sianturi 2008.pdf
DESCRIPTION
ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE TERMOFIL KASAR DARI SUMBER AIR PANASPENEN SIBIRUBIRU SUMATERA UTARATRANSCRIPT
ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE TERMOFIL KASAR DARI SUMBER AIR PANAS
PENEN SIBIRUBIRU SUMATERA UTARA
TESIS
Oleh
DESSY CHRISTINA SIANTURI
067030006/BIO
SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN 2008
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE TERMOFIL KASAR DARI SUMBER AIR PANAS
PENEN SIBIRUBIRU SUMATERA UTARA
TESIS
Untuk Memperoleh Gelar Magister Sains dalam
Program Studi Biologi pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara
Oleh
DESSY CHRISTINA SIANTURI 067030006/BIO
SEKOLAH PASCASARJANA
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN
2008
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Judul Tesis : ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE TERMOFIL KASAR DARI SUMBER AIR PANAS PENEN SIBIRUBIRU SUMATERA UTARA Nama Mahasiswa : Dessy Christina Sianturi Nomor Pokok : 067030006 Program Studi : Ilmu Biologi
Menyetujui Komisi Pembimbing
(Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) (Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc.) Ketua Anggota Ketua Program Studi Direktur
(Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) (Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc.) Tanggal lulus : 26 September 2008
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Telah diuji pada
Tanggal : 26 September 2008
PANITIA PENGUJI TESIS Ketua : Dr. Dwi Suryanto, M.Sc. Anggota : 1. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc. 2. Dr. Delvian SP., MP. 3. Dr. Herla Rusmarilin, MS.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
ABSTRAK
Telah dilakukan isolasi bakteri termofil penghasil enzim amilase dari sumber air panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara di Laboratorium Mikrobiologi MIPA Universitas Sumatera Utara dari bulan Februari-Juli 2008. Enam belas isolat bakteri penghasil amilase didapatkan melalui uji iodin pada media pati yang digunakan untuk pertumbuhan isolat-isolat tersebut. Melalui pengukuran diameter zona bening pada media selektif amilase dengan uji iodin dipilih tiga isolat yang paling besar zona beningnya yaitu PN1, PN4 dan PN9. Enzim amilase kasar yang dihasilkan ketiga isolat terpilih tersebut diuji aktivitasnya lewat konsentrasi glukosa yang dihasilkan dari hidrolisis pati pada pengaruh suhu inkubasi dan pH yang berbeda. Dari hasil pengujian didapatkan hasil amilase kasar isolat PN9 menghasilkan glukosa lebih banyak pada suhu 80oC (165,78µg/ml) diikuti oleh amilase kasar isolat PN1 (117,88 µg/ml) dan PN4 (129,19 µg/ml), meskipun pada suhu optimum aktifitasnya (60°C) amilase isolat PN4 menghasilkan glukosa yang lebih banyak sebagai hasil hidrolisis pati yaitu 437,22 µg/ml. Amilase kasar isolat PN1 memiliki aktivitas katalik yang lebih tinggi pada pH yang alkalis (pH 9,0) dibandingkan dengan PN4 dan PN9. Amilase kasar isolat PN4 aktivitas amilasenya lebih tinggi di suasana pH yang sifatnya sedikit asam sampai netral (pH 5,0 – pH 7,0). Amilase kasar isolat PN9 memiliki aktivitas katalik yang tertinggi dari ketiga isolat dan optimum aktivitasnya pada pH substrat yang bersifat netral (pH 7,0) dengan glukosa hasil hidrolisis tertinggi (390,11µg/ml). Kata kunci : Amilase termofil, air panas Penen, enzim amilase, isolasi bakteri.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
ABSTRACT
Isolation of amylolytic thermophile bacteria from Penen Hot spring Sibirubiru has been carried out in Microbiology Laboratory, Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Sumatera Utara from February to July 2008. Sixteen amylolytic bacterial isolates were obtained through the Iodine test on starch media. Three out of sixteen isolates showed relatively high hydrolytic activity and were used for further study. PN9 showed enzyme activity at 80oC by producing 165,78 µg/ml glucose, followed by PN4 with 129,19 µg/ml and PN1 with 117,88 µg/ml glucose, respectively. Optimum activity were showed by PN4 at 60oC by producing 437,22 µg/ml glucose. This isolate also showed relatively high enzyme activity at pH 5,0-7,0. Crude enzyme activity were measured at different of temperature and pH. However PN9 showed the highest activity among isolates tested and has optimum activity at pH 7,0 with glucose production 390,11µg/ml. Key word : Thermophile amylase, Penen hot spring, amylase enzyme, isolation of bacteria.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
UCAPAN TERIMA KASIH
Dengan segenap jiwaku aku menyerukan terima kasih padaMu ya Tuhan, karena
atas segala rencana, berkat kasih dan pertolonganMulah aku dapat melalui dan
menyelesaikan perkuliahan serta tugas akhir tesis ini. Besar kasih dan kuasaMu dan
segala puji syukur kupanjatkan kehadiratMu Tuhan.
Terima kasih yang sebesar besarnya saya ucapkan kepada Pemerintah Provinsi
Sumatera Utara lewat BAPPEDA Provinsi Sumatera Utara yang memberikan
kesempatan dan bantuan finansial selama perkuliahan saya di Program Studi Biologi
SPs USU.
Dengan selesainya tesis ini perkenankanlah saya mengucapkan terima kasih
yang sebesar-besarnya kepada: Rektor Universitas Sumatera Utara Bapak Prof.
Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp.A(K), atas kesempatan fasilitas yang diberikan
kepada kami untuk menyelesaikan pendidikan program Magister, Direktur Sekolah
Pascasarjana Ibu Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc., Ketua Program Studi Biologi
Bapak Dr. Dwi Suryanto, M.Sc dan Sekretaris Program Studi Biologi Bapak Prof. Dr.
Ing. Ternala Alex Barus, M.Sc. atas kesempatan dan bimbingan yang diberikan
kepada kami selama mengikuti perkuliahan pada program Studi Biologi Pascasarjana
Universitas Sumatera Utara ini.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada :
1. Bapak Dr. Dwi Suryanto, M.Sc selaku pembimbing I dan Bapak Prof. Dr. Erman
Munir, M.Sc selaku pembimbing II saya, yang selama penelitian dan penyusunan
tesis ini telah banyak memberikan bantuan dan masukan sehingga tesis ini dapat
selesai.
2. Bapak Dr. Delvian, SP, MP dan Ibu Dr. Ir. Herla Rusmarilin MS, selaku dosen
penguji yang telah banyak memberikan masukan saran untuk penyelesaian tesis
ini agar lebih baik, terima kasih buat dukungannya.
3. Bapak Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc. selaku Kepala Laboratorium Mikrobiologi
FMIPA USU dan Bapak Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si. Apt., selaku Kepala
Laboratorium Kimia Farmasi Kuantitatif Fakultas Farmasi USU yang memberi
saya kesempatan melakukan penelitian tesis di laboratorium tersebut.
4. Bapak dan Ibu dosen di Program Studi Biologi Magister SPs USU, terima kasih
untuk ilmu yang sudah diberikan selama ini.
5. Bu Nurhasni Muluk Laboran Mikrobiologi dan Bu May Laboran Kimia Farmasi Kuantitatif, terima kasih buat bantuannya selama saya melakukan penelitian di
laboratorium. Buat adik-adik Asisten Lab Mikrobiologi Atika, Lidya, Netty,Ginta,
Ansen dan yang lainnya, juga buat Muti dan Faksi di Lab Kimia Farmasi
Kuantitatif. Terima kasih atas bantuannya selama di Laboratorium.
6. Ayahandaku Drs. F. Sianturi dan Ibundaku R. A. Tambunan, BA. Tiada terbalas
segala doa, kebaikan, dukunganmu, dan pengorbananmu sehingga ananda bisa
menyelesaikan tugas akhir tesis ini. Kupersembahkan semua yang kudapatkan ini
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
untuk melengkapi kebahagianmu, telah kuwujudkan harapanmu, juga buat Ibu
mertuaku Ny. Pdt. Nalom Simanjuntak br. Tampubolon. Terima kasih buat
dukungan doamu. Buat kakak, abang dan adik-adikku semua, terima kasih buat
dukungan semangat dari kalian semua.
7. Suamiku tercinta Ir. Basar S.L. Simanjuntak, tanpa semangat dan semua bantuan
dan dukungan yang kau berikan aku tidak dapat menyelesaikan perkuliahanku dan
tugas tesisku ini, terima kasih yang tak terkira buatmu. Anak-anakku tercinta Adela,
Otniel dan si kecilku Regita, kalian merupakan motivasi terbesar dalam hidup mama.
Terima kasih buat pengertianmu untuk semua tugas kuliah mama selama ini, buat
waktu bermain dan belajar bersama yang terpakai untuk kuliah mama. Semoga apa
yang mama peroleh ini dapat menjadi motivasi baik buat kehidupan kalian kelak
untuk belajar yang sungguh-sungguh.
8. Kepala Sekolah dan segenap rekan guru serta pegawai di SMA Negeri 3 Medan
yang selalu memberikan semangat pada saya untuk menyelesaikan kuliah ini.
9. Teman-temanku di S2 Biologi 06, khususnya di Mikrobiologi (Bu Bunga, Bu Dewi
Bu Nur, Bu Sri, Bu Ros, Bu Iche, Pak Jusuf dan Pak Parasian), terima kasih buat
kebersamaan selama ini, juga buat teman-teman di Biologi 07 dan Biologi 08,
terima kasih atas dukungannya.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna, karena itu penulis
sangat mengharapkan kritik dan saran dari pembaca yang bermanfaat untuk
menyempurnakan tesis ini. Semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi penelitian dan
ilmu pengetahuan.
(Dessy Christina Sianturi)
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 12 Desember 1970 di Medan, putri dari Bapak
Drs. F. Sianturi dan Ibu R.A. Tambunan, BA., sebagai anak pertama dari empat
bersaudara. Penulis menjalani pendidikan di SD Negeri Sei Petani Medan Baru dari
tahun 1977 sampai tahun 1983, kemudian masuk ke SMP Katholik RK Makmur
Medan dari tahun 1983 sampai tahun 1986 dan kemudian melanjut ke SMA Negeri 8
Medan dari tahun 1986 sampai tahun 1989. Tahun 1989 melanjutkan Pendidikan ke
IKIP Negeri Medan dengan mengambil Jurusan Biologi di Fakultas Pendidikan
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan lulus Sarjana Pendidikan Biologi pada
tahun 1993.
Penulis memperoleh SK Pengangkatan sebagai guru Pegawai Negeri Sipil pada
tahun 1994 dan ditempatkan sebagai guru Biologi di SMA Negeri Padang Tualang
Kabupaten Langkat dan tahun 1998 mutasi ke SMA Negeri 3 Medan dan sampai saat
ini aktif bertugas sebagai guru Biologi di SMA Negeri 3 Medan.
Pada tahun 1997 penulis menikah dengan Ir. Basar SL. Simanjuntak dan
dikarunia 3 orang anak yaitu Adela Yohanna Simanjuntak, Otniel Wahana
Simanjuntak dan Regita Flora Simanjuntak.
Penulis melanjutkan pendidikan ke Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera
Utara dengan mengambil jenjang Magister program studi Biologi pada bulan
September 2006 dengan bantuan dana dari Pemerintah Propinsi Sumatera Utara
melalui BAPPEDA Propinsi Sumatera Utara.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRAK ....................................................................................................................i
ABSTRACT..................................................................................................................ii UCAPAN TERIMA KASIH .......................................................................................iii RIWAYAT HIDUP ....................................................................................................vii DAFTAR ISI .............................................................................................................viii DAFTAR TABEL .......................................................................................................xi DAFTAR GAMBAR .................................................................................................xii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................xiii BAB I. PENDAHULUAN .........................................................................................1 1.1. Latar Belakang Masalah .........................................................................1 1.2. Permasalahan …………………………………………………………..4 1.3. Tujuan penelitian ………………………………………………………5 1.4. Hipotesis ……………………………………………………………….5 1.5. Manfaat Penelitian ..................................................................................5 1.6. Pembatasan masalah ...............................................................................5 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................7 2.1. Amilum ..................................................................................................7 2.2. Enzim .....................................................................................................9 2.3. Enzim Amilase .....................................................................................11
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
2.4. Bakteri Termofil .................................................................................16 2.5. Amilase dari Mikroorganisma .............................................................19 2.6. Amilase dari Mikroba Termofil ……………………………………..21 2.7. Sumber Air Panas Penen Sibirubiru .. ……………………………….24 BAB III. METODE PENELITIAN ...........................................................................26 3.1. Waktu dan Tempat ...............................................................................26 3.2. Bahan dan Alat ....................................................................................26 3.3. Sampel Percobaan ................................................................................26 3.4. Pengambilan Sampel Air Panas ...........................................................27 3.5. Isolasi Bakteri dan Pemurnian Bakteri ................................................27 3.6. Pembuatan Stok Kultur ........................................................................28 3.7. Uji Diameter Zona Bening Hasil Hidrolisis Pati .................................29 3.8. Karakterisasi Morfologi Bakteri Penghasil Enzim Amilase Termofil ...............................................................................................29 3.9. Karakterisasi Bakteri Penghasil Amilase Secara Mikroskopis ............30 3.10. Uji Sifat Biokimia Bakteri Amilase Termofilik …...………………30 3.11. Pembuatan Larutan Standar Glukosa .................................................31 3.12. Produksi Enzim Amilase Dari Isolat ...............................................32 3.13. Ekstraksi Enzim Dari Kultur Cair Bakteri .........................................32 3.14. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar Dari Isolat Bakteri Termofil .............................................................................................33 3.15. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ..................................................................................................33
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
3.16. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim ...........................................34 3.17. Metode Statistik dan Analisis Data ....................................................35 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................37 4.1. Isolasi dan Seleksi Bakteri Amilolitik .................................................37 4.2. Karakterisasi Morfologi dan Uji Biokimia ..........................................37 4.3. Hasil Seleksi Isolat Untuk Pengujian Aktifitas Enzim Amilase Kasar .....................................................................................41 4.4. Pengaruh Suhu Inkubasi terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ....43 4.5. Pengaruh pH terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ......................47 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................................52 5.1. Kesimpulan ..........................................................................................52 5.2. Saran ....................................................................................................53 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................54
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
DAFTAR TABEL
Nomor Halaman
Tabel 1. Penggunaan Amilum Di Bidang Industri .......................................................9 Tabel 2. Enzim Amilase Dari Mikroorganisma Dan Aplikasinya Pada Bidang Industri .........................................................................................................22 Tabel 3. Karakter Morfologi dan Uji Biokimia Isolat Bakteri Termofil Amilolitik Penen Sibirubiru ..........................................................................38 Tabel 4. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ............43 Tabel 5. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Sumber Air Panas Penen Sibirubiru .......................48
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
DAFTAR GAMBAR Nomor Halaman Gambar 1. Struktur Kimia Dari Amilosa Dan Amilopektin ........................................8 Gambar 2. Jenis Reaksi Hidrolisis Yang Dikatalis Oleh Enzim Amilase .................13 Gambar 3. Konversi Amilum Menjadi Glukosa Oleh Enzim α dan ß Amilase .................................................................................................14 Gambar 4. Rentang Suhu Lingkungan Yang Menggambarkan Keberadaan Tempat Hidup Bakteri .............................................................................16 Gambar 5. Diameter Zona Bening Hasil Hidrolisa Pati oleh Enzim Amilase Isolat Bakteri Termofil Penen .................................................................41 Gambar 6. Tiga Isolat Terpilih Berdasarkan Diameter Zona Bening Uji Iodin ........42 Gambar 7. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Sumber Air Panas Penen Sibirubiru ..................44 Gambar 8. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Sumber Air Panas Penen ....................................50
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Judul Halaman
1. Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas ..................................................................60 2. Uji Adanya Produksi Enzim Amilase Oleh Isolat Bakteri ...................................61 3. Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase .........................................62 4. Produksi Enzim Amilase Dan Ekstraksi Enzim Dari Kultur ................................63 5. Pembuatan Larutan StandarGlukosa ......................................................................64 6. Pengukuran Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ............................................................................................65 7. Pengukuran Pengaruh pH Substrat Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ........................................................................................................66 8. Pembuatan Larutan Blanko ...................................................................................67 9. Hasil Uji Diameter Zona Bening Hidrolisa Pati ...................................................68 10. Analisis Varians Untuk Aktifitas Enzim ..............................................................69 11. Kurva Standart Glukosa .................................................................................... 72 12. Foto-Foto Pewarnaan Bakteri Isolat Penen ..........................................................73
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Masalah
Enzim dihasilkan oleh semua makhluk hidup untuk mengkatalis reaksi
biokimia dalam tubuh mahluk hidup tersebut sehingga reaksi-reaksi itu dapat
berlangsung lebih cepat. Enzim memegang peranan penting dalam dunia industri
seperti industri tekstil, detergen, bahan pangan dan minuman, bahan kimia, obat-
obatan dan industri kulit (Muchtadi et al., 1992). Produksi dan perdagangan enzim
didominasi oleh kelompok enzim hidrolitik seperti amilase, protease, katalase dan
lipase. Enzim untuk kebutuhan industri diekstraksi dari berbagai jenis sel mahluk
hidup, tetapi pada saat ini enzim lebih banyak diekstraksi dari berbagai jenis
mikroorganisma, sebab mikroorganisma menghasilkan enzim yang dapat
dimanfaatkan manusia dalam jumlah dan jenis yang sangat bervariasi selain
mikroorganismanya sendiri dapat dikulturkan untuk memperoleh enzim yang
dihasilkannnya (Palmer, 1985).
