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SEZIONE I

GIUNTA REGIONALE- Deliberazioni

DELIBERAZIONE 15 marzo 2004, n. 233

O.T.T. - Rete regionale della sicurezza di organi etessuti: modello organizzativo regionale per le attivi-tà di istopatologia inerenti la valutazione del donato-re di organi e tessuti.

LA GIUNTA REGIONALE

Visto:- il Piano sanitario regionale 2002-2004, approvato

con Del. C.R. n. 60/2002, che, nell’assumere come obiet-tivo prioritario la fruibilità di trapianto ad un numerosempre più elevato di cittadini toscani, ritiene indispen-sabile consolidare e riorganizzare il sistema esistente;

- la Delibera C. R. n. 138 del 29 luglio 2003 “Do-nazione e trapianto: indirizzi operativi per l’attuazionedel Piano Sanitario regionale 2002-2004” che approva ildocumento “O.T.T. Organizzazione Toscana Trapianti”ed impegna la Giunta Regionale a porre in essere tutti gliadempimenti necessari per la realizzazione della suddet-ta organizzazione;

- la propria deliberazione n.814 del 4 agosto 2003, conla quale si è provveduto a nominare il coordinatore regio-nale trapianti ai sensi dell’art.11 della Legge 91/1999nella persona del Prof. Franco Filipponi, ed a impegnarelo stesso a presentare proposte del nuovo assetto organiz-zativo, sulla base degli indirizzi stabiliti con la suindicataDel. C.R. n. 138/2003;

Premesso che:- la legge n.91/99 recante “Disposizioni in materia di

prelievi e di trapianti di organi e tessuti” all’art.14,comma 5 impegna il Ministro della Sanità a definire conproprio decreto i criteri e le modalità per la certificazio-ne dell’idoneità dell’organo prelevato al trapianto;

- il Decreto del Ministro della Salute del 02.08.02“Criteri e modalità per la certificazione dell’idoneitàdegli organi prelevati al trapianto” definisce le condizio-ni che allo stato attuale delle conoscenze scientificheprecludono l’utilizzazione dell’organo al trapianto e rin-via la definizione dei criteri di idoneità ad apposite lineeguida, predisposte dal Centro nazionale trapianti;

- il Centro nazionale trapianti ha predisposto il docu-mento concernente “Criteri generali per la valutazione diidoneità del donatore”, approvato nella Conferenza Stato-Regioni del 30/09/03, mediante il quale ha definito ilivelli di rischio accettabili/non accettabili per l’utilizzodegli organi e le modalità operative del processo di valu-tazione del rischio, individuando nel Centro Regionale

Trapianti la struttura di coordinamento alla quale si rife-riscono tutte le rianimazioni ed i coordinatori locali nelleprocedure di segnalazione del potenziale donatore;

Ritenuto necessario, allo scopo di ridurre il rischio ditrasmissione di malattie infettive e neoplastiche, garanti-re a livello regionale l’esecuzione di test per diagnosticaoncologica e morfo-funzionale d’organo, con tempi dirisposta compatibili col processo di donazione;

Preso atto che: - in data 8 ottobre 2003, su iniziativa del Coordinatore

Regionale Trapianti, è stato istituito un gruppo di lavorofinalizzato a pianificare le attività di istopatologia ineren-ti la valutazione del donatore, aperto a tutti gli operatoridel settore;

- il Gruppo di lavoro ha elaborato un documento tec-nico-organizzativo, condiviso unanimamente da tutti glioperatori interessati, che propone un modello organizza-tivo per Area Vasta con disponibilità del servizio inurgenza H24/365gg presso le strutture di anatomia pato-logica delle 3 aziende ospedaliere Pisana, Senese eCareggi;

- i Responsabili dell’ U.O. Anatomia Patologica 1dell’Azienda ospedaliera Senese, del DipartimentoPatologia umana ed Oncologia dell’Azienda ospedalieraPisana e del Dipartimento di Patologia Umana eOncologia dell’ Azienda ospedaliera Careggi hannoespresso formale assenso alla proposta organizzativa e sisono impegnati a collaborare secondo le modalità previ-ste nel documento allegato 1) parte integrante e sostan-ziale del presente atto;

Ritenuto pertanto di adottare il modello organizzati-vo regionale per le attività di istopatologia inerenti lavalutazione del donatore di organi e tessuti, come daallegato 1) parte integrante e sostanziale del presenteatto;

A voti unanimi

DELIBERA

1. di approvare, per le motivazioni espresse in narra-tiva, il modello organizzativo regionale per le attività diistopatologia inerenti la valutazione del donatore diorgani e tessuti, come da allegato 1) parte integrante esostanziale del presente atto;

2. di identificare come strutture di riferimento condisponibilità del servizio in urgenza H24/365gg:

- U.O. Anatomia Patologica 1 dell’AziendaOspedaliera Senese, per l’Area Vasta Senese;

- U.O. di Anatomia Patologia e Diagnostica Moleco-lare ed Ultrastrutturale dell’Azienda Ospedaliera Pisana,per l’Area Vasta Pisana;

Supplemento al Bollettino Ufficiale della Regione Toscana n. 14 del 7.4.2004

3Supplemento al Bollettino Ufficiale della Regione Toscana n. 14 del 7.4.2004

- Dipartimento di Patologia Umana e Oncologiadell’Azienda Ospedaliera Careggi, per l’Area Vasta Fio-rentina;

3. di fissare al 1 maggio 2004 l’avvio della nuovaorganizzazione.

Il presente provvedimento, soggetto a pubblicità aisensi dell’art. 41, comma 1 lett. b. della L.R. 9/95 - è

pubblicato per intero, compreso l’allegato 1, sulBollettino Ufficiale della Regione Toscana ai sensi del-l’art. 3, comma 1 e 2 della L.R. 18/96.

Segreteria della Giunta Il Direttore Generale

Valerio Pelini

SEGUE ALLEGATO

4 Supplemento al Bollettino Ufficiale della Regione Toscana n. 14 del 7.4.2004

ALLEGATO 1

PROTOCOLLO ANATOMO-PATOLOGICO

DONAZIONE

In tema di sicurezza nella donazione di organi, sono state redatte linee guida nazionali (12 settembre

2003) con lo scopo di ridurre al minimo il rischio di trasmissione di malattie infettive e

neoplastiche. Oltre a rischio di trasmissione di neoplasia, la sicurezza della donazione è rivolta

anche alla valutazione della idoneità degli organi.

Le indicazioni delle linee guida, riguardo alla possibilità di trasmissione neoplastica sono

brevemente riassunte:

L’idoneità del donatore si deve basare, in tutti i casi, su:

- anamnesi

- esame obiettivo

- esami strumentali e di laboratorio

- esami istopatologici e/o autoptici

Se al momento del decesso il possibile donatore è portatore di un tumore maligno, può essere

donatore di organi solo nel caso si tratti di uno dei tumori seguenti:

- carcinoma in situ

- basalioma

- carcinoma spinocellulare cutaneo senza metastasi

- carcinoma in situ della cervice uterina

- carcinoma in situ delle corde vocali

- carcinoma papillifero dell’epitelio uroteliale (T0 secondo la classificazione TNM).

Per altri tumori, quali il carcinoma prostatico clinicamente silente, il carcinoma follicolare

minimamente invasivo della tiroide o il carcinoma papillifero capsulato della tiroide, il centro

trapiantologico può decidere di utilizzare l’organo, previo consenso informato.

Per i tumori cerebrali, secondo la recente classificazione OMS 2000, i portatori di tumori a basso

grado (I-II) sono stati giudicati idonei per la donazione di organi.

I portatori di alcuni tumori ad alto grado (III) sono utilizzabili solo in situazione di urgenza clinica

comprovata.

