sinteza i karakterizacija kompleksa prelaznih metala … sinteza i karakterizacija kompleksa...

UNIVERZITET U BEOGRADU

HEMIJSKI FAKULTET

Milica R. Milenković

SINTEZA I KARAKTERIZACIJA

KOMPLEKSA PRELAZNIH METALA SA

KONDENZACIONIM PROIZVODOM

2-(DIFENILFOSFINO)BENZALDEHIDA I

ETIL-KARBAZATA

doktorska disertacija

Beograd, 2015

UNIVERSITY OF BELGRADE

FACULTY OF CHEMISTRY

Milica R. Milenković

SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION

OF TRANSITION METAL COMPLEXES

WITH CONDENSATION PRODUCT OF

2-(DIPHENYLPHOSPHINO)

BENZALDEHYDE AND ETHYL

CARBAZATE

Doctoral Dissertation

Belgrade, 2015

Mentor

_____________________________________

Dr Katarina Anđelković, redovni profesor

Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu

Članovi komisije:

_____________________________________

Dr Dušan Sladić, redovni profesor

Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu

______________________________________

Dr Natalija Krstić, viši naučni saradnik

IHTM-Centar za hemiju Univerziteta u Beogradu

Datum odbrane___________________________

ZAHVALNICA

Ova doktorska disertacija je urađena na Katedri za opštu i neorgansku hemiju,

Hemijskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu u okviru projekta Ministarstva prosvete,

nauke i tehnološkog razvoja pod nazivom „Interakcije prirodnih proizvoda, njihovih

derivata i kompleksnih jedinjenja sa proteinima i nukleinskim kiselinama”. Deo istraživanja

je urađen na Institutu za onkologiju i radiologiju u Beogradu, Institutu za nuklearne nauke

„Vinča” u Beogradu, Farmaceutskom fakultetu Univerziteta u Beogradu, Hemijskom

departmanu Univerziteta u Parmi i Hemijskom fakultetu Univerziteta Adam Mickiewicz u

Poznanju.

Iskreno se zahvaljujem prof. dr Katarini Anđelković, mentoru, koja je predložila

temu ove disertacije, na ukazanom poverenju, strpljenju, korisnim savetima, pruženoj

pomoći i podršci tokom izrade i pisanja doktorske disertacije, konstantnom praćenju moga

rada i prenetom znanju. Hvala na pruženim uslovima i obezbeđenim sredstvima bez kojih

ne bi bilo ove teze.

Zahvaljujem se prof. dr Dušanu Sladiću na nesebičnoj pomoći i savetima,

konstruktivnim smernicama tokom izrade i uobličavanja ove teze, pomoći tokom pisanja

radova, na sugestijama koje su mi pomogle da rešim nedoumice na koje sam nailazila

tokom istraživanja, korisnim diskusijama, prenetom znanju i uvek prijatnoj i stimulativnoj

radnoj atmosferi.

Zahvaljujem se dr Nataliji Krstić na nesebičnoj pomoći i korisnim sugestijama

prilikom pisanja ove teze.

Zahvaljujem se dr Dušanki Radanović na savetima i korisnim diskusijama.

Zahvaljujem se Božidaru Čobeljiću na pomoći tokom eksperimentalnog rada,

pisanja radova, prijateljstvu, razumevanju, strpljenju, nebrojenim satima konstruktivnih

razgovora i nesebičnoj podršci koju mi je pružao u toku izrade ove disertacije.

Zahvaljujem se svojim dragim prijateljima i kolegama Maji (dr Maji Šumar

Ristović) i Jeri (dr Dejanu Jeremiću) na iskrenom prijateljstvu, nesebičnoj drugarskoj

pomoći koju su mi pružili, na zanimljivim razgovorima koje smo vodili, a koji su dali

gomilu odličnih ideja i na svim prijatnim trenucima koje smo zajedno proveli u našoj 527

laboratoriji.