Salah satu jenis enzim yang banyak dihasilkan oleh mikroorganisma
adalah enzim amilase. Enzim amilase memiliki distribusi yang sangat luas dan
merupakan salah satu jenis enzim yang paling banyak dipelajari baik di Indonesia
maupun di luar Indonesia. Enzim ini memiliki aplikasi untuk skala yang sangat
luas mulai dari industri tekstil sampai ke pengujian-pengujian yang sangat luas
(Aiyer, 2005). Kebutuhan amilase di dunia sangat tinggi, pada tahun 2004 saja
mencapai penjualan sekitar US $2 milyar, sedangkan amilase yang digunakan
untuk industri makanan dan minuman pada tahun 2004 bernilai sekitar US $11
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
juta. Produksi amilase sendiri oleh Bacillus lichineformis dan Aspergillus sp
sekitar 300 ton enzim murni pertahun (Sivaramkrisnan et al., 2000).
Enzim amilase digunakan dalam menghidrolisis berbagai jenis sumber
amilum menjadi senyawa-senyawa sederhana seperti maltosa, glukosa dan
produksi bioetanol yang memiliki nilai ekonomi lebih tinggi. Enzim amilase
merupakan salah satu dari enzim hidrolitik yang dapat memecah ikatan-ikatan
pada amilum hingga terbentuk maltosa (Poedjiadi, 1994). Pengetahuan tentang
manfaat amilase yang berasal dari mikroba untuk hal yang bersifat komersial
merupakan awal dari penggunaan enzim dalam industri beberapa dekade yang lalu
(Walter & Nagesh, 1965).
Saat ini amilase yang bersumber dari mikroorganisma termofil dan
hipertermofil lebih banyak digunakan dalam bidang industri, terutama industri yang
menggunakan suhu tinggi dalam prosesnya. Hal ini terjadi karena enzim yang
berasal dari mikroorganisma tersebut memiliki termostabilitas dan aktivitas yang
tetap optimal pada suhu yang tinggi (Vieille & Zeikus, 2001).
Bakteri termofil penghasil enzim amilase dapat diisolasi dari berbagai
tempat seperti sumber-sumber geotermal, daerah vulkanoik, pemandian mata air
panas di darat maupun mata air panas di laut dalam dan juga dari proses
pembuatan kompos (Brock, 1978). Bakteri termofil mampu hidup secara optimal
di atas suhu 45oC, dengan struktur protein penyusun enzim yang tetap stabil atau
tidak terdenaturasi oleh panas. Mikroorganisma ini sendiri tidak hanya bersifat
toleran terhadap suhu lingkungannya yang bersifat ekstrim tetapi juga mampu
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
untuk bertahan hidup dan berkembangbiak pada kondisi suhu yang ekstrim
tersebut (Brock, 1986).
Banyak penelitian yang dilakukan baik di Indonesia maupun di luar
Indonesia untuk mencari dan mendapatkan informasi tentang bakteri termofil
penghasil enzim amilase ini. Misalnya Hyun dan Zeikus (1985) berhasil
mengisolasi dan mengkarakterisasi sifat biokimia dari Clostridium
thermosulfurogenes yang diperoleh dari Octopus Hot Spring di Taman Nasional
Yellow Stone. Isolat ini menghasilkan enzim β-amilase yang memiliki aktivitas
optimum pada suhu 75oC–80oC. Fu Shaw et al. (1995) berhasil mempurifikasi
dan mendata sifat dari Thermus sp, penghasil enzim ekstraseluler α-amilase dari
sedimen sumber air panas di Taman Nasional Yangmin Shan, Taiwan bagian
Utara. Enzim amilase tersebut bekerja optimum pada suhu 70oC. Al-Qodah et al.
(2007), berhasil mendeterminasi parameter kinetik dari enzim amilase yang
dihasilkan oleh Bacillus sphaericus yang berasal dari sumber air panas di
Jordania, dengan suhu optimum aktivitasnya pada suhu 50oC. Hartuti (2006)
berhasil mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri termofil penghasil amilase
yang bersumber dari pemandian Air panas Pawan, Riau. Ternyata ada 24 isolat
yang bersifat amilolitik. Diantara isolat tersebut 15 isolat berbentuk basil gram
negatif, delapan isolat berbentuk basil gram positif sedangkan satu berbentuk
kokus gram negatif. Semuanya memiliki suhu inkubasi optimum sebesar 50oC.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
1.2. Permasalahan
Proses-proses kimia dalam bidang industri banyak yang berlangsung pada
suhu yang relatif tinggi di atas 40oC. Agar proses reaksi berlangsung cepat
dibutuhkan bantuan enzim, namun enzim yang digunakan harus bersifat stabil
pada suhu yang tinggi tersebut. Banyak industri yang melibatkan bantuan enzim
amilase terutama amilase termostabil dalam proses reaksi-reaksi kimianya, karena
itu perlu dicari dan diteliti sumber-sumber di muka bumi yang dapat
menghasilkan enzim amilase termostabil tersebut.
Indonesia merupakan negara pertanian yang mana hasil pertaniannya
banyak berasal dari golongan karbohidrat. Hal ini tentu membutuhkan banyak
enzim amilase untuk pengolahan hasil pertanian tersebut agar memiliki nilai
ekonomi yang lebih tinggi dan lebih bermanfaat. Indonesia juga sebagai salah satu
wilayah yang memiliki aktivitas vulkanoik dan sumber geotermal yang banyak,
memiliki kesempatan untuk menghasilkan sumber-sumber mikroorganisma yang
dapat memproduksi enzim amilase termostabil tersebut. Salah satu sumber
geotermal itu adalah mata air panas yang cukup banyak tersebar di Indonesia
termasuk di Sumatera Utara. Di Sumatera Utara sendiri terdapat sumber mata air
panas yang banyak jumlahnya, salah satunya adalah sumber mata air panas Penen
Sibirubiru yang ada di Kabupaten Deli Serdang. Untuk itu diharapkan dari sumber
mata air panas Penen Sibirubiru tersebut dapat ditemukan mikroorganisme
termofil terutama bakteri penghasil enzim amilase yang tetap memiliki aktivitas
pada suhu tinggi.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
1.3. Tujuan Penelitian
a. Untuk mendapatkan serta mengetahui karakter isolat bakteri termofil yang memiliki potensi amilolitik dari sumber air panas Penen Sibirubiru .
b. Untuk mengetahui potensi aktivitas enzim amilase termofil kasar dari isolat bakteri termofil di sumber air panas Penen Sibirubiru tersebut.
1.4. Hipotesis
a. Terdapat beberapa isolat bakteri termofil yang memiliki karakter berbeda
serta mampu menghasilkan enzim amilase.
b. Terdapat perbedaan potensi aktifitas enzim amilase kasar yang dihasilkan
bakteri termofil isolat Penen tersebut.
1.5. Manfaat Penelitian
a. Untuk mendapatkan isolat bakteri termofil penghasil enzim amilase yang
hidup di sumber air panas Penen Sibirubiru dan data karakternya.
b. Untuk mengetahui berapa besar potensi aktivitas enzim amilase kasar yang
dihasilkan oleh isolat bakteri termofil Penen tersebut.
c. Sebagai sumber informasi untuk penelitian lebih lanjut terhadap usaha
ekplorasi enzim amilase termofil.
1.6. Pembatasan Masalah
Berdasarkan masalah yang telah dirumuskan penelitian ini dibatasi pada
isolasi bakteri dan karakterisasi yang dilakukan pada tingkat pengamatan
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
makroskopis, mikroskopis dan sifat biokimia dari isolat–isolat bakteri yang
diperoleh serta pengujian aktivitas enzim amilase kasar lewat pengaruh variasi
suhu inkubasi dan pH substrat yang berbeda.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Amilum
Amilum adalah polimer karbohidrat dengan rumus molekul (C6H10O5)n.
Karbohidrat golongan polisakarida ini banyak terdapat di alam, terutama pada
sebagian besar tumbuhan. Amilum dalam bahasa sehari-hari disebut juga pati
terdapat pada umbi, daun, batang dan biji-bijian. Amilum merupakan kelompok
terbesar karbohidrat cadangan yang dimiliki oleh tumbuhan sesudah selulosa (Liu,
2005). Butir-butir pati apabila diamati dengan mikroskop ternyata berbeda-beda
bentuknya dan ukurannya tergantung dari tumbuhan apa pati tersebut diperoleh
(Poedjiadi, 1994).
Amilum disusun oleh dua kelompok polisakarida yaitu amilosa (Gambar
1.), kira kira 20–28% dan amilopektin sebagai sisanya (Poedjiadi, 1994). Baik
amilosa maupun amilopektin memiliki monomer yang sama yaitu molekul
glukopiranosa. Amilosa terdiri dari 100-10000 unit -D-glukopiranosa per
molekulnya, yang tiap unitnya berikatan lewat ikatan α-1,4 glikosida (Liu, 2005).
Tiap rantai polimer molekulnya memiliki satu ujung gula tereduksi dan satu
ujungnya lagi gula non reduksi sehingga molekul amilosa merupakan rantai
terbuka (Poedjiadi, 1994).
Amilosa merupakan bagian terdepan dari rantai amilum, bersifat larut
dalam air yang dipanaskan dan dapat membentuk endapan dalam air, yang
sifatnya tidak dapat balik (Aiyer, 2005). Amilopektin merupakan rantai molekul
polisakarida yang memiliki banyak percabangan. Molekul D-glukopiranosa yang
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
menjadi unit monomernya yang berikatan lewat ikatan α-1,4 glikosida seperti
pada amilosa yang membentuk rantai lurus dan ikatan α-1,6 glikosida yang
membentuk percabangan pada rantai amilopektin tersebut (Murray et al., 2003).
Molekul amilopektin lebih besar dari molekul amilosa dengan berat moleklunya
berkisar antara 106–109 g permolnya (Liu, 2005). Molekul amilosa merupakan
molekul yang larut dalam air dan memberikan warna biru apabila tercampur
dengan larutan iodin, sedang amilopektin merupakan molekul yang tidak larut
dalam air dan akan kelihatan berwarna merah bila terkena iodin (Sale, 1961).
Butir-butir pati tidak larut dalam air dingin, tetapi apabila suspensi dalam
air dipanaskan terbentuk suatu larutan koloid yang kental. Bila pati dipanaskan
dan didilusi dengan asam, pati akan terhidrolisis menjadi dekstrin, maltosa dan D-
glukosa (Sale, 1961). Semua hasil hidrolisis ini memiliki sifat yang larut dalam
air. Hidrolisis dari pati juga dapat terjadi dengan bantuan enzim amilase yang akan
mengubah amilum menjadi maltosa dalam bentuk β-maltosa (Poedjiadi, 1994 ).
Gambar 1. Struktur kimia dari (a) Amilosa, (b) Amilopektin (Murray et al., 2003)
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Dalam kehidupan manusia amilum berperan sebagai sumber makanan
penghasil energi utama dari golongan karbohidrat, disamping itu amilum juga
dapat berperan sebagai bahan aditif pada proses pengolahan makanan, misalnya
sebagai penstabil dalam proses pembuatan puding. Amilum juga berperan dalam
pembuatan sirup dan pemanis buatan seperti sakarin. Dalam bidang non makanan,
amilum digunakan untuk bahan baku dalam proses pembuatan kertas, pakaian dari
katun, industri cat, maupun untuk produksi hidrogen. Tabel 1. di bawah ini
menunjukkan peran amilum di berbagai bidang.