Altri tumori maligni intracranici, i cui portatori non devono essere presi in considerazione per la

donazione, sono rappresentati dai tumori gliali grado IV, neoplasie embrionali, tumori a cellule

germinali e altri tumori che frequentemente metastatizzano a distanza (vedi linee guida)

Se dall’anamnesi del possibile donatore risulta, in passato, una neoplasia potenzialmente

trasmissibile con il trapianto, definita guarita, gli organi non sono utilizzabili nel caso che:

1. siano trascorsi meno di dieci anni dalla diagnosi clinica di guarigione

2. si tratti di:

- carcinoma mammario

- melanoma

- leucemie

- linfomi


Le indicazioni delle linee guida, riguardo alla valutazione della idoneità degli organi sono

brevemente riassunte:

- L’anamnesi, l’esame obiettivo e la diagnostica strumentale devono esplorare la

funzionalità degli organi ed evidenziare l’eventuale presenza di patologie d’organo in

atto

- La valutazione dell’idoneità dei singoli organi è fatta sui dati raccolti nella rianimazione

(anamnesi, esame obiettivo, diagnostica strumentale, di laboratorio ed eventualmente

istopatologica).

Il laboratorio di Anatomia Patologica, per rispondere a queste esigenze diagnostiche,

necessita di laboratori con apparecchi di nuova generazione, personale Medico e Tecnico

adeguatamente formato e in grado di essere operativo in h24, per 365gg/anno.


MODALITA’ DI PRELIEVO E DI INVIO DEL MATERIALE

Validazione del fegato

Prelevare un frammento di tessuto epatico della profondità di almeno 1 cm, dalla capsula.

Porre il campione in garza imbevuta di fisiologica e in un contenitore chiuso che porti il nome e il

cognome del donatore.

Validazione del rene

Prelevare campioni di tessuto renale corticale che contengano almeno 10 glomeruli

Porre il frammento di rene destro e rene sinistro nel fissativo di Serra (procurato dal laboratorio di

anatomia patologica all’equipe locale) in contenitori separati recanti il nome e il cognome del donatore.

Per tutti gli altri organi e tessuti

Porre il campione in garza imbevuta di fisiologica e in un contenitore chiuso che porti il nome e il

cognome del donatore.

Compilare una scheda con i dati anagrafici del donatore, accompagnata dal Dossier del Centro di

Allocazione di organi e tessuti.

Il materiale sarà inviato:

Firenze

Dipartimento di Patologia Umana e Oncologia dell'Azienda Ospedaliera-Universitaria Careggi,

Viale Morgagni 85, 50134 Firenze, per l'Area Vasta Fiorentina.

Pisa

U.O. di Anatomia Patologica e Diagnostica Molecolare ed Ultrastrutturale dell'Azienda Ospedale-

Università Pisana, Via Roma 57, 56126 Pisa, per l'Area Vasta Pisana.

(tel e fax: 050/996891).

Siena

U.O. di Anatomia Patologica 1 dell'Azienda Ospedaliera Senese, Via Scotte 6, 53100 Siena, per

l'Area Vasta Senese.

La diagnosi istologica sarà comunicata per telefono e fax:

- al Centro di Allocazione di organi e tessuti (cellulare del reperibile: 348/2810142, fax: 055-4277698)

- al coordinamento locale:

Pisa

Coordinamento trapianti di fegato della Sez. Trapiantologia Epatica Universitaria (tel: 335/7260211 o n.

breve 4629, fax: 050-995420)

Coordinamento trapianti di rene-pancreas (tel: 050-994234, fax: 050-996893)

Siena

Sezione di Anatomia Patologica - Dipartimento di Patologia Umana ed Oncologia (tel: 0577-

233240, fax: 0577-233235)


Tutti gli organi scartati devono pervenire al laboratorio di Anatomia Patologica secondo le normali

procedure, la diagnosi sarà inviata al reparto richiedente. Nel caso venga diagnosticata una patologia

trasmissibile, il referto deve essere inviato, oltre che al reparto richiedente, anche al Centro di Allocazione

di organi e tessuti.

Sarà attivato un Controllo di Qualità fra le tre Anatomie Patologiche della Regione Toscana, dedicate alla

diagnostica della donazione, sui parametri utilizzati per la validazione del fegato e del rene.

Saranno programmati incontri, non più di due volte l’anno, fra i Patologi dedicati alla donazione.


ESAME AL CRIOSTATO


VALUTAZIONE DEL FEGATO IN ESTEMPORANEA

Laboratorio di Anatomia Patologica

Tecnico:

Accettazione del preparato nel sistema operativo WINSAP che gestisce l’attività del laboratorio.

Controllo di qualità di accettazione ad opera del tecnico accettante. In caso di non conformità telefonare al

Centro di coordinamento locale o al Centro di Allocazione di organi e tessuti.

Medico:

Descrizione macroscopica del preparato e misurazione dello stesso: questi dati vengono annotati su scheda

di accettazione (allegato). Riduzione del materiale e posizionamento dello stesso su apposito supporto del

criostato.

Controllo di idoneità del materiale ad opera del medico.

Tecnico:

Sezioni al criostato e colorazione con ematossilina-eosina (vedi allegato).

Medico:

Diagnosi al microscopio (vedi allegato).

Nel referto devono essere indicati:

- dimensioni e sede del prelievo

- presenza di artefatti da diatermocoagulazione

- eventuale essiccamento del materiale

Comunicazione telefonica della diagnosi al Centro locale.

Trascrizione della diagnosi nel sistema operativo.

Inviare per fax la risposta al coordinamento trapianti di fegato della Sez. Trapiantologia Epatica

Universitaria-Pisa ed al Centro di Allocazione di organi e tessuti.

Tempo

30 min

.


VALUTAZIONE DI ALTRI TESSUTI IN ESTEMPORANEA

(nodulo polmone, nodulo epatico, linfonodo, altro)


Tecnico:




Medico:



criostato.


Tecnico:


Medico:






Comunicazione telefonica della diagnosi al Centro di coordinamento locale.


Inviare per fax la risposta al Centro di coordinamento locale ed al Centro di Allocazione di organi e tessuti.

Tempo

30 min

Nel caso in cui l’esame al criostato non sia dirimente, avviare la procedura per esame definitivo

(vedi esame definitivo)


VALUTAZIONE DI CAMPIONI DI NOTEVOLI DIMENSIONI IN ESTEMPORANEA

(grosso polipo del colon, grosso linfonodo, altro)


Tecnico:




Medico:



criostato.


Tecnico:


Medico:








Inviare per fax la risposta al Centro di coordinamento locale ed al Centro di Allocazione di organi e tessuti.

Tempo

30 min- 1h (in relazione al numero di campioni ottenuti)

Nel caso in cui l’esame al criostato non sia dirimente, avviare la procedura per esame definitivo

(vedi esame definitivo)


VALUTAZIONE DELLA PROSTATA IN ESTEMPORANEA


Tecnico:



coordinamento locale o al Centro di Allocazione di organi e tessuti.

Medico:

Descrizione macroscopica del preparato e misurazione della prostata e vescichette seminali,

staccare le vescichette seminali e pesare la prostata: questi dati vengono annotati su scheda di

accettazione (allegato). In assenza di reperti obiettivabili, separare l’apice, il lobo destro e il lobo

sinistro, l’organo deve essere sottoposto in toto ad esame istopatologico. Iniziare l’esame da aree

sospette o dalla parte più periferica dell’organo. Riduzione del materiale e posizionamento dello

stesso su apposito supporto del criostato.


Medico e Tecnico:

Identificare ciascun campione come apice, lobo destro, lobo sinistro e con un numero progressivo che

deve corrispondere esattamente a quello riportato sul vetro. (es: apice 1, 2 ecc.; lobo destro 1, 2 ecc.; lobo

sinistro 1, 2, ecc.)

