síndromes de prader-willi e angelman
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Discente: Igor Vinícius
Acadêmico do curso de Ciências Biológicas – 6º período
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Epidemiologia:
A prevalência da Síndrome de Prader-Willi varia de 1 para cada 15.000 a 30.000 indivíduos, acometendo igualmente ambos os sexos (CASSIDY; DRISCOLL, 2009).
Esse índice pode estar subestimado, pois há pacientes que apresentam um quadro clínico moderado, com características comportamentais sutis.
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A síndrome de Prader-Willi foi descrita primeiramente em 1956 em pacientes que apresentavam:
Atividade fetal diminuída
Hipotonia infantil severa
Problemas de alimentação na infância
Hipogonadismo e hipogenitalismo
Estatura baixa
Mãos e pés pequenos
Atraso no desenvolvimento
psicomotor
Aparência facial característica
Retardo mental moderado
Fome insasiável que levava a um quadro de obesidade na infância
Problemas no comportamento
Tendência ao desenvolvimento de diabetes na adolescência.
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A Síndrome de Prader-Willi é causada por uma deleção intersticial em 15q11-q13, no cromossomo herdado do pai.
Erro no imprinting: a fertilização por um espermatozóide que ainda possui um imprinting feminino produz uma criança portadora da síndrome.
Dissomia uniparental, ocorrendo a herança dos dois cromossomos 15 provenientes da mãe.
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Epidemiologia
A prevalência da Síndrome de Angelman está estimada em 1:10.000 a 1:40.000 nativivos em todo o mundo. (CLAYTON-SMITH; LAAN, 2003) e atinge homens, mulheres e todos os grupos raciais e éticos igualmente.
A síndrome tem sido bastante divulgada nos últimos anos, especialmente por causa da descoberta dos mecanismos genéticos que levam ao surgimento da doença.
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A síndrome de Angelman foi descrita pela primeira vez em 1965 com base nas características de três crianças:
Severo retardo mental;
Epilepsia;
Deglutição atípica;
Marcha atáxica;
Microcefalia;
Dificuldades na fala;
Movimentos desconexos;
Sorriso frequente;
Excitabilidade sem motivo;
Deficiência intelectual grave e alterações no sono.
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A etiologia molecular da AS pode se dar de quatro formas: Deleção da região crítica do cromossomo materno
15q11q13;
Dissomia uniparental paterno(UPD) do cromossomo 15;
Imprinting genômico incorreto causando falta de expressão da cópia materna do gene da proteína ubiquitina-ligase E3A (UBE3A) no cérebro;
Mutações intragênicas na cópia do gene herdado pela mãe, que incluem deleção, inserção e mutações missense no sítio de splicing.
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UBE3A faz parte de um pequeno subconjunto de genes humanos que são “imprintados”. No cérebro, o gene UBE3A derivado paternalmente é silenciado, e apenas a cópia herdada maternalmente é ativa.
UBE3A: gene candidato para o autismo. Alterações genéticas na região cromossômicas 15q11-q13 são as mais encontradas na maioria das mutações identificadas e relacionadas aos Distúrbios do Espectro Autista.
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A origem mais provável da UPD paterna é a não-disjunção materna produzindo um embrião com monossomia do cromossomo 15.
Resgate pós-zigótico através da duplicação do cromossomo 15 paterno.
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A deleção no centro de imprinting no gameta feminino resulta em uma não troca do imprinting materno adequadamente durante a ovogênese;
Os alelos paternos continuam sendo expressos no óvulo, que, quando é fecundado, origina um concepto erroneamente “imprintado” e portador da AS.
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A metilação envolve a adição de um grupo metil ao DNA, por exemplo, ao carbono 5 do anel de pirimidina da citosina, ocorrendo uma redução da expressão genética.
Ocorre geralmente em citosinas localizadas dentro de um dinucleotídeo de citosina-guanina, conhecimentos como “Ilhas CpG”.
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Detecção de metilação em ilhas CpG:
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP): observa a diferença em sequências homólogas do DNA, pela presença de fragmentos de diferentes tamanhos após a digestão por uma endonuclease de restrição específica.
PCR específica de metilação usando amostras de DNA tratadas com bissulfito e PCR alelo-específica, seguida por eletroforose em gel.
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Após o DNA ser separado por eletroforese em gel 0,1% e aderido a uma membrana de nylon, o que se espera na análise da eletroforese é:
Pacientes com PWS apresentarem uma banda materna não metilada, enquanto os com AS apresentem uma banda paterna não metilada.
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MS-MLPA: Uma sonda de MLPA contem dois oligonucleotídeos: um sintético e um longo derivado de M13.
A seqüência detectada pela sonda de MS-MLPA contêm uma sequencia de reconhecimento para a HpaII ou HhaI. Sondas que reconhecem seqüência que estão metiladas geram um sinal. Se o sítio CpG estiver não metilado, o complexo sonda MS-MLPA e DNA genômico será digerido e não vai gerar produto de PCR nem amplificação exponencial do mesmo.
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Foi realizada a amplificação de sonda dependente de ligação específica de metilação multiplex (MS-MLPA) para validar o método de análise de metilaçao-específica (MS-MA).
MS-MLPA detecta número de cópias de genes e tem a capacidade de diferenciar deleções de possíveis UPDs.
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52 amostras de sangue pacientes.
19 deles foram testados através da PCR específica para metilação e tratadas com bissulfito para a região do promotor SNRPN e foram positivas tanto para PWS (12) como para AS (7).
As outras 33 amostras foram de indivíduos não-afetados.
O DNA genômico foi extraído de sangue periférico (3 mL) com o uso do Kit da PUREGENE ® DNA Purification.
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Para a análise de metilação, foi extraído DNA genômico com bissulfito de sódio e utilizando o KitTM DNA Methylation, de acordo com o protocolo do fabricante.
Após o tratamento com bissulfito, amplificou-se por PCR um fragmento de 322 pb da região promotora do gene SNRPN e o exon parcial correspondente aos nucleotídeos g.5 ao g.326.
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A PCR foi feita em um volume de reação de 20 µl usando um buffer 1x do conjunto de reagentes SYBR Green I LightCycler FastStartMaster, primers a 0,5 µM cada, 4 mM de MgCl2 e 2 µl de DNA tratado com bissulfito.
Ativação de desnaturação 95 ° C por 10 min.
30 ciclos com uma temperatura de desnaturação de 95 ° C durante 10 s; anelamento a 68 ° C durante 30 s e um aumento de 72 ° C a uma velocidade de transição rápida de 20 ° C / s.
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Produtos de PCR foram desnaturadas a 95° C;
Abaixou para uma temperatura de 40° C;
Aqueceu-se a 95° C novamente com uma taxa de transição térmica de 0,05° C/s, monitorando-se continuamente a fluorescência.
A análise dos dados foi realizada com o software LightCycler, Ver. 5,32 (Roche Diagnostics), com o derivativo de alterações de fluorescência no eixo y e a temperatura no eixo x.
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Uma mistura dos probes foi comprada da MRC-Holland e continham 43 probes, 25 específicos de genes da região crítica para a PWS/AS (15q11-12).
Dentre esses específicos, 15 são sensíveis à metilação e contêm o sítio de restrição para a HhaI e somente 5 deles foram selecionados por se ligarem a seqüências alvo metiladas e, portanto, adequados para a diferenciação genotípica.
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Essas 5 sondas têm como alvo regiões imprintadas. 4 delas hibridizam na região promotora do SNRPN gerando fragmentos de tamanhos de 142, 166, 190 e 247 pb e 1 sonda na região promotora (exon 1) que codifica para a necdina (NDN) gerando um fragmento de PCR de 418 pb.
Foi utilizado 80 ng de DNA genômico para cada amostra testada. Usou-se 10 mol/L de Tris-EDTA para diluição do DNA se necessário.
Após 16 h de hibridização à 60° C, amostras foram igualmente divididas em 2 alíquotas. A primeira alíquota foi submetida à ligação apenas, enquanto que a segunda foi submetida à ligação e digestão enzimática.
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A normalização e análise dos dados foi feito pelo software GeneMarker, Ver. 1.4 normaliza a altura do pico (intensidade de fluorescência) de cada fragmento.
Dados resultantes foram colocados em um modelo de regressão em uma razão: proporção entre a intensidade da fluorescência no eixo y e do tamanho do fragmento no eixo x.
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Proporções da intensidade da fluorescência de 1.5: duplicação; 1.0: sequência selvagem; 0.5: deleção e 0.0: ausência da sequência.
Os limites superiores e inferiores para as proporções de altura usadas para determinar os números de cópia foram estabelecidos como: <0.65 para deleção e >1.35 para duplicação.
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Espera-se que o amplicon dos pacientes com PWS derretam a uma temperatura mais alta (~87°C) devido às maiores concentrações de GC oriundos dos alelos paternos metilados.
Um amplicon de um paciente com AS derreteria a uma temperatura mais baixa (~83°C) devido aos alelos não metilados paternos.
Um aplicon de mesmo tamanho do tipo selvagem possuiria ambos os picos no espectro de fusão.
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Picos de fusão de amplicons detectados em uma amostra de tipo selvagem à 82.37 e 86.74°C.
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Pico de fusão de um único amplicon à 83°C, indicando ou uma deleção típica de AS ou uma dissomia uniparental paterna do cromossomo 15.
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Pico de fusão um único amplicon à 86,68°C, indicando ou uma deleção típica de PWS ou uma dissomia uniparental materna do cromossomo 15.
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Comparou-se os dados da proporção de altura obtida com as 5 sondas sensíveis à metilação (4 SNRPN e 1 NDN) para uma amostra tratada com ligação e reações de ligação/digestão.
Os autores encontraram que os padrões distintos da proporção de altura eliminou a possibilidade de deleções, levantando as possibilidades de UPD ou defeitos no centro de imprinting.
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Amostra de um paciente com AS testada: a proporção de altura das sondas do cromossomo 15 permaneceram próximas a 0,5 após a ligação e amplificação (similar ao padrão de ligação de PWS).
Porém, uma proporção de altura de 0 (0 cópias) foi observada nas 5 sondas sensíveis à metilação após ligação, digestão e amplificação por PCR.
Isso foi distinto dos tipos selvagem e dos padrões de ligação/digestão da PWS. Alelo paterno não metilado.
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Determinação do status de UPD para PWS e AS
Foram testadas as amostras de PWS-UPD por MS-MLPA. Todas as sondas do cromossomo 15 tiveram uma proporção de altura de 1.0 após ligação e amplificação. Foi compatível com outras amostras de PWS com status de UPD confirmados.
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Ao contrário, se uma amostra tiver perdido o alelo materno e herdado as duas cópias do pai, tem-se um caso de AS-UPD. Encontrou-se uma proporção de 0 para todas as sondas sensíveis à metilação após ligação, digestão e amplificação.
Esse padrão é predito dentro da suposição de que os dois alelos paternos herdados não estão metilados e serão digeridos pela HhaI, não havendo produtos de PCR e portanto, não amplificados.
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Detecção de duplicação rara no cromossomo 15
Os resultados mostraram que todas as sondas do cromossomo 15, exceto o 4, tiveram uma proporção de intensidade de fluorescência de 1,5 após a ligação e amplificação por PCR.
Encontrou-se diferentes proporções de intensidade de fluorescência para sondas sensíveis à metilação (0.5) e para as específicas de regiões não-metiladas (1.5).
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O gene SNRPN está localizado na região crítica para as PWS/AS, onde o promotor e o éxon 1 parcial está completamente metilado no cromossomo materno e não metilado no cromossomo paterno.
É usada na análise de metilação com base na PCR e gel, com 99% de taxa de detecção para pacientes com PWS e 80% para os pacientes com AS.
1% restante de pacientes com PWS: variantes em uma única base ou deleções pequenas.
20% de pacientes com AS: sequência variante no gene UBE3A ou causa desconhecida.
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Porém, a análise de metilação baseada em PCR e no gel consome muito tempo e está sujeita à contaminação cruzada.
A MS-MA pode determinar padrões aberrantes de metilação de DNA na região promotora e no éxon parcial 1 do gene SNRPN.
Varredura das amostras podem ser completadas dentro de 45 minutos em um ensaio em tubo-fechado.
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Limitações do MS-MA: não consegue diferenciar as deleções da UPD e padrões de imprinting raros atribuídos à duplicação no cromossomo na região crítica para as PWS/AS.
Deve ser complementada por técnica que mostre a origem parental dos cromossomos, utilizando marcadores STR altamente polimórficos no cromossomo 15.
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A análise de STR requer amostras do probando e dos pais.
Requer grande quantidade de DNA para o tratamento com bissulfito.
Compensados pelo MS-MLPA: informação do status de metilação e do número de cópias pelo uso das enzimas de restrição específicas de sítios metilados. Não exige amostras dos pais e pouca quantidade de DNA do paciente (20-200 ng).
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A análise de STR fornece dados de confirmação de status UPD. Já a MS-MLPA é usada para confirmar status de metilação e número de cópias de genes.
Apesar da análise de STR ainda ser necessária para confirmar o status de UPD, a combinação da MS-MA e da MS-MLPA pode levar à substituição de testes citogenéticos tradicionais como o FISH.
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