה משמעותית בין 50הגנים ששני הפקטורים נקשרו אליהם )כ-

גנים(.

לצורך אימות התוצאות נעשתה בדיקת ביטוי שהכיל את אותם הרצפים. microarrayהגנים על

E2Fגני מטרה של חדשים

הניסוי חשף מספר גדול של גני מטרה שלא זוהו קודם לכן, בעלי פונקציונליות של תיקון

.M ו- G2דנ"א, נקודות ביקורת של השלבים

נעשה חיפוש של רצפי קונצנזוס לקישור . התגלה שבחלק גדול מגני E2Fפקטורי

המטרה קיימים מספר אתרי קישור לפקטורים, לעומת זאת בכמה מהם לא היה אף רצף כזה.

E2Fאימות גני מטרה של חדשים

E2F4 לפעילות p130 ו- p107נחיצותם של

, p130 ו- p107בתאי עכבר עם מוטציות ב- לא E2F4שעתוקם של חלק מגני המטרה של

דוכא.

עובדה זאת אומתה ע"י בדיקת ביטוי גנים שזוהו genome-wide locationקודם לכן ע"י שיטת ה-

.E2F4כגני מטרה של

+בקרה

-

אימות הממצא

סקירת תוצאות המאמרתרומת המאמר בחקר רשת הבקרה במחזור

התא:

מתוצאות מחקרים קודמים המתבססים על ניתוח ביטוי גנים, התקבלו קבוצות פונקציונליות של

. E2Fגנים המבוקרים ע"י – גנים העוסקים אימות תוצאות קודמות

בבקרה על מחזור התא.

- גנים העוסקים הרחבת תוצאות קודמותברפליקציה של דנ"א.

סקירת תוצאות המאמר )המשך(

– למשפחת בדיקת תיאוריות חדשות ואימותןE2F יש תפקיד גם מעבר לשלב S בניגוד למה

שסברו )ויכלו להוכיח( בעבר.

הסברה שלגנים של תיקון דנ"א תפקיד חשוב בזמן ההכפלה מחוזקת ע"י מציאתם של גנים כאלה

במחקר.

נקשר לגנים שמהווים E2F – גילויים לא צפוייםנקודות ביקורת במחזור התא.

G1 שמשמש לעצירת מחזור התא ב- p53לדוגמא: כתגובה לפגיעה בדנ"א.

סיכום

מיפוי רשתות רגולטוריות של תהליכים תאיים בכלל ושל מחזור התא בפרט,

מסייע באיסוף מידע על מחלות.

ביטוי + קישור = מיפוי רשתות .רגולטוריות

שיטה ביולוגית שעובדת – מי צריך שיטות חישוביות ?