Tabel 1. Penggunaan amilum di bidang industri (Liu, 2005)
Jenis Industri Penggunaan Amilum/ Amilum Termodifikasi
Makanan Pengental, pelapis makanan, film makanan Bahan perekat Pembuat lem Kertas dan papan Kertas penjilid, pembungkus,pengepak Textil Dalam proses sizing, finishing dan printing Farmasi Kapsul obat, bahan pelarut obat Pengeboran minyak Modifikasi pengental Detergen Surfaktan, bahan pensuspensi, bahan pemutih, aktivator pemutih Kimia pertanian Pemungkus biji, pembungkus pestisida,benang pintal Plastik Pembungkus makanan, filler Kosmetik Bedak dan talk Purifikasi Flokulan Bidang Medis Scaffold, plasma eksterder, produk absorben untuk sanitasi
2.2. Enzim
Enzim merupakan protein khusus yang dapat bergabung dengan suatu
substrat spesifik untuk mengkatalisasi reaksi biokimia dari substrat tersebut
(Maier et al., 2000). Dalam reaksi tersebut enzim mengubah senyawa yang
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
disebut substrat menjadi bentuk suatu senyawa baru yang disebut produk. Enzim
memiliki substrat spesifik dan reaksi kimia yang spesifik untuk dikatalisnya
(Palmer, 1985). Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu, pH dari lingkungan
tempat enzim bekerja, konsentrasi substrat, aktivator dan inhibitor enzim.
Suhu bepengaruh besar terhadap aktivitas enzim. Semua enzim bekerja
dalam rentang suhu tertentu pada tiap jenis organisma. Peningkatan suhu eksternal
secara umum akan meningkatkan kecepatan reaksi kimia enzim, tetapi kenaikan
suhu yang terlalu tinggi akan menyebabkan terjadinya denaturasi enzim yaitu
kerusakan struktur protein enzim, terutama kerusakan pada ikatan ion dan ikatan
hidrogennya. Hal ini menyebabkan terjadinya penurunan kecepatan reaksi yang
dikatalis oleh enzim tersebut. Denaturasi enzim di atas suhu optimum akan
menyebabkan terjadinya kematian pada sel organisma, tetapi beberapa organisma
mampu bertahan hidup dan tetap aktif pada suhu yang sangat tinggi, dimana
organisma lain sudah tidak mampu lagi hidup seperti bakteri dan alga yang
ditemukan pada sumber-sumber air panas di taman Nasional Yellow Stone
Amerika, suhu optimum untuk hidupnya sebesar 70oC (Brock & Brock, 1978).
Selain suhu aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH lingkungan tempat enzim
tersebut bekerja. Banyak enzim yang sensitif terhadap perubahan pH dan setiap
enzim memiliki pH optimum untuk aktivitasnya. Perubahan pH dapat
menyebabkan berhentinya aktivitas enzim akibat proses denaturasi pada struktur
tiga dimensi enzim (Palmer, 1985). Umumnya enzim bekerja optimum pada
rentang pH 6-8, tetapi beberapa jenis organisma dapat hidup pada pH yang lebih
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
rendah yang dikenal dengan istilah asidofil ataupun pada pH yang lebih tinggi
yang dikenal dengan istilah alkalifil.
Aktivitas enzim di lingkungan juga terjadi pada berbagai sumber
mikroorganisma seperti bakteri, jamur dan aktinomisetes. Mikroorganisma ini
menghasilkan enzim intraseluler dan enzim ekstraseluler. Enzim intraseluler
merupakan enzim yang langsung digunakan di dalam sel, dan sering ditemukan
pada bagian membran dari sebuah organel sel. Enzim ekstraseluler merupakan
enzim yang dilepas dari sel ke lingkungan untuk menghidrolisis molekul polimer
di lingkungan, seperti selulosa, hemiselulosa, lignin, ataupun juga untuk
memfasilitasi pengambilan suatu zat dari lingkungan bagi kebutuhan
metabolismanya (Maier et al., 2000). Enzim ekstraseluler dapat dipisahkan dari
lingkungan dengan filtrasi ataupun sentrifugasi (Palmer, 1985), sedangkan enzim
intraseluler dapat diekstrak dari dalam sel lewat proses pemecahan sel.
2.3. Enzim Amilase
Amilase adalah kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk
memutuskan ikatan glikosida yang terdapat pada molekul amilum. Hasil hidrolisis
atau pemecahan molekul amilum ini adalah molekul-molekul yang lebih kecil
seperti maltosa, dekstrin dan terutama molekul glukosa sebagai unit terkecil
(Reddy et al., 2003). Amilase dihasilkan oleh berbagai jenis organisma hidup,
mulai dari tumbuhan, hewan, manusia bahkan pada mikroorganisma seperti
bakteri dan fungi. Kelompok enzim ini memiliki banyak variasi dalam
aktivitasnya, sangat spesifik, tergantung pada sumber organismanya dan
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
tempatnya bekerja. Enzim amilase memiliki nama asli diastase dan pertama kali
ditemukan dan diisolasi oleh Anselme Payen pada tahun 1833. Seiring dengan
penemuan-penemuan baru di bidang penelitian kelompok enzim amilase yang
dapat mendegradasi amilum dan senyawa polisakarida lainnya juga semakin
bertambah jumlahnya. Menurut Aiyer (2005), Hagihara et al. (2001) beberapa
kelompok enzim amilase tersebut adalah:
a. Alpha amilase (α –amilase), EC.3.2.1.1
Disebut juga dengan 1,4–α-D-glukan glukanohidrolase atau glukogenase. Enzim
ini bekerja memutus ikatan α-1,4 glikosida pada amilum secara acak terutama
pada rantai yang panjang (Gambar 2.) sehingga menghasilkan maltotriosa dan
maltosa dari polimer amilosa pada amilum (Gambar 3.), dan menghasilkan
glukosa dan sedikit dekstrin dari polimer amilopektin penyusun amilum. Karena
sifatnya yang dapat memutus ikatan glikosida secara acak, enzim ini bekerja lebih
cepat dibanding amilase lainnya terutama β-amilase. Pada kelompok hewan α–
amilase merupakan enzim pencerna amilum yang utama. Enzim α–amilase
merupakan kelompok metaloenzim yang tidak dapat bekerja sama sekali bila ion
calsium tidak ada (Palmer, 1985). α–Amilase merupakan jenis enzim yang
bersifat calcium metalloenzyme dependent.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Gambar 2. Jenis reaksi hidrolisis yang dikatalis Oleh enzim amilase (Nickerson & Brown, 1965)
b. Beta amilase (β-amilase) , EC.3.2.1.2
Disebut juga 1,4–α-D-glukan maltohidrolase ataupun sakarogen amilase. Enzim
ini dijumpai pada kelompok tumbuhan, bakteri dan fungi. Enzim ini bekerja
menghidrolisis amilum dari bagian ujung non reduksi dan menghidrolisis ikatan α-
1,4 glikosida pada tahap kedua hidrolisis amilum sehingga terbentuk molekul
maltosa yang disusun oleh dua unit glukosa pada saat yang sama setelah -
amilase bekerja. Selama proses pematangan buah β-amilase bekerja memecah
amilum menjadi gula sehingga buah yang matang terasa manis. Jaringan hewan
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
tidak menghasilkan enzim β-amilase, kecuali bila ada mikroorganisma yang
bersimbiosis di saluran pencernaannya. Produk akhir dari hasil hidrolisa enzim -
amilase dan β-amilase ini dapat di β-amilase lihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Konversi amilum menjadi glukosa oleh enzim α dan β-Amilase (Alexander, 1977) c. Gamma amilase (γ –amilase), EC.3.2.1.3
Disebut juga glucan 1,4-α–glukosidase, amiloglukosidase, ekso-1,4-α–
glukosidase, lisosomal α-glukosidase, glukoamilase, 1,4-α-D-glukan
glukohidrolase. Merupakan pemutus terakhir ikatan glikosida pada bagi ujung non
reduksi dari amilosa dan amilopektin untuk menghasilkan unit glukosa.
d. Pullulanase, EC.3.2.1.41
Merupakan enzim pemutus cabang, menghidrolisis hanya pada ikatan α-1,6
glikosida, seperti pullulan 6-glukanohydrolase.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
e. α-Glukosidase,EC.3.2.1.20
Memutus ikatan α-1,4 glikosida dari molekul amilosa ataupun amilopektin
menjadi rantai-rantai pendek oligosakarida.
f. Enzim Penghasil Siklodekstrin
Enzim yang dapat menghidrolisis amilum menjadi jenis siklik D-glukosil non
reduksi yaitu suatu jenis polimer yang disebut siklodekstrin atau sakhardinger
dekstrin. Jenis ini dijumpai misalnya pada amilase yang dihasilkan oleh Bacillus
macerans.
Berdasarkan arahnya memutus ikatan glikosida dari amilum, maka enzim
amilase dapat dikategorikan menjadi 2 kelompok (Reddy et al., 2003) yaitu
endoamilase dan ektoamilase. Endoamilase melakukan hidrolisis secara acak
dari bagian depan molekul amilum sehingga menghasilkan molekul
oligosakarida dalam bentuk rantai lurus maupun bercabang dengan panjang rantai
yang bervariasi sedangkan ektoamilase melakukan hidrolisis dari ujung non
reduksi dan dengan produk akhir molekul yang pendek.
Enzim amilase secara konstitusi merupakan kelompok enzim yang sangat
dibutuhkan dalam bidang industri, dengan pangsa pasar mencapai hampir 25%
dari pasaran enzim di dunia (de Carvalho et al., 2008). Penggunaan enzim amilase
dalam industri sangat luas mulai dari industri pembuatan roti, sirup, pemanis,
campuran oligosakarida, dekstrin, industri textil, pembuatan ethanol, pengujian
limbah cair yang mengandung amilum, industri detergen, industri obat dan
suplemen enzim (Palmer, 1985). Karena enzim ini sangat bernilai komersil maka
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
perlu ditemukan banyak sumber-sumber penghasil enzim amilase dengan
karakteristik yang sesuai dengan yang dibutuhkan.
2.4. Bakteri Termofil
Suhu merupakan salah satu faktor penting di lingkungan yang mengontrol
aktivitas dan evolusi dari organisma hidup (Brock, 1978). Tidak semua tingkatan
suhu cocok bagi pertumbuhan dan reproduksi dari organisma. Dengan demikian
tinggi rendahnya suhu lingkungan sangat penting bagi organisma. Secara Umum
ada 4 kelompok pembagian mikroorganisma berdasarkan suhu lingkungan
tempatnya hidup yaitu mikroorganisma psikrofil, mesofil, termofil dan
hipertermofil, sebagaimana yang di gambarkan oleh Thiel (Gambar 4.)
Thermal vents > 100oC 100oC 90oC Hipertermofil 80oC-100oC 80oC Mata air panas 60oC–80 oC 70oC Termofil 45oC-80oC Pasteurisasi 65oC 60oC 50oC
40oC Tubuh manusia Mesofil 20oC-50oC 37oC
30oC 20oC 10oC Refrigerator 4oC Psikrofil -10oC-25 oC 0oC -10o C Freezer -20oC Gambar 4. Rentang suhu lingkungan yang menggambarkan keberadaan tempat hidup mikroorganisma (Thiel, 1999)
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Ada empat peristiwa yang menjadi penyebab lingkungan bersuhu
tinggi yaitu sinar matahari, pembakaran, letusan gunung api, peluruhan
radioaktif dan aktifitas geotermal di perut bumi (Brock, 1978). Dengan
ditemukannya mikroorganisma yang memiliki kemampuan untuk hidup pada
suhu yang relatif tinggi (60oC atau lebih) konsep tentang daya tahan dan
kestabilan protoplasma sel untuk bertahan pada batas limit suhu 42oC – 45oC
perlu dipikirkan kembali. Istilah termofil pertama kali dipergunakan oleh Miquel
pada tahun 1879, untuk menggambarkan organisma yang dapat berkembang pada lingkungan dengan suhu tinggi pada saat mana bagi organisma lain sudah
tidak dapat hidup (Morrison & Tanner, 1921).
Menurut klasifikasi fisiologis yang dibuat Gilter dijelaskan organisma termofil memiliki suhu minimum untuk hidupnya sebesar 45oC,
optimum 55oC dan maksimum 70oC. Muir dan Rikhie mendefinisikan bakteri
termofil merupakan organisma yang tumbuh sangat baik pada suhu 60oC– 70oC ,
sedangkan Hiss dan Zinsser menyatakan bakteri termofilik merupakan bakteri
yang didapatkan dari sumber air panas ataupun lapisan bagian paling atas dari
permukaan tanah (Morrison & Tanner, 1921). Bakteri termofil juga merupakan
kelompok mikroorganisma yang dapat ditemukan di lingkungan yang sangat
bervariasi kondisinya serta tetap eksis pada suhu tinggi dengan sifat obligat,
fakultatif maupun termotoleran (Singleton & Amelunxen, 1973). Spesies
termofil paling banyak ditemukan pada kelompok bakteri dan dapat tetap hidup
pada keadaan aerob, anaerob fakultatif dan anaerob.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Kelompok bakteri termofil tergolong dalam kelompok Archaebacteria yang
secara umum struktur selnya memiliki beberapa kelebihan dibanding kelompok
bakteri lainnya. Kelompok ini umumnya memiliki daya adaptasi yang sangat
tinggi terhadap kondisi lingkungan yang bersifat ekstrim seperti temperatur, kadar
garam, pH, tekanan dan oksigen dimana mikroorganisma lain tidak dapat
mempertahankan aktifitas hidupnya (de Rosa et al., 1986).
Kemampuan hidup dari mikroorganisma termofil ini berhubungan dengan
struktur selnya yang memiliki kelebihan dalam beberapa hal, yaitu :
a. Struktur membran sel
Membran sel setiap mahluk hidup tersusun atas senyawa lipid dan protein
yang disebut lipoprotein. Pada umumnya bagian lipid dari membran sel mahluk
hidup dihubungkan oleh ikatan ester, sedangkan pada organisma termofil senyawa
lipid membran selnya mengandung ikatan eter yang terbentuk lewat proses
kondensasi dari gliserol atau senyawa poliol kompleks lainnya dengan alkohol
isoprenoid yang mengandung 20, 25 atau 40 atom karbon (de Rossa et al., 1986).
Lebih jauh lagi senyawa eter gliserol pada Archaebacteria ini mengandung 2,3 О-
sn-gliserol yang menyebabkan struktur lipoprotein dari membran sel termofil
tersebut lebih stabil.
b. Struktur Protein
Chaperonin merupakan suatu jenis protein yang merupakan jenis protein
yang tidak umum dijumpai pada protein-protein fungsional lainnya di dalam sel.
Protein ini berperan dalam mempertahankan kembali struktur tiga dimensi dari
protein fungsional sel dari denaturasi suhu lingkungan yang bersifat ekstrim.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Protein ini memiliki struktur yang tetap stabil, tahan terhadap denaturasi dan
proteolisis (Kumar & Nussinov, 2001). Protein ini dapat membantu organisma
termofil mengembalikan fungsi aktifitas enzimnya bila terdenaturasi oleh suhu
yang tinggi (Everli & Alberto, 2000). Chaperonin tersusun oleh molekul yang
disebut chaperone, yang membentuk struktur chaperonin seperti tumpukan kue
donot pada sebuah drum. Tiap cincin donat ini terdiri atas 7, 8 atau 9 subunit
chaperone tergantung jenis organismanya. Dalam aktivitasnya mempertahankan
struktur protein fungsional agar tetap stabil, chaperonin membutuhkan molekul
ATP.
c. Struktur DNA Gyrase
DNA gyrase merupakan salah satu anggota kelompok enzim
topoisomerase yang berperan dalam mengontrol topologi DNA suatu sel dan
memegang peran penting dalam proses replikasi dan transkripsi DNA. Semua
jenis topoisomerase dapat merelaksasikan DNA tetapi hanya DNA gyrase yang
dapat mempertahankan struktur DNA tetap berbentuk supercoil ( Maxwell, 1999).
DNA gyrase disusun oleh 90-150 pasangan basa-N DNA. DNA gyrase ini juga
selalu dijumpai pada organisma yang hidup di lingkungan di atas 70oC dan juga
dapat dijumpai pada organisma yang hidup pada suhu sekitar 60oC. DNA ini
merupakan salah satu kelengkapan sel dari organisma termofil (D’ Amaro et al.,
2007).
2.5. Amilase dari Mikroorganisma
Enzim yang digunakan untuk keperluan industri sebagian besar diisolasi
dari mikroba. Pemilihan mikroba sebagai sumber enzim mempunyai beberapa
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
keuntungan bila dibandingkan dengan enzim yang diisolasi dari tumbuhan
maupun hewan. Keuntungan itu antara lain sel mikroba lebih mudah untuk
ditumbuhkan dan kecepatan pertumbuhannya relatif lebih cepat, skala produksi
sel lebih mudah ditingkatkan apabila dikehendaki produksi yang lebih besar,
biaya produksinya relatif lebih murah, kondisi selama produksi tidak tergantung
oleh adanya perubahan musim dan waktu yang dibutuhkan dalam proses produksi
lebih singkat (Poernomo, 2003).
Amilase secara umum diproduksi oleh tumbuhan, hewan, manusia dan
mikroba, tetapi enzim amilase yang berasal dari fungi dan bakteri mendominasi
penggunaan enzim amilase di bidang industri. Beberapa dari jenis Bacillus sp. dan
Actinomycetes, termasuk Termomonospora dan Thermoactinomycetes merupakan
kelompok yang memiliki kemampuan besar dalam meproduksi enzim amilase,
Bacillus licheniformis memiliki kemampuan untuk menghasilkan enzim amilase
dalam kondisi lingkungan yang bersifat alkalis (Reddy et al., 2003)
Enzim amilase yang dihasilkan oleh mikroba terutama dari bakteri,
merupakan jenis enzim ekstraseluler (Palmer, 1985). Bakteri menghasilkan enzim
ini di dalam sel dan menggunakannya di luar sel, yaitu untuk menghidrolisis
sumber makanan yang mengandung amilum yang terdapat di lingkungannya.
Molekul amilum tidak dapat masuk ke dalam sel bakteri karena ukurannya sangat
besar, karena itu molekul amilum dihidrolisis terlebih dahulu oleh enzim amilase
ekstraselular menjadi molekul karbohidrat yang lebih sederhana dan kecil ukuran
molekulnya. Molekul hasil hidrolisis amilum oleh enzim amilase tersebut
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
selanjutnya akan ditransport masuk ke dalam sel bakteri dan digunakan sebagai
sumber karbon bagi aktivitas pertumbuhan dan kehidupannya (Benson, 1994).
Enzim amilase ekstraseluler yang dihasilkan bakteri maupun fungi tersebut
dimanfaatkan sebagai katalisator dalam industri maupun untuk keperluaan dalam
bidang kesehatan (Tabel 2.). Untuk mendapatkan enzim amilase dari mikroba
tersebut maka kultur mikroba yang memproduksi enzim amilase ekstraseluler
tersebut disentrifugasi untuk mendapatkan supernatan yang mengandung enzim
amilase ekstraselular (Palmer, 1985).
Tabel 2. Enzim amilase dari mikroorganisma dan aplikasinya pada bidang industri (Brock & Brock, 1978) Enzim
Sumber
Aplikasi
Industri
Fungi Pembuatan roti Roti Bakteri Pembungkus kertas Kertas Fungi Pabrik sirup dan glucosa Makanan Bakteri Binatu Amilum Fungi Obat pencernaan Farmasi
Amilase
Bakteri Pembersih pakaian Tekstil
2.6. Amilase dari mikroba termofil
Enzim hidrolitik yang dihasilkan oleh mikroorganisma termofil
merupakan salah satu kelompok yang menarik perhatian untuk dipelajari
(Cordeiro et al., 2002). Enzim dari mikroorganisma termofil ini memiliki nilai
komersial yang cukup tinggi dalam bidang industri karena memiliki daya
termostabilitas yang tinggi, stabil terhadap zat-zat yang bersifat dapat
mendenaturasi enzim seperti detergen dan senyawa organik lainnya, stabil dalam
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
kondisi lingkungan yang asam maupun alkalis, sangat cocok untuk proses
fermentasi di bidang industri (www.osmania.ac.in). Kelebihan-kelebihan ini
menjadikan enzim yang berasal dari mikroorganisma termofil semakin
berkembang penggunaannya dalam bidang industri dan bioteknologi.
Konsep tentang termostabilitas yang dimiliki oleh enzim yang berasal dari
mikroorganisma termofil ini dilandaskan pada dua konsep yaitu pertama struktur
molekular pada selnya yang memang tersusun oleh molekul protein yang
termostabil, kedua termostabilitas itu berkaitan dengan adanya asosiasi senyawa
protein enzim dengan molekul lainnya seperti lipid, polisakarida maupun protein
lainnya yang menyebabkan terbentuknya suatu senyawa yang memiliki
mekanisma yang memungkinkannya tetap stabil saat menghadapi kondisi yang
dapat menginaktivasinya (Hibino et al., 1974).
Hampir 70% sektor industri yang menggunakan enzim dalam prosesnya
memanfaatkan enzim yang berasal dari mikroorganisma termofil. Industri
detergen misalnya menggunakan protease yang bersifat tahan suasana alkalis,
industri amilum menggunakan enzim amilase, amiloglukosidase dan
glukoisomerase yang berasal dari mikroorganisma termofil.
Amilase termostabil digunakan dalam skala yang cukup luas pada proses
industri. Enzim amilase yang digunakan tersebut berkisar pada -amilase, ß-
amilase, glukoamilase, pullulanase dan jenis lainnya (Illanes, 1999). Diantara
semua jenis enzim amilase, -amilase dari mikroorganisma termofil ini memiliki
nilai aplikasi komersil yang paling tinggi dalam bidang industri makanan,
minuman, pembuatan sirup yang mengandung glukosa, maltosa maupun
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
oligosakarida. -Amilase pertama sekali diisolasi dari isolat Bacillus
amyloliquefaciens dan digunakan dalam bidang industri selama bertahun-tahun
(Cordeiro et al., 2002), tetapi penemuan enzim amilase termostabil dari isolat
Bacillus licheniformis ternyata menunjukkan adanya termostabilitas yang lebih
tinggi sekitar 10-20oC dibandingkan dari amilase termostabil pada B.
amyloliquefaciens (Rath & Subramanyam, 1998). Selanjutnya enzim–enzim
amilase termostabil juga berhasil didapatkan dari mikroorganisma seperti B.
subtilis, B. stearothermophilus, B. calcalovelox, B. alcalophilus, Thermus sp.,
Clostridium acetobutylicum, Pyrococcus furiosus, Sulfolobus acidocaldarius, dan
lainnya. Selain yang dihasilkan oleh bakteri ternyata beberapa kelompok fungi
seperti Aspergillus oryzae, A. niger dan Saccharomyces castelli juga
menghasilkan amilase termostabil, demikian juga halnya dengan kelompok
Aktinomisetes seperti Thermomyces vulgaris, Streptomyces thermoviolaceaus
memproduksi amilase yang bersifat termostabil (Rath & Subramanyam, 1998).
Akhir-akhir ini penelitian terhadap mikroorganisma termofil penghasil
enzim amilase termostabil telah diarahkan bukan hanya yang bersifat temofil saja
tetapi juga hipertermofil (mampu hidup di atas suhu 80oC) seperti amilase yang
didapatkan pada Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei yang memiliki aktifitas
katalitik sampai 130oC (Carolina, 1999). Pada umumnya mikroba-mikroba
termofil tersebut dijumpai di sumber-sumber air panas, daerah aktifitas gunung
berapi, maupun di dasar laut yang memiliki sumber mata air panas.
Adapun faktor-faktor yang dianggap berhubungan dengan termostabilitas
enzim-enzim dari mikroorganisma termofil bervariasi pada berbagai spesies
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
termofil, namun beberapa hal umum yang ditemukan antara lain terjadinya
peningkatan ikatan hidrogen dan salt bridge pada protein dari enzim termofik.
Selain itu ditemukan juga adanya perbedaan jenis dan komposisi asam amino
penyusun protein enzim termofil bila dibandingkan dengan protein enzim yang
mesofilik. Pada enzim temofilik terjadi penurunan jumlah sistein dan serin secara
nyata, sedangkan jumlah arginin dan tirosin meningkat secara nyata. Asam amino
prolin juga lebih sedikit ditemukan pada struktur -heliks pada protein termofilik
(Kumar et al., 20000).
2.7. Sumber Air Panas Penen Sibirubiru
Manifestasi panas bumi di permukaan adalah sebagai indikasi adanya
aktifitas panas bumi di bawah permukaan tersebut. Bentuk manifestasi aktifitas
panas bumi di dalam perut bumi itu dapat berupa munculnya mata air panas,
munculnya bualan gas ke permukaan tanah, fumarola, solfatara dan tanah panas.
Mata air panas yang muncul ke permukaan ini dapat mengandung klorida,
bikarbonat ataupun sulfat.
Sumber air panas meskipun memiliki suhu cukup tinggi ternyata dapat
dijadikan untuk lingkungan tempat kehidupan bagi beberapa mikroorganisma
yang tahan terhadap suhu air yang panas tersebut, seperti bakteri, fungi maupun
alga yang bersifat termofil. Sumber air panas selain memiliki air yang suhunya
cukup tinggi juga memiliki suatu aroma khas yaitu berupa aroma hidrogen
peroksida (H2S) yang berasal dari aktifitas bakteri anaerob yang menggunakan
senyawa-senyawa sulfur.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Sumber mata air panas Penen Sibirubiru terletak di desa Penen Kecamatan
Sibirubiru Kabupaten Deli Serdang Propinsi Sumatera Utara. Tepatnya berada di
posisi geografis 03o 18’ 02,7” LU dan 98o 38’ 53,3” BT. Memiliki suhu air sekitar
47oC sampai 57o C, dengan pH air berkisar netral 6,8.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan dari bulan Februari 2008 sampai Juli 2008
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.
3.2. Bahan dan Alat
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah media agar
untuk seleksi bakteri termofil, media agar untuk seleksi bakteri amilolitik, kristal
violet, aquadest, gram iodin, alkohol, safranin, malachit green, reagen DNS, sitrat
buffer phosphat, glukosa monohidrat, NaOH, larutan iodin, media untuk produksi
enzim amilase. Alat yang digunakan adalah botol sampel steril, termometer, pH
meter (Hanna Instrument), timbangan analitik, hoki stik, shakerwaterbath (Julabo
Sw22), vortex, waterbath (Griffin), bunsen, pipet serologi, propipet, mikropipet
(Gilson), jarum ose, tabung uji, sentrifuge, petridish, erlenmeyer, tabung reaksi,
otoklaf (Yamato), inkubator (Fisher), oven (Gallenkamp), gelas benda, mikroskop
lanjutan, kamera foto digital, spektofotometer.
3.3. Sampel Percobaan
Sampel percobaan dalam hal ini adalah isolat-isolat bakteri termofil
penghasil enzim amilase, yang didapat dari kolam sumber air panas yang ada di
sumber mata air panas Penen Sibirubiru.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
3.4. Pengambilan Sampel Air Panas
Sampel air panas diambil dari sumber mata air panas, masing-masing pada
3 tempat yang berbeda. Sebelum sampel air diambil terlebih dahulu dilakukan
pengukuran parameter fisika dan kimia di lapangan kerja. Parameter yang diukur
pertama adalah suhu air di tiap titik pengambilan dengan menggunakan
termometer yang dicelupkan selama 3 menit ke dalam tiap bagian tempat
pengambilan sampel dan di catat suhunya. Parameter kedua adalah pH air di tiap
titik pengambilan diukur dengan pH meter yang dicelupkan ke permukaan air lalu
angka pH yang tertera dicatat. Sampel air diambil dari bagian kolam dengan
kedalaman 50 cm dari permukaan air. Sampel air diambil sebanyak 200 ml dari
tiap tempat dan dimasukkan ke dalam botol steril dan diberi label. Selanjutnya
sampel air di bawa ke Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas
MIPA Universitas Sumatera Utara, untuk dilakukan isolasi.
3.5. Isolasi Bakteri dan Pemurnian Bakteri
Media yang digunakan untuk mengisolasi bakteri termofil adalah Luria
agar (ekstrak yeast 5 g, tripton 5 g, NaCl 5 g, tepung agar 5 g dalam 1 liter
aquadest) disterilkan, dituang pada petri steril. Setelah media padat sebanyak 0,1
ml sampel air panas disebar dengan hoki stik pada permukaan agar, diinkubasi
selama 48 jam pada suhu 65oC. Tiap sampel air panas dibuat ulangannya 2 kali.
Untuk pemurnian bakteri, tiap koloni bakteri yang tumbuh berbeda pada
kultur sebelumnya diambil satu ose dan digores ke tiap cawan petri lain yang
mengandung media agar selektif amilolitik (Yeast ekstrak 0,2 %, pepton 0,5 %,
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
NaCl 0,05 %, MgSO4 0,05%, CaCl2 0,015%, tepung agar 2 % dan soluble pati
1%), diinkubasi selama 24 jam pada suhu 65oC. Hal ini dilakukan untuk
mendapatkan biakan tunggal tiap jenis bakteri termofil penghasil amilase yang
hidup pada sumber air panas Penen. Setiap isolat murni yang dapat tumbuh
diasumsikan dapat menggunakan media yang mengandung pati tersebut. Untuk
memastikannya dilakukan uji iodin dengan cara meneteskan iodin pada
permukaan agar yang berisi isolat, bila terdapat zona bening pada media
mengindikasikan enzim amilase diproduksi oleh isolat sehingga di daerah tersebut
amilum sudah dihidrolisis (Cappucino, 1983), sedangkan media yang berwarna
biru kehitaman menandakan pati di tempat itu belum terhidrolisis. Sebelum
pengujian tiap isolat disiapkan dulu stok kulturnya pada media miring. Hal ini
perlu dilakukan karena uji iodin membuat isolat bakteri mati karena larutan iodin
bersifat desinfektan (Pelczar & Chan, 1988).
3.6. Pembuatan Stok Kultur
Stok kultur disiapkan dengan cara menggores satu ose dari tiap isolat
bakteri yang tumbuh di kultur pemurnian sebelumnya, dalam bentuk media miring
dengan komposisi media sama seperti media pemurnian isolat. Kultur diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 65oC, selanjutnya disimpan di kulkas untuk stok isolat.
Stok kultur ini diremajakan sekali dalam 3 minggu.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
3.7. Uji Diameter Zona Bening Hasil Hidrolisis Pati
Isolat bakteri disuspensikan dalam larutan NaCl fisiologis sampai
kekeruhannya sama dengan kekeruhan Larutan Mac Farland 0,5 standart yang
setara dengan 108 CFU. Dari tiap suspensi bakteri diambil 5 µl suspensi dengan
menggunakan mikropipet, lalu diteteskan dengan tepat pada bagian tengah cawan
petri yang sudah berisi media agar pati yang disterilkan. Kultur diinkubasi selama
72 jam pada suhu 65oC. Tiap isolat bakteri yang tumbuh pada media pati tersebut
ditetesi dengan larutan iodin untuk melihat kemampuan daya amilolitiknya. Isolat
yang menghasilkan enzim amilase menghasilkan zona bening pada agar di sekitar
koloninya jika ditetesi dengan larutan iodin. Lebar zona bening yang terbentuk
diukur dengan menggunakan jangka sorong (Hartuti, 2006). Tiga isolat terbesar
zona beningnnya selanjutnya digunakan dalam penelitian ini untuk pengujian
parameter aktifitas enzim amilase kasar.
3.8. Karakterisasi Morfologi Bakteri Penghasil Enzim Amilase Termofil
Morfologi isolat bakteri penghasil amilase diamati pada kultur isolat yang
dimurnikan. Pengamatan morfologi dari tiap isolat meliputi warna koloni, bentuk
koloni dilihat dari atas, permukaan koloni dilihat dari samping dan tepi koloni
dilihat dari atas (Cappuccino, 1983).
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
3.9. Karakterisasi Bakteri Penghasil Amilase Secara Mikroskopis
Pewarnaan gram dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri,
diletakkan pada kaca objek yang ditetesi 1 tetes air, disebar, kemudian difiksasi
dengan memanaskannya di atas lampu bunsen. Pewarnaan dilakukan dengan
kristal violet dengan memiringkan gelas objek. Setelah 1 menit dibilas dengan air
perlahan, kemudian diberi gram iodin, setelah itu secepatnya diberi aseton alkohol
dan dibilas. Kemudian diteteskan larutan safranin sebagai zat warna tandingan,
dibiarkan satu menit, lalu dibilas dengan air dan dikeringkan perlahan dengan
tissue. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop, bentuk dan penataan sel-selnya
serta gramnya (Cappuccino, 1983).
Pewarnaan spora dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri,
difiksasi pada kaca objek, lalu diberikan 2-3 tetes Malachite green, lalu
dipanasuapkan selama 5 menit (sampai uap terlihat), didiamkan selama 1 menit,
bilas dengan aquadest, diteteskan safranin dan dibiarkan selama 30 detik, lalu
dikeringkan tanpa pamanasan Setelah itu diamati dengan mikroskop, spora
berwarna hijau sedangkan bagian sel lainnya berwarna merah (Cappucinno,
1983).
3.10. Uji Sifat Biokimia Bakteri Amilase Termofilik
Uji katalase dilakukan dengan mengambil 2 tetes hidrogen peroksida 3%
diletakkan pada kaca objek, satu ose isolat bakteri, diletakkan di atas cairan
hidrogen peroksida tersebut. Uji katalase positif ditandai dengan dihasilkannya
gelembung udara (Cappuccino,1983).
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Uji sitrat dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri, digores
pada permukaan media Simon Citrat Agar dan dengan ose lurus satu ose isolat
bakteri juga ditusukkan ke bagian tengah media sampai ke dasar tabung reaksi.
Media kultur tersebut diinkubasi pada suhu 65oC selama 48 jam. Uji positif bila
media berubah dari warna hijau menjadi warna biru (Cappuccino, 1983).
Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan menggores isolat bakteri
pada permukaan media miring Triple Sugar Iron agar dan juga ditusuk lurus pada
bagian tengah media. Kultur dinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC, lalu
diamati perubahan warna media. Uji positif bila terjadi perubahan warna media
TSIA dari warna teh menjadi warna oranye atau kuning (Cappuccino, 1983).
Uji gelatinase dilakukan dengan menginokulasikan isolat bakteri dengan
cara menusuk cara tegak lurus jarum ose pada bagian tengah media Gelatin, lalu
diinkubasi selama 5 hari pada suhu 65oC, setelah itu kultur media disimpan dalam
kulkas selama 15 menit. Uji gelatinase positif ditandai dengan bentuk media yang
tetap cair meskipun telah disimpan di dalam kulkas (Cappuccino, 1983).
Uji Motilitas dilakukan dengan cara menginokulasikan isolat bakteri
dengan cara menusukkan jarum ose secara tegak lurus hingga setengah tinggi
media Sulfit Indol Motility pada tabung reaksi. Tabung diinkubasi selama 48 jam
pada suhu 65oC, setelah itu diperhatikan jejak pergerakan bakteri (Cappuccino,
1983).
3.11. Pembuatan Larutan Standar Glukosa
Aktivitas enzim amilase yang akan diuji dari ketiga isolat terpilih
diplotkan ke kurva standar glukosa agar dapat diketahui berapa konsentrasi
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
glukosa yang diperoleh dari hasil hidrolisis amilum yang dikatalis enzim amilase
isolat terpilih tersebut. Untuk membuat larutan standar glukosa tersebut dibuat
larutan–larutan glukosa dengan konsentrasi mulai dari 80-260 µg/ml. Untuk tiap
konsentrasi diambil 1 ml larutan glukosa tersebut, dan ditambahkan 1,5 ml larutan
reagen DNS, divorteks, kemudian diinkubasi dididihkan selama 5 menit,
didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit, ditambah aquabidest sebanyak
20 ml, divortex, lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.
Dari tiap hasil absorbansi masing-masing larutan glukosa dengan konsentrasi
yang berbeda tersebut dibuat garis regresi yang menunjukkan hubungan linier
antara absorbansi dan kadar glukosa (Junaidi, 2008).
3.12. Produksi Enzim Amilase Dari Isolat
Satu ose kultur bakteri amilolitik dari stok kultur yang berumur 1 hari
dimasukkan ke dalam media cair steril untuk perangsang pembentukan amilase.
Media cair terbuat dari (gram per liter larutan) 6 peptone, 0,5 KCl, 0,5
MgSO4.7H2O, 1 pati. Larutan kemudian disterilisasi. Media yang mengandung
kultur bakteri diinkubasi pada suhu 65oC selama 72 jam pada shakerwaterbath
dengan kecepatan 150 rpm (Ajayi, 2007).
3.13. Ekstraksi Enzim Dari Kultur Cair Bakteri
Setelah diinkubasi selama 72 jam, kultur cair bakteri dimasukkan ke dalam
tabung centrifuge dan diputar selama 20 menit dengan kecepatan 6000 rpm.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Supernatan yang mengandung ekstrak dari enzim amilase kasar diambil dengan
mikropipet untuk di uji aktivitasnya (Palmer, 1985).
3.14. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar Dari Isolat Bakteri
Termofil
Aktivitas enzim amilase dideterminasi lewat metode DNS dengan
menggunakan pati sebagai substrat (Bernfeld, 1951; Bailey, 1988). Supernatan
dari kultur enzim amilase kasar digunakan sebagai sampel enzim. Aktivitas enzim
amilase dihitung berdasarkan data kadar glukosa relatif sebagai mg glukosa yang
dihasilkan oleh 1 ml filtrat kasar amilase. Satu Unit aktifitas enzim didefenisikan
sebagai banyaknya µmol glukosa yang dihasilkan dari hidrolisa pati oleh 1 ml
ekstrak kasar enzim amilase selama masa inkubasi. Untuk melihat besarnya satu
unit aktifitas enzim tersebut digunakan rumus:
AE = MG x 1000 .............................(Kombong, 2004)
BMg x MI di mana : AE = Aktifitas enzim ( Unit/mL filtrat enzim).
MG = Miligram glukosa yang dihasilkan dari reaksi hidrolisa pati
BMg = Berat Molekul Glukosa = 180
MI = Masa Inkubasi = 20 menit
3.15. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar
Sebanyak 1 ml ekstrak amilase kasar hasil sentrifugasi dimasukkan ke
dalam tabung uji, lalu ditambahkan 1% larutan pati yang sudah dilarutkan dalam
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
sitrat bufer fosfat pH 6,5. Larutan pati dan enzim tersebut diinkubasi pada
waterbath dengan suhu yang bervariasi mulai suhu 40oC, 50oC, 60oC, 65oC, 70oC,
80oC selama 20 menit. Untuk blanko disiapkan 2 ml ekstrak amilase kasar dalam
tabung uji dan dipanaskan hingga mendidih selama 20 menit, lalu secepatnya
dimasukkan dalam es selama 5 menit untuk menginaktivasi enzim tersebut.
Bagian ini digunakan untuk blanko. Ke dalam tabung blanko ditambahkan juga
larutan pati 1% dalam sitrat bufer fosfat pH 6,5, lalu diinkubasi pada suhu yang
bervariasi sama dengan sampel enzimnya yang aktif selama 20 menit. Untuk
menghentikan reaksi setelah 20 menit, ke dalam tiap tabung uji ditambahkan 2 ml
reagen DNS (terbuat dari 1 g 3,5,dinitrosalicyclic acid, 20 ml NaOH dan 30 g
sodium potassium tartarate dalam 100 ml larutan). Tabung uji dipanaskan hingga
mendidih selama 5 menit, didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit dan
ditambahkan air yang didestilasi sebanyak 20 ml. Tiap larutan dalam tabung uji
kemudian dideterminasi intensitas warnanya dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansinya diplotkan
dengan kurva standart glukosa yang terbuat dari larutan glukosa monohidrat
dengan konsentrasi antara 80–260 µg/ml yang telah dibuat sebelumnya (Junaidi,
2008). Tiap sampel pengujian aktifitas enzim dibuat ulangannya sebanyak tiga
kali.
3.16 Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim
Aktivitas enzim amilase dideterminasi lewat metode DNS (3,5-dinitro
salicylic acid) dengan menggunakan pati sebagai substrat (Bernfeld, 1951; Bailey,
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
1988). Filtrat dari kultur enzim amilase kasar digunakan sebagai sampel enzim.
Sebanyak 1 ml ekstrak amilase kasar hasil sentrifugasi dimasukkan ke dalam
tabung uji, lalu ditambahkan 1% larutan pati yang sudah dilarutkan dalam sitrat
bufer fosfat dengan variasi pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 dan pH 9, Lalu tiap
sampel diinkubasi pada waterbath dengan menggunkan suhu 65oC selama 20
menit, setelah itu ditambahkan masing-masing 2 ml reagen DNS, dididihkan
selama 5 menit, didinginkan pada air mengalir selama 15 menit, ditambahkan
masing-masing aquadest sebanyak 20 ml, divortex dan absorbansinya diukur
dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Untuk
blanko digunakan enzim yang sudah dinonaktifkan dengan cara dididihkan selama
20 menit lalu didinginkan dengan es selama 5 menit.. Untuk perlakuannya dibuat
sama dengan perlakuaan sampel pH yang mau diuji.
3.17. Metode Statistik dan Analisis data
Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode Rancangan Acak
Lengkap (RAL) yang bersifat eksperimen dan Non Faktorial dengan
menggunakan model persamaan :
Yij = µ + τi + εij ..................................(Yitnosumarto, 1991).
dimana : Yij = µg/ml glukosa yang dihasilkan oleh reaksi amilase + pati pada
perlakuan ke-i ulangan ke-j
µ = nilai tengah umum
τi = pengaruh perlakuan ke-i
εij = galat percobaan pada perlakuan ke-i ulangan ke-j
i = 1, 2, 3, 4,5,6 dalam hal ini adalah suhu perlakuan inkubasi yaitu
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
40, 50, 60, 65, 70 dan 80oC untuk perlakuan parameter suhu dan
pH4, 5, 6, 7, 8, 9 untuk perlakuan parameter pH substrat ( p)
j = 1,2,3 (n)
Hasil pengamatan karakterisasi makroskopis, mikroskopis dan uji biokimia
dipaparkan secara deskriptif, sedangkan hasil berupa data kuantitatif hasil uji
aktifitas enzim dianalisis varian. Bila didapatkan perbedaan nyata atau sangat
nyata dilanjutkan dengan Uji Duncan Multiple Range Test untuk melihat
perbedaan antar perlakuan yang dibuat (Yitnosumarto, 1991).
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Isolasi dan Seleksi Bakteri Amilolitik
Dari isolasi bakteri dari sampel air panas Penen didapatkan 22 isolat masing-
masing terdiri dari 5 isolat dari lokasi I (suhu 48oC, pH 6,8), 12 isolat dari lokasi II
(suhu 55oC, pH 6,8) dan 5 isolat dari lokasi III (suhu 57oC, pH 6,7). Masing-masing
isolat dimurnikan pada media agar pati 1% dan didapatkan hasil 2 isolat amilolitik
dari lokasi I, 10 isolat dari lokasi II dan 4 isolat dari lokasi III. Setiap isolat yang
dapat dimurnikan dianggap dapat menggunakan pati tetapi untuk memastikan
dilakukan uji iodin. Isolat yang mampu menghidrolisis pati menghasilkan zona
bening di sekeliling isolat setelah ditetesi iodin (Cappuccino, 1983). Sebelum
penetesan iodin dilakukan terlebih dahulu dilakukan karakterisasi morfologis dari
koloni, juga dibuat stok kultur untuk ke enam belas isolat yang tumbuh tersebut. Dari
hasil uji iodin didapatkan hasil enam belas isolat yang tumbuh itu semuanya dapat
menghidrolisis pati.