Zahvaljujem se svojim dragim kolegama iz velike laboratorije na prvom spratu:

Jovani, Tanji, Ireni, Ivani, Tufiju i Marku na podršci i saradnji tokom svih ovih godina.

Zahvaljujem se koleginicama iz laboratorije 474 dr Miroslavi Vujčić i Barbari

Janović na korektnoj i uspešnoj saradnji.

Veliko hvala mojoj Ljubi Anđelković, dragom prijatelju, čija mi podrška puno

znači.

A najveće hvala, naravno, mom taji Ratku Milenkoviću, na podršci, pomoći i

razumevanju, od „malih nogu” do današnjih dana.

SINTEZA I KARAKTERIZACIJA KOMPLEKSA PRELAZNIH

METALA SA KONDENZACIONIM PROIZVODOM

2-(DIFENILFOSFINO)BENZALDEHIDA I ETIL-KARBAZATA

REZIME

U ovom radu opisana je sinteza, karakterizacija i biološka aktivnost kompleksa

Co(III), Fe(III), Pd(II) i Ni(II) sa kondenzacionim proizvodom

2-(difenilfosfino)benzaldehida i etil-karbazata.

U radu je opisana i jednostavna metoda za sintezu racemskog hidrazinom

premošćenog difosfonijum jedinjenja, analoga biciklo[3.3.2]dekana, 5,5,11,11-tetrafenil-

5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata.

U svim sintetisanim kompleksima hidrazonski ligand je tridentatno koordinovan za

jon metala preko atoma fosfora, iminskog azota i karbonilnog kiseonika. Oktaedarsko

okruženje u kompleksima Co(III) i Fe(III) formiraju dva molekula hidrazonskog liganda. U

Fe(III) kompleksu ligand je koordinovan u neutralnom obliku, dok pri formiranju Co(III)

kompleksa dolazi do deprotonovanja liganda. U kvadratno-planarnim kompleksima Pd(II) i

Ni(II) hidrazonski ligand je koordinovan kao monoanjon, dok četvrto koordinaciono mesto

zauzima hlorido ligand u Pd(II) kompleksu ili pseudohalogenidi (cijanat, tiocijanat i azid) u

Ni(II) kompleksima.

In vitro citotoksična aktivnost Co(III) kompleksa na svim testiranim ćelijskim

linijama veća je od aktivnosti cisplatina. Kompleks Co(III) u koncentraciji od IC50 dovodi

do smanjenja procenta ćelija u G1 i malog povećanja procenta ćelija u S fazi ćelijskog

ciklusa, kod ćelija HeLa, bez značajnog povećanja apoptotičke frakcije ćelija (frakcija sub-

G1). Efekat dejstva Co(III) kompleksa na progresiju ćelijskog ciklusa je privremen, ćelije

koje su preživele tretman sposobne su da uspostave normalan ćelijski ciklus. Interakcije

Co(III) kompleksa sa DNA su minimalne i nisu uzrok njegovom citotoksičnom dejstvu.

Kompleksi Ni(II) pokazuju citotoksičnu aktivnost na svim testiranim ćelijskim

linijama. Aktivnost Ni(II) kompleksa je najveća prema ćelijskoj liniji humane mijeloidne

leukemije K562. Naročito veliku aktivnost prema ovoj ćelijskoj liniji pokazuje azido

kompleks, čija je aktivnost slična aktivnosti cisplatina. Analiza ćelijskog ciklusa je

pokazala da kompleksi Ni(II) u koncentraciji od 0,5×IC50 dovode do povećanja procenta

ćelija u fazi sub-G1 i smanjenja procenta ćelija u fazi G1 ćelijskog ciklusa, i izazivaju

oštećenja DNA kod ćelija HeLa.

Naelektrisanje i geometrija kompleksa utiču na njihovo antimikrobno dejstvo.

Oktaedarski kompleksi Co(III) i Fe(III) koji su elektroliti imaju izraženiju antibakterijsku

aktivnost, dok su kvadratno-planarni kompleksi Pd(II) i Ni(II) koji su neelektroliti bolji

antifungalni agensi.