Tecnico:


Preparare due vetri per ogni sezione, uno da destinare, in caso di necessità, all’indagine

immunoistochimica (vedi allegato)

Medico:

Diagnosi al microscopio ottico.



Inviare per fax la risposta al Centro di Allocazione di organi e tessuti e al Centro di coordinamento locale.

Tempo

3-4 h in relazione al numero dei campioni ottenuti.

Per il trapianto di fegato il tempo d’ischemia fredda deve essere il più breve possibile, pertanto di

solito il tempo concesso è al massimo 1-2h e l’esame al criostato viene avviato esaminando aree

sospette o la parte più periferica dell’organo.

Per il trapianto di rene occorre l’esame definitivo dell’intera prostata e pertanto dopo aver

esaminato il numero maggiore di campioni al criostato (per la donazione di fegato), l’organo viene

avviato all’esame definitivo (per la donazione di rene). (vedi esame definitivo)


ESAME DEFINITIVO


VALUTAZIONE DI PROSTATA IN DEFINITIVO


Tecnico:




Medico:

Descrizione macroscopica del preparato e misurazione della prostata e vescichette seminali,

staccare le vescichette seminali e pesare la prostata: questi dati vengono annotati su scheda di

accettazione (allegato). In assenza di reperti obiettivabili, separare l’apice, il lobo destro e il lobo

sinistro, l’organo deve essere sottoposto in toto ad esame istopatologico.


Medico e Tecnico:

Porre i campioni in cassette che riportino il numero di accettazione del preparato e le lettere corrispondenti

ad apice, lobo destro, lobo sinistro.

Tecnico:

Processazione veloce con URM con programma di 3 ore o RHS con programma di 150 minuti (vedi

allegato). Colorazione con E.E. nel coloratore automatico (vedi allegato).

Medico:

Diagnosi al microscopio ottico.

Comunicazione telefonica della diagnosi al Centro di Allocazione di organi e tessuti.


Inviare per fax la risposta al Centro di Allocazione di organi e tessuti e al Centro di coordinamento locale.

Tempo

7 h (in relazione al numero di campioni ottenuti)


VALIDAZIONE DEI RENI


Tecnico:




Medico:

Descrizione macroscopica dei preparati e misurazione: questi dati vengono annotati su scheda di

accettazione (allegato). Inserimento dei campioni nelle biocassette che riportano il numero di accettazione

e le lettere corrispondenti a rene destro e rene sinistro.


Tecnico:

Processazione con URM (programma 30 min) o RHS (programma 40 minuti) o PATHCENTRE

(programma 1h e 36 minuti, previa fissazione in MWO a 160 Watt per 10 min) (vedi allegato)

Preparare 8 vetri per ciascun blocchetto con almeno due sezioni per ogni vetro, due da destinare a EE, due

al PAS e due alla tricromica di Masson.

Eseguire colorazioni speciali: PAS e tricromica di Masson (vedi allegato).

Medico:

Diagnosi al microscopio ottico con valutazione di SCORE morfofunzionale (vedi allegato)


Inviare per fax la risposta al Centro di coordinamento locale e al Centro di Allocazione di organi e tessuti.

Tempo

4 h


ESAME DEFINITIVO DI LESIONI DOPO ESAME ESTEMPORANEO

(nodulo polmone, nodulo epatico, linfonodo, grosso polipo, altro)


Tecnico:

Accettazione del preparato nel sistema operativo che gestisce l’attività del laboratorio.

Medico e Tecnico:

Dopo scongelamento, i campioni vengono inseriti in biocassette che riportano il numero di accettazione e

viene avviata la procedura con URM ( programma 1h o 2h in base alle dimensioni del campione) o RHS (

90 min o 120 min in base alle dimensioni del campione) (vedi allegato).

Tecnico:

Colorazione con EE (vedi allegato).

Medico:

Diagnosi al microscopio.



Inviare per fax la risposta al Centro di coordinamento locale e al Centro di Allocazione di organi e tessuti.

Tempo

4 h


TUTTO IL MATERIALE D’USO PER L’ALLESTIMENTO DI PREPARATI

ISTOPATOLOGICI E’ COLLOCATO IN UN ARMADIO CONTRASSEGNATO CON LA

DICITURA “TRAPIANTI”

CHECK-LIST ESAME ESTEMPORANEO

Avviare il criostato alla temperatura di -20-21°C per il tessuto e di –25°C per la camera.

Verificare che i supporti in metallo siano puliti e numericamente sufficienti per esame della prostata.

Verificare la disponibilità di OCT per il congelamento.

Verificare la disponibilità di vetrini portaoggetto e coprioggetto.

Verificare la disponibilità di formalina al 10% già pronta.

Verificare la disponibilità di acqua distillata.

Controllare i reagenti della colorazione veloce, se necessario sostituirli.

Controllare la qualità del balsamo per montare le sezioni.

CHECK-LIST ESAME DEFINITIVO

Avviare l’apparecchio URM o RHS.

Verificare la disponibilità di formalina (vedi allegato) già pronta.

Verificare la disponibilità di fissativo di Serra (vedi allegato).

Verificare disponibilità di JFK (soluzione per disidratazione-diafanizzazione, esclusiva per

l’apparecchio URM oRHS).

Verificare la qualità della paraffina nella stufa a 68°C.

Verificare la disponibilità di acqua distillata.

Controllare i reagenti della colorazione ematossilina–eosina, se necessario sostituirli.

Controllare la qualità del balsamo per montare le sezioni.

Verificare la disponibilità di vetrini portaoggetto e coprioggetto

CHECK-LIST VALIDAZIONE RENI

Come per esame definitivo.

Controllare la disponibilità del fissativo di Serra.

kit di colorazione per Pas (da conservare in frigorifero a 4°C, come indicato sulla confezione) e

Tricromica.

CHECK-LIST IMMUNOISTOCHIMICA- prostata-METODICA OPZIONALE

Reagenti:

tampone Ventana per apparecchio

tampone Ventana per MWO

anticorpo 34 E12

kit di rivelazione Ventana per immunoistochimica

protocollo 121 DAB non paraffin per 34 E12 su congelato

protocollo 9 DAB paraffin per 34 E12 su paraffina.


METODI

ESAME AL CRIOSTATO

Eseguire sezioni di 5-6 micron.

Fissare il tessuto in alcol/formolo (vedi allegato) per 1 min.

Sciacquare in acqua distillata.

Immergere in ematossilina di Harris (vedi allegato) per 1 min.

Acqua distillata un tuffo.

Differenziare in acqua di fonte fino al viraggio della colorazione.

Eosina alcolica un tuffo.

Disidratare in alcol 95.

Disidratare in alcol 99.

Diafanizzare in xilolo.

Montare con balsamo.


PROCESSAZIONE CON U.R.M.

Avviare l’unità U.R.M accendendo sia l’interruttore situato in alto a sinistra sulla camera di processazione,

che quello posto nel retro dello schermo digitale del PC.

La prima videata che appare sullo schermo conferma l’inserimento della scheda di sicurezza SMART:

premere “OK”.

Appare la videata principale “METODI”, nella quale vengono elencati i metodi presettati.

Scegliere il programma d’interesse.

Scegliere il contenitore che si desidera utilizzare.

Selezionare la fase di processazione alla quale si vuole procedere.

N.B.: Prima di iniziare l’intero procedimento di processazione ricordare i seguenti aspetti tecnici:

Non utilizzare parti di metallo all’interno della camera di processazione.

In ogni singola fase controllare sempre l’andamento dei valori di temperatura e pressione, minime

oscillazioni sono normali. Per evitare eventuali perdite di P avere cura di riavvitare le viti in modo

equilibrato, esercitando pressione in uguale misura su ognuna di esse.