4.2. Karakterisasi Morfologis dan Uji Biokimia
Enam belas isolat bakteri yang teridentifikasi dapat menghidrolisis pati tersebut,
dikarakterisasi sifat morfologi dan biokimianya, hasil dapat dilihat pada Tabel 3 di
bawah ini:
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Tabel 3. Karakter Morfologi dan Sifat Biokimia Isolat Bakteri Termofil Amilolitik Penen Sibirubiru Karakter morfologis Uji biokimia sederhana Kode Bentuk Tepi Elevasi Warna Bentuk/ G S T S G S K isolat koloni koloni koloni koloni tataan sel r p S I e C a a o I M l A t m r A a a a t l i a n se PN1 tidak beraturan berombak datar krem pseudobasil + + + + + - + mono, strepto PN2 bulat berombak datar putih pseudobasil + + + + + + + Mono,strepto PN3 tidak beraturan berombak naik krem pseudobasil - - + + + + + mono,diplo PN4 bulat berombak datar krem pseudobasil + + + + + + + mono, diplo PN5 tidak beraturan berombak datar krem pseudobasil + + + + + - + mono, diplo PN6 tidak beraturan rata datar krem pseudobasil + + - + + - - mono, diplo PN7 tidak beraturan rata naik krem pseudobasil + + + + + + - mono, diplo
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Lanjutan Tabel 3 : PN8 bulat berombak datar krem pseudobasil - - + + + + - mono, diplo PN9 tidak beraturan berombak naik krem pseudobasil + + + + + + + mono, diplo PN10 tidak beraturan berombak datar krem pseudobasil mono, diplo - - + + + + + strepto PN11 tidak beraturan filamen datar krem pseudobasil - - + + + + + mono, strepto PN12 tidak beraturan filamen datar krem pseudobasil + + + + + + + mono, diplo PN13 tidak beraturan filamen datar krem pseudobasil + + + + + + - mono, diplo PN14 rizoid berlekuk datar Putih pseudobasil + + + + + - + Mono, diplo PN15 rizoid filamen datar krem Kokus/ + + + + + - - Mono, diplo PN16 bulat rata datar putih pseudobasil + + + + + - + Mono, diplo
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Dari hasil pewarnaan gram terlihat isolat amilolitik Penen ini 15 berbentuk
batang pendek (pseudobasil) dan satu kokus. Untuk sifat gram 12 isolat gram
positif dan 4 isolat bersifat gram negatif. Duabelas dari 16 isolat dapat
membentuk endospora, sehingga diduga sebagian besar yang berbentuk basil,
gram positif dan endospora positif dan katalase positif tersebut berasal dari genus
Bacillus. Bakteri jenis ini mampu bertahan hidup dalam bentuk sel vegetatifnya
sampai suhu 70oC, pada suhu yang lebih tinggi dari 70oC bakteri ini membentuk
endospora (Tarigan, 1988; Pelczar & Chan, 1988).
Hasil uji biokimia pada media Simon Citrat Agar menunjukkan 10 dari 16
isolat amilolitik Penen dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya.
Kemampuan menggunakan sitrat ini ini ditandai oleh berubahnya warna media
SCA dari warna hijau menjadi warna biru (Cappuccino, 1983).
Hasil uji biokimia fermentasi karbohidrat dengan media TSIA
memperlihatkan 15 dari 16 isolat menunjukkan hasil positif dapat menggunakan
media TSIA sebagai sumber karbon. Limabelas isolat tersebut memperlihatkan
hasil fermentasi pada bagian atas berwarna merah dan bagian dasar kuning
sehingga dari sumber carbon yang tersedia isolat hanya dapat memfermentasi
glukosa untuk sumber energinya. Tidak ada di antara limabelas isolat tersebut
yang memproduksi H2S karena tidak terjadi pembentukan warna hitam pada
bagian dasar media setelah fermentasi 48 jam (Cappuccino, 1983).
Hasil uji motilitas dengan media SIM memperlihatkan 16 isolat tersebut
bersifat motil. Hal ini ditandai dengan adanya jejak pergerakan bakteri sesudah
media yang diinokulasi dengan isolat diinkubasi selama 3 hari.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Hasil uji gelatinase dengan media gelatin agar memperlihatkan 16 isolat
dapat menghidrolisis gelatin. Hal ini tampak dari bentuk media gelatin yang sudah
diinokulasi dan diinkubasi selama 3 hari lalu sesudah itu disimpan di kulkas
selama 30 menit ternyata tetap cair (Cappuccino, 1983).
Hasil uji katalase memperlihatkan 11 dari 16 isolat positif menghasilkan
katalase. Hal ini ditandai dengan munculnya gelembung oksigen dari permukaan
isolat ketika ditetesi dengan H2O2 (Cappuccino, 1983).
4.3. Hasil Seleksi Isolat Untuk Pengujian Aktifitas Enzim Amilase Kasar
Hasil pengujian hidrolisis pati secara semikuantitatif yang dilakukan
terhadap 16 isolat bakteri termofil amilolitik Penen didapatkan data sebagaimana
ditunjukkan oleh Gambar 4.1 di bawah ini serta pada Lampiran 9.
0
5
10
15
20
25
30
35
zon
a be
ning
(mm
PN1 PN2 PN3 PN4 PN5 PN6 PN7 PN8 PN9 PN10PN11PN12PN13PN14PN15PN16Isolat bakteri
Gambar 5. Diameter zona bening hasil hidrolisis pati oleh enzim amilase isolat bakteri termofil
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Igarashi et al. (1998) berhasil mengisolasi bakteri termofilik penghasil
enzim amilase dengan aktifitas hidrolitik yang termasuk kriteria memiliki potensi
tinggi adalah yang zona beningnya > 26 mm, potensi sedang bila diameter zona
beningnya berkisar 14–26 mm dan potensi rendah bila diameter zona beningnya <
14 mm. Zona bening yang terbentuk di sekeliling isolat setelah ditetesi larutan
iodin menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut telah menghidrolisis pati di
bagian media pati tersebut (Cappuccino, 1983). Dengan demikian berdasarkan
kriteria potensi yang dibuat oleh Igarashi et al. (1998) dari 16 isolat bakteri
termofil amilolitik Penen tersebut 6 isolat berpotensi rendah yaitu PN10, PN13,
PN16, PN8, PN5 dan PN7. Potensi sedang dimiliki oleh 7 isolat yaitu PN2, PN12,
PN11, PN6, PN14, PN15, PN3 sedangkan yang berpotensi tinggi ada 3 isolat
yaitu PN4, PN1 dan PN9 seperti terlihat pada Gambar 6.
(A) (B) (C) Gambar 6. Tiga Isolat Terpilih Berdasarkan Diameter Zona Bening Uji Iodin. Setelah Inkubasi 72 jam: (A) Isolat PN1 (B) Isolat PN4 dan (C) Isolat PN9 Dari hasil uji hidrolisis zona bening dipilih tiga isolat terbesar zona
beningnya yaitu isolat PN9 (31,58 mm), PN1 (29,93 mm) dan PN4 (27,33 mm)
untuk diuji aktifitas enzim amilase kasarnya.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
4.4. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar
Dari hasil pengujian aktifitas enzim amilase kasar yang diperoleh dari
supernatan ketiga isolat terpilih, diperoleh data besar konsentrasi glukosa hasil
hidrolisis pati seperti pada Tabel 4 dan Lampiran 10
Tabel 4. Pengaruh suhu inkubasi terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil
Isolat Suhu konsentrasi
glukosa Aktivitas enzim Notasi (°C) (µg/ml) (Unit/ml)per menit = 0.05
PN1 40 207.63 0.058 c 50 290.63 0.081 b 60 352.83 0.098 a 65 175.38 0.049 d 70 130.56 0.036 e 80 117.38 0.033 e
PN4 40 367.24 0.102 b 50 379.36 0.105 b 60 437.22 0.121 a 65 184.99 0.051 c 70 143.83 0.040 cd 80 129.19 0.036 d
PN9 40 211.19 0.059 c 50 275.31 0.076 b 60 328.37 0.091 a 65 351.69 0.098 a 70 181.35 0.050 d 80 165.78 0.046 d
Ket: Huruf yang sama pada notasi untuk masing-masing isolat menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata pada tingkat kepercayaan 95%.
Dari Tabel 4 di atas terlihat aktivitas amilase kasar isolat PN1 dan PN4 optimal
pada suhu 60oC. Aktivitas PN1 menurun hampir 48% bila suhu inkubasi
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
dinaikkan menjadi 65oC, demikian juga aktivitas PN4 menurun hampir 43% saat
suhu inkubasi dinaikkan menjadi 65oC. Aktivitas PN9 optimal pada suhu 65oC,
aktivitas enzim ini juga menurun sekitar 48% ketika suhu dinaikkan jadi 70oC.
Kisaran suhu optimum pada aktifitas enzim kasar dari ketiga isolat tersebut
didukung hasil penelitian sebelumnya yang pernah dilakukan terhadap berbagai
jenis enzim amilase dimana suhu optimum untuk enzim amilase dari
mikroorganisma termofil berkisar antara 50oC–70°C (Madi et al., 1987; Bessler et
al., 2003; Cordeiro et al., 2002). Beberapa spesies Bacillus yang termofil juga ada
ditemukan menghasilkan enzim amilase yang memiliki aktivitas optimum pada
suhu 80°C (Vihinen & Mantsala, 1990; Viara et al., 1993; Carvalho et al., 2008).
Dari aktivitas enzim amilase kasar ketiga isolat Penen tetap optimal pada suhu
60oC-650C, berarti ketiga jenis enzim ini memiliki sifat yang termofilik. Ketiga
jenis enzim amilase kasar tersebut memiliki kemampuan untuk tetap melakukan
aktivitas kataliknya sampai suhu 80oC, walaupun aktivitas tersebut mengalami
penurunan pada suhu yang lebih tinggi dari 60oC (Gambar 7.).
050
100150200250300350400450500
40 50 60 65 70 80
Suhu inkubasi (oC)
Kon
sent
rasi
glu
kosa
( µg
/ m
l)
PN1 PN4 PN9
Gambar 7. Pengaruh suhu inkubasi terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Analisis varians pengaruh suhu inkubasi (Lampiran 10.1) menunjukkan
suhu inkubasi mempengaruhi aktivitas enzim amilase kasar isolat PN1. Uji
Duncan pada Tabel 4 memperlihatkan suhu inkubasi dinaikkan dari dari 40oC
sampai 70oC berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat PN1
tetapi peningkatan suhu inkubasi dari 70oC menjadi 80oC menunjukkan hasil
yang tidak berbeda nyata.
Suhu inkubasi juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim amilase kasar
isolat PN4 (Lampiran 10.2). Suhu inkubasi menunjukkan pengaruh yang berbeda
nyata untuk kenaikan suhu dari 40oC hingga 60oC, tetapi kenaikan suhu dari 60oC
hingga 80oC tidak menunjukkan aktivitas yang berbeda nyata. Pada amilase kasar
isolat PN4 perubahan suhu dari 65oC - 80oC juga tidak berbeda nyata seperti
ditunjukkan pada Tabel 4.
Suhu inkubasi juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim isolat PN9 ketika
dilakukan Analisa Varian seperti pada Lampiran 10.3 Uji pengaruh variasi suhu
seperti pada Tabel 4 menunjukkan jika kenaikan suhu inkubasi dari 40oC – 60oC
menunjukkan aktivitas yang berbeda nyata, tetapi kenaikan suhu dari 60oC
menjadi 65oC tidak menunjukkan hasil yang berbeda nyata. Aktivitas kembali
berbeda bila suhu dinaikkan dari 60oC menjadi 70oC, tetapi kenaikan suhu dari
70oC menjadi 80oC tidak menunjukkan perbedaan nyata.
Bila dibandingkan aktivitas amilase kasar berdasarkan variasi suhu
inkubasi enzimatik dari ke tiga isolat Penen tersebut maka dengan masa inkubasi
selama 20 menit pada suhu 60oC enzim amilase PN4 ternyata menghasilkan
glukosa terbanyak (437,22 µg/ml) dibandingkan enzim amilase PN1 (352,84
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
µg/ml) dan amilase PN9 (328,37 µg/ml), tetapi pada suhu inkubasi enzimatik
yang tertinggi digunakan dalam penelitian ini yaitu suhu 80oC enzim amilase
PN10 menghasilkan glukosa terbanyak yaitu 165,78 µg/ml, PN4 (129,19 µg/ml)
dan PN1 (117,38 µg/ml). Dengan demikian terlihat jika amilase PN9 relatif lebih
toleran terhadap suhu tinggi.
Berdasarkan hasil yang diperoleh aktivitas enzim amilase kasar dari isolat
bakteri termofil Penen lebih tinggi dibandingkan oleh aktivitas amilase kasar yang
didapatkan dari isolat bakteri termofil yang berasal dari lumpur panas Lapindo
(Junaidi, 2008) yang pada suhu inkubasi 40oC hanya berkisar antara 135 - 75
µg/ml. Aktivitas amilase kasar isolat Penen ini menunjukkan aktivitas yang lebih
tinggi dibandingkan aktivitas amilase kasar dari Thermus sp. (Fu-Shaw et al.,
1995) yang besarnya 3,5 unit/ml untuk masa inkubasi 1 jam (0,058 Unit/ml untuk
per menit ) pada suhu inkubasi 60oC ataupun yang pernah didapatkan dari amilase
kasar isolat limbah buangan pabrik ubi oleh Oboh (2005) yang besarnya 2,2
unit/ml untuk masa inkubasi 30 menit (0,07 Unit/ ml per menit).
Mikroorganisma termofil dapat menghasilkan enzim yang memiliki
aktivitas pada suhu yang tinggi melebihi enzim dari mikroorganisma mesofil
karena 3 komponen perlengkapan yang dimiliki oleh mikroorganism termofil itu
sendiri pertama berupa protein yang tetap stabil, tahan terhadap denaturasi dan
proteolisis (Kumar & Nussinov, 2001). Protein ini dikenal dengan nama
Chaperonins yang dapat membantu mikroorganisma termofil mengembalikan
fungsi aktivitas enzimnya bila terdenaturasi oleh suhu yang tinggi (Everly &
Alberto, 2000). Kelebihan kedua mikroorganisma termofil memiliki membran sel
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
yang terbuat dari struktur lipid yang resisten terhadap suhu tinggi sehingga
mampu untuk hidup di lingkungan bersuhu tinggi (Herbert & Sharp, 1992; de
Rosa et al., 1994). Komponen ketiga yang dimiliki oleh mikroorganisma termofil
adalah suatu struktur DNA yang disebut Reverse DNA Gyrase yang menghasilkan
suatu bentuk superkoil yang bermuatan positif sehingga DNA memiliki titik leleh
yang lebih tinggi dari pada titik leleh DNA pada mikroorganisma non termofil.
