TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

----------------------------------------

BỘ MÔN : SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

ĐỀ TÀI :

Lớp : ĐHTP4

GVHD : ThS Trần Đức Việt

Sinh viên thực hiện :

1. 08243421 Bùi Thị Bích Hằng

2. 08104521 Nguyễn Thị Thu Hằng

3. 08212521 Nguyễn Bảo Khuyên

4. 08108721 Đỗ Trọng Lam

5. 08234201 Nguyễn Mỹ Linh

6. 08105241 Nguyễn Thị Thuỳ

Linh

Niên khoá : 2008-2012

T.P Hồ Chí Minh, 11/2009

PHẦN MỞ ĐẦU

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

Công nghệ tái tổ hợp DNA còn gọi là công nghệ di truyền - là sự kết hợp của

sinh học phân tử và di truyền học - ra đời vào những năm đầu của thập niên 70

trong thế kỷ 20. Phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên được nhóm các nhà nghiên cứu

Mỹ là Berg, Boyer và Cohen tạo ra năm 1972

Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và tiến hành các thí nghiệm lắp

ghép gen và đã thu được nhiều kết quả ứng dụng được trong thực tiễn.

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA ngày càng có nhiều ảnh hưởng đến nông nghiệp,

công nghệ thực phẩm, y dược, bảo vệ môi trường,... như: sản xuất thuốc kháng sinh,

vác xin, kháng thể đơn dòng và các protein có hoạt tính sinh học dùng để chữa bệnh

như insulin chữa bệnh tiểu đường, interferon chữa bệnh ung thư, các hormon tăng

trưởng cho con người. Xác định vị trí của các gen mã hóa cho các tính trạng mong

muốn, giúp cho việc lai tạo, chọn giống cũng như tạo ra các sinh vật chuyển gen

nhanh và hiệu quả cao,...

Trong công nghệ thực phẩm, công nghệ tái tổ hợp DNA đóng một vai trò quan

trọng trong việc tạo ra các vi sinh vật chuyển gen mang các tính trạng mong muốn

nhằm tạo ra năng suất và chất lượng cao cho sản phẩm. Ví dụ:

o Trong sản xuất rượu, ngày nay người ta đã dùng các chủng vi sinh vật có khả

năng tạo rượu cao và cho hương vị tốt. Phần lớn các chủng đó được nghiên

cứu, tuyển chọn, lai tạo bằng kĩ thuật tái tổ hợp DNA

o Đối với các sản phẩm lên men sữa như phomat và sữa chua, trước kia, người

ta thường sử dụng những vi sinh vật tự nhiên để lên men nên khó kiểm soát

quá trình lên men và hiệu quả không cao. Ngày nay, với kĩ thuật tái tổ hợp

DNA, người ta đã tạo được các chủng mới với các tính chất xác định và đã

điều khiển được quá trình lên men theo định hướng mong muốn.

o Trong những năm gần đây, bằng cách sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp, người ta đã

tuyển chọn và tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các

2

enzyme chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm tốt để sản xuất enzyme. Enzyme λ -

amylase chịu nhiệt đã và đang được sử dụng nhiều để sản xuất nha, đường

glucose từ tinh bột

Chính vì vậy nhóm chúng tôi đã quyết định chọn đề tài tiểu luận môn Sinh học

đại cương là “Kĩ thuật tái tổ hợp DNA” để tìm hiểu rõ hơn và nắm vững phương

pháp tiến hành của kĩ thuật này.

Tiểu luận được thực hiện dựa trên việc tìm kiếm và tổng hợp các tài liệu. Đối

tượng nghiên cứu chủ yếu là vi khuẩn

3

PHẦN NỘI DUNG

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

1. Nguyên lí cơ bản của kĩ thuật tái tổ hợp DNA

Công nghệ di truyền sử dụng các phương pháp sinh học phân tử để tách DNA

từ một cơ thể sống và sau đó cắt, nối các gen trên DNA. Bằng cách như vậy, người

ta có thể loại bỏ các gen không mong muốn và đưa vào các gen mới đặc hiệu theo

chủ ý lựa chọn.

Các thao tác cắt, nối trên DNA được thực hiện bên ngoài cơ thể sống trong các

ống nghiệm (in vitro). Phân tử DNA mới được tạo dựng sau các thao tác cắt, nối có

một số đặc điểm khác với phân tử DNA ban đầu được tách ra từ tế bào sống, được

gọi là DNA tái tổ hợp và kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA.

Sự tái tổ hợp DNA được xem là thành công chỉ sau khi đưa được phân tử

DNA tái tổ hợp vào trong tế bào sống và chúng biểu hiện các hoạt tính di truyền và

ở thế hệ con cháu sẽ mang phân tử DNA tái tổ hợp

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều bước:

- Bước 1 : Nuôi tế bào cho plasmid để có vector chuyển gen và nuôi tế bào cung cấp

gen cần chuyển

- Bước 2 : Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho

- Bước 3 : Phân lập hai loại DNA bằng cùng một loại enzym giới hạn

- Bước 4 : Trộn chung hai loại DNA đã bị cắt

- Bước 5 : Bổ sung enzym nối ligase để tạo ra ADN tái tổ hợp hoàn chỉnh.

- Bước 6 : Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng.

- Bước 7 : Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ mang ADN tái tổ hợp và theo dõi hoạt

động, biểu hiện của gen thông qua sản phẩm của gen lấy từ tế bào cho.

4

Hình: Các bước tạo DNA tái tổ hợp

1,2: Cắt DNA của tế bào cho và plasmid bằng cùng một loại enzyme giới hạn

3 : Đưa DNA tái tổ hợp vào trong tế bào nhận

4 : Nhân dòng

2. Các enzyme sử dụng trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA

2.1 Enzyme giới hạn RE (Restriction Enzyme)

Trong công nghệ di truyền muốn tạo ra ADN tái tổ hợp để đưa vào tế bào

chủ cần phải có công cụ cắt plasmid hình vòng và đoạn ADN của tế bào rồi cho

chúng nối lại với nhau. Công cụ cắt ADN là các enzym giới hạn

5

2.1.1 Khái niệm về enzym giới hạn

Thông thường tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage (thể thực khuẩn) thì vi khuẩn

đó bị phage phá huỷ. Một số chủng vi khuẩn sau khi bị nhiễm phage lại không bị

phá huỷ, do trong tế bào vi khuẩn này có loại enzym có khả năng cắt DNA phage

thành những đoạn nhỏ. Năm 1970, Hamilton Smith là người đầu tiên tách được loại

enzym này từ loại vi khuẩn Haemiphilus influenzae được gọi tên là HinII. Ngay sau

đó, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng, phần lớn các loài vi khuẩn mang loại

enzym có chức năng cắt DNA lạ xâm nhập để bảo vệ tế bào khỏi bị xâm nhập của

các DNA lạ. Những enzym đó được gọi là enzym giới hạn.

Enzym giới hạn là enzym có khả năng nhận biết những đoạn trình tự DNA

nhất định và cắt DNA ở ngay điểm này hay ở điểm kế cận. Tuỳ theo phương thức

cắt và nguồi gốc của enzym giới hạn mà người ta phân loại và đặt tên cho các

enzym giới hạn đó

2.1.2 Phân loại enzym giới hạn

Các enzym giới hạn được phân thành 3 loại: I, II và III.

Các enzym giới hạn được dùng phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp

thuộc kiểu II. Bao gồm những enzyme có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc

hiệu. Khi nhận biết được trình tự đó, chúng cắt ngay tại vị trí nhận biết. Các enzym

này cắt bên trong mạch DNA (không phân huỷ từ 2 đầu của DNA) nên còn được

gọi là enzym endonuclease. Enzym giới hạn kiểu II thực chất là endonuclease giới

hạn kiểu II.

Các enzym giới hạn kiểu II: Cách gọi tên các enzym giới hạn kiểu II cũng

như các enzym giới hạn khác dựa trên quy ước chung. Tên enzym giới hạn được

ghép bởi chữ cái đẩu tiên là tên chi và hai chữ tiếp theo là hai chữ cái tên loài của vi

sinh vật mà enzym được tách chiết. Nhưng chữ và số La mã tiếp theo là tên của

chủng và dòng của loài sinh vật cụ thể đã tách chiết enzym:

Ví dụ: E.coRI (thuộc chi Escherichia, loài coli, chủng Ry 13) Một số loại

khác như E.coRV, BamHI, HaeIII, Smal, …

6

2.1.3 Tính đặc hiệu vị trí

- Trình tự nhận biết của RE: Đặc trưng quan trọng nhất của các trình tự nhận

biết là chúng có cấu trúc đối xứng nghịch đảo (palindromic), nghĩa là hai mạch của

trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng được đọc theo chiều 5’ đến 3’ ở mỗi sợi

đơn. Các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn được cấu tạo từ 4 đến 6 đôi base.

Ví dụ như đoạn DNA được đóng khung sau:

- Các kiểu cắt của RE:

Cắt đầu bằng: Một số RE tạo vết cắt trên phân tử DNA ngay chính giữa

palindrom, tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng. Sau khi cắt, hai đầu không có khả năng

tự kết hợp trở lại. Ví dụ:

Cắt đầu dính (đầu lệch): Cắt bên này và bên kia của tâm đối xứng để tạo ra hai

đầu lệch nhau một vài base. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bị

bắt cặp trở lại.Ví dụ:

7

2.2 Nuclease

Các enzym nuclease phân hủy các axit nucleic bằng cách làm đứt các liên kết

phosphodieste là liên kết nối các nucleotit cùng một mạch với nhau. Các nuclease

có khả năng phân cắt phân tử DNA hoặc RNA. Có ba kiểu phân loại các nuclease:

1 - Dựa vào bản chất của cơ chất mà nó tác dụng, người ta chia nuclease làm 2 loại:

- Deoxyribonuclease (DNase), cơ chất của nó là DNA

- Ribonuclease (RNase), cơ chất của nó là RNA

2 - Dựa theo kiểu liên kết mà enzyme thủy phân, người ta cũng chia ra làm hai loại:

- Nuclease "a": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphodiester giữa cacbon

(C3’) và nhóm phosphate.