Mantenere la paraffina in stufa alla temperatura di 67°-69°C prima dell’uso.

La campana di vetro viene alzata e abbassata rispettivamente con i comandi “OPEN” e “CLOSE”, il PC

chiede sempre conferma di questi comandi (videata “CHECK CHAMBER”), premendo “OK”, oppure

l’annullamento, premendo “CANCEL” (ad es. per evitare il caso in cui le viti siano ancore avvitate e

abbiamo dato il comando “OPEN”).

Le viti di sicurezza vengono avvitate usando il comando “ROTOR START” per far ruotare gradualmente

il carosello nella posizione desiderata. Avvitare e svitare usando la chiave in polipropilene che si trova

sopra la camera di processazione.

Alla fine di ogni fase di processazione per selezionare la fase successiva occorre premere “METODI”.

FISSAZIONE

1) Riempire il contenitore di vetro con formalina o Serra, porre l’agitatore magnetico e le

biocassette, quindi il coperchio in teflon. Il livello del fissativo deve raggiungere e

lievemente superare il foro piccolo posto in prossimità del bordo superiore del coperchio in

teflon del contenitore da 4 biocassette (nei contenitori da 15 e da 60, 5-10 mm sopra le

byocassette).

2) Inserire il contenitore nella camera e verificare che l’agitatore magnetico abbia cominciato a

girare: abbassare la campana di vetro, avvitare uniformemente le viti, chiudere la camera e

premere “START”.

3) Un segnale acustico avverte che la fissazione si è conclusa: premere “OK” e attendere la

depressurizzazione della campana di vetro.

4) Aprire la camera, svitare le viti, far alzare la campana di vetro ed estrarre il contenitore.

5) Verificare che la fissazione del materiale sia avvenuta, altrimenti ripetere da capo l’intero

passaggio.

N.B. Prima di eseguire la disidratazione avere cura di tamponare bene le biocassette per eliminare

l’eccesso di formalina. Quindi risciacquarle per 10-15 sec in alcool 99°, tamponarle nuovamente e

passare alla fase successiva.


DISIDRATAZIONE

1) Riempire il contenitore di vetro con soluzione JFC (livello consigliato come per il fissativo),

porre le biocassette, l’agitatore magnetico e il coperchio in teflon.

I passaggi 2-3-4 come nella fissazione.

VAPORIZZAZIONE

1) Trasferire le biocassette nel contenitore di vetro vuoto: in questa fase non utilizzare l’agitatore

magnetico e il coperchio in teflon. Il trasferimento deve essere molto rapido (entro 1 min).

2-3-4 come sopra

IMPREGNAZIONE IN PARAFFINA

1)Estrarre dalla stufa il contenitore di vetro contenente la paraffina, porvi le biocassette,

l’agitatore magnetico e il coperchio in teflon (tenuti anch’essi nel forno fino a quel

momento). Il livello della paraffina deve coprire appena le biocassette.

N.B. Il trasferimento dalla stufa all’U.R.M deve essere molto rapido per evitare il

raffreddamento della paraffina e la formazione di uno strato della stessa sulla superficie del

vetro. In tal caso porre il contenitore di paraffina con le biocassette in stufa fino a far

sciogliere tale strato.

2-3-4 come sopra.

5) Procedere all’inclusione del materiale e riporre nel forno la paraffina sciolta.

6) Salvare la procedura eseguita con il numero di accettazione del caso.

Per spegnere l’unità U.R.M. premere “METODI”, quindi “EXIT”, quindi “YES” per confermare

di voler uscire dal programma. Con il mouse far comparire sullo schermo a sinistra la barra e

cliccare “START”, selezionare “SHUT DOWN” (ultimo in basso), quindi “OK” per arrestare il

sistema. Attendere sullo schermo la scritta che avverte che il PC è pronto ad essere spento.

Spegnere gli interruttori posti in alto a sinistra della camera di processazione e sul retro dello

schermo del PC.


PROGRAMMI PRESETTATI IN URM

I programmi da eseguire sono indicati da un tempo in minuti-ore in base alle dimensioni del

campione:

Tempo Dimensioni (mm)

1) 30 min. 2x2 o 2,5

2) 1h 5x2,5x2

3) 1h 30 min. 10x5x2,5

4) 2h 15x10x3

5) 2h 30 min. 20x15x3

6) 3h 25x20x3

7) 4h 30x25x5

Per la fissazione occorre:

1) fissare a T ambiente per un tempo uguale a quello previsto in URM o RHS

es: programma da 30 min, fissare a T ambiente 15 min

2) eseguire la fissazione in URM o RHS per il tempo stabilito dal programma scelto

3) post-fissazione per un tempo uguale a quello previsto in URM o RHS

es: programma da 30 min, fissare a T ambiente per altri 15 min, prima di iniziare la

disidratazione

Programma da 30 min

Tempo totale Tempo parziale Watt T mbar

Fissazione 15min 3 min 500 35° 1800

12 min 500 45° 1800

Disidratazione 20 min 2 min 300 35° 1800

2 min 300 45° 1800

2 min 300 60° 1800

14 min 300 70° 1800

Vaporizzazione 1 min 30 500 70° 500

Impregnazione 10 min 30 1 min 500 70° 400

1 min 500 70° 300

1 min 500 70° 200

7 min 30 500 70° 100


Programma da 2 ore



27 min 300 45° 1800

Disidratazione 1h 31 5 min 300 35° 1800

5 min 300 45° 1800

5 min 300 60° 1800

1h 300 70° 1800

16 min 300 70° 1800


Impregnazione 28 min 5 min 500 75° 500

5 min 500 75° 400

2 min 500 75° 300

2 min 500 65° 200

2 min 500 65° 150

12 min 500 65° 100

Programma da 3 ore



43 min 700 45° 1800

Disidratazione 2h 25 5 min 700 35° 1800

5 min 700 45° 1800

5 min 700 60° 1800

1h 700 70° 1800

1h 700 70° 1800

10 min 700 70° 1800


Impregnazione 38 min 5 min 500 75° 500

5 min 500 75° 400

2 min 500 75° 300

2 min 500 65° 200

2 min 500 65° 150

22 min 500 65° 100

Ciascuna procedura deve essere salvata nel sistema operativo dell’apparecchio con il numero

di accettazione del materiale e una stampa dell’intero procedimento, eseguito dalla macchina,

deve essere allegato al dossier del donatore insieme alla diagnosi istopatologica, scheda di

accettazione, scheda tecnica e scheda degli eventi.


PROCESSAZIONE CON RHS

Avviare l’unità RHS accendendo l’interruttore situato in alto a sinistra sulla parte frontale del forno. Per

aprire lo sportello spingere la maniglia verso il basso e poi verso l’esterno.

Sullo schermo appare il menu principale, toccando sullo schermo selezionare “RHS-2”: Istoprocessazione

senza vuoto” poi “30 cassette” poi “CONTINUA”.

Scegliere il programma desiderato, poi “ESEGUI”, poi “FISSAZIONE”.

N.B.: Prima di cominciare l’intero procedimento di processazione ricordare i seguenti aspetti

tecnici:

Non utilizzare parti di metallo all’interno della camera di processazione.

In ogni singola fase controllare sempre l’andamento dei valori di temperatura e pressione. Il grafico rosso

deve sovrapporsi al grafico blu già predisposto dallo strumento, minime oscillazioni sono previste. Nel

caso di variazioni notevoli rispetto ai parametri del grafico blu, lo strumento si blocca automaticamente.