Selain kemampuan mikroorganismanya maka enzim termofil ini juga memiliki
perangkat genetik yang membuatnya memiliki daya katalis pada suhu tinggi.
Perangkat genetik tersebut menyangkut komposisi asam amino arginin dan tirosin
yang meningkat pada protein enzimnya, jumlah ikatan hidrogen dan salt bridge
yang meningkat pada struktur protein enzimnya dan struktur komformasi -helix
dari protein enzim (Kumar et al., 2000).
4. 5. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar Dari hasil pengujian aktivitas enzim amilase kasar yang diperoleh dari
supernatan ketiga isolat terpilih, diperoleh hasil konsentrasi glukosa hasil
hidrolisis pati seperti terlihat pada Tabel 5 dan Lampiran 10.4-10.6
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Tabel 5. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil
Isolat pH konsentrasi
glukosa Aktivitas enzim Notasi (µg/ml) (Unit/ml per menit) = 0.05
PN1 4,0 75.68 0.021 e 5,0 122.79 0.034 d 6,0 157.09 0.044 c 7,0 188.65 0.052 ab 8,0 203.28 0.056 a 9,0 172.6 0.048 bc
PN4 4,0 117.53 0.033 c 5,0 180.41 0.050 b 6,0 224.78 0.062 a 7,0 176.98 0.049 b 8,0 117.07 0.033 c 9,0 94.2 0.026 d
PN9 4,0 267.31 0.074 bc 5,0 285.6 0.079 b 6,0 350.09 0.097 a 7,0 390.11 0.108 a 8,0 239.18 0.066 c 9,0 134.91 0.037 d
Keterangan: Huruf yang sama pada notasi dari masing-masing isolat menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata pada tingkat kepercayaan 95%. Amilase dari isolat PN1 menunjukkan aktivitas optimumnya pada pH 8.
Aktifitas optimum pada pH 8,0 pernah diteliti sebelumnya pada amilase dari isolat
Bacillus sp strain SMIA-2 (Carvalho et al., 2008) juga pada amilase dari isolat
Bacillus sp KSM-K38 yang memiliki rentang pH optimumnya 8,0-9,5. Bahkan
pada pH 10,0 aktivitas optimumnya masih mencapai 50% (Hagihara et al., 2001).
Aktifitas enzim PN1 meningkat mulai dari pH 4 sampai pH 8 hal ini menunjukkan
jika amilase isolat PN1 lebih cocok digunakan pada pH lingkungan yang sifatnya
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
alkalis. Aktivitas enzim amilase PN1 ini juga dipengaruhi oleh suhu ketika
dilakukan Analisa Varian (Lampiran 10.4). Uji Duncan (Tabel 5.)menunjukkan
enzim amilase isolat PN1 aktifitasnya pada pH 4,0 hingga pH 7,0 terus
mengalami peningkatan dan peningkatan pH itu menghasilkan aktivitas yang
masing-masing berbeda nyata, tetapi tidak ada perbedaan nyata untuk aktivitas
enzim ketika pH menjadi pH 8,0 maupun pada pH 9,0.
Dari data yang diperoleh ternyata enzim amilase kasar isolat PN4 aktivitas
optimumnya berada pada pH 6,0. Aktivitas optimum di pH 6,0 ini juga dijumpai
pada enzim amilase dari isolat bakteri Thermus sp. (Fu-Shaw et al., 1995), dan
enzim dari isolat limbah pabrik tapioka (Oboh, 2005). Aktivitas amilase isolat
PN4 ini meningkat mulai dari pH 4–6 tetapi mulai mengalami penurunan sekitar
21% ketika pH menjadi 7. Penurunan aktivitas terus terjadi sampai pH 8, dengan
aktivitas enzimnya menurun sebesar 58% dibandingkan pada saat aktivitas
optimumnya. Analisis varians menunjukkan pH berpengaruh sangat nyata pada
aktivitas amilase PN 4 (Lampiran 10.5). Uji Duncan (Tabel 5.) menunjukkan
aktivitas enzim pada pH 4,0 tidak berbeda nyata dengan aktivitas enzim pada pH
8,0, demikian juga dengan aktivitas enzim pada pH 5,0 tidak berbeda nyata
dengan pada pH 7,0.
Isolat PN9 menghasilkan enzim amilase kasar yang aktifitas optimumnya
pada pH 7,0. Aktivitas optimum pada pH ini pernah ditemukan pada enzim
amilase dari isolat Clostridium thermosulforogenes (Swamy & Seenayya, 1996),
juga pada isolat Bacillus licheniformis (Haq et al., 2005), juga pada amilase dari
isolat Bacillus amyloliquefaciens (Syu & Chen, 1997). Aktivitas amilase isolat
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
PN9 ini menunjukkan peningkatan dari pH 4,0 sampai pH 7,0, tetapi mulai terjadi
penurunan sebesar 38% ketika pH meningkat menjadi 8. Aktivitas terus menurun
sebesar 65 % dari aktivitas optimumnya dengan peningkatan pH sampai 9,0. pH
substrat berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat PN9
(Lampiran 10.6). Uji Duncan (Tabel 5.) menunjukkan aktivitas enzim amilase
kasar PN9 berbeda nyata ketika pH substrat berubah dari pH 5,0 menjadi 6,0 dan
pada pH 8,0 serta 9,0 aktifitas juga menunjukkan hasil yang berbeda nyata. Hal ini
menunjukkan enzim amilase dari isolat PN9 ini lebih cocok digunakan pada pH
yang cenderung netral untuk mendapatkan hasil yang optimum.
Pengaruh pH terhadap aktivitas amilase kasar ketiga isolat tersebut dapat
dilihat pada Gambar 8 di bawah ini
Gambar 8. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Dari grafik terlihat jika pada pH yang paling rendah (pH4) aktivitas
amilase terbesar untuk 20 menit masa inkubasi tenyata PN9 menghasilkan glukosa
terbanyak (267,31 µg/ml) dibandingkan enzim amilase PN4 (117,53 µg/ml) dan
050
100150200250300350400450
4 5 6 7 8 9
pH
Kon
sent
rasi
glu
kosa
(µg/
ml)
PN1 PN4 PN9
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
amilase PN1 (75,68 µg/ml), tetapi pada pH yang paling tinggi (pH9) aktivitas
enzim amilase PN10 menghasilkan glukosa terbanyak yaitu 172,60 µg/ml, PN1
(134,91 µg/ml) dan PN4 (94,20 µg/ml). Dengan demikian terlihat jika amilase
PN9 relatif lebih toleran terhadap lingkungan pH asam dibandingkan amilase PN1
yang lebih toleran terhadap lingkungan yang bersifat alkalis.
Bila dibandingkan dengan tempat hidup alami dari isolat Penen ini yang
berkisar pada pH 6,7-pH 6,8 maka kemampuan enzim untuk melakukan aktifitas
kataliknya yang optimum tidak berbeda jauh dengan kondisi pH pada pengujian di
laboratorium dimana pH optimum PN4 pH optimumnya 6,0, PN9 optimum pada
pH 7,0, tetapi PN1 ternyata memiliki sifat alkalitoleran yang cukup baik untuk
aktifitas optimumnya pada pH 8,0.
Secara keseluruhan enzim amilase kasar ketiga isolat Penen ini masih dapat
melakukan aktifitas kataliknya dari pH 4,0 juga sampai pH 9,0. Hal ini terjadi
karena mikroorganisma dari kelompok termofil umumnya memiliki kelengkapan
sel yang lebih baik agar dapat hidup lebih toleran terhadap perubahan pH
lingkungan. Kelengkapan sel ini terutama dijumpai pada muatan ion yang tinggi
pada membran selnya yang berhubungan dengan kemampuannya
mengembangkan daya toleransi menghadapi peningkatan pH lingkungan
(Ulukanli, 2002) yang ekstrim. Mikroorganisma ekstremofil ini juga umumnya
menghasilkan enzim yang sifatnya toleran menghadapi perubahan pH lingkungan
reaksi kimia kataliknya.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5. 1. Kesimpulan
Dari hasil penelitian yang telah dilakukan tentang aktivitas amilase kasar dari
isolat bakteri sumber air panas Penen Sibirubiru dapat disimpulkan:
1. Sumber air panas Penen Sibirubiru memiliki isolat bakteri termofil yang
berbeda-beda karakter morfologi demikian juga biokimianya dan sebanyak 16
isolat bakteri tersebut ternyata menghasilkankan enzim amilase.
2. Terdapat perbedaan aktivitas hidrolitik di antara isolat bakteri termofil amilolitik Penen tersebut dalam mendegradasi amilum pada media agar pati.
Tiga isolat terbesar untuk zona bening hidrolisis pati didapatkan pada isolat
PN9 (31,58 mm), PN1 (29,93 mm) dan PN4 (27, 33 mm).
3. Tiga isolat terpilih memperlihatkan aktifitas enzim yang berbeda-beda pada
pengaruh suhu inkubasi demikian juga pada pengaruh pH.
4. Aktifitas PN1, PN4 dan PN9 dalam menghidrolisis pati optimum pada suhu
60o-65oC. Pada suhu 60oC amilase PN4 menghasilkan glukosa terbanyak (437,
22 µg/ml) tetapi peningkatan suhu dari 65o-80oC menunjukkan amilase PN9
memiliki aktifitas tertinggi diantara ketiga enzim amilase terpilih meskipun
konsentrasi glukosa yang dihasilkan semakin menurun (351,69 µg/ml-165,78
µg/ml).
5. pH memiliki pengaruh yang berbeda terhadap aktifitas optimum enzim amilase
dari ketiga isolat tersebut. PN1 aktifitas optimumnya pada pH yang alkalis
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
yaitu pada pH 8,0 (203,28 µg/ml), PN 4 pada pH 6,0 (224,78µg/ml) dan PN9
pada pH 7 (390,11µg/ml). Pada pH yang paling rendah digunakan (pH4)
amilase PN9 memiliki aktifitas tertinggi (267,31µg/ml)dibandingkan amilase
PN1 dan PN4, tetapi untuk pH tertinggi yang digunakan (pH 9,0) amilase
PN1 memiliki aktifitas tertinggi menghidrolisis pati (172,60 µg/ml).