- Nuclease "b": Thuỷ phân đặc hiệu liên kết phosphoester giữa cacbon

(C5’) và nhóm phosphate

Hình: Phân loại nuclease theo liên kết bị cắt

8

3 - Dựa theo hoạt tính enzyme, người ta cũng chia ra làm hai loại exonuclease và

endonuclease:

- Exonuclease: Cắt các liên kết phosphoester từ hai đầu của chuỗi

polynucleotide và từ đó cắt dần từng nucleotide, chúng đòi hỏi là phải có nhóm OH

(3’) hoặc OH (5’) tự do ở hai đầu chuỗi.

- Endonuclease: Thường thuỷ phân liên kết phosphoester ở vị trí bất kỳ bên

trong chuỗi và tạo ra các oligonucleotide.

Các loại nuclease chủ yếu:

- Enzym ADNase I (endonuclease) tách chiết từ tụy của bò, xúc tác phản ứng

thủy phân các liên kết ngay sau một bazo nito ở cả mạch đơn và mạch kép hoàn toàn

ngẫu nhiên.

- Enzym S1 nuclease (endonuclease) là enzym tách chiết từ nấm mốc

Aspegillus oryzae. S1 nuclease BAL 3 (endonuclease) phân cắt cả 2 đầu 5’ và 3’ của

ADN và không có khả năng cắt nội liên kết.

- Enzym exonuclease III là một 3’ exonuclease cắt đầu 3’ của mạch đơn và tạo

thành các đoạn ADN có đầu 5’ nhô ra.

- Enzym ARNase tách chiết từ tụy bò. Enzym này thường được sử dụng để

loại bỏ ARN trong hỗn hợp ADN và ARN.

- Enzym ARNase H dùng để loại bỏ ARN trong các phân tử lai ADN-ARN,

nhất là sau phản ứng phiên mã ngược để hình thành mạch thứ hai của cADN, từ đó

tạo nên phân tử cADN kép.

9

2.3 Enzyme nối

2.3.1. Ligase

Để kết nối hoặc hàn hai mảnh DNA hoặc RNA người ta phải sử dụng enzyme

ligase trong sự có mặt của ATP. Khi đó tạo ra một liên kết ester giữa một mảnh

chứa 5’ −phosphat và một mảnh chứa 3’−OH => liên kết phosphodiester. Chúng

thường được sử dụng kết hợp với enzyme khác như kinase và alkaline phosphatase.

Thông thường, chắp hai mảnh đầu dính dễ hơn hai mảnh có đầu phẳng.

Có 3 loại enzym nối thường dùng trong công nghệ di truyền:

- Enzym E.coli ADN ligase được tách chiết từ vi khuẩn E.coli, xúc tác phản

ứng nối hai đoạn trình tự ADN có đầu sole.

- Enzym T4 ADN ligase được tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm vào E.coli, có

chức năng giống như E.coli ADN ligase nhưng lại có khả năng nối hai đoạn trình tự

ADN có đầu bằng và là enzym nối được ưa chuộng nhất hiện nay.

- Enzym T4 ARN ligase tách chiết từ phage T4 xâm nhiễm E.coli, có khả năng

nối hai trình tự ARN bằng các liên kết phosphodiester.

Ngoài các loại enzym nối kể trên, hiện nay người ta còn sử dụng các đoạn

nối (đầu dính–adaptor) cho các enzym cắt đầu bằng. Adaptor xúc tác nối các đoạn

ADN do có các enzym giới hạn cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu so le. Mỗi đoạn

enzym cắt đầu bằng đều có các loại adaptor đặc trưng riêng.

2.3.2. Các enzyme dephosphoryl hoá ( khử nhóm PO4-3 )

Alkaline phosphatase:

Được trích ly từ E. Coli hay từ ruột bê. Đặc tính của enzyme này là hoạt động

ở pH kiềm và có khả năng xúc tác khử nhóm phosphate 5’ của một chuỗi DNA

hoặc RNA và các nucleotide tự do.

Alkaline phosphatase được ứng dụng để:

- Loại bỏ nhóm phosphate 5’ trên trình tự DNA hoặc RNA trước khi đánh dấu

phóng xạ 5’ của chúng bằng P32 làm mẫu dò phân tử lai.

- Loại bỏ nhóm phosphate 5’ trên một vector vừa mới bị cắt bởi enzyme RE.

Nhằm tránh vector này đóng kín trở lại, khiến cho việc cài mảnh DNA ngoại lai vào

bị cản trở. Trong trường hợp này, sợi kép được cài vào có mang hai nhóm phosphat

ở 5’ sẽ tạo ra hai trong bốn liên kết este để hình thành một DNA tái tổ hợp kép vòng

kín có chứa hai khe hở.

10

Hình: Phản ứng nối DNA ngoại lai với vector đã khử nhóm PO4.3

Sự chắp nối vector đã bị khử PO4.3 ở 5’ với DNA ngoại lai tạo ra DNA tái tổ

hợp sợi kép có hai chỗ trống (OH) do OH 3’ của đoạn ngoại lai không tạo liên kết

ester với OH 5’ của vector đã khử nhóm PO4.3

2.4 Các enzym polymerase

2.4.1 Khái niệm

Các enzym polymerase xúc tác cho quá trình sao chép các axit nucleic

(ADN, hoặc ARN) được sử dụng nhiều trong công nghệ tái tổ hợp DNA. Khi nói về

một enzym polymerase nào đó, người ta thường dùng thuật ngữ “ phụ thuộc ADN ”

hoặc “ phụ thuộc ARN ” để chỉ axit nucleic mà enzym này xúc tác cho việc sao

chép. ADN polymerase phụ thuộc ADN thì sao chép ADN sang ADN; ADN

polymerase phụ thuộc ARN thì sao chép ARN sang ADN, còn enzym ARN

polymerase phụ thuộc ADN thì phiên mã ADN sang ARN. Các enzym này tổng

hợp axit nucleic bằng cách nối các nucleotit với nhau theo nguyên tắc bổ sung dựa

theo mạch khuôn. Quá trình tổng hợp mạch mới bổ sung diễn ra theo chiều 5’-3’ và

sự khởi đầu cần có đầu 3’-OH tự do.

11

2.4.2 Phân loại

Các enzyme DNA polymerase: Enzym ADN polymerase I, Enzym T4 ADN

polymerase, Enzym Taq polymerase…Hiện nay còn có nhiều loại ADN polymerase

khác lưu hành trên thị trường như T7 ADN polymerase, Vent ADN polymerase …

Các enzyme RNA polymerase: Có ba loại enzym ARN polymerase thường

được dùng trong thực tế, đó là SP6 ARN polymerase, T3 ARN polymerase và T7

ARN polymerase …

Enzym phiên mã ngược (Reverse transcriptase): Có khả năng tổng hợp DNA

một mạch gọi là DNA bổ trợ (cDNA) từ khuôn mARN, hoặc từ một đoạn

polynucleotit được tổng hợp bằng con đường hóa học. Nhờ có con đường phiên mã

ngược này mà có thể tổng hợp được hầu hết các gen riêng biệt nào đó nếu như có

mặt mARN của gen đó. Các cDNA mạch đơn có thể biến thành mạch kép nhờ DNA

polymerase và được gọi là cDNA mạch kép (c-DNA duplex). Đoạn cDNA mạch

kép có thể gắn vào plasmid rồi biến nạp vào vi khuẩn, từ đó tạo dòng c-DNA. Nếu

cDNA có nguồn gốc từ một gen thì ta tạo được dòng gen. Trong trường hợp mARN

trưởng thành khi đã ở ngoài nhân thì ta sẽ thu được dòng gen chỉ chứa những đoạn

mã hóa (exon). Không có đoạn không mã hóa (intron).

3. Thu nhận gen

Ngày nay, người ta có thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật di truyền bằng ba

phương pháp: tách chiết DNA trực tiếp từ tế bào, tổng hợp bằng phương pháp hoá

học, tổng hợp từ mARN tương ứng

3.1 Tách chiết DNA trực tiếp từ tế bào

Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu tiên của sự phát triển

kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Toàn bộ phân tử DNA của một sinh vật được cắt nhỏ

thành những đoạn có kích thước 1,5÷2kb bằng restriction enzyme (RE).

Điện di hoặc sắc kí để tách đoạn DNA tinh khiết.

Nhược điểm: tốn nhiều công sức và thời gian nhưng ngày nay người ta vẫn sử

dụng để tạo ngân hàng DNA bộ gen (genonic DNA libraries).

3.2 Tổng hợp bằng phương pháp hoá học

Năm 1969, gen nhân tạo đầu tiên được tổng hợp do nhóm nghiên cứu

Khorama, đó là gen mã hoá tổng hợp tRNA vận chuyển amino axit (alamin) ở nấm

12

men gồm 77 cặp nucleotide. Gen đầu tiên không được biểu hiện vì không có các

trình tự điều hoà.

Về sau, chính nhóm này đã tổng hợp được gen có hoạt tính: đó là gen mã hóa

cho chất ức chế tRNA vận chuyển tyrosine ở E. Coli, có chiều dài khoảng 200 cặp

nucleotide.

Vào năm 1977, K. Itakura và Boyer đã tổng hợp được gen mã hóa sinh tổng

hợp hormone somatostatin của động vật có vú được biểu hiện ở E. Coli. Và từ đó,

nòi E. Coli mang gen tổng hợp hóa học được tạo ra. Sau này, người ta tổng hợp hóa

học gen mã hóa hormone tăng trưởng của người dàì 584 cặp nucleotide.

Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nòi vi khuẩn

tổng hợp insulin, một loại hormone chữa bệnh tiểu đường cho người. Gen insuline

được tổng hợp từ hơn 40 đoạn oligonucleotide khác nhau, sau đó, được nối lại nhờ

enzyme lygase để tạo ra hai chuỗi polynucleotide dài 271 và 286 cặp nucleotide mã

hóa, tổng polypeptide A có 21 aminoaxit, polypeptide B có 30 aminoaxit.

Qua các kết quả thu được, các nhà khoa học đã khẳng định rằng: muốn tổng

hợp được gen bằng phương pháp hoá học cần phải biết trình tự của axit amin ở

protein mà gen đó chịu trách nhiệm tổng hợp.

3.3 Tổng hợp từ mRNA của gen tương ứng

Tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ kỹ thuật của Gubler và Hoffman với sự có mặt

của enzyme phiên mã ngược (Rever transcriptase). Sau đó, cDNA (complementary)

gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng cDNA.

Phương pháp:

- Tổng hợp cDNA sợi kép đầu bằng từ mRNA dưới tác dụng của enzyme sao

chép ngược.

- Metyl hóa các vùng hạn chế (có trong đoạn cDNA sợi đôi) được nhận biết

bởi enzyme EcoRI để bảo vệ vùng này không bị cắt khi thao tác với EcoRI.

- Tạo đầu dính bằng cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết

bởi EcoRI, sau đó, cắt bằng enzyme EcoRI. Trong trường hợp này, chỉ có đoạn nối

bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn (do được metyl hóa). Đưa cDNA vào vector

tạo DNA tái tổ hợp.

- Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở EcoRI và đã khử

nhóm phosphat.

13

- Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa và enzyme ligase để tạo vector tái

tổ hợp.

- Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong các điều kiện thích

hợp để tạo dòng.

Ưu điểm: Gen thu nhận bằng phương pháp này đã loại bỏ được những trình tự

không mã hoá. Bằng con đường này, người ta đã tạo dòng gen mã hoá tổng hợp

globine của người, động vật và chim, protein thủy tinh thể mắt bò, ovalbumine

(protein lòng trắng trứng) và fibroin tơ tằm.

Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát triển, nó kết hợp

với các phương pháp khác của sinh học phân tử và được ứng dụng trong nhiều lĩnh

vực.

Hình: Sơ đồ tổng hợp gen từ mRNA

4. Vector chuyển gen

Trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA, chúng ta không thể đưa trực tiếp một gen từ tế

bào này sang tế bào khác mà cần thông qua một phương tiện để chuyển gen được

gọi là vector chuyển gen

4.1 Yêu cầu của vector chuyển gen

Phải có trình tự nhận biết để enzyme restriction endonuclease có thể nhận biết

và cắt

Vector phải có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ

thuộc vào sự sao chép bộ gen của tế bào chủ

14

Có trình tự điều hoà thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ

Có kích thước tương đối nhỏ để dễ xâm nhập vào tế bào.

Có khả năng tạo nhiều bản sao để khi tách khỏi tế bào được số lượng lớn, đảm

bảo sự khuếch đại của gen lạ mong muốn được gắn vào.

Dễ theo dõi sự biểu hiện của gen tái tổ hợp, yêu cầu này là cần thiết cho việc

phát hiện dòng cần tìm (chứa các gen đánh dấu, thường là các gen kháng chất kháng

sinh, hoặc gen tổng hợp chất màu)

4.2 Vector chuyển gen là plasmid

Các plasmid là những mẫu DNA nhỏ, ngắn, dạng vòng (khép kín), sợi đôi nằm

ngoài nhiễm sắc thể, được tìm thấy đầu tiên trong tế bào một số vi khuẩn. Chúng

sao chép được là nhờ một số enzyme có mặt trong tế bào vi khuẩn và không phụ

thuộc vào sự sao chép nhiễm sắc thể vi khuẩn do mỗi plasmid đều có vị trí khởi

đầu phiên mã (ori) riêng.

Do kích thước nhỏ nên plasmid chỉ chứa rất ít gen chọn lọc, thường đặc tính

chọn lọc là kháng kháng sinh. Từ khi được phát hiện đến nay, các plasmid không

ngừng được cải tiến và ngày càng được có thêm nhiều đặc tính quí cho việc tạo

dòng.

Trong phòng thí nghiệm, người ta sử dụng các plasmid nhân tạo mà được tạo

ra từ các plasmid tự nhiên và cài thêm một số chuỗi DNA.

4.2.1 Các plasmid thế hệ thứ nhất

Là những plasmid đầu tiên được sử dụng để tách dòng - được tìm thấy trong

tự nhiên như pSC101 (Stalay-Cohen), ColE1. Tuy vậy các plasmid này có rất ít

những đặc tính cần thiết. Sau này, các nhà nghiên cứu đã tìm ra các plasmid nhân

tạo thế hệ hai, ba bằng cách tập trung nhiều đặc tính quí của nhiều plasmid tự nhiên

vào một cấu trúc duy nhất.

4.2.2 Plasmid thế hệ thứ hai

Plasmid thế hệ thứ 2 được tạo ra bằng cách kết hợp các đặc tính quý của

nhiều plasmid tự nhiên, gắn thêm gen chỉ thị để tạo nên một plasmid mới. Điển hình

cho plasmid thế hệ thứ hai và cũng là một trong những plasmid được sử dụng rộng

rãi nhất trong Công nghệ di truyền, đó là plasmid pBR322

pBR322 - là plasmid được sử dụng rất phổ biến vào những năm 1980 để nhân

dòng trong tế bào E. Coli. Nó được tìm ra vào năm 1977 bởi Bolivar Rodrigues.

15

Hình: Cấu tạo plasmid pBR322

Có nhiều điểm nhận biết bởi enzyme cắt hạn chế và trong số đó có nhiều điểm

nhận biết nằm trong gen kháng kháng sinh. Ví dụ: gen kháng ampicilline (AmpR )có

ba trình tự nhận biết bởi ba enzyme cắt hạn chế là PstI, PvuI, ScaI. Còn gen kháng

tetracycline (TetR )có sáu điểm nhận biết là: EcoRV, BamHI, SphI, SlaI, XmaIII,

NnuI.

Ưu điểm của pBR322 là chúng có số bản sao lớn. Thực nghiệm cho thấy cứ 15

plasmid tái tổ hợp được biến nạp trong E. Coli, số lượng này có thể tăng lên từ

1.000 đến 3.000 bản sao trong điều kiện nuôi cấy tốt.

4.2.3 Các plasmid thế hệ ba

Đây là các plasmid mạnh và đa năng, tiện sử dụng cho nhiều loại RE khác

nhau với hàng chục trình tự nhận biết của chúng được nối tiếp nhau thành một đoạn

dài gọi là polylinker. Kích thước nhỏ, sao chép nhanh trong tế bào vi khuẩn, tạo số

lượng bản sao lớn

Các plasmid thế hệ 3 được chia làm 3 nhóm lớn:

- Dãy pUC như: pUC18, pUC19

- Dãy Gemini: Plasmid pGEM3, Plasmid pCR 2.1

- Nhóm các plasmid Bluescript

4.3.2.1 Dãy pUC:

pUC là plasmid của University California, có kích thước 2,6kb và có một số

đặc trưng sau:

16

(PstI, PvuI, ScaI)

(EcoRV, BamHI, SphI,

SlaI, XmaIII, NnuI.)

- Có một mảnh operon lacZ, các vi khuẩn chủ yếu sử dụng với pUC dùng để

tổng hợp enzyme β-galactosidase.

- Có vùng polylinker với 13 vùng giới hạn của 13 enzyme cắt hạn chế.

- Ở pUC18, vùng hạn chế (EcoRI, SacI, KnpI, XmaI, BamHI, XbaI, SalI,

HindI, AccI, BspmI, PstI, SphI, Hind III).

- Ở pUC19, vùng polylinker có trình tự ngược lại (Hind III.....EcoRI).

- Có một gen bền với ampicilline, gen này mã hoá cho protein (enzyme) vốn

được tiết ra trong khoảng ngoại biên màng sinh chất của vi khuẩn.

Hình: Cấu tạo plasmid pUC

Sự hiện diện của lacZ tạo thuận lợi cho vector tái tổ hợp bằng cách quan sát

các vi khuẩn trên thạch để chọn vi khuẩn có khả năng tiếp nhận một plasmid. Sự có

mặt của gen kháng ampicilline cho phép pUC được tiến hành nuôi cấy trên môi

trường có ampicilline

Ưu điểm: Kích thước nhỏ, dễ biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Vùng polylinker

cho phép gắn xen bất kỳ trình tự DNA lạ nào, hoặc có thể cho phép tạo dòng đoạn

DNA có hai đầu dính khác nhau mà không cần chất gắn.

4.3.2.2 Plasmid pGEM3 :

Hình: Cấu tạo plasmid pGEM3 (Gemini)

17

Kích thước khoảng 3kb, mang gen kháng ampicilline (AmpR) và vùng

polylineker gồm 13 trình tự nhận biết bởi 13 enzymee cắt hạn chế tương tự như

vùng polylineker của pUC19.

Hai promotor đặc trưng cho RNA-polymerase Sp6 và T7 ở hai bên vùng

polylinker. Vì vậy có ưu điểm là cho phép phiên mã đoạn DNA gắn trong vector

thành nhiều RNA, mà các RNA này thường được dùng làm mẫu dò, hoặc dùng

trong nghiên cứu cấu trúc chức năng của RNA.

4.3.2.3 Nhóm các plasmid bluescript:

Bluescrip là vector lai nhân tạo phage sợi và plasmid vì vậy nó được kết hợp

tất cả những ưu điểm của các phage và ưu điểm của các plasmid, có thể xem đó là

nhóm có tiềm năng nhất hiện nay.

Cấu tạo: Bluescript có cấu tạo dạng vòng khép kín, kích thước vào khoảng

2.961bp, bao gồm:

- Một mảnh lacZ ở đầu 5’ của gen này có cài sẵn polylinker gồm 21 vùng giới

hạn: KpnI, ApaI, DraII, XhoI, AccI, HindII, SalI, ClaI, HindIII, EcoRV, EcoRI,

PstI, SmaI, BamHI, SpeI, XbaI, NotI, XmaI, SacII, BstXI, SacI hoặc ngược lại. Ở

vùng polylinker người ta còn tìm thấy một vùng nhận biết tương đối hiếm (NotI) mà

không có ở dãy pUC. Với 2 promoter T3 và T7 để thu được đoạn cài RNA cùng

chiều hoặc ngược chiều qua việc sử dụng RNApolymerase của phage T3 nhận biết

promoter T3 hoặc ngược lại.

- Một mảnh DNA của phage tùy mục đích sử dụng có thể là phage M13 hoặc

phage f1.Vùng này sẽ sử dụng khi người ta muốn DNA tái bản dưới dạng sợi đơn

hoặc sợi đôi, ngoài ra ở vùng này còn chứa điểm khởi đầu cho sự tái bản (ori). Song

sự tái bản chỉ có thể xảy ra bởi sự đồng gây nhiễm với một virus trợ giúp (virus

helper). Virus này sẽ bổ khuyết những chức năng thiếu bằng cách mang đến những

gen mã hóa các enzyme cần thiết cho sự tái bản. Phụ thuộc vào sự cài đặt của mảnh

DNA này so với chiều của gen lacZ, người ta sẽ có vector bluescipt + hoặc −. Cặp

này cho phép nhận được sợi cùng chiều hoặc ngược chiều.

- Một gen chống chịu được ampicilline, gen này cho phép chọn lựa tất cả

những vi khuẩn đã sát nhập một bluescript. Trong vector bluescript còn có điểm

khởi đầu sao chép colEI ori, chuỗi này cho phép nhân bản của phagemid

(bluenscript) ở trong E. Coli như plasmid. Giống gốc E. Coli được sử dụng thường

18

là XL1Blu, trong bộ máy di truyền của chúng có chứa gen mã hóa tổng hợp

tetracycline. Điều này cho phép dễ dàng chọn lựa những vector đã sát nhập vào vi

khuẩn.

Hình: Cấu tạo pBluescript SK (+/-)

Ứng dụng: Tùy theo điều kiện thao tác người ta có thể sử dụng bluescript để

nhân bản một đoạn DNA sợi đơn hoặc sợi kép hoặc sao chép RNA invitro để sản

xuất đầu dò lai hóa hoặc tạo ngân hàng cDNA.

4.3 Vector chuyển gen là phage

Phage (thực khuẩn thể) là virus xâm nhiễm vi khuẩn làm phân giải vi khuẩn.

Việc sử dụng phage làm vector chuyển gen có nhiều ưu điểm hơn so với vector là

plasmid:

- Dễ xâm nhập vào vi khuẩn.

- Khả năng nhân lên nhanh trong tế bào chủ.

- Khả năng tiếp nhận đoạn DNA lạ lớn hơn plasmid.

Tuy nhiên, việc sử dụng phage có nhiều bất lợi như:

- Thao tác ghép DNA lạ phức tạp.

- DNA tái tổ hợp không tạo thành khuẩn lạc như DNA tái tổ hợp là

plasmid, mà thành đĩa phân giải xuất hiện trên mặt thạch phủ đầy vi khuẩn.

19

Phần lớn các nhóm phage sử dụng làm vector đều bắt nguồn từ phage λ thuộc

thế hệ thứ nhất.

Phage λ (thế hệ đầu)

Cấu tạo gồm hai phần: Phần đầu chứa DNA và được đóng gói trong vỏ

protein. Phần đuôi cho phép virus có thể tự cố định trên các tế bào chủ là vi khuẩn:

DNA của phage: Sợi đôi, mạch thẳng, dài 48,5kb gồm hàng chục gen. Đầu tận

cùng cuả DNA là sợi đơn gồm 12 nucleotide và chúng được gọi là những đầu dính.

Phage sinh sôi nẩy nở theo hai cách:

- Chu kỳ tan: phage được sinh sôi nẩy nở trong vi khuẩn. Các phage mới được

tạo ra sẽ đi ra khỏi vi khuẩn bằng cách làm tan vi khuẩn này.

- Sinh tan: Là một kiểu sinh sản khác của virus, phage không làm tiêu tan vi

khuẩn, thay vì tự sinh sản trong tế bào chất, phage sát nhập DNA của mình với

DNA của vi khuẩn.

Hình: Cấu tạo của phage λ

Hình: Tạo DNA tái tổ hợp

20

4.4 Các vector chuyển gen khác

4.4.1. Các cosmid

4.4.1.1 Đặc tính cấu tạo

Cosmid vector được thiết kế để nhân dòng những đoạn ADN lớn (khoảng

40-45 kb). Đây là loại vector nhân tạo kết hợp các thuộc tính của plasmid với

phage. Cosmid vector có chứa đầu cos (đầu dính) của phage giúp ADN của phage

từ dạng thẳng nối lại thành vòng tròn nên có thể gói bọc dễ dàng trong phần đầu của

phage. Mặt khác cosmid vector lại có phần gốc plasmid, do vậy chúng có khả năng

tự nhân đôi như những plasmid của vi khuẩn.

Do hầu như toàn bộ phần ADN của phage đã được cắt bỏ, nên chúng có khả

năng mang đoạn ADN ngoại lai có kích thước lớn. Khi đoạn ADN ngoại lai được

ghép nối, các cosmid tái tổ hợp sẽ được gói bọc trong phage. Phage mang ADN tái

tổ hợp không tự nhân lên được vì phần ADN phage đã bị loại bỏ nhưng chúng vẫn

có khả năng lây nhiễm vào vi khuẩn. Tuy nhiên sau khi vào vi khuẩn, chúng lại có

khả năng tự nhân lên do bản thân trong vi khuẩn đã có plasmid bình thường.

Cosmid mang đoạn gen lạ có thể dài đến 45 kb dùng để lập thư viện gen ở ruồi

giấm, chuột, thậm chí cả ở người.

4.4.1.2 Ưu điểm và ứng dụng của cosmid

Cũng như phage, cosmid cho khả năng xâm nhiễm tế bào vi khuẩn lớn, nhận

đoạn cài có kích thước lớn.

Hình: Cấu tạo cosmid

Trong tế bào chủ, nó tự nhân bản như plasmid. Cho nên người ta nhận được

những khuẩn lạc, chứ không phải đĩa phân giải trên mặt thạch, thuận lợi cho việc

quan sát.

21

Với những tiện lợi trên, người ta dùng cosmid để tách dòng từ những gen lớn

để tạo ngân hàng genom (bộ gen). Những vi khuẩn mang vector này có khả năng

chống chịu với môi trường có ampiciline.

Tuy vậy việc ứng dụng cosmid để tách dòng cũng rất khó khăn và vất vả.

4.4.2 Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC(Yeart - Artificial -

Chromosomes)

Do nhu cầu tạo dòng với những trình tự DNA ngày càng lớn, các nhà nghiên

cứu tìm tòi phát triển những vector ngày càng mới. Ngày nay người ta đã tạo ra

YAC cho phép tạo dòng với những đoạn DNA dài 150÷1.000kb, trung bình là

350kb. Bằng nghiên cứu cho thấy ở nấm men (Saccharomyces Cerevisiae), nhiễm

sắc thể muốn nhân đôi và phân ly tốt cần ba trình tự:

- 2 TEL (telomere): Trình tự đầu cuối của NST

- CEN (centrmere - tâm động): Trình tự trung tâm của NST, đảm bảo sự chia

đôi và đi về 2 cực của tế bào

- ARS (autonomously replicating sequence): Trình tự sao chép tự chủ tương tự

như ori ở plasmid

Dựa vào đó người ta đã cấu tạo NST nhân tạo có đủ ba trình tự nói trên với

cấu tạo gồm 2 cánh tay, giữa 2 cánh tay người ta có thể cài đặt một đoạn DNA cần

tạo dòng với kích thước khoảng 150 đến 1.000kb. Trên mỗi cánh tay gồm các gen

đánh dấu di truyền để chọn lọc các tế bào nấm men có chứa YAC và các chuỗi tận

cùng có chức năng telomer đoạn cuối của NST. Một trong hai cánh tay mang một

mảnh DNA hoạt động như một tâm động và một nguồn tái bản ori. Việc cài DNA lạ

vào gen mã hóa chất ức chế tRNA vận chuyển tyrsine sẽ làm biến đổi màu sắc

khuẩn lạc tế bào gốc có mang gen hổ phách (khuẩn lạc từ trắng sang đỏ) khi có mặt

của DNA lạ. Đây là dấu hiệu về sự hiện diện của YAC tái tổ hợp trong tế bào nấm

men.

Các nhiễm sắc thể này được đưa vào tế bào chủ (nấm men), nó được nhân lên

như NST khác ở trong tế bào nấm men và ta có được những gen mong muốn.

22

5. Các bước tiến hành trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA

5.1 Tạo DNA tái tổ hợp

5.1.1 DNA tái tổ hợp là gì?

DNA gồm 3 thành phần chính: base nitơ dạng purine và pyrimidine (A,T,C,G),

đường pentose (đường 5 carbon) và axit phosphoric (H3PO4). Ba thành phần này

có tỷ lệ 1:1:1 và chúng liên kết với nhau tạo thành một nucleotide:

Hình: Cấu tạo một nucleotide

Cấu trúc của DNA được Watson-Crick khám phá ra. Đó là chuỗi xoắn kép

cong nhẹ nhàng, có cấu trúc không gian 3 chiều, gồm hai sợi song song, đối xứng

và bổ sung cho nhau theo một qui luật nghiêm ngặt: A bắt cặp với T và C bắt cặp

với G nhờ các liên kết hydro.

Với cấu trúc đặc biệt của phân tử DNA và sự bắt cặp nghiêm ngặt của các base

nitơ, nhiều nhà nghiên cứu đã nảy ra ý tưởng: nếu tạo ra được những đuôi ở một

trong hai sợi của phân tử DNA khác nhau thì chúng có thể nối lại với nhau nhờ bắt

cặp bổ sung.

Vào những năm 70, người ta đã tạo được những phân tử DNA tái tổ hợp đầu

tiên bằng nhiều phương pháp khác nhau.

DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA lai - được tạo ra từ hai hay nhiều

nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kỹ

thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc

của các loài khác nhau.

Ví dụ: Hai vector là plasmid, phage λ được cài mảnh DNA lạ để tạo ra DNA

tái tổ hợp. Các DNA lạ này được gọi là đoạn cài hay DNA ngoại lai. Nó chính là

23

một mảnh (đoạn) DNA hay là gen mà người nghiên cứu quan tâm và ghép nó vào

DNA của plasmid hay DNA của virus.

Hình: Mô hình biểu diễn sự tạo ra DNA tái tổ hợp

5.1.2 Công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp

Năm 1973, Staley Cohen và Annie Chang đã tạo ra những phân tử DNA tái tổ

hợp từ các loài khác nhau, có nhiều ưu điểm và đã được biến nạp trong tế bào chủ.

Và từ đây, công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời. Sau đó, nhiều nhà khoa học đã lao vào

các thí nghiệm lắp ghép gen và nhanh chóng thu được những kết quả có ứng dụng

trong thực tiễn.

5.1.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Nuôi các tế bào vi sinh vật cho vector chuyển gen (thường là DNA plasmid

hoặc DNA phage). Tách chiết và làm sạch các vector chuyển gen

Nuôi tế bào cung cấp gen cần chuyển. Sau đó cũng tách chiết và làm sạch các

gen này.Ngoài ra, người ta còn sử dụng DNA tổng hợp bằng phương pháp hóa học

hoặc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược

Chuẩn bị các enzyme để cắt, nối các đoạn DNA lại với nhau như enzyme

restriction, enzyme ligase cùng với sự hợp tác của một số enzyme khác như kinase

và alkanline phosphotase,…

5.1.2.2 Công đoạn cắt

RE (Restriction Endonuclease) kiểu II: là những enzyme cắt hạn chế ở những

vị trí xác định và được dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp bởi vì chúng có một

số ưu điểm: Hầu như chỉ có một kiểu hoạt tính cắt, enzyme khác đảm nhiệm việc

cải biên. Mỗi một enzyme cắt ở vị trí phù hợp định trước ngay ở bên trong hay cạnh

24

trình tự nhận biết. Chúng chỉ cần ion Mg+2 và không cần năng lượng ATP. Các

enzyme này gặp chuỗi đích của nó trên phân tử DNA và cắt DNA thành hai mảnh

dạng đầu bằng hay đầu dính

Ví dụ:

5.1.2.3 Công đoạn nối

Dùng enzyme DNA ligase để nối các đoạn DNA và vector chuyển gen để tạo

thành DNA tái tổ hợp

DNA ligase là một enzyme xúc tác các phản ứng nối hai mảnh DNA bằng cách

tạo cầu nối phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH) của hai nucleotide đứng

cạnh nhau. Trong sinh học phân tử, người ta coi DNA ligase như một chất keo phân

tử để kết dính các mẫu DNA lại với nhau.

1 - Nối đầu bằng:

Nối đầu bằng được xảy ra khi hai đoạn DNA đầu bằng đứng cạnh nhau. Dưới

tác dụng của enzyme ligase, liên kết phosphodiester giữa đầu 5’(P) và đầu 3’(OH)

được hình thành và hai nucleotide được nối lại với nhau

Khả năng nối hai đoạn DNA đầu bằng rất thấp. Để tăng hiệu suất phản ứng,

thường người ta phải tăng nồng độ của các đoạn DNA.

2 - Nối đầu lệch:

Đầu tiên, hai mảnh DNA đầu lệch do có những base bổ sung nên chúng tiến gần lại

nhau để tạo liên kết hydro giữa các base nitơ bổ sung. Sau đó, hai nucleotide của hai

đầu nối tạo liên kết este giữa OH(3’) và P(5’) dưới tác dụng của enzyme DNA

ligase.

25

Hình: DNA và các phản ứng nối

5.1.3 Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp

5.1.3.1. Phương pháp đơn giản dùng đầu lệch

1 - Chọn và xử lý DNA plasmid:

Plasmid được tách từ tế bào E. Coli hoặc tế bào nấm men theo phương pháp

chiết tách DNA plasmid. Sau đó, dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo ra

plasmid hở có hai đầu lệch nhau.

2 - Chọn và xử lý đoạn cài:

DNA đoạn cài được thu nhận và lựa chọn, tinh chế theo mục đích của từng

nghiên cứu. Cắt DNA bằng enzyme RE loại II cùng loại với enzyme cắt plasmid

(EcoRI) để tạo ra các vết cắt giống nhau.

3 - Tạo plasmid tái tổ hợp:

26

Ghép đoạn cài vào plasmid bằng cách ủ các DNA đoạn cài với plasmid với sự

có mặt của enzyme DNA ligase, ta thu được DNA tái tổ hợp.

Hình: Phương pháp dùng đầu lệch

5.1.3.2. Phương pháp sử dụng đoạn nối (linker)

1 - Chọn và xử lý vector plasmid: (tương tự như trên)

2 - Chọn và xử lý đoạn cài:

Linker là những đoạn DNA dài 10 đến 15 nucleotide, được tổng hợp bằng

phương pháp hóa học, sao cho ở giữa mỗi linker phải có trình tự nhận biết bởi một

enzyme cắt hạn chế loại II. Ví dụ như EcoRI có chuỗi đích là G/AATTC.

cDNA đầu bằng được tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme sao chép ngược theo

cơ chế nuclease S1. Metyl hóa các vùng hạn chế có trong đoạn cDNA sợi đôi được

nhận biết bởi enzyme EcoRI.

27

Ủ linker có chứa chuỗi đích G/AATTC với cDNA và enzyme DNA ligase để

tạo phân tử lai. Cắt phân tử DNA lai bởi enzyme EcoRI, ta được phân tử lai có hai

đầu lệch.

3 - Tạo vector tái tổ hợp:

Để tạo vector tái tổ hợp, người ta ghép phân tử DNA lai đầu lệch vào plasmid

mà cũng được cắt bởi cùng một enzyme EcoRI. Nhờ tác dụng của enzyme DNA

ligase mà vector tái tổ hợp được tạo thành

Hình 4.5. Dùng các đoạn nối linker tạo DNA tái tổ hợp

28

5.1.3.3. Phương pháp sử dụng enzyme terminal transferase (ETT)

Nguyên tắc: Dựa vào đặc tính của enzyme terminal transferase có khả năng

gắn cùng một loại nucleotide vào đầu 3’(OH) của phân tử DNA.

Cách tạo DNA tái tổ hợp bằng phương pháp này được tiến hành theo 4 bước:

1 - Bước 1:

Chọn và phân lập DNA lạ đầu bằng và plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có

chứa chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI(G/GATCC).

Cắt plasmid bằng enzyme BamHI để tạo plasmid hở có hai đầu dính.

Cắt DNA lạ bằng enzyme exonuclease theo hướng 5’→ 3’ để tạo DNA có hai

đầu lệch nhau.

2 - Bước 2:

Ủ DNA lạ với cùng một loại nucleotide dCTP với sự có mặt của enzyme

terminal transferase để tạo đuôi polyC ở đầu 3’(OH) của DNA lạ.

Ủ plasmid với cùng một loại nucleotide dGTP với sự có mặt của enzyme

terminal transferase để tạo đuôi polyG ở đầu 3’(OH) của plasmid hở.

3 - Bước 3:

Đưa DNA lạ vào plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, các đầu mút

của homopolymer có trình tự bổ sung (---GGGG 3’/3’CCCC---)sẽ bắt cặp với nhau.

4 - Bước 4:

Bổ sung enzyme DNA-polymerase I để gắn các nucleotide tương ứng vào chỗ

trống theo nguyên tắc bổ sung. Ligase nối liên kết phosphodiester và cuối cùng tạo

được plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI.

Ưu điểm của phương pháp là ghép DNA lạ đầu bằng vào plasmid để tạo DNA

tái tổ hợp và chế tác được DNA đầu lệch từ DNA đầu bằng.

29

Hình: Cách tạo DNA tái tổ hợp dùng enzyme terminal transferase

5.2 Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận

5.2.1 Hoá biến nạp

Theo Mandel và Higa cho thấy rằng, E. Coli trở nên rất dễ bị biến nạp bởi

DNA ngoại lai khi các tế bào vi khuẩn được xử lý trong môi trường có CaCl2 và

trước đó được sốc nhiệt ở 42°C.

Hóa biến nạp là phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa

vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. Quá trình được thực hiện theo hai buớc sau: Xử lý

30

tế bào chủ trong dung dịch CaCl2 ở nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào và

ủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ đã xử lý.

Hiệu suất của phương pháp hóa biến nạp này vào khoảng 105 đến 106 tế bào

biến nạp trên 1mg DNA tái tổ hợp. Qua các kết quả thực nghiệm, người ta thấy

rằng, các tế bào phát triển ở pha sớm đến pha giữa dễ được biến nạp hơn.

Những nghiên cứu sau này cho thấy việc xử lý tế bào bằng các ion kim loại

hóa trị hai như Mg+2, Mn+2 và Ba+2 cũng cho khả năng biến nạp lớn. Ngoài ra, hiệu

suất biến nạp còn phụ thuộc vào kích thước của plasmid, plasmid càng nhỏ thì hiệu

suất biến nạp càng cao.

5.2.2 Điện biến nạp

Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao thế cục bộ theo xung để tạo lỗ nhỏ trên

màng sinh học của tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp dễ dàng.

Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, tuy

nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều có khi lên tới 70%. Hiệu suất của phương

pháp này phụ thuộc vào các yếu tố sau:

- Độ mạnh của điện trường tác động lên các loại tế bào khác nhau là khác nhau

- Độ dài của hằng số thời gian (thời gian ngắt xung - ms). Theo nhiều nghiên

cứu, hầu hết đối với các loại tế bào sinh vật, hiệu quả biến nạp cao khi hằng số thời

gian đạt được khoảng 6ms

- Nồng độ tế bào chủ

- Nồng độ DNA tái tổ hợp

- Giai đoạn phát triển của tế bào (quá già hoặc quá non đều không thích hợp)

- Môi trường dung dịch đệm

- Cấu trúc màng tế bào.

5.2.3 Bắn gen

Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng được bao bọc DNA và bắn

trực tiếp vào tế bào.

Ưu điểm: Phương pháp này có thể biến nạp cho tất cả các loại tế bào thực vật.

Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào.

Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận được cây biến nạp

khảm (cây có tế bào biến nạp và tế bào không biến nạp).

31

Một số thành tựu đã đạt được bằng phương pháp bắn gen: Năm 1988,

Mc.Cabe và cộng sự đã nhận được cây đậu tương biến nạp đầu tiên bằng phương

pháp bắn gen. Năm 1990, Promm, Gordon, Kamm và cộng sự đã nhận được cây

ngô biến nạp ở nhiều phòng thí nghiệm. Những năm gần đây có hàng loạt công bố

về biến nạp thành công ở lúa. Năm 1996, Zthang và cộng sự đã biến nạp ở đu đủ,

mía và bông. Điều đó đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp này.

5.2.4 Vi tiêm

Phương pháp vi tiêm là phương pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi để đưa

DNA tái tổ hợp vào mỗi tế bào nhất định. Đây là quá trình lai ghép cho tế bào bậc

cao hoặc tế bào hợp tử. Tùy thuộc từng trường hợp cụ thể, người ta có thể chọn

phương pháp sao cho việc đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào có hiệu quả cao.

Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào và quyết định

đưa DNA vào loại tế bào nào. Đưa chính xác và thậm chí vào tận nhân của tế bào

và có thể quan sát được. Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn, tế bào tiền phôi

cũng có thể tiến hành một cách chính xác. Có thể biến nạp cho mọi giống cây.

Nhược điểm: Một phát tiêm chỉ được một tế bào và thao tác cần phải khéo léo

và tỉ mỉ.

5.2.5 Tải nạp

Tải nạp là hiện tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector là virus từ vi khuẩn

cho sang vi khuẩn nhận, trong đó có quá trình chuyển gen và tái tổ hợp gen ở vi

khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage).

Thực nghiệm đã chứng minh được tải nạp ở E. Coli qua phage λ, phage P1 và

ở Bacillus subtilis qua phage SP10. So với các phương pháp trên, tải nạp cho hiệu

suất cao hơn.

Như vậy, đến nay đã có nhiều phương pháp hóa học, hóa lý, cơ học và sinh

học để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ. Tùy các đối tượng và yêu cầu cụ thể,

phương pháp này hay phương pháp khác có hiệu quả và được sử dụng nhiều hơn.

5.3 Phương pháp xác định dòng cần tìm

Sau khi đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ, người ta chọn ra những tế bào có

mang gen lạ và kiểm tra. Sau đó những dòng tế bào này được đem nhân lên tạo

thành dòng tế bào và duy trì lâu dài. Để nhận biết tế bào chưa DNA tái tổ hợp và tế

bào thường, người ta thường dùng các phương pháp sau:

32

5.3.1. Phương pháp lai axit nucleic(sử dụng gen đánh dấu)

Khái niệm đầu dò: Các đầu dò là những mảnh DNA được đánh dấu, có khả

năng nhận biết một chuỗi DNA hoặc RNA đồng đẳng qua lai hóa.

Đặc điểm của đầu dò: Là một đoạn axit nucleic (DNA hoặc RNA) sợi đơn.

Đầu dò phải bổ sung các base nitơ, đối song song với đoạn axit nucleic cần nhận

biết. Đầu dò phải so mốc được, đó là các đầu đánh dấu phóng xạ.

Các loại đầu dò:cDNA làm đầu dò cực tốt, ngoài ra, mRNA và oligonucleotide

cũng có thể làm đầu dò

Nguyên tắc: Dựa vào khả năng biến tính khi nhiệt độ tăng và hồi tính kho nhiệt

độ giảm từ từ của DNA. Khi nhiệt độ tăng quá nhiệt độ sinh lý(80 – 950C), hai sợi

đơn DNA sẽ tách rời nhau do liên kết hydro bị đứt. Khi hạ nhiệt độ từ từ, các mạch

đơn bắt cặp trở lại

Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu (đầu) dò đã được đánh dấu bằng đồng vị phóng

xạ hoặc hóa chất. Biến tính dòng cần tìm ở dưới dạng một sợi, sau đó hạ nhiệt độ từ

từ, các sợi đơn tương đồng bắt cặp với nhau. Sự bắt cặp xảy ra giữa DNA và DNA,

RNA và DNA, RNA và RNA.Biến tính DNA và lai phân tử

5.3.2. Phương pháp sử dụng kháng thể

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng đặc trưng của một số protein và kháng thể mà

chúng ta có thể nhận biết được qua phản ứng đặc trưng đó như phản ứng tạo màu,

phản ứng kết tủa.

Cách tiến hành: Chọn kháng thể đặc trưng cho protein (thuốc thử cho protein).

Tách protein được biểu hiện trong quá trình tạo dòng. Ủ protein với kháng thể đặc

33

trưng. Sau đó tiến hành nhận biết thông qua các dấu hiệu của phản ứng đặc trưng

giữa protein và kháng thể.

Ứng dụng: Chủ yếu sử dụng trong y học với hai yêu cầu sau: DNA cần nghiên

cứu được gắn vào vector phải biểu hiện protein khi tạo dòng và đồng thời, vector

tạo dòng phải là vector biểu hiện (ví dụ như vector λgt11). Protein biểu hiện cần

phải có kháng thể đặc trưng.

5.3.3. Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn

Nguyên tắc: Dựa vào sự mất khả năng kháng thuốc của vi khuẩn mang vector

tái tổ hợp khi chúng được nuôi cấy trong môi trường kháng sinh.

Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng cho vector có từ hai gen kháng thuốc

trở lên, ví dụ như vector pBR322. Trong plasmid pBR322 có hai gen kháng thuốc

AmPR và TetR. Trên các gen này có những điểm nhận biết của các RE nơi cài đặt

DNA lạ. Khi gắn DNA lạ vào một trong hai gen nói trên thì gen nhận đoạn cài mất

khả năng kháng thuốc. Quan sát những khuẩn lạc bị mất gen kháng thuốc, chứng tỏ

những khuẩn lạc đó có chứa gen cần tạo dòng.

Ưu điểm của phương pháp là ít tốn kém so với phương pháp lai.

5.3.4. Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình

Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi màu sắc của khuẩn lạc, chứng tỏ rằng, khuẩn

lạc đó có chứa gen lạ.

Cách tiến hành: Chuẩn bị hai mẫu thử nghiệm mà plasmid tạo dòng có chứa

gen lacZ (ví dụ như dãy pUC), một mẫu để so sánh còn mẫu kia để cài DNA lạ vào

gen lacZ. Sau đó, nuôi cấy cả hai mẫu trong môi trường có chất cảm ứng X-Gal

(5.brom-4chloro-3indolyl D-galactopynoside). Chất cảm ứng này bị phân hủy bởi

enzyme β-galactosidase tạo ra galactose và X (dẫn xuất indol), ngoài môi trường,

dẫn xuất này bị oxy hóa cho màu xanh đậm. Qua quan sát, ta thấy plasmid không

chứa gen lạ cho khuẩn lạc màu xanh do gen lacZ tổng hợp enzyme β-galactosidase.

Còn plasmid thứ 2 cho khuẩn lạc màu trắng, điều đó chứng tỏ nó chứa DNA lạ

được cài trong gen lacZ và chọn những khuẩn lạc màu trắng.

6 Ứng dụng

Công nghệ di truyền được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và sản

xuất liên quan đến nông nghiệp, y dược, bảo vệ môi trường, công nghệ thực phẩm...

34

6.1.Trong y dược:

Vận dụng kỹ thuật di truyền, các nhà khoa học đã có thể chẩn đoán các bệnh

do rối loạn di truyền và tiến tới điều trị bằng cách thay gen bệnh bằng gen lành, đưa

gen lành vào cơ thể để bù đắp cho các gen bị thiếu hụt- đây là một hướng ứng dụng

khó thực hiện nhất hiện nay.

Ứng dụng công nghệ di truyền mạnh nhất trong y tế là nghành sản xuất thuốc

kháng sinh, vác xin, kháng thể đơn dòng dùng để phân tích miễn dịch, định vị các

khối u, phát hiện một số protein có liên quan đến sự hình thành khối u…

Nhờ công nghệ sử dụng DNA tái tổ hợp mà người ta có thể sản xuất một số

protein có hoạt tính sinh học dùng để chữa bệnh như insulin chữa bệnh tiểu đường,

interferon chữa bệnh ung thư, các hormon tăng trưởng cho con người. Bản chất của

công nghệ này là làm thay đổi bộ máy di truyền của tế bào bằng cách đưa gen mã

hóa cho một protein đặc hiệu và bắt nó hoạt động để tạo ra một lượng lớn loại

protein mà con người cần.

6.2. Trong nông nghiệp:

Kỹ thuật di truyền được sử dụng để xác định vị trí của các gen mã hóa cho các

tính trạng mong muốn, giúp cho việc lai tạo, chọn giống cũng như tạo ra các sinh

vật chuyển gen nhanh và hiệu quả cao như: chuyển gen để tạo ra giống cây trồng có

khả năng chống sâu hại, kháng lại vi sinh vật gây bệnh, chống chịu thuốc trừ cỏ,

quả chín chậm, năng suất chất lượng cao... Đối với các động vật nuôi, công nghệ di

truyền tạo ra các vật nuôi chuyển gen hormone sinh trưởng làm cho chúng tăng

trọng nhanh hoặc tạo động vật nuôi tăng sản lượng và chất lượng sữa, tạo sữa, có

chứa các protein có tác dụng kháng sinh hoặc tạo phủ tạng có thể thay thế cho

người.... Ví dụ:

Chuyển gen kháng được nhiều loại thuốc diệt cỏ từ thuốc lá cảnh vào cây đậu

tương (1989).

Cấy gen qui định khả năng chống chịu lại 1 số chủng vi rút gây thối củ vào

khoai tây (1990).

Ở Việt Nam, chuyển gen kháng rầy nâu, kháng sâu, gen tổng hợp vitamin A

vào một số loại cây trồng: lúa, ngô, khoai tây, cà chua, đu đủ...

Cây trồng chuyển gen cải tiến các protein hạt: người ta đã đưa gen mã hóa một

loại protein chứa các amino acid có lưu huỳnh vào cây đậu lupin. Kết quả là tăng

35

100% hàm lượng protein trong hạt. Hạt này được dùng để nuôi cừu, tăng trọng

lượng 7% và sản lượng lông tăng 8% so với cừu nuôi bằng loại hạt bình thường.

Cây trồng chuyển gen mang tính bất dục đực: ứng dụng trên các cây tự thụ

phấn như bắp,… vì các cây có ưu thế lai cao thường là kết quả của quá trình ngoại

phối. Nguyên lý chung của phương pháp là chuyển một gen mã hoá enzyme phân

giải ARN tên là barmnase tách từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens gắn

promotor TA29. Promotor TA29 chỉ hoạt động ở vùng hạt phấn do vậy, khi gen

barmnase gắn với promotor được chuyển vào cây thì toàn bộ ARN ở hạt phấn bị

phá huỷ mà không ảnh hưởng tới các vùng khác. Kết quả là tạo được các dòng bất

dục đực

Ngoài ra, ta còn tạo được động vật biến đổi gen: như chuyển gen sinh trưởng

của bò vào lợn, chuyển gen xác định mùi sữa ở người vào tế bào phôi bò cái làm

sữa bò có mùi sữa người và dễ tiêu hoá dùng để nuôi trẻ em trong vòng 6 tháng

tuổi, chuyển gen tổng hợp hoocmon sinh trưởng ở người vào cá trạch.

Lợn mang gen người ghép nội tạng Khoai tây chuyển gen chứa vacxin ngừa

viêm gan B

Đậu được chuyển gen kháng thuốc Gạo biến đổi gen có nhiều vitamin A,

diệt cỏ protein hơn

36

Cà chua chứa gen sàn xuất sắc tối của hoa mõm chóchống oxy hóa

Chuyển gen kháng sâu bệnh vào cây bông (bên phải)

Cây đu đủ chuyển gen kháng virus (bên trái)và cây đối chứng

6.3 Trong bảo vệ môi trường

- Làm sạch đất ô nhiễm: Selen là một nguyên tố hóa học, gây độc đối với thực

vật nếu hàm lượng của chúng quá cao trong đất. Đất canh tác tại một số vùng của

bang California được tưới tiêu mạnh và nước hòa tan selen có trong đá phiến sét.

Khi nước bốc hơi trên mặt đất, senlen sẽ tích tụ ngày càng nhiều. Cây mù tạt Ấn Độ

(Brassica juncea) vốn có khả năng kháng và hấp thụ selen qua rễ. Tuy nhiên, Terry

và cs (Đại học California) đã thúc đẩy thêm khả năng trên của cây mù tạt bằng cách

bổ sung một số gen tạo enzyme đói selen. Kết quả là loại thực vật GM này có thể

hấp thụ selen cao gấp 4,3 lần so với mù tạt Ấn Độ dạng hoang dại, và chúng được

thu hoạch 45 ngày sau khi trồng.

37

Hình: Cây mù tạt chuyển gen

- Tạo ra những chủng vi khuẩn phân hủy dầu mỏ, phân hủy chất hữu cơ làm

sạch nước bẩn: Tổ hợp 4 gen từ 4 chủng có khả năng cắt mạch hữu cơ của dầu mỏ

vào cùng một chủng vi khuẩn và dùng chủng vi khuẩn đó để phân hủy lớp dầu

loang trên biển.

6.4 Trong công nghệ thực phẩm

6.4.1 Trong công nghệ lên men

Đây là một lĩnh vực quan trọng trong sản xuất thực phẩm. Việc tuyển chọn

các chủng vi sinh vật có khả năng lên men tốt, đem lại hiệu quả cao là rất cần thiết.

Các nghiên cứu sử dụng công nghệ di truyền phục vụ cho công nghệ lên men chủ

yếu đi vào hai hướng chính là:

- Phân tích di truyền các loại vi sinh vật sử dụng trong quá trình lên men, xác

định các gen mã hóa cho các tính trạng mong muốn nhằm tạo ra năng suất và chất

lượng sản phẩm lên men.

- Tạo ra các vi sinh vật chuyển gen phục vụ cho các qui trình lên men.

Ví dụ:

Trong sản xuất rượu, ngày nay người ta đã dùng các chủng vi sinh vật có khả

năng tạo rượu cao và cho hương vị tốt. Phần lớn các chủng đó được nghiên cứu,

tuyển chọn, lai tạo bằng công nghệ di truyền.

Để sản xuất rượu vang, trước đây, người ta phải dùng hai loại vi sinh vật là S.

Cerevisiae để tạo ra hàm lượng rượu trong dịch lên men và sau đó, sử dụn

Leuconostos trong lên men phụ ở quá trình tàng trữ, nhằm nâng cao chất lượng của

rượu. Ngày nay, người ta tiến tới dùng một chủng vi sinh vật chuyển gen để thực

hiện cả hai quá trình.

Công nghệ di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc tuyển chọn và tạo ra

các vi sinh vật có hoạt tính enzyme cao, sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Đối

38

với các sản phẩm lên men sữa như phomat và sữa chua, trước kia, người ta thường

sử dụng những vi sinh vật tự nhiên có mặt trong sữa để lên men, do vậy, người ta

khó lòng kiểm soát quá trình lên men và hiệu quả không cao. Ngày nay, với công

nghệ di truyền, người ta đã tạo được các chủng mới với các tính chất xác định và đã

điều khiển được quá trình lên men theo định hướng mong muốn.

6.4.2 Sản xuất enzyme

Trong những năm gần đây, bằng cách sử dụng công nghệ di truyền, người ta

đã tuyển chọn và tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme

chịu nhiệt, chịu axit, chịu kiềm tốt. Enzyme λ-amylase chịu nhiệt đã và đang được

sử dụng nhiều để sản xuất nha, đường glucose từ tinh bột.

6.4.3 Enzyme tái tổ hợp có khả năng khử độc tố Aflatoxine

Độc tố vi nấm quan trọng và nguy hiểm nhất hiện nay thuộc nhóm aflatoxin.

Các độc tố này là chất chuyển hóa của các loài vi nấm Aspergillus, nồng độ giới

hạn đã được WHO qui định được có trong thực phẩm là 5ppb (5μg/Kg).

Tập đoàn China medicine của Trung quốc đã thực hiện một dự án nghiên cứu

và sản xuất thành công một sản phẩm sinh học gọi là rADTZ (recombinant aflatoxin

detoxifizym enzyme) - enzyme tái tổ hợp khử độc tính aflatoxin.

Toàn bộ cấu trúc gen của rADTZ được tái tổ hợp từ một loại vi nấm. Để chế

tạo rADTZ phải làm nhiều công đoạn: nuôi cấy vi nấm, tinh chế protein, tạo dòng

gen, tái tổ hợp gen, và lên men.

Hợp chất này là dẫn xuất của một enzyme ngoại tế bào, enzyme này có khả

năng làm phá vỡ cấu trúc vòng bifuran làm mất độc tính, và có chức năng như là

một chất đối kháng (antidote) của aflatoxin. Do đó, rADTZ có triển vọng dùng để

làm một chất khử độc tố aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc

Những thuốc thử phát hiện sinh học dựa trên men rADTZ có thể được sử dụng

trong kiểm nghiệm y học để ứng dụng vào việc giám định và kiểm tra chất lượng

sản phẩm của ngành công nghiệp sản xuất thực phẩm. Hơn nữa, hiên nay, người ta

chưa thực hiện được việc khử độc tố aflatoxin bị nhiễm trong sữa. Việc xử lý bằng

cách kiềm hoá và chiếu tia cực tím (UV) được sử dụng để khử aflatoxin trong dầu

đậu phọng, cách xử lý này có thể ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm sau xử lý.

Trong khi đó xử lý bằng rADTZ trong những điều kiện đặc biệt không làm ảnh

hưởng đến chất lượng và điều kiện bảo quản của sản phẩm.

39

PHẦN KẾT LUẬN

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

Từ những nghiên cứu thuần tuý ban đầu, công nghệ di truyền đã chuyển thành

một nghành công nghiệp trị giá nhiều tỷ USD

Bên cạnh những ứng dụng cực kỳ to lớn, có lợi cho con người, các nhà khoa

học cũng cảnh báo một số hiểm hoạ tiềm ẩn mà các sinh vật biến đổi gen có thể gây

ra, ví dụ như gen của các sinh vật biến đổi thất thoát ra ngoài tự nhiên, truyền sang

sinh vật khác có thể gây nguy hiểm cho hệ sinh thái.

Tuy ngày nay, các nhà khoa học đã có thể tổng hợp được các gen nhân tạo hay

ghép gen này hay gen kia vào bộ máy di truyền của một sinh vật nào đó, nhưng

chắc chắn, còn rất nhiều vấn đề về những bí ẩn của sự sống, nhất là ở các sinh vật

bậc cao vẫn chưa được khám phá. Người ta có thể chứng tỏ sự vô hại của các loại

thực phẩm từ thực vật, động vật hay vi sinh vật chuyển gen qua các thí nghiệm,

nhưng về lâu dài, người ta chưa thể khẳng định được sự vô hại đó, vì vậy, không ít

người đã tỏ ra lo lắng khi sử dụng chúng thường xuyên với một số lượng lớn.

40

PHỤ LỤC

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

1. Restriction enzyme

Enzyme Source Recognition

Sequence Cut

EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC

3'CTTAAG

5'---G AATTC---3'

3'---CTTAA G---5'

EcoRII Escherichia coli 5'CCWGG

3'GGWCC

5'--- CCWGG---3'

3'---GGWCC ---5'

BamHI Bacillus

amyloliquefaciens

5'GGATCC

3'CCTAGG

5'---G GATCC---3'

3'---CCTAG G---5'

HindIII Haemophilus influenzae 5'AAGCTT

3'TTCGAA

5'---A AGCTT---3'

3'---TTCGA A---5'

TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA

3'AGCT

5'---T CGA---3'

3'---AGC T---5'

NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC

3'CGCCGGCG

5'---GC GGCCGC---3'

3'---CGCCGG CG---5'

HinfI Haemophilus influenzae 5'GANTC

3'CTNAG

5'---G ANTC---3'

3'---CTNA G---5'

Sau3A Staphylococcus aureus 5'GATC

3'CTAG

5'--- GATC---3'

3'---CTAG ---5'

PovII* Proteus vulgaris 5'CAGCTG

3'GTCGAC

5'---CAG CTG---3'

3'---GTC GAC---5'

SmaI* Serratia marcescens 5'CCCGGG 5'---CCC GGG---3'

41

3'GGGCCC 3'---GGG CCC---5'

HaeIII* Haemophilus aegyptius 5'GGCC

3'CCGG

5'---GG CC---3'

3'---CC GG---5'

HgaI Haemophilus gallinarum 5'GACGC

3'CTGCG

5'---NN NN---3'

3'---NN NN---5'

AluI* Arthrobacter luteus 5'AGCT

3'TCGA

5'---AG CT---3'

3'---TC GA---5'

EcoRV* Escherichia coli 5'GATATC

3'CTATAG

5'---GAT ATC---3'

3'---CTA TAG---5'

EcoP15I Escherichia coli 5'CAGCAGN 25 NN

3'GTCGTCN 25 NN

5'---CAGCAGN 25 NN ---3'

3'---GTCGTCN 25 NN---5'

KpnI Klebsiella pneumoniae 5'GGTACC

3'CCATGG

5'---GGTAC C---3'

3'---C CATGG---5'

PstI Providencia stuartii 5'CTGCAG

3'GACGTC

5'---CTGCA G---3'

3'---G ACGTC---5'

SacI Streptomyces

achromogenes

5'GAGCTC

3'CTCGAG

5'---GAGCT C---3'

3'---C TCGAG---5'

SalI Streptomyces albus 5'GTCGAC

3'CAGCTG

5'---G TCGAC---3'

3'---CAGCT G---5'

ScaI Streptomyces

caespitosus

5'AGTACT

3'TCATGA

5'---AGT ACT---3'

3'---TCA TGA---5'

SpeI Sphaerotilus natans 5'ACTAGT

3'TGATCA

5'---A CTAGT---3'

3'---TGATC A---5'

SphI Streptomyces

phaeochromogenes

5'GCATGC

3'CGTACG

5'---G CATGC---3'

3'---CGTAC G---5'

StuI Streptomyces 5'AGGCCT 5'---AGG CCT---3'

42

tubercidicus 3'TCCGGA 3'---TCC GGA---5'

XbaI Xanthomonas badrii 5'TCTAGA

3'AGATCT

5'---T CTAGA---3'

3'---AGATC T---5'

Key: * = blunt ends ; N = C or G or T or A ; W = A or T

2. H&Đ an toàn thực phẩm từ ADN tái tổ hợp

Hiện nay ngừời tiêu dùng khắp nơi trên thế giới đang quan tâm đến vần đề an

toàn thực phẩm đối với các sản phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp. Thông tin

đưa ra dưới đây dựa trên tài liệu của Institute of Food Technologists (USA). Đây là

một tổ chức phi lợi nhuận, với hơn 29.000 thành viên từ các nước khác nhau, thuộc

lĩnh vực khoa học và công nghệ thực phẩm.

Hỏi: Sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp có an toàn

không?

CÓ. Thực tế mà nói thì các quá trình của công nghệ ADN tái tổ hợp còn chính xác

và dễ dự đoán hơn so với công nghệ lai tạo giống với kỹ thuật “cổ truyền”

(conventional). Việc chuyển một hoặc vài gien đã được nghiên cứu đặc tính kỹ

lưỡng thường có ít rủi ro hơn so với phương pháp lai tạo giống “cổ truyền”. Ở

phương pháp cổ truyền, hàng trăm nghìn gien của mỗI cây tương tác lẫn nhau và tạo

nên hàng loạt tái tổ hợp ngẫu nhiên. Ngoài ra, tất cả các thực phẩm có nguồn gốc từ

ADN tái tổ hợp đều được kiểm tra nghiên cứu kỹ lưỡng trước khi đưa ra thương

mại hoá. Nhiều tổ chức khoa học quốc tế đã nghiên cứu và đưa ra kết luận rằng “Sử

dụng thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp là hoàn toàn an toàn”

Hỏi: Sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp có làm biến đổi

ADN của ngừơi sử dụng không?

KHÔNG. ADN bị phân cắt hoàn toàn và rất nhanh trong quá trình tiêu hoá.

Hỏi: Trong trường hợp sử dụng thực phẩm chuyển gien thì người tiêu dùng

có ăn một lượng lớn ADN tái tổ hợp không?

KHÔNG. Các gien chuyển sử dụng kỹ thuật ADN tái tổ hợp chỉ chiếm 1/250.000

trên tổng số ADN của thực phẩm đó. Không có bằng chứng nào cho thấy có xảy ra

sự chuyển gien từ ADN của thực phẩm “cổ truyền” sang sinh vật hay người tiêu

dùng, nguy cơ xảy ra chuyển gien từ thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp

còn thấp hơn rất nhiều lần so với ADN từ thực phẩm “cổ truyền”

43

Hỏi: Đã có trường hợp nào mà tiêu thụ thực phẩm có nguồn gốc từ ADN

tái tổ hợp gây ảnh hưởng đến sức khoẻ chưa?

CHƯA. Cho đến nay chưa có báo cáo nào về vấn đề này. Tuy nhiên cũng có những

trường hợp báo cáo không chính xác. Cụ thể vào năm 1980, đã có báo cáo về 1.500

người bị ngộ độc và 37 người chết do sử dụng L-tryptophan sản xuất bởi sinh vật có

nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp. Tuy nhiên, các nghiên cứu sau đó đã cho thấy rằng,

đồng thời với việc đưa vi sinh vật có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp vào sản xuất

Tryptophan, nhà sản xuất này đã bỏ bớt một bước quan trọng trong quá trình tinh

sạch, vì thế lượng carcbon hoạt hoá còn lại trong sản phẩm rất cao. Đây là nguyên

nhân dẫn đến trường hợp trên.

Hỏi: Hiện nay những yếu tố nào được sử dụng trong việc đánh giá an toàn

thực phẩm?

An toàn thực phẩm được đánh giá dựa trên nhiều yếu tố, trong đó bao gồm: vi sinh

vật, độc tố, chất gây dị ứng, và thành phần dinh dưỡng. Để đánh giá độ an toàn của

gien được chuyển, các nhà khoa học còn quan tâm đến nguồn gốc của gien. Gien

phải có nguồn gốc an toàn đối với người tiêu thụ (V.D: gien bắt nguồn từ một thực

phẩm khác). Độc tố và chất gây dị ứng đều được nghiên cứu trên các đối tượng

chuyển gien trước khi đưa ra thương mại hoá. Ngoài ra, sự tương tác giữa protein

của gien chuyển và protein của vật chủ cũng được nghiên cứu nhằm loại bỏ những

trường hợp tương tác gây thay đổi đặc tính sản phẩm của gien chuyển. Cuối cùng,

thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp còn được đánh giá, so sánh với thực

phẩm “cổ truyền” cùng loại.

Hỏi: Thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp an toàn như vậy, tại sao

vẫn có một nhóm người không ủng hộ?

Đây quả thật là một câu hỏi khó trả lời, mỗi người nhìn nhận sản phẩm mới, công

nghệ mới dựa trên nhiều yếu tố khác nhau như, khoa học, an toàn, giá thành, độ

thuận tiện, tính phổ biến, v. v. và “what’s in it for me?”. Thậm chí những công nghệ

mới trong y học chữa bệnh cũng còn cần trải qua nhiều năm mới được công nhận

hoàn toàn. Đối với thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp, nhiều vấn đề do

người tiêu dùng thể hiện đều không có những bằng chứng khoa học ủng hộ.

Hiểu biết đầy đủ về công nghệ ADN tái tổ hợp là cần thiết để hiểu biết đúng về an

toàn của thực phẩm có nguồn gốc từ ADN tái tổ hợp.

44

Thông tin thêm về vấn đề này hiện có ở http://www.ift.org

(Translated by Le Tien Dung 2002)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

1. ThS Lò Thanh Sơn, Bài giảng Công nghệ di truyền, Trường Đại hoc Tây Bắc

2. Phạm Thành Hổ, Sinh học đại cương, NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí

Minh, 2002

3. http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme

4. http://highered.mcgraw-hill.com/sites/dl/free/0072437316/120060/

ravenanimation.html

5. http://www.cynosura.org/index.php?

option=com_content&view=article&id=10:ha-an-toan-thc-phm-t-adn-tai-t-

hp

6. http://www.ihph.org.vn/DownloadFolder/AFLATOXIN%20chau%20vinh

%20thi.pdf

45

MỤC LỤC

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

PHẦN MỞ ĐẦU 2

PHẦN NỘI DUNG 4

1. Nguyên lí cơ bản của kĩ thuật tái tổ hợp DNA 4

2. Các enzyme sử dụng trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA 5

2.1 Enzyme giới hạn RE (Restriction Enzyme) 5

2.1.1 Khái niệm về enzym giới hạn 6

2.1.2 Phân loại enzym giới hạn 6

2.1.3 Tính đặc hiệu vị trí 7

2.2 Nuclease 8

2.3 Enzyme nối 10

2.3.1. Ligase 10

2.3.2. Các enzyme dephosphoryl hoá ( khử nhóm PO4-3 ) 10

2.4 Các enzym polymerase 11

2.4.1 Khái niệm 11

2.4.2 Phân loại 12

3. Thu nhận gen 12

3.1 Tách chiết DNA trực tiếp từ tế bào 12

3.2 Tổng hợp bằng phương pháp hoá học 12

3.3 Tổng hợp từ mRNA của gen tương ứng 13

4. Vector chuyển gen 14

4.1 Yêu cầu của vector chuyển gen 14

4.2 Vector chuyển gen là plasmid 15

46

4.2.4 Các plasmid thế hệ thứ nhất 15

4.2.5 Plasmid thế hệ thứ hai 15

4.2.6 Các plasmid thế hệ ba 16

4.3 Vector chuyển gen là phage 19

4.4 Các vector chuyển gen khác 21

4.4.1. Các cosmid 21

4.4.2 Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC 22

5. Các bước tiến hành trong kĩ thuật tái tổ hợp DNA 23

5.1 Tạo DNA tái tổ hợp 23

5.1.1 DNA tái tổ hợp là gì? 23

5.1.2 Công đoạn chính tạo DNA tái tổ hợp

24

5.1.3.1 Chuẩn bị nguyên liệu 24

5.1.3.1 Công đoạn cắt 24

5.1.3.1 Công đoạn nối 25

5.1.3 Các phương pháp tạo DNA tái tổ hợp 26

5.1.3.1 Dùng đầu lệch 26

5.1.3.2 Sử dụng đoạn nối (linker) 27

5.1.3.3 Sử dụng enzyme terminal transferase (ETT) 29

5.2 Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận 30

5.2.1 Hoá biến nạp 30

5.2.2 Điện biến nạp 31

5.2.3 Bắn gen 31

5.2.4 Vi tiêm 32

5.2.5 Tải nạp 32

5.3 Tạo dòng phân tử 32

5.3.1 Phương pháp lai axit nucleic(sử dụng gen đánh dấu) 33

5.3.2 Phương pháp sử dụng kháng thể 33

5.3.3 Phương pháp phát hiện do mất hoạt tính vì xen đoạn 33

5.3.4 Phương pháp phát hiện do thay đổi kiểu hình 34

6 Ứng dụng 34

6.1 Trong y dược 34

47

6.2 Trong nông nghiệp 35

6.3 Trong bảo vệ môi trường 36

6.4 Trong công nghệ thực phẩm 37

PHẦN KẾT LUẬN 40

PHỤ LỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

48