FISSAZIONE

1. Prendere il contenitore di vetro e inserirlo nel suo supporto di plastica, porvi dentro il

dischetto isolante e l’agitatore magnetico nel suo alloggio, infine il rack con le biocassette

da processare, riempire il contenitore di vetro con formalina o Serra fino a 1 cm sopra le

biocassette. Coprire con il coperchio. Inserirlo nel forno in corrispondenza del suo alloggio.

Premere “START” sullo schermo.

2. Un segnale acustico avverte che la fissazione si è conclusa: premere “STOP AUDIO

ALARM” per interrompere l’allarme poi “BACK” poi “JFC” per eseguire la fase della

disidratazione.

3. Verificare che la fissazione del materiale sia avvenuta, altrimenti ripetere da capo l’intero

passaggio.

DISIDRATAZIONE

1. Estrarre dal forno il contenitore di vetro, vuotarlo dalla formalina, asciugarlo con la

carta, riempirlo di nuovo con soluzione JFC (livello consigliato come per il fissativo),

porre le biocassette, l’agitatore magnetico e il coperchio.

2. Inserire nel forno come sopra e premere “START” sullo schermo.

3. Alla fine della disidratazione premere “STOP AUDIO ALARM” per interrompere

l’allarme poi “BACK”, poi “IMPREGNAZIONE CON PARAFFINA”

IMPREGNAZIONE IN PARAFFINA

1. Estrarre dalla stufa il contenitore di vetro contenente la paraffina, il dischetto

isolante, l’agitatore magnetico e il rack, verificare il livello della paraffina (come i

precedenti) se è necessario correggerlo aggiungendo paraffina già fusa, porvi le

biocassette e coprire con il coperchio a retina.


2. Alla fine dell’impregnazione premere “STOP AUDIO ALARM” per interrompere

l’allarme poi “BACK” fino al menu principale, quindi spengere l’interruttore in alto

a sinistra sulla parte frontale del forno.

3. Riporre il contenitore della paraffina dentro la stufa.

N.B. Il trasferimento dalla stufa all’RHS deve essere molto rapido per evitare il

raffreddamento della paraffina e la formazione di uno strato della stessa sulla superficie del

vetro. In tal caso porre il contenitore di paraffina con le biocassette in stufa fino a far

sciogliere tale strato.

Procedere all’inclusione del materiale.

PROGRAMMI PRESETTATI IN RHS IN USO

Programma di 40 min:

Fissazione 8 min +/-10 min

Disidratazione5 min +/-10 min

Impregnazione 9 min+/-10 min

Programma di 150 min:

Fissazione 28 min +/-10 min

Disidratazione1h 35 +/-10 min

Impregnazione 39 min+/-10 min

Ciascuna procedura deve essere salvata nel sistema operativo dell’apparecchio con il numero

di accettazione del materiale e una stampa dell’intero procedimento, eseguito dalla macchina,

deve essere allegato al dossier del donatore insieme alla diagnosi istopatologica, scheda di

accettazione, scheda tecnica e scheda degli eventi.


PROCESSAZIONE CON “PATHCENTRE”

Questa processazione prevede una fissazione “veloce” nel forno a microonde per 10 min a 160 Watt.

Verificare la fissazione ed eventualmente ripetere (il programma del Pathcentre prevede 10 min di

fissazione in formalina).

La macchina è pronta per essere usata. I reagenti vengono controllati ed eventualmente cambiati una volta

a settimana dal tecnico di turno presente la mattina.

PROCESSAZIONE

Per aprire il coperchio della camera premere “LID” posto davanti alla macchina. Aspettare lo scatto e

aprire prima il pannello anteriore e poi il coperchio;

Mettere le biocassette nei cestelli (se sono molte legarle e distribuire il carico tra tutti i cestelli);

Chiudere il coperchio e poi il pannello anteriore;

Premere “Processazione”, premere “2” (Programma per biopsie urgenti da 1h36m), premere “Inizio”;

Terminato il programma compare la scritta “Drenaggio”, premere;

Un segnale acustico avverte la fine di questa fase;

Aprire la camera e togliere le biocassette, richiudere;

Premere “Uscita”, poi “Lavaggio” e “Lavaggio standard”, (ATTENZIONE: se la macchina segnala un

controllo di qualità il lavaggio non inizia, quindi premere “Ignora” e “Inizio”).

CONTROLLO DI QUALITA’ (CQ)

La macchina non dovrebbe mai presentare un controllo di qualità se cambiata settimanalmente, nel

caso però che si presenti questa circostanza ecco che cosa fare.

Possiamo vedere se c’è un CQ entrando nel programma che dobbiamo utilizzare (Premere

“Processazione”, “2”), se in alto sullo schermo compare la scritta “Controllo di qualità” premere in

basso “Controllo di qualità”.

La freccetta a lato indica il materiale da sostituire, quindi cambiarlo e premere le frecce per spostare

il cursore (quadrato nero sotto la colonna “volte usato”) sul materiale sostituito, quindi premere

“Cancella”.

a) Se il CQ segnala “AIR BAG”, “FILTRO A CARBONE”, TRAPPOLA VAPORI” e

“BATTERIA” si può procedere lo stesso e cambiarli successivamente.

b) Se il CQ segnala un materiale che non possiamo cambiare (per es. la paraffina che non ha

tempo per sciogliersi o qualsiasi altro reagente che non abbiamo al momento disponibile)

spostare il cursore e premere “Ignora”.


METODO PER PROCESSAZIONE VELOCE (utilizzato a Siena)

Processatore a microonde CEM-MARS 5. L’apparecchio è dotato di una sonda, che introdotta nel

contenitore perfettamente chiuso con un tappo a vite, permette il raggiungimento della pressione e

della temperatura idonea. Quando il processatore viene acceso, appaiono nel display i diversi

programmi: a seconda che il campione sia un agobiopsia o un cuneo, il tempo di processazione

varia.

Il campione solitamente pervenuto in liquido di serra, viene trasferito in una biocassetta e inserito

nel primo contenitore quindi procederemo secondo la seguente metodica:

AGOBIOPSIA CUNEO

LIQUIDO DI SERRA 3 min.- w 300 15 min.- w 300

ALCOOL 95° 3 min.- w 300 15 min.- w 300

ALCOOL ASSOLUTO 3 min.- w 300 15 min.- w 300

XILOLO 3 min.- w 300 15 min.- w 300

Trasferiamo quindi il campione in paraffina, mantenuta liquida in stufa a 60°. L’agobiopsia resterà

in paraffina per circa 20 min, mentre il cuneo per circa 30 min.

A questo punto viene effettuata l’inclusione e a raffreddamento avvenuto, il taglio al microtomo.

Per la lettura allestiamo 8 vetrini (usiamo vetrini caricati elettrostaticamente) per ciascun blocchetto

con almeno due sezioni per ciascun vetrino, dello spessore di circa 3 micron, due da destinare EE,

due al PAS e due alla tricromica di Masson, che vengono sparaffinati a temperatura ambiente. (Si

allestiscono, inoltre, alcuni vetrini in più, per eventuali indagini successive):

xilolo 2 min

xilolo 2 min

alcool assoluto 2 min

alcool assoluto 2min

alcool 95° 2 min

alcool 85° 2 min

alcool 70° 2 min

acqua distillata.

Si preparano, quindi

ematossilina eosina:

ematossilina di Gill 2 1 min

acqua corrente 5 min

eosina 30”

differenziare in alcool 95°, disidratare, chiarificare e montare.

P.A.S.:

Acido periodico 0.5% a T.A. 5 min.

Lavaggio in H20 dist.

Reattivo di Schiff in forno a microonde (Panasonic) 100 watt per 3’ e 30”, avendo cura di

inserire nel forno anche un contenitore d’acqua.

Passaggio rapido in metabisolfito di Na 5%

Lavaggio in H2O di fonte 1 min.

Contrastare con ematossilina di Gill 2 per 1 min.