5. 2. Saran
Enzim amilase dari isolat PN1, PN4 dan PN9 ini memiliki aktivitas enzim
kasar yang cukup potensial dilihat dari kemampuan aktivitasnya pada suhu
inkubasi yang cukup tinggi dan pada pH yang berkisar netral, tetapi aktivitas ini
masih perlu diteliti lebih lanjut untuk melihat interaksi antara suhu dan pH juga
pengaruh faktor eksternal lainnya untuk mendapatkan data yang lebih baik lagi
tentang potensi aktivitas enzim amilase isolat Penen tersebut. Perlu dilakukan juga
penelitian lanjut untuk aktivitas enzim ini pada tingkat yang lebih murni sehingga
potensi enzim amilase isolat Penen ini dapat diketahui datanya lebih jelas dan
dapat diketahui kemampuan yang dimiliki enzim amilase tersebut untuk
digunakan pada bidang aplikatif.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
DAFTAR PUSTAKA Aiyer PV. 2005. Amylases and their applications. African Journal of Biotechnology. 4: 125–1529. Ajayi OA & Fagade EO. 2007. Heat activation and stability of amylase from Bacillus species. African Journal of Biotechnology. 6: 1181–1184. Alexander M. 1977. Introduction to soil microbiology. John Wiley & Son. p.191. Al-Qodah Z, Daghstani H, Geopel & Lafi W. 2007. Determination of kinetic parameters of -Amylase producing thermophile Bacillus sphaericus. African Journal of Biotechnology. 6: 699–706. Bailey MJ. 1988. A note on the use to dinitrosalicyclic acid for determining the products of enzymatic reaction. App. Microbiol. Biotechnol. 29: 494 – 496. Benson HJ. 1994. Microbiological applications. Win C. Brown Publication. Bernfeld. 1951. Enzyme of starch degradation and synthesis. In: Advance in Enzymology. Interscience Publications. Inc. New York. Bessler C, Schmitt J, Maurer KH & Schmitt RD. 2003. Directed evolution of bacterial -amylase: Toward enhance pH- performance and higher specific activity, Protein Science 12: 2141– 149. Biology Amylase Lab. http://departement.oxy/edu/test/Amylase. (12 April 2008). Brock TD & Brock KM. 1978. Basic microbiology with application. 2nd edition. Prentice Hall, Inc, New Jersey. p.583. Brock TD. 1978. Thermophillic microorganisms and life at high temperatures. Springer–Verlag, New York. Brock TD. 1986. Thermophiles: General, Molecular. 2nd Applied Microbiology. A Willey Interscience Publication. Cappucino JG. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Addison Wesley Publishing Company.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Carolina M, Pereira N & Andrade A. 1999. Thermophilic microorganism and their polymer–hidrolytic enzyme. Brazilian Archives of Biology and Technol. 12: 12-130. Cordeiro CA, Martin ML & Luciano AB. 2002. Production and properties of -amylase from thermophilic Bacillus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 33: 57– 61. De Carvalho RV, Correa T & da Silva J. 2008. Properties of an amylase from thermophillic Bacillus sp. Brazillian Journal of Microbiology. 39: 102-107. De Rossa M, Gambacorta A & Gliozzi A. 1986. Structure, Biosynthesis and Physicochemichal Properties of Archaebacterial Lipids. Microbiological Reviews. 50: 70-80. De Rossa M, Morana A, Riccio A, Gambacorta A, Trincone A & Incani, O. 1994. Lipid of the archaea: a new tool for bioelectronic. Biosens. Bioelectr. 9: 669– 675. Dwidjoseputro D. 1989. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta. Erickson HM. 1992. Usage recommendations for -amylase: maximizing enzyme activity while minimizing enzyme-artifact binding residues. The 1992 Book And Paper Group Annual.p. 24–33. Everly C & Alberto J. 2000. Stressors, stress and survival: overview. Front Bioscience. 5: 780–86. Fu Shaw J., Fu Pang L & Chiu Chen S. 1995. Purification and properties of an extracellular -amylase from Thermus sp. Bot. Bull. Acad. Sin. 36: 195-200. Hagihara H, Igarashi K & Hayashi Y. 2001. Novel -amylase that is highly Resistant to chelating reagents and chemical oxidants from the Alkaliphilic Bacillus Isolate KSM-K38. Applied and Environmental Microbiology. 67: 1744–1750. Haki GD & Rakshit SK. 2003. Developments in industrially importants thermostable enzymes: a review. Bioresource Technol. 89: 17- 34. Haq I, Ashraf H, Qadeer MA & Iqbal J.2005. A source of alpha amylase production by Bacillus licheniformis. Bioresource Technol. 96: 1201-1204.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Hartuti MS. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase dari kawasan wisata Pemandian Air Panas Pawan-Roka Hulu. Skripsi. Unversitas Riau. Herbert R & Sharp R.1992. Molecular Biology and Biotechnology of Extremophiles. Chapman and Hall, New York. Hibino Y, Nosoch Y & Samejima J. 1974. Structur stabillity relationship in proteins: new approach to stability enzymes. Biochem. 75: 553–561. Holt JG. 1994. Bergey’s manual of determinative bacteriology. William & Wilkins, United Stated of Amerika. Hyun HH. & Zeikus JG. 1985. General biochemial characterization of thermostable extracellular ß-amylase from Clostridium thermosulfurogenes. Appl Environ Microbiol. 49: 1162–167. Igarshi YH, Hiroshi H, Katsuhisha S & Mikio S. 1998. Enzymatic properties of a novel liquefying-amylase from an alkaliphilic Bacillus Isolate and entire nucleotida and amino acid sequences. Appl Environ Microbiol 64: 3282–3289. Illanes A. 1999. Stability of biocatalysts. Electronic Journal of Biotechnology. 2: 1-9. Junaidi HM. 2008. Deteksi produksi Amilase. http://www.blogger.com/profile/. <1 Juni 2008)> Kombong H . 2004. Evaluasi daya hidrolitik enzim glukoamilase dari filtrat kultur Aspergillus niger. Jurnal Ilmu Dasar. 5: 16–20. Kumar S & Nussinov R. 2001. How do thermophillic protein deal with heat ? A review. Cell. Moll. Life Sci. 58: 1216– 233. Liu Q. 2005. Understanding Starch and Their Role in Foods. Taylor & Francis Group, LLC. Madi E, Antranikian G, Ohmiya, K & Gottschalk. 1987. Thermostable amylolytic enzyme from a new Clostridiumisolates . Appl Environ Microbiol. 53: 1661-1667. Maier RM, Pepper IL & Gerba CP. 2000. Environmental Microbiology. Academic Press. London.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Maxwell A. 1999. DNA Gyrase and the mechanism of DNA supercoiling. Dept. Biochemistry of Leichester . Mohan C. 2003. Buffers. EMD Bioscience Calbiochem. Germany. Morrison LE & Tanner FW. 1921. Aerobic thermophilic bacteria from water in studies on thermophilic bacteria. Journal Bacteriol. p. 343–366. Muchtadi S, Nurleni & Made. 1992. Enzim dalam Industri Pangan. Institut Pertanian Bogor. Murray RK, Granner DK, Mayes PA & Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper. ECC Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. Nickerson WJ & Brown RG. 1965. Advanced in Applied Microbiology. Academic Press. 7: 275. Oboh G. 2005. Isolation and Characterization of amylase from fermentedcassava (Manihot esculenta Crantz) waste water. African Journal of Biotechnology. 4: 1117–1123. Palmer T. 1985. Understanding Enzyme. Ellishorwood Publisher. Pandey A, Nigam P, Soccol CR, Soccol VT, Singh D & Mohan R. 2000. Advance In microbial amylases. Biotechnol. Appl. Biochem.31: 135–152. Pelczar MJ & Chan EC. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia Press. Poedjiadi A. 1994. Dasar – dasar Biokimia. Penerbit Universitas Indonesia. Poernomo AT & Purwanto DA. 2003. Uji aktifitas crude enzim proteolitik Bacillus subtilis FNCC 0059 hasil fermentasi curah. Majalah Farmasi Airlangga. 3: 103–107. Properties of enzymes isolated from thermophilic microbes. http://www.osmania.ac.in/Microbiology. <12 Oktober 2007> Rath CC & Subramanyam VR. 1998. Isolation of thermophilic bacteria from hot spring of Orissa, India. Geobios. 25: 113-119.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Reddy NS, Nimmagadda A & Rao KR. 2003. An overview of themicrobial -Amylase family. African Journal of Biotechnology. 2: 645–648. Rothschild LJ & Mancinelli RL. 2001. Life in extreme environments. Nature. 409: 1092-1011. Sale BS. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology. Mc. Graw Hill Book Company, Inc. Santos EO & Martin ML. 2003. Effect of the Medium Composition on Formation of Amylase by Bacillus sp. Brazilian Archives of Biology and Technology. 46: 129–134. Silva T, Tony M, Derlene A & Carvalho, AF. 2005. Production of Saccharogenic and Dextinogenic Amylases by Rhizomucor pusilus A 13.36. The Journal of Microbiology. 43: 561 – 568. Singleton R & Amelunxen RE. 1973. Proteins from Thermophilic Microorganism. Bacteriological Review. 37 : 320–342. Sivaramakrishnan S, Gangadharan D, Nampoothiri KD, Sossol CR & Pandey A.2006. α-amylase from microbial sources- An overview on recent developments. Food. Technol. Biotechnol. 44: 173-184. Swammy MV, Saerami N & Seenayya G. 1994. β-amylase from Clostridium thermocelluum SS8 a thermophillic, anaerobic, cellulolytic bacterium. Lett. App. Microbial.18: 301–304. Swammy MV & Seenayya G. 1996. Thermostable Pullulanase and -amylases activity from Clostridium thermosulforogenes SV9 Optimization of Culture condition for enzyme productions. Process Biochem. 157– 162. Syu MJ & Chen YH. 1997. A study on the -amylase fermentation perfomed by Bacillus amyloliquefaciens. Chem. Eng. Journal. 65: 237–247. Tarigan J. 1988. PengantarMikrobiologi. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Pengembangan Lembaga Pendidikan Tenaga Kependidikan. Thiel T. 1999. Introduction to Bacteria. In Science in The Real World. Dept. of Biology Univ. of Missouri –St. Louis.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Viara N, Elena P & Elka I. 1993. Purification and Characterization of thermostable Bacillus stearothermophilus alpha - amylase. Biotechnol. Appl. Biochem. 12: 427- 435. Vieille C & Zeikus G. 2001. Hyperthermophilic Enzymes: Source, Uses, and Molecular Mechanism for Thermostability. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65: 1–43. Vihinen M & Mantsala P. 1990. Characterization of an thermostable Bacillus stearothermophilus alpha-amylase. Biotechnol. App. Biochem. 12: 427-433. Walter WW & Nagesh S. 1965. Microbial Amylases. Advanced in Applied Microbiology. Academic Press. 7: 273–304. Yitnosumarto S. 1991. Percobaan: Perancangan, Analisis danInterpretasinya. P.T. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 1. Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas
Dipipet 0,1 ml
Disebar pada media agar selektif termofil Diinkubasi pada suhu 65°C selama 48 jam
Tiap isolat berbeda diambil satu ose Digores pada media agar selektif amilase (media agar + pati) Diinkubasi 24 jam pada suhu 65°C
Ditetesi larutan iodin
Bla terdapat zona bening pada media berarti pati dipecah oleh enzim amilase bakterial (pati + iodin berwarna biru kehitaman)
`
Sampel air panas Penen
Kultur campuran bakteri termofil isolat air panas Penen
Kultur murni bakteri termofil amilolitik isolat air panas Penen
Bakteri termofil penghasil enzim amilase isolat air panas Penen
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 2. Uji Adanya Produksi Enzim Amilase Oleh Isolat Bakteri
tiap isolat tunggal
Diambil dengan ose Masukkan dalam larutan fisiologis divortex Disamakan keruhnya dengan larutan Mac Farland 108
Dipipet 5 µl Masukkan dalam media Agar+pati1% inkubasi 72 jam 65°C
isolat bakteri tumbuh
Ditetesi larutan iodin
menghasilkan zona zona bening
zona bening diukur dengan jangka sorong dipilih 3 yang terbesar zona beningnya
hasil pengenceran
isolat menghasilkan enzim amilase
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 3. Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase
Isolat tunggal bakteri Penghasil enzim amilase
Karakteristik makroskopis
Karakteristik mikroskopis
Karakteristik biokimia sederhana
- Warna koloni - Bentuk koloni dari permukaan - Bentuk koloni dilihat dari samping - Tepi koloni dilihat dari atas
- Pewarnaan gram - Bentuk sel - Penataan sel - Pewarnaan spora
- Uji katalase - Uji Sitrat - Uji TSIA - Uji SIM - Uji gelatinase
Hasil pengamatan
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 4. Produksi Enzim Amilase Dan Ekstraksi Enzim Dari Kultur
Diambil satu ose Dilarutkan dalam media produksi amilase yang sudah disterilisasi Diinkubasi pada suhu 65°C selama 72 jam pada shaker waterbath kecepatan 150 rpm
Disentrifuge selama 20 menit Kecepatan 6000 rpm Supernatan disedot pelan dengan mikropipet, supernatan ini adalah bagian yang mengandung enzim kasar amilase
Isolat tunggal penghasil amilase
Kultur bakteri dengan produksi enzim amilase
Supernatan yang mengandung amilase kasar
Uji pengaruh suhu inkubasi & pH substrat terhadap aktivitas amilase kasar
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 5. Pembuatan Larutan Standar Glukosa
`
Dididihkan selama 5 menit
dinginkan dengan air mengalir selama 15 menit
ditambah aquabidest 20 ml
diabsobansi pada panjang gelombang 540 nm dengan spektrofotometer
Dibuat larutan glukosa 1000 µg/ml sebanyak 100 ml
Diencerkan menjadi berbagai konsentrasi dari 80–260 µg/ml
Tiap konsentrasi dibuat dalam tabung reaksi berbeda masing-masing 1 ml lalu tiap tabung ditambah reagen DNS 1,5 ml
Kurva standart glukosa
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 6. Pengukuran Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar
Diambil 1 ml Masukkan ke tabung reaksi Tambahkan 1% larutan pati dalam larutan sitrat buffer fosfat pada pH 6,5 Diinkubasi pada waterbath suhu 40°C, 50°C, 60°C, 65°C, 70°C dan 80°C selama 20 menit Setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap tabung reaksi Dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit Didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit Ditambah 20 ml aquabidest Determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Diplotkan dengan larutan standart glukosa
Ekstrak amilase dari supernatan
Data hasil pengujian
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 7. Pengukuran Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar
Diambil 1 ml Masukkan ke tabung reaksi Tambahkan 1% larutan pati dalam larutan sitrat buffer fosfat pada variasi pH 4,0, pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0 pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0 Diinkubasi pada waterbath suhu 65°C selama 20 menit Setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap tabung reaksi Dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit Didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit Ditambah 20 ml aquabidest Determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Diplotkan dengan larutan standart glukosa
Data hasil pengujian
Ekstrak kasar amilase dari isolat terpilih
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 8. Pembuatan Larutan Blanko Diambil 2ml Dipanaskan hingga mendidih selama 20 menit Ditambah larutan pati 1% dalam sitrat buffer fosfat sampai pH 6,5 Diinkubasi 20 menit pada variasi suhu 65°C Setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap test tube Dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit Didinginkan 15 menit dengan air mengalir Ditambah 20 ml aquabidest
Determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.
Data hasil pengujian
Ektrak kasar enzim amilase
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 9. Hasil Uji Diameter Zona Bening Hidrolisa Pati
Isolat Diameter(mm) Urutan terbesar
PN1 29.93 2 PN2 14.55 10 PN3 20.88 4 PN4 27.33 3 PN5 13.56 12 PN6 15.95 7 PN7 13.85 11 PN8 12.96 13 PN9 31.58 1
PN10 11.33 16 PN12 14.85 9 PN13 11.63 15 PN14 18.42 6 PN15 18.9 5 PN16 12.3 14
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 10. Analisis Varians Untuk Aktifitas Enzim Tabel 1. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN1
SK db JK KT F hit
F.05=3,11
perlakuan F.01=5,06 5 128883.84 25776.77
Galat Percob. 12 2402.16 200.18
Total 17 128.77 **
KK = 0.0666117 x 100% 6.66%
Tabel 2. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN4
SK db JK KT F hit
F.05=3,11 perlakuan F.01=5,06
5 276812.28 55362.46 Galat Percob.
12 7588.82 632.40 Total
17 87.54 **
KK = 0.0008759 x 100% 8.760%
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Tabel 3. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN9
SK db JK KT F hit
F.05=3,11 perlakuan F.01=5,06
5 91215.2697 18243.05 Galat Percob.
12 1781.59 148.47 Total
17 122.88 **
KK = 0.0482981 x 100% 4.82%
Tabel 4. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN1
SK db JK KT F hit
F.05=3,11 perlakuan F.01=5,06
5 91215.2697 18243.05 Galat Percob.
12 1781.59 148.47 Total
17 122.88 ** KK = 0.0482981 x 100% 4.82%
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Tabel 5. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN4
SK db JK KT F hit
F.05=3,11 perlakuan F.01=5,06
5 1283.60 7485.93 Galat Percob.
12 21.41 52.04 Total
17 143.86 ** KK = 0.0475116 x 100% 4.75%
Tabel 6. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN9
SK db JK KT F hit
F.05=3,11 perlakuan F.01=5,06
5 4106.87418 23951.29 Galat Percob.
12 175.113939 425.53 Total
17 56.29 **
KK = 0.0742378 x 100% 7.42%
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 11. Kurva Standar Glukosa
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
LAMPIRAN 12. Foto-Foto Pewarnaan Bakteri Isolat Penen
Foto 1. Pewarnaan Gram Isolat PN9 dengan Perbesaran 600x (12,5 x 40 ) Gram positif bentuk pseudobasil
Foto 2. Pewarnaan Gram Isolat PN4 dengan Perbesaran 600x (12,5 x 40 ) Gram
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
positif bentuk pseudobasil
Foto 3. Pewarnaan Gram Isolat PN1 dengan Perbesaran 600x (12,5 x 40 ) Gram positif bentuk pseudobasil
Foto 4. Pewarnaan Spora PN4 / SP5, dengan Perbesaran 600x (12,5 x 400)
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Foto 5. Pewarnaan Spora PN1/Sp1 dengan Perbesaran 600x (12,5 x 40)
Foto 6. Pewarnaan Spora PN9/SP10 dengan Perbesaran 600x (12,5 x 40)
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008
Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008