Ključne reči: hidrazoni, fosfinski ligandi, kompleksi metala, kristalna struktura, biološka

aktivnost

Naučna oblast: Hemija

Uža naučna oblast: Neorganska hemija

UDK broj: 546

SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION OF TRANSITION METAL

COMPLEXES WITH CONDENSATION PRODUCT OF

2-(DIPHENYLPHOSPHINO)BENZALDEHYDE AND ETHYL

CARBAZATE

SUMMARY

In this work synthesis, characterization and biological activity of Co(III), Fe(III),

Pd(II) and Ni(II) complexes with condensation product of

2-(diphenylphosphino)benzaldehyde and ethyl carbazate are presented.

Also, the facile preparation of a racemic hydrazine bridged diphosphonium

compound possessing a ring system analogous to bicyclo[3.3.2]decane,

5,5,11,11-tetraphenyl-5,6,11,12-tetrahydro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]diphosphocinium

diperchlorate is reported.

In all synthesized complexes hydrazone ligand was coordinated as a tridentate to the

metal ion through phosphorus, imine nitrogen and carbonyl oxygen atoms. In complexes of

Co(III) and Fe(III) octahedral environment was formed by two molecules of hydrazone

ligands. In Fe(III) complex the ligand was coordinated in neutral form, while the formation

of Co(III) complex leads to deprotonation of the ligand. In square-planar Pd(II) and Ni(II)

complexes hydrazone ligand was coordinated as monoanion, while the fourth coordination

place was occupied by chlorido ligand in Pd(II) complex or pseudohalides (cyanate,

thiocyanate, and azide) in Ni(II) complexes.

In vitro cytotoxic activity of Co(III) complex against all of the tested cell lines was

higher than the activity of cisplatin. Complex of Co(III) at IC50 concentration induced

reduction in the percentage of cells in G1 phase and a small increase in the percentage of

cells in S phase of the cell cycle in HeLa cells, with no significant increase in the fraction

of apoptotic cells (sub-G1 fraction). Effect of Co(III) complex action on cell cycle

progression is temporary, the cells that survive the treatment are able to establish normal

cell cycle. Minimal interactions of Co(III) complex with DNA are not the reason for the

observed cytotoxicity of this complex.

Complexes of Ni(II) exhibited cytotoxic activity against all of the tested cell lines.

Activity of Ni(II) complexes was the largest on human myelogenous leukemic cell line

K562. Especially high activity against this cell line was observed for azido complex,

similar to that of cisplatin. The complexes of Ni(II) at 0,5×IC50 induced increase of the

percentage of cells in sub-G1 phase and decrease of percentage of cells in the G1 phase of

the cell cycle in HeLa cells and caused DNA damage.

The charge and geometry of the complex might cause a selectivity of antimicrobial

activity. Octahedral electrolyte complexes of Co(III) and Fe(III) have a more pronounced

antibacterial activity, while the square-planar non-electrolyte complexes of Pd(II) and

Ni(II) are better antifungal agents.

Keywords: hydrazones, phosphine ligands, metal complexes, crystal structure, biological

activity

Area of science: Chemistry

Sub-area of science: Inorganic chemistry

UDC number: 546

LISTA SKRAĆENICA

HeLa – tumorske ćelije epitela poreklom iz humanog karcinoma grlića materice

B16 – ćelije mišijeg melanoma

U2-OS – humane ćelije osteosarkoma

U2-OS/Pt – humane ćelije osteosarkoma rezistentne na cisplatin

MRC-5 – humani fetalni fibroblasti pluća

Hep-2 – humane epitelne ćelije karcinoma larinksa

MCF-7 – humane ćelije adenokarcinoma dojke

HT-29 – humane ćelije karcinoma debelog creva

A549 – ćelije humanog plućnog adenokracinoma

MDA-MB-361 – ćelije humanog kancera dojke

FemX – humane ćelije melanoma

LS-174 – humane ćelije kancera debelog creva

K562– humane ćelije leukemije

CDDP – cisplatin

SDS – natrijum-dodecil-sulfat

PI – propidijum-jodid

FITC – fluorescein-izotiocijanat

Tris – tris(hidroksimetil)aminometan

TS – Tris, NaCl

TAE – Tris-acetat, EDTA

HEPES – 4-(2-hidroksietil)piperazin-1-etansulfonska kiselina

DMSO – dimetil-sulfoksid

FCS – fetalni teleći serum

RPMI – Roswell Park Memorial Institute

MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum-bromid

DNA – dezoksiribonukleinska kiselina

EtOH – etanol

MeOH – metanol

COSY – Correlation spectroscopy

HSQC – Heteronuclear Single Quantum Coherence spectroscopy

HMBC – Heteronuclear Multiple-Bond Correlation spectroscopy

DEPT – Distortionless Enhancement by Polarization Transfer spectroscopy

NOESY – Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

LC-MS – Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

HPLC – High-Performance Liquid Chromatography

TOF – Time-Of-Flight mass spectrometry

FT-IR – Fourier Transform Infrared spectroscopy

ATR –Attenuated Total Reflection

SQUID – superconducting quantum interference device

Sadržaj

1. UVOD ................................................................................................................................. 1

2. OPŠTI DEO ........................................................................................................................ 2

2.1. Acilhidrazoni 2-(difenilfosfino)benzaldehida i njihovi kompleksi ............................. 2

2.2. Biološka aktivnost derivata 2-(difenilfosfino)benzaldehida i njihovih kompleksa ... 11

3. EKSPERIMENTALNI DEO ............................................................................................ 14

3.1. Materijal i metode ...................................................................................................... 14

3.2. Sinteza etil-(2E)-2-[2-(difenilfosfino)benziliden]hidrazinkarboksilata (HL) ........... 15

3.3. Sinteza Co(III) kompleksa ([CoL2]BF4) ................................................................... 15

3.4. Sinteza Pd(II) kompleksa ([PdLCl]) ......................................................................... 15

3.5. Sinteza Fe(III) kompleksa ([Fe(HL)2][FeCl4]2Cl) .................................................... 16

3.6. Sinteze Ni(II) kompleksa ........................................................................................... 16

3.6.1. Sinteza kompleksa [NiL(OCN)] ......................................................................... 16

3.6.2. Sinteza kompleksa [NiL(NCS)] .......................................................................... 17

3.6.3. Sinteza kompleksa [NiL(N3)].............................................................................. 17

3.7. Sinteza 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]

difosfocinijum-diperhlorata (1) ................................................................................... 17

3.7.1. Sinteza jedinjenja 1 u reakciji dihidrazida malonske kiseline sa

2-(difenilfosfino)benzaldehidom ......................................................................... 17


2-(difenilfosfino)benzaldehidom u prisustvu Cd(ClO4)2·6H2O ........................... 18


2-(difenilfosfino)benzaldehidom u prisustvu Co(ClO4)2·6 H2O .......................... 19

3.7.4. Sinteza jedinjenja 1 iz hidrazin-sulfata i 2-(difenilfosfino)benzaldehida ........... 19

3.8. Rendgenska strukturna analiza .................................................................................. 19

3.8.1. Rendgenska strukturna analiza liganda HL i kompleksa [CoL2]BF4 ................. 19

3.8.2. Rendgenska strukturna analiza kompleksa [PdLCl] i [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl ..... 22

3.8.3. Rendgenska strukturna analiza kompleksa [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i

[NiL(N3)] ............................................................................................................. 24

3.8.4. Rendgenska strukturna analiza 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-

biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata (1) i 5,5,11,11-tetrafenil-

5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata

monohidrata (1×H2O) .......................................................................................... 26

3.9. Biološka aktivnost ...................................................................................................... 28

3.9.1. Antimikrobna aktivnost ....................................................................................... 28

3.9.2.Test na račićima Artemia salina ........................................................................... 30

3.9.3. Citotoksična aktivnost ......................................................................................... 31

3.9.4. Analiza ćelijskog ciklusa ..................................................................................... 32

3.9.5. Test za apoptozu .................................................................................................. 32

3.9.6. Ispitivanje interakcija sa DNA ............................................................................ 33

4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................. 35

4.1. Sinteze ........................................................................................................................ 35

4.2. Opis kristalnih struktura ............................................................................................. 40

4.2.1. Rendgenska strukturna analiza liganda HL ........................................................ 40

4.2.2. Rendgenska strukturna analiza kompleksa [CoL2]BF4 ...................................... 41

4.2.3. Rendgenska strukturna analiza kompleksa [PdLCl] .......................................... 44

4.2.4. Rendgenska strukturna analiza kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl ...................... 45

4.2.5. Rendgenska strukturna analiza Ni(II) kompleksa ............................................... 46


biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata (1) .................................... 52

4.3. IR spektri .................................................................................................................... 58

4.3.1. IR spektar kompleksa [CoL2]BF4 ....................................................................... 58

4.3.2. IR spektar kompleksa [PdLCl] ........................................................................... 59

4.3.3. IR spektar kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl ....................................................... 59

4.3.4. IR spektri Ni(II) kompleksa [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)] ................. 59

4.4. NMR spektri .............................................................................................................. 60

4.4.1. NMR spektri kompleksa [CoL2]BF4................................................................... 60

4.4.2. NMR spektri kompleksa [PdLCl] ...................................................................... 63

4.4.3. NMR spektri Ni(II) kompleksa [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)] ............ 66

4.4.4. NMR spektri 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo

[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata (1) ............................................................. 70

4.5. Magnetna merenja za kompleks [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl ............................................. 71

4.6. Biološka aktivnost ...................................................................................................... 72

4.6.1. Biološka aktivnost kompleksa [CoL2]BF4 .......................................................... 72

4.6.2. Biološka aktivnost kompleksa [PdLCl] i [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl ........................ 81

4.6.3. Biološka aktivnost Ni(II) kompleksa .................................................................. 83

4.6.4. Biološka aktivnost 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo

[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata (1) i

(1E)-[2-(difenilfosfino)benziliden]hidrazina (2).................................................. 91

5. ZAKLJUČAK ................................................................................................................... 93

6. REFERENCE ................................................................................................................... 96

7. PRILOG ............................................................................................................................ 99

BIOGRAFIJA ..................................................................................................................... 162

1

1. UVOD

Potencijalno tridentatni acilhidrazoni 2-(difenilfosfino)benzaldehida koji poseduju

„meki” atom fosfora i „tvrde” atome azota i kiseonika u zavisnosti od eksperimentalnih

uslova i centralnog metalnog jona mogu se koordinovati u neutralnom ili monoanjonskom

obliku kao PNO tridentatni, PN bidentatni ili P monodentatni ligandi [1–14]. Raznovrsnost

u načinu koordinacije omogućava formiranje kompleksnih jedinjenja različite geometrije i

naelektrisanja. Prisustvo supstituciono inertnog atoma fosfora i labilnih atoma azota i

kiseonika koji svoje mesto mogu ustupiti drugim ligandima je svojstvo kompleksa metala

sa acilhidrazonima 2-(difenilfosfino)benzaldehida koje je značajno za njihovu katalitičku

aktivnost [4,8,9]. Iako je do sada ispitana biološka aktivnost malog broja derivata

2-(difenilfosfino)benzaldehida i njihovih kompleksa publikovani rezultati ukazuju na

značajnu antitumorsku i antimikrobnu aktivnost ovih jedinjenja [10,13,15,16]. Cilj ovog

rada je bila sinteza, potpuna strukturna karakterizacija i ispitivanje biološke aktivnosti

kompleksa Co(III), Ni(II), Pd(II) i Fe(III) sa kondenzacionim proizvodom

2-(difenilfosfino)benzaldehida i etil-karbazata.

2

2. OPŠTI DEO

2.1. Acilhidrazoni 2-(difenilfosfino)benzaldehida i njihovi kompleksi

Kondenzacionom reakcijom 2-(difenilfosfino)benzaldehida i različitih hidrazida

dobijeni su ligandi prikazani u tabeli 1, koji poseduju kombinaciju „mekog” atoma fosfora i

„tvrdih” azotovih i kiseonikovih donorskih atoma. U zavisnosti od centralnog metalnog

jona i eksperimentalnih uslova ligandi ovog tipa mogu se koordinovati kao PNO tridentati,

PN bidentati ili P monodentati ili kao PNO anjonski helatori nakon disocijacije

hidrazonskog protona (tabela 1). Atom fosfora je supstituciono inertan (zbog dπ–pπ

povratnog vezivanja „back bonding”) i stabilizuje metal u niskom spinskom stanju, dok

supstituciono labilni atomi azota ili kiseonika svoje koordinaciono mesto mogu ustupiti

drugim ligandima. Zbog ovih karakteristika proučavana je katalitička aktivnost kompleksa

metala sa acilhidrazonskim ligandima koji sadrže PNO donorske atome.

Kvadratno-planarni Pd(II) kompleksi 2-(difenilfosfino)benzaldehida-benzoilhidrazona,

-pikolinoilhidrazona, -nikotinoilhidrazona i -izonikotinoilhidrazona su katalizatori u

homogenim hidrogenizacijama terminalnih dvostrukih i trostrukih veza [8]. Acetato

paladijum(II) kompleksi 2-(difenilfosfino)benzaldehid-acetilhidrazona, -benzoilhidrazona,

-p-metilbenzoilhidrazona, -p-bromobenzoilhidrazona i -p-nitrobenzoilhidrazona su

korišćeni kao katalizatori u homogenoj hidrogenizaciji stirena i drugih nezasićenih C–C

veza pod blagim uslovima. Uočeno je da katalitička aktivnost kompleksa zavisi od baznosti

hidrazonskog azota [9]. Oktaedarski Ru(II) kompleksi sa tridentatnim

2-(difenilfosfino)benzaldehid-acetilhidrazonom i -benzoilhidrazonom su visoko stereo- i

regio-selektivni katalizatori u reakciji između benzoeve kiseline i terminalnih alkina [4].

U do sada opisanim kvadratno-planarnim Pd(II) kompleksima acilhidrazonski ligand je

koordinovan PNO tridentatno kada je deprotonovan, dok se neutralni ligand može

koordinovati na dva načina, PN bidentatno ili PNO tridentatno. U svim do sada opisanim

Ni(II) kompleksima acilhidrazonski ligand je deprotonovan i tridentatno PNO koordinovan

za jon metala. Geometrija Ni(II) kompleksa je kvadratno-planarna, jedini izuzetak je

tetraedarski cijanato Ni(II) kompleks sa kondenzacionim proizvodom

3

2-(difenilfosfino)benzaldehida i semioksamazida (HL12). U svim oktaedarskim Fe(II) i

Fe(III) kompleksima sa 2-(difenilfosfino)benzaldehid-benzoilhidrazonom (HL1) po dva

molekula acilhidrazonskog liganda su tridentatno koordinovana za jon metala preko PNO

donorskih atoma (Tabela 1). Kompleksi Co(III) sa acilhidrazonima

2-(difenilfosfino)benzaldehida nisu poznati u literaturi.

4

Tabela 1. Acilhidrazoni 2-(difenilfosfino)benzaldehida i njihovi kompleksi

Ligand Oznaka Kompleks Koordinacija HLn

liganda (n = 1–16 ) Ref.

HL1

[PdL1(CH3COO)]

[PdL1Cl]

[PdL1I]

[PdL1(C≡C–C6H5)]

[PdL1(C≡C–tBu)]

[Pd(HL1)Cl2]

[Pd(HL1)Cl]CF3SO3

[Pd(HL1)(Me)Cl]

[PdL1(Me)]

[Pd(HL1)(Me)]CF3SO3

[Pd(HL1)(MeCO)Cl]

[PdL1(COMe)]

[Pd(HL1)(MeCO)](CF3SO3)

[NiL1(CH3COO)]

[NiL1Cl]

[NiL1(C≡C–C6H5)]

[NiL1(C≡C–tBu)]

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PN

PNO

PN

PNO

PNO

PN

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

1

1

1

1

2

2

2

3

3

3

3

3

3

2

2

2

2

5

HL1

trans-[Ru(HL1)(PPh3)Cl2]·CH2Cl2

[RuL1(PPh3)(CH3CN)Cl]

[Ru(HL1)(PPh3)(CH3CN)Cl][PF6]

[Ru(HL1)(PPh3)(CH3CN)Cl][BPh4]

[RuL1(PPh3)(CH3CN)2][BPh4]

[Ru(HL1)(PPh3)(CH3CN)Cl]Cl

[Ru(L1)2]·2H2O

[Ru(HL1)(dmso)2Cl2]

[Ru(HL1)(dmso)Cl2]·1/2dmso·H2O

[Ru(HL1)(p-cimen)Cl2]·2CHCl3

[Fe(HL1)2]Cl[FeCl4]

[Fe2(HL1)2Cl6]

[Fe(HL1)2]Cl2

[Fe(HL1)2](CF3SO3)2

[Fe(L1)2]

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PN

PNO

P

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

5

5

5

5

5

6

HL1

[Rh(HL1)(CO)Cl]

[RhL1(CO)]

[Rh(HL1)(CO)]CF3SO3

[Rh(HL1)(MeCO)ClI]

[RhL1(MeCO)(dmso)Cl]

[RhL1(MeCO)(dmso)I]

[RhL1(CO)(Me)I]

[RhL1(MeCO)I]

[RhL1(MeCO)(THF)I]·THF

[Rh(HL1)(MeCO)I]CF3SO3

[Rh(HL1)Cl3]

[RhL1Cl2(dmso)] (dmso)

[Rh(HL1)Cl1,6I0,4(MeCO)]·CH2Cl2

[Rh(HL1)Cl2H(CO)]

PN

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PN

6

6

6

6

6

6

6

6

6

6

7

7

7

7

HL2

[PdL2(CH3COO)]

[PdL2Cl]

[PdL2I]


PNO

PNO

PNO

PNO

8

8

8

8

7

HL3

[PdL3(CH3COO)]

[PdL3Cl]

[PdL3I]


PNO

PNO

PNO

PNO

8

8

8

8

HL4

[PdL4(CH3COO)]

[PdL4Cl]

[PdL4I]


PNO

PNO

PNO

PNO

8

8

8

8

HL5

[PdL5(CH3COO)]

[PdL5Cl]


PNO

PNO

PNO

9

2

2

HL6

[PdL6(CH3COO)]

[PdL6Cl]


PNO

PNO

PNO

9

2

2

HL7

[PdL7(CH3COO)]

[PdL7Cl]


PNO

PNO

PNO

9

2

2

8

HL8 [PdL8Cl]

[PtL8Cl]

PNO

PNO

10

10

HL9

[PdL9(CH3COO)]

[PdL9Cl]


trans-[Ru(HL9)(PPh3)Cl2]·1/2CH2Cl2

[RuL9(PPh3)(CH3CN)Cl]

[Ru(HL9)(PPh3)(CH3CN)Cl][PF6]·CH2Cl2

[Ru(HL9)(PPh3)(CH3CN)Cl][BPh4]

[RuL9(PPh3)(CH3CN)2][PF6]

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

PNO

9

2