Viraggio in H2O di fonte 10 min

Disidratare, chiarire, montare.


TRICROMICA MASSON :

Ematossilina di Harris a T.A. 3 min.

Viraggio con carbonato di litio 1%

Sciacquare in acqua di fonte per 1 min.

Biebrich scarlet-acid fuchsin 20 min. (biebrich scarlet sol.acquosa 1% 90ml

Acid fuchsin sol.acquosa 1% 10ml

Acido acetico glaciale 1 ml)

Differenziazione con H2O acetica 1%

Acido fosfomolibdico 1% a T.A. 1 min.

Verde luce 2% 2 min.

Differenziazione in H2O acetica 1%

Disidratare, chiarire, montare

INDAGINE OPZIONALE

IMMUNOISTOCHIMICA con 34 E12 con immunocoloratore VENTANA

Sezioni congelate

Preparare le etichette per protocollo DAB non paraffin presente nel programma Ventana

Inserire le sezioni congelate nel coloratore Ventana

Avviare il protocollo n° 121 del coloratore Ventana per 34 E12 su sezione congelate

Sezioni paraffinate

Preparare le etichette per protocollo DAB paraffin presente nel programma Ventana

Le sezioni devono essere asciugate in stufa a 60° C per due ore

Sparaffinare e idratare le sezioni

Eseguire smascheramento antigenico in forno a microonde: tre cicli di 5 min a 660 W

Far raffreddare le sezioni

Avviare il protocollo n° 9 del coloratore Ventana per 34 E12 su sezione paraffinate

Il sistema di immunocolorazione Ventana è approvato FDA per uso diagnostico.


PERIODIC ACID SCHIFF ( P.A.S.)

Ditta : Microstain

Codice n. 010231- paraffin

- Aggiungere 50 ml di acqua distillata nel flacone A, agitare bene per 2 minuti: la soluzione

ottenuta conservata in frigorifero sara’ valida per un anno.

- Portare la sezione all’acqua distillata.

- Porre 10 gocce del reagente A sulla sezione: lasciare agire 10 minuti.

- Lavare in acqua bidistillata.

- Porre 10 gocce del reagente B sulla sezione: lasciare agire 30 minuti.


- A 80 ml di acqua distillata, aggiungere 10 gocce della soluzione C e 10 gocce della

soluzione D: porre il tutto in una vaschetta verticale per istologia e immergervi il vetrino per

10 minuti.

- Lavare in acqua distillata.

- Porre 10 gocce del reagente E sulla sezione: lasciare agire 1 minuto.

- Far virare in acqua corrente di fonte per 5 minuti.


- Disidratare attraverso la serie ascendente degli alcol, xilene e balsamo.

Risultati:

Colorazione positiva

Rosso MagentaNuclei cellulari

blu


TRICROMICA di MASSON

Ditta: BIO-OPTICA

Codice n. 010802

Con blu di anilina

Metodo di elezione per il tessuto connettivo, particolarmente indicato per gameti, nuclei,

neurofibrille, nevroglia, collagene, cheratina,

fibrille intracellulari e immagini in negativo dell’apparato di Golgi.

Metodo

- portare la sezione all’acqua distillata

- porre sulla sezione 6 gocce della soluzione A (ematossilina ferrica sec. Weigert), aggiungere

6 gocce della soluzione B (ematossilina ferrica sec. Weigert): lasciare agire 10 minuti.

- Senza lavare, sgocciolare il vetrino e porre sulla sezione 10 gocce della soluzione C (acido

picrico soluzione alcolica): lasciare agire 4 minuti.

- Lavare rapidamente in acqua distillata lasciando la sezione di colore giallo e porre sul

vetrino 10 gocce della soluzione D (Ponceau-fucsina sec. Masson): lasciare agire 4 minuti.

- Lavare in acqua distillata e porre sulla sezione 10 gocce della soluzione E ( acido

fosfomolibdico): lasciare agire 10 minuti.

- Senza sciacquare, sgocciolare il vetrino e porvi 10 gocce della soluzione F ( bleu di anilina

sec. Masson): lasciare agire 5 minuti.

- Lavare in acqua distillata e disidratare rapidamente attraverso la serie ascendente degli alcol

sostando 1 minuto nell’ultimo assoluto, xilene e balsamo.

Risultati

Nuclei e gameti

nero

Citoplasma, cheratina, fibre muscolari, granuli acidofili

rosso

Collagene, muco, granuli basofili dell’ipofisi

blu

Granuli cellule delta dell’ipofisi

blu

Eritrociti

giallo


FISSATIVI e SOLUZIONI

FISSATIVO PER ESAME AL CRIOSTATO (ALCOL/FORMOLO)

90 ml alcol 80

10 ml formolo 37%

5 ml acido acetico glaciale

FORMALINA TAMPONATA 10%

90 ml PBS

10 ml formalina 37%-40%

FISSATIVO ALCOL/FORMOLO (SERRA) PER BIOPSIE RENALI

300 ml alcol 95

175 ml formalina 37%-40%

25 ml acido acetico glaciale

EMATOSSILINA DI HARRIS

300 ml di ematossilina

9 ml di acido acetico

EOSINA ALCOLICA


COLORAZIONE IN EMATOSSILINA-EOSINA MANUALE

Xilolo 5 min

Xilolo 5 min

Alcol 99 5 min

Alcol 99 5 min

Alcol 95 5 min

Alcol 95 5 min

Lavaggio in acqua distillata

Ematossilina di Harris 1 min

Lavaggio in acua distillata

Viraggio in acqua di fonte 5 min

Eosina alcolica 10 sec

Alcol 95 5 min

Alcol 95 5 min

Alcol 99 5 min

Alcol 99 5 min

Xilolo 3 min

Montare con Eukitt

COLORAZIONE IN EMATOSSILINA-EOSINA CON COLORATORE AUTOMATICO

Xilolo 5 min

Xilolo 5 min

Alcol 99 1 min

Alcol 95 1 min

Lavaggio in acqua 1 min

Acqua distillata 30 sec

Ematossilina 4 min

Lavaggio in acqua 30 sec

Alcol acido 20 sec

Lavaggio in acqua ammoniaca 1 min

Lavaggio in acqua 1 min

Acqua distillata 30 sec

Eosina alcolica 30 sec

Alcol 95 1 min

Alcol 99 1 min

Xilolo

Montare con Eukitt

Ematossilina acidificata : 300 ml ematossilina + 6 ml acido acetico

Acqua ammoniaca: 300 ml acqua di fonte + 3-6 ml ammoniaca

Alcol-acido: 1400 ml alcol 99+600 ml acqua distillata+ 20 ml HCl


SCORE MORFOFUNZIONALE RENE

( Karpinski J et al. Transplantation 1999; 67: 1162-67))

Parametri considerati score

Sclerosi glomerulare 0-3

atrofia tubulare 0-3

fibrosi interstiziale 0-3

stato arterie e arteriole 0-3

Per ciascun rene si otterrà uno score finale da 0 a 12

0: no lesioni o < 5% arterie normali

1: < 20% o lieve ispessimento arterioso (spessore della parete inferiore al calibro dell’arteriola)

2: 20-50% o moderato ispessimento arterioso (spessore della parete ugulae al calibro dell’arteriola)

3: > 50% o grave ispessimento arterioso o occlusione del lume (spessore della parete superiore al

calibro dell’arteriola)

NOTA: LA BIOPSIA PER ESSERE DIAGNOSTICA DEVE CONTENERE ALMENO 10

GLOMERULI

CRITERI PER RECLUTARE O SCARTARE I RENI

Score finale Commento

0-3 OK per singolo trapianto

4-6 OK per doppio trapianto

7-12 Organi scartati

Uno score 3 vascolare rappresenta controindicazione al trapianto indipendentemente dallo score

glomerulare, tubulare e interstiziale.

Transplant Pathology Internet Service, Pittsburgh: http://tpis.upmc.edu/

Role of Donor Kidney Biopsies in Renal Transplantation

It is recommended that all donor kidneys should be examined by a pre-transplantation or post-

perfusion biopsy. Such an examination provides a baseline with which future biopsies may be

compared. Pre-existing lesions such as capillary thrombosis, arteriolosclerosis, glomerulosclerosis

and interstitial fibrosis can be recorded, so that the occurrence of the same lesions in post-

transplantation biopsies is not misconstrued as evidence of tacrolimus/cyclosporine toxicity or

chronic allograft nephropathy. A donor kidney is mandatory in clinical settings such as an older

donor (age > 55), hypertension, diabetes mellitus, acute tubular necrosis, disseminated intravascular

coagulation, or unexplained rise in serum creatinine prior to death. Sometimes a biopsy becomes

necessary when preliminary gross examination of the organ shows cortical scarring, renal artery

atherosclerosis, or the presence of localized neoplastic nodules.

The sample of choice is a generous wedge biopsy about 1cm long and 0.5 cm in depth. The

suggested size ensures that at least half the cortical zone is available for evaluation, and minimizes

erroneous conclusions due to superficial subcapsular scarring secondary to senile arteriolosclerosis.

Some centers prefer that both a wedge and a needle biopsy be performed to provide assurance that

the deep cortex has been adequately sampled.


Urgent histologic processing of donor biopsies can be performed, when the decision on whether or

not to transplant is contingent on the morphologic findings. Since prolonged cold ischemia is

detrimental to long term graft function, the biopsies need to be read as soon as possible. Rapid

processing protocols can yield quality permanent within 2 hours of the receipt of a specimen.

Consistently providing this level of service, however, requires that both a technologist and a

pathologist to be on call 24 hours a day, 7 days a week. As an alternative, a frozen section service

can be offered with only the pathologist required to be on call outside of normal working hours.

Frozen section morphology is adequate to recognize sclerotic glomeruli, advanced interstitial

fibrosis and arteriosclerosis in the donor kidney.

Interpretation of a donor kidney biopsy calls for a semi-quantitative assessment of the degree of

glomerulosclerosis, arteriosclerosis, and interstitial fibrosis present. If most of the glomeruli are

patent and there is only mild arteriosclerosis and interstitial fibrosis present, the donor kidney is

suitable for use. However, the extent of acceptable chronic changes within the donor kidney has not

yet been rigorously defined. A widely accepted empiric rule based, in part, on a study by Gaber et al

is that kidneys with greater than 20% sclerotic glomeruli not be used. At Pittsburgh, surgeons are

also hesitant to use any kidney with more than mild interstitial fibrosis (greater than 25% of cortical

area affected) or mild arteriosclerosis (greater than 25% luminal occlusion).

Many studies have attempted to validate the utility of donor biopsies in clinical practice by formal

statistical analysis. The conclusions have not been uniform: interstitial fibrosis, glomerulosclerosis,

or arteriosclerosis have variably been identified as a critical parameter in different patient

populations. Glomerular, interstitial and vascular lesions are frequently (but not always)

proportional to each other, and it stands to reason that advanced changes in any of the major

anatomic compartments in a donor kidney should contraindicate transplantation. Yet, studies which

fail to find any correlation between donor biopsy findings and post-transplantation graft function

have also been published. Many of these investigations have methodological problems that include

small numbers of patients, insufficient histologic detail for critical evaluation, studies limited to

biopsies with only mild histologic changes, and use of only crude graft survival rates in evaluating

clinical outcome.

Biopsies performed in the setting of suspected or laboratory documented disseminated intravascular

coagulation need to be evaluated for the extent of microvascular injury. Organs with diffuse and

extensive glomerular thrombosis should be discarded. On the other hand, the presence of scattered

capillary thrombi present in a minority of glomeruli does not necessarily contraindicate

transplantation. When the donor serum creatinine is normal or marginally elevated, successful

transplantation has been reported. Isolated fibrin thrombi can apparently be dissolved by an intact

fibrinolytic system, although this may result in a transient microangiopathic hemolytic anemia in a

few instances.

Occasionally, donor biopsies will show changes consistent with glomerulonephritis. There are well

documented instances of glomerulonephritis having been transmitted from donor to recipient as a

result of renal transplantation. The risk is probably the highest for IgA nephropathy, a disease with

high prevalence in some geographic regions. Based on isolated case reports in the literature, it

would appear that mild glomerular changes in the donor biopsy can probably be ignored. Thus,

modest donor derived IgA deposits do not cause significant graft dysfunction, and can

spontaneously resolve with time. Similar observations have been made regarding donor transmitted

membranoproliferative glomerulonephritis Type I. Focal segmental sclerosis has also been shown

not to progress in the post-transplantation period.

The final indication for a donor kidney biopsy is the presence of a grossly visible nodule noticed

during harvesting of the organ. When histologic examination shows a benign cyst, leiomyoma or

angiomyolipoma, it is safe to proceed with transplantation. However, finding a small epithelial


neoplasm can generate dilemmas that may be difficult to resolve, particularly when a high grade

carcinoma is not demonstrated. The distinction between a so-called renal adenoma and a small low

grade renal cell carcinoma is arbitrary, and traditionally based on the size of the lesion. If the donor

lesion is small (say less than 0.5cm) and completely excised, the risk of residual or recurrent

carcinoma in the recipient is probably extremely small. Dr. Israel Penn has reported 6 cases, where

wide excision of the donor nodule led to an uneventful course documented by up to 186 months of

post-transplantation follow up. The rare occurrence of post-transplant renal allograft carcinoma,

despite the estimated 7-25% incidence (based on routine autopsy data) of small renal cell neoplasms

in donor kidneys, also suggests that the use of such kidneys might be reasonable, at least in the

context of informed recipient consent. Nonetheless, this is a controversial issue, and some transplant

centers refuse to accept organs with small epithelial neoplasms.

REFERENCES

1. Brunt EM, Kisson JM, Cole BR, Hanto DW. Transmission and resolution of type I

membranoproliferative glomerulonephritis in recipients of cadaveric renal allografts.

Transplantation 1988;46:595.

2. Curschellas E, Landmann J, Durig M, Huser B, Kyo M, Basler V, Thiel G, Mihatsch MJ.

Morphologic findings in "zero-hour" biopsies of renal transplants. Clin Nephrol 1991;36:215.

3. Gaber LW, Moore LW, Alloway RR, Amiri MH, Vera SR, Gaber AO. Glomerulosclerosis as a

determinant of post-transplant function of older donor renal allografts. Transplantation

1995;60:334.

4. Leunissen KM, Bosman FT, Nieman FH et al. Amplification of the nephrotoxic effect of

cyclosporine by preexistent chronic histological lesions in the kidney. Transplantation 1989;48:590.

5. Nyberg G, Hedman L, Blohme I, Svalander C. Morphologic findings in baseline kidney biopsies

from living related donors. Transplant Proc 1979;24:355.

6. Penn I. Transmission of cancer with donor organs. Transplantation Proceedings 1988;20:739.

7. Randhawa PS, Minervini MI, Lombardero MI, Duquesnoy R, Fung J, Shapiro R, Jordan M,

Vivas C, Scantlebury V, Demetris AJ. Biopsy of marginal donor kidneys: correlation of histologic

findings with graft dysfunction. Transplantation, 2000, in press.

8. Ruers TJM, Bossman F, Kootstra G, van Hoof JP. Intravascular coagulation and kidney donation.

Transplantation 1986;42:307.

9. Ratner LE, Joseph V, Zibari G et al. Transplantation of kidneys from hypertensive cadaveric

donors. Transplant Proc 1995;27:989.

10. Sanflippo F, Croker BP, Bollinger RR. Fate of four cadaveric donor renal allografts with

mesangial IgA deposits. Transplantation 1982:33:370.

11. Seron D, Carrera M, Grino JM, et al. Relationship between donor renal interstitial surface and

post?transplant function. Nephron Dial Transplant 1993; 8:539.

12. Silva FG, Chander P, Pirani CL. Disappearance of glomerular mesangial IgA deposits after

renal allograft transplantation. Transplantation 1982;33:214.

13. Wang HJ, Kjellstrand CM, Cockfield SM, Solez K. On the influence of sample size on the

prognostic accuracy and reproducibility of renal transplant biopsy. Nephrol Dial Transplant

1998;13:165.


VALUTAZIONE DEL FEGATO AL CRIOSTATO

Controindicazioni al trapianto:

Steatosi macrovescicolare >30%

Necrosi epatocellulare evidente

Infiammazione riferibile ad epatite cronica attiva in portatori di infezioni HBV, HCV

Fibrosi con connessioni portali, fibrosi peridottale evidente

Steatosi microvescicolare non costituisce controindicazione

Transplant Pathology Internet Service, Pittsburgh: http://tpis.upmc.edu/

Biopsy Evaluation of the Donor Organ

Frozen Sections

Increased utilization of transplantation as treatment for patients with end-stage hepatic disease has

resulted in a significant shortfall of available livers. Efforts to expand the available donor pool have

resulted in the inclusion of older donors and others, who because of underlying chronic non-hepatic

disease, might not have been considered in the past. This has resulted in more requests for frozen

section biopsy evaluation of the liver and other organs from "marginal" donors. In conjunction with

other data, the information gained from the biopsy analysis is used to determine whether the organ

is suitable for transplantation (1, 2).

If possible, the pathologist should grossly inspect the organ and assist in choosing the biopsy site

and type. In general, a 1.5 cm2 subcapsular wedge or 2.0 cm long needle core from the anterior

inferior edge of the liver is adequate in most cases, when the anticipated changes are diffuse. Biopsy

sampling of the interface between the normal parenchyma and a mass lesion or focal defect is

intuitive.

The donor liver is most frequently subjected to biopsy analysis. Frozen section requests are most

often prompted by the macroscopic appearance of the organ, which raises uncertainties in the mind


of the recipient surgeon. A grossly fatty liver most often prompts the request for biopsy evaluation.

Currently, transplantation is contraindicated when a malignant tumor or severe macrovesicular

steatosis , involving 60% or more of the parenchyma is detected(1-4). Donors livers with this

degree of steatosis predictably cause a typical syndrome in the recipient shortly after reperfusion,

which is caused by lysis of the steatotic hepatocytes .

In livers with less severe macrovesicular steatosis , it is up to the recipient surgeon to decide when

less than optimal organs are used for transplantation. They are best able to determine the risk to

benefit ratio of using a particular organ for transplantation in a particular recipient. For example,

donor livers with less than 30-40% macrovesicular steatosis will function after transplantation, but

the recipient will suffer from fibrinolysis and a bleeding diathesis shortly after reperfusion.

Microvesicular steatosis on the other hand, is often found after a short period of warm ischemia and

other insults. In our experience, it usually does not predictably result in post-transplant graft

dysfunction and therefore, is not a contraindication to transplantation. In other instances, a mass

lesion or even the clinical circumstances surrounding the donor's death may trigger the need for

quick histopathologic evaluation of the graft.

In our experience, the routine H & E stained frozen section are adequate to determine the severity of

steatosis; fat stains are not necessary. There are however, several important caveats that deserve

particular mention. It is extremely important that the biopsy is freshly obtained. Fat quickly

leeches from liver biopsies left open to the ambient air or resting on a dry paper towel for more than

several minutes. In such cases, a subsequent frozen section can significantly underestimate the

severity of steatosis. Organs that otherwise would have been discarded will be used, often with

disastrous consequences. In addition, biopsies kept in "physiological" saline are significantly

distorted by this medium, such that interepretation becomes extremely difficult, if not impossible.

Clumping of the cytoplasm and edema of the extracellular spaces distorts the morphology so much

so, that it becomes impossible to detect areas of necrosis.

Predominantly mononuclear portal inflammation is a common finding in donor organ biopsies. In

such cases, the differential diagnosis is quite broad, because the findings are usually mild and non-

specific. Viral hepatitis infection, particularly type C, should be excluded in such cases. The

serological test results for hepatitis infection are usually available from the procurement agency and

known to the donor surgeon. In the absence of viral hepatitis infection, a prolonged stay for more

than two to three days in the intensive care unit for the donor is commonly associated with this

finding. In such cases, the liver can be used without any problems.


Several frozen sections have been requested from inexperienced donor surgeons, because the liver

has "a funny color", which is usually greyish-brown. In most instances, such requests can be

handled over the telephone, without a frozen section by simply asking the donor's age. However, a

persistent surgeon may still request that the liver be examined microscopically. In such cases,

lipofuschin , which is deposited primarily in the centrilobular regions is responsible for the gross

coloration. It increases with age, such that donors older than 60 years will contain enough

lipofuschin to grossly affect the color of the liver. Inexperienced pathologists can mistake

lipofuschin pigment for cholestasis or iron deposits. Iron deposits in the early stages of genetic

hemochromatosis are periportal, in contrast to the centrilobular predominance of lipofuschin. Bile

stasis can be distinguished from lipofuschin by the presence of pigment in the canaliculi, between

the hepatocytes and bile is amorphous, whereas lipofuschin is more granular in appearance.

Focal nodular hyperplasia(FNH) lesions are occasionally detected on frozen section of donor livers.

Most often, these are detected on frozen section evaluation of small(1.0 - 3.0 cm) subcapsular

nodule(s). Another name for FNH is "focal cirrhosis". Remembering this name is helpful in making

the diagnosis. This older name also should serve as a reminder that the pathologist has to be aware

that the donor liver is being evaluated for a focal lesion, so a mistaken diagnosis of cirrhosis is not

made.

Small firm white, well-circumscribed subcapsular nodules also frequently prompt a request for

frozen section evaluation of the donor liver to rule out a primary or metastatic malignacy. Often,

these turn out to be old fibrotic granulomas from histoplasmosis, or "histoplasmomas" .

Non-central nervous system malignancies are a contra-indication to liver transplantation. When

such lesions are encountered, the donor organ is disgarded or used for research purposes. It may be

difficult however, in some cases to make a diagnosis of a neoplasm with certainty, particularly on

frozen section. This is particularly true for hematolymphoid tumors , which are notoriously difficult


to diagnose in this circunstance. It is best in such cases to err on the conservative side, particularly if

the potential recipient is stable enough to wait for another donor. In addition, in many cases it is

particularly helpful to examine any other donor tissue that might provide useful information.

REFERENCES

1. Kakizoe S, Yanaga K, Starzl TE, Demetris AJ. Frozen section of liver biopsy for the

evaluation of liver allografts. Transplant Proc 1990;22(2):416-7.

2. Markin RS, Wisecarver JL, Radio SJ, et al. Frozen section evaluation of donor livers before

transplantation. Transplantation 1993;56:1403-1409.

3. D'Alessandro AM, Kalayoglu M, Sollinger HW, et al. The predictive value of donor liver

biopsies on the development of primary nonfunction after orthotopic liver transplantation.

Transplant Proc 1991;23:1536-7.

4. Adams R, Reynes M, Johann M, et al. The outcome of steatotic grafts in liver

transplantation. Transplant Proc 1991;23:1538-1540.

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Forno a micro-onde da laboratorio

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manuale)

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