LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIAPENENTUAN TRANSAMINASE GLUTAMAT-PIRUVAT SERUM DARAH

I. TUJUANMenentukan transaminase glutamat-piruvat yang terdapat pada serum darah ayamII. DASAR TEORIAsam amino mempunyai peranan penting bagi tubuh. Selain menyediakan kebutuhan nitrogen, asam-asam amino dapat digunakan sebagai sumber energi jika nitrogen dilepas. Asam-asam amino tidak dapat disimpan dalam tubuh. Jika jumlah asam amino berlebih atau kekurangan sumber lain (karbohidrat atau protein), tubuh akan menggunakan asam amino sebagai sumber energi. Asam amino memerlukan pelepasan gugus amin. Gugus amin ini kemudian dibuang karena bersifat toksik bagi tubuh. Terdapat dua tahap pelepasan gugus amin dari asam amino yaitu transaminasi dan deaminasi oksidatif. Transaminasi merupakan proses utama untuk melepaskan gugus nitrogen dari asam amino. Umumnya nitrogen dipindahkan sebagai gugus amino dari asam amino ke -ketoglutarat sehingga terbentuk glutamat. Sedangkan asam amino semula berubah menjadi asam keto padanannya.Misalnya asam amino aspartat dapat diubah atau mengalami transaminasi membentuk asam -ketooksaloasetat dalam proses ini gugus amino dipindahkan ke -ketoglutarat yang berubah menjadi asam amino glutamat.Semua asam amino kecuali asam amino lisin dan treonin dapat mengalami reaksi transaminasi. Enzim yang mengkatalisis reaksi ini dikenal sebagai enzim transaminase atau aminotransferase. Untuk sebagian besar reaksi ini, -ketoglutarat dan glutamate berfungsi sebagai salah satu pasangan asam -keto, asam amino. kofaktornya adalah piridoksal fosfat.Secara keseluruhan, pada reaksi transaminasi, gugus amino dari salah satu gugus asam amino pada asam amino kedua karena bersifat reversibel, reaksi ini dapat digunakan untuk mengeluarkan nitrogen dari asam amino atau untuk memindahkan nitrogen ke dalam -keto untuk membentuk suatu asam amino. Dengan demikian, reaksi tersebut berperan pada penguraian maupun pembentukan asam amino. Oleh karena itu, reaksi ini amat penting dalam metabolisme asam amino.Pada reaksi transaminasi, gugus -amino dipindahkan secara enzimatik ke atom karbon pada -ketoglutarat sehingga dihasilkan asam -keto, analog dari asam amino yang bersangkutan. Reaksi ini menyebabkan terjadinya aminasi -ketoglutarat membentuk L-glutamat. Glutamat dapat mengalami deaminasi oksidatif melalui oksidasi yang dikatalisis oleh glutamat dehidrogenase yang menghasilkan ion ammonium dan -ketoglutamat. Dimana NAD+ atau NADP+ berfungsi sebagai kofaktor. Reaksi ini berlangsung di mitokondria sebagian besar sel bersifat reversibel. reaksi ini dapat menggabungkan ammonia ke glutamate atau membebaskan ammonia dari glutamate. akibat reaksi transaminasi, glutamate dapat memperoleh nitrogen dari asam amino lain dan melepaskan amoniamelalui reaksi glutamat dehidrogenase. proses ini merupakan salah satu sumber ammonia yang masuk ke dalam siklus urea.Kebanyakan enzim transaminase bersifat spesifik bagi -ketoglutarat sebagai molekul penerima gugus amino. Namun demikian, enzim tersebut tidak terlalu spesifik sebagai substratnya, yaitu asam L-amino yang memberikan gugus aminonya. Berikut ini beberapa transaminase yang paling penting dinamakan sesuai dengan molekul pemberi gugus aminonya.

Asam L-alanin + -ketoglutarat piruvat + L-glutamat

Asam L-aspartat+ -ketoglutarat oksaloasetat + L-glutamat

Asam L-leusin + -ketoglutarat -ketoisokaroat + L-glutamat

Asam L-tirosin + -ketoglutarat p-hidroksifenilpiruvat + L-glutamatHati, ginjal, dan otot mengandung banyak transaminase glutamat-oksaloasetat (TGO), disebut juga sebagai aspartat aminotransferase dan transaminase glutamat-piruvat (TGP), disebut juga sebagai alanin aminotransferase. Serum pada keadaan normal menunjukkan aktivitas enzim tersebut, tetapi rendah. Hanya apabila terjadi kerusakan sel pada jaringan-jaringan tersebut, maka enzim-enzim intraseluler di atas akan keluar dari sel dan masuk ke dlaam darah. Kenaikan aktivitas TGO dan TGP serum dapat dijumpai pada jenis penyakit yang menyangkut jaringan tertentu.Pada praktikum ini dilakukan penentuan transaminase glutamat-piruvat serum darah ayam.BAHANJUMLAH

Serum DarahSecukupnya

Larutan 2,4dinitrifenilhidrasinSecukupnya

Larutan NaOH 0,4 NSecukupnya

Larutan buffer fosfat pH 4,7Secukupnya

Larutan standar piruvatSecukupnya

Larutan substratSecukupnya

III. PROSEDUR KERJA DAN HASIL PENGAMATANNO PROSEKUR KERJAHASIL PENGAMATAN

10,5 mL substrat dimasukan ke dalam tabung reaksi dan inkubasi dalam penangas air dalam suhu 37 selama 3 menit. Larutan substrat bening tak berwarna Setelah dilakukan inkubasi selama 3 menit pada suhu 37 larutan tetap bening tak berwarna.

2Tambahkan dengan 0,1 mL serum, dicampurkan dengan baik dan diinkubasi selama 60 menit. Setelah dilakukan penambahan 0,1 mL serum larutan berubah warna menjadi sedikit merah. Setelah dilakukan inkubasi larutan tetap berwarna kemerahan.

3Tabung yang telah diikubasi diambil dan keudian ditambahkan 0,5 mL DNFH kemudian dikocok degan baik Larutan DNFH berwarna oranye

Gambar 1 Larutan DNFH Setelah dilakukan penambahan larutan DNFH maka larutan yang berwarna kemerahan berubah warna menjadi merah sedikit oranye.

4Sebanyak 0, 5 mL substrat ditambahkan dengan 0,5 mL larutan DNFH dan kemudian ditambahkan dengan 0,1 mL larutan serum (larutan ini digunakan sebagai larutan control) Setelah dilakukan penambahan larutan larutan DNFH pada larutan substrat yang bening tak berwarna terbentuk larutan yang berwarna oranye. Kemudia setelah ditambahkan larutan serum terbentul larutan yang berwarna kemerahaan.

5Sebanyak 0,5 mL larutan substrat ditambahkan dengan 0,1 mL aquades dan kemudian ditambahkan larutan DNFH (larutan ini sebagai larutan blanko) Setelah dilakukan penambahan aquades pada larutan substrat terbentuk larutan yang being tak berwarna. Ketika dilakukan penambahan larutan DNFH maka terbentuk larutan yang berwarna oranye.

6Sebanyak 0,5 mL larutan standar piruvat ditambahkan dengan larutan substrat sebanyak 0,4 mL dan ditambahkan 0,1 mL aquades dan kemudian ditambahakan larutan DNFH sebanyak 0,5 mL (larutan ini digunakan sebagai larutan standar) Larutan standar piruvat ditambahkan dengan larutan standar terbentuk larutan yang bening tak berwarna dan kemudian dilakukan penambahan aquades maka terbentuk larutan yang bening tak berwarna Setelah dilaukan penambahan larutan DNFH yang berwarna oranye maka terbentuk larutan yang berwarna oranye.

7Semua tabung yang telah diisi dengan larutan DNFH dibiarkan bereaksi selama 20 menit dan kemudian dilakukan penamabahan larutan NaOH 0,4 N sebanyak 5 mL Tabung 1 (larutan sampel) yang awalnya berarna oranye kemerahan ketika ditambahkan larutan NaOH 0,4 N yang being tak berarna terbentuk larutan yang berwarna coklat.

Gambar 2Larutan sampel ditambah NaOH Tabung 2 (larutan control) yang berwarna kemerahan ketika dilakukan penambahan larutan NaOH 0,4 N sebanyak 5 mL terbentuk larutan yang berwarna merah. Tabung 3 (larutan blanko) larutan yang berwarna oranye dan kemudian ditambahkan dengan larutan NaOH 0,4 N larutan awalnya berwarna oranye terjadi perubahan warna pada larutan yaitu menjadi berwarna coklat.

Gambar 3Larutan blanko ditambah NaOH Tabung 4 ( larutan standar) yaitu yang awalnya berwarna orante ketika ditambahkan larutan NaOH 0,4 N yang bening tak berwarna, larutan mengalami perubahan warna menjadi berwarna merah.

8Campuran pada prosedur diatas dicampurkan dengan baik kemudian didiamkan pada suhu kamar selama 10 menit kemudian ditentukan serapannyaSetelah campuran didiamkan selama 10 menit kemudian ditentukan serapannya maka didapatkan hasil sebagai berikut:TabungAbsorbansi%T

Tabung 1 (larutan sampel)0,45545%

Tabung 2 (larutan control)0,39540,5 %

Tabug 3 (larutan Blanko)0,37542,5 %

Tabung 4 (larutan standar)0,7617%

IV. PEMBAHASANPada praktikum ini dilakukan penentuan transaminase glutamat-piruvat (TGP) yang terdapat pada serum darah. Transaminasi merupakan proses utama untuk melepaskan gugus nitrogen dari asam amino. Umumnya nitrogen dipindahkan sebagai gugus amino dari asam amino ke -ketoglutarat sehingga terbentuk glutamat. Sedangkan asam amino semula berubah menjadi asam keto padanannya. Agar reaksi ini dapat berlangsung, diperlukan suatu enzim yaitu enzim transaminase glutamat. Enzim transaminase glutamat adalah enzim yang mengkatalisis reaksi transaminasi antara asam L-alanin dan -ketoglutarat menghasilkan asam piruvat dan asam L-glutamat. Dalam reaksi ini terjadi pelepasan gugus nitrogen dari alanin sehingga menghasilkan asam piruvat. Gugus nitrogen yang dilepaskan alanin ditangkap oleh -ketoglutarat menghasilkan L-glutamat. Reaksi transaminasi yang terjadi adalah sebagai berikut.Alanin -ketoglutarat asam piruvat L-glutamat

Gambar 4 Reaksi Transaminasi Glutamat

Kebanyakan enzim transaminase bersifat spesifik terhadap -ketoglutarat sebagai molekul penerima gugus amino. Substrat dalam percobaan ini adalah amino L-alanin dan asam -ketoglutarat. Pada reaksi tersebut, gugus -amino pada asam amino alanin dipindahkan secara enzimatis ke dalam atom karbon pada -ketoglutarat sehingga dihasilkan asam piruvat yang merupakan asam -keto analog dengan asam L-alanin. Reaksi tersebut juga diikuti dengan aminasi -ketoglutarat menghasilkan asam L-glutamat. Reaksi tersebut diikuti dengan aminasi -ketoglutarat menghasilkan asam L-glutamat.Pada percobaan ini dilakukan beberapa pengujian yaitu untuk larutan sampel, larutan kontrol, larutan blangko, dan larutan standar. Untuk larutan uji digunakan 0,5 mL substrat (mengandung 200 mM asam L-alanin dan 2 mM asam -ketoglutarat). Kemudian ditambahkan 0,1 mL larutan serum darah ayam. Fungsi dari serum darah ayam adalah sebagai penyedia enzim transaminase glutamat-piruvat. Sebelum ditambahkan serum darah, larutan uji terlebih dahulu diinkubasi pada suhu 37oC selama 3 menit. Inkubasi ini bertujuan untuk mengkondisikan suhu larutan substrat sesuai dengan suhu optimum terjadinya reaksi transaminase glutamat piruvat.Setelah proses inkubasi selesai, larutan kemudian ditambahkan 0,1 mL serum darah ayam terhadap larutan uji. Setelah itu kembali diinkubasi selama 60 menit. Setelah diinkubasi selama 60 menit, dilakukan penambahan larutan 2,4-dinitrofenilhidrazin. Senyawa 2,4-dinitrofenilhidrazin yang ditambahkan akan bereaksi dengan asam piruvat yang dihasilkan dari reaksi transaminasi sehingga menghasilkan senyawa berwarna. Senyawa berwarna ini kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektronik 20+. Reaksi yang terjadi melibatkan gugus karbonil pada asam piruvat menghasilkan senyawa kompleks piruvat 2,4-dinitrofenilhidrazin. Dengan adanya penambahan larutan DNFH menyebabkan warna larutan menjadi oranye yang mengindikasikan terbentuknya kompleks berwarna. Reaksinya yang terjadi adalah sebagai berikut.

asam piruvat 2,4-dinitrofenilhidrazin piruvat 2,4-dinitrofenilhidrazin

Gambar 5 Reaksi pembentukan piruvat 2,4-dinitrofenilhidrazin

Kemudian untuk larutan kontrol, dibuat dengan cara mencampurkan 0,5 mL substrat dengan 0,5 mL DNFH dan 0,1 mL serum darah ayam. Kemudian diinkubasi selama 10 menit. Pengujian terhadap larutan kontrol ini bertujuan untuk mengetahui jumlah DNFH yang bereaksi dengan substrat. Pada -ketoglutamat terdapat gugus karbonil yang dapat bereaksi dengan DNFH menghasilkan kompleks berwarna. adapun reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut.

-ketoglutarat 2,4-dinitrofenilhidrazin ketoglutarat 2,4-dinitrofenilhidrazin

Gambar 6 Reaksi Pembentukan ketoglutarat 2,4-dinitrofenilhidrazin

Adanya jumlah DNFH yang bereaksi dengan substrat akan mengganggu dan berkontribusi dalam absorbansi larutan sampel. Adanya reaksi ini menyebabkan absorbansi larutan sampel menjadi bertambah. Dalam perhitungan, absorbansi larutan sampel akan dikurangi dengan hasil absorbansi larutan kontrol. Dengan perlakuan ini maka absorbansi yang terukur bisa saja hanya absorbansi kompleks piruvat 2,4-dinitrofenilhidrazin. Dengan cara ini absorbansi larutan substrat yang mengandung piruvat dapat diketahui. Kemudian dilakukan pula pengujian terhadap larutan standar. Larutan standar dibuat dengan menambahkan 0,4 mL larutan substrat, 0,1 mL aquades dan 0,5 mL larutan DNFH ke dalam 0,1 mL larutan standar piruvat dan kemudian diinkubasi selama 20 menit. Pengujian terhadap larutan standar ini bertujuan untuk membandingkan absorbansinya dengan larutan yang diuji. Dengan perbandingan tersebut, bila larutan standar telah diketahui konsentrasinya maka konsentrasi piruvat dalam larutan uji dapat diketahui.Pengujian terhadap larutan blangko juga dilakukan karena larutan yang digunakan menunjukkan warna tertentu. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengukuran absorbansi larutan blanko yang mengandung aquades dan larutan DNFH. Larutan blangko dibuat dari 0,5 mL substrat ditambahkan 0,1 mL aquades dan 0,5 mL larutan DNFH. Selanjutnya, larutan yang terbentuk diinkubasi selama 20 menit. Ke dalam larutan ditambahkan 5 mL NaOH, diaduk dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang 510 nm.Sebelum dilakukan pengujian absorbansi dengan spektronik 20+, pada larutan sampel, larutan standar dan larutan kontrol dilakukan penambahan 5 mL NaOH 0,4 N terlebih dahulu. Tujuannya adalah untuk menghentikan reaksi antara gugus karbonil dan asam piruvat. Reaksi antara gugus karbonil dan asam piruvat hanya berlangsung dalam suasana sedikit asam, sehingga ketika ditambahkan larutan NaOH 0,4 N reaksi akan terhenti.Dari hasil pengukuran absorbansi dengan menggunakan spektronik 20+ didapatkan harga %T dari larutan sampel, kontrol, standar, dan blanko sebagai berikut.

Tabel 1. Hasil pengukuran absorbansiTabungAbsorbansi%T

Tabung 1 (larutan sampel)0,45545%

Tabung 2 (larutan control)0,39540,5 %

Tabug 3 (larutan Blanko)0,37542,5 %

Tabung 4 (larutan standar)0,7617%

Dari tabel diatas maka dapat dihitung kada puruvat pada serum dara dengan rumus sebagai berikut:

dengan, T = serapan untuk zat yang diuji (sampel)K = serapan untuk kontrolS = serapan untuk standarB = serapan untuk blanko

Piruvat yang terbentuk per menit oleh per liter serum adalah sebagai berikut.

Berdasarkan hasil perhitungan diatas, maka kadar piruvat yang dihasilkan dalam serum darah yang diuji yaitu sebesar 10,44 mmol piruvat per menit per liter serum, kadar ini lebih rendah bila dibandingkan dengan kadar maksimum normal yaitu 23 mmol piruvat per menit per liter serum. Maka kadar piruvat dalam serum darah ayam tersebut adalah tergolong normal.Kadar piruvat yang dihasilkan ini dapat digunakan sebagai tolak ukur kadar transaminase glutamat piruvat yang dihasilkan pada serum darah. Dengan mengasumsikan bahwa kadar piruvat sebanding dengan kadar transamirase glutamat piruvat pada serum darah, maka kadar enzim transaminase glutamat piruvat dapat dinyatakan sebesar 10,44mmol piruvat per menit per liter serum.

V. KESIMPULANBerdasarkan pembahasan diatas maka dapat disimpulkan bahwa kadar enzim transaminase glutamat piruvat sebanding dengan kadar piruvat dalam serum darah ayam yaitu sebesar 10,44 mmol piruvat per menit per liter serum.VI. DAFTAR PUSTAKAFessenden, F dan Fessenden. 1994. Kima Organik Jilid 2. Jakarta : ErlanggaFrieda Nurlita, dkk. 2002. Kimia Organik II. Singaraja : Institut Keguruan dan Ilmu Pendidikan Negeri Singaraja.Girindra, Aisyah dan Titin Supriyanti. 1994. Dasar dasar Biokimia. Jakarta ; Universitas Indonesia.Ismono. 1978. Cara-cara Optik Dalam Analisis Kimia. Diktat. Bandung: Jurusan Kimia ITB.Lehninger, Albert.L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1 dan 3 Alih Bahasa Maggy Thenawidjaya. Jakarta: Erlangga.Morrison, Robert Thornton and Robert Neilson Boyd.1983.Organic Chemistry Fourth Edition.Singapore: Allyn and Bacon, IncRedhana, I Wayan. 2004. Buku Ajar Biokimia Jilid I. Singaraja : Institut Keguruan dan Ilmu Pendidikan Negeri Singaraja.Redhana, I Wayan. 2010. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja : Universitas Pendidikan Ganesha.Tika, I Nyoman. 2010. Buku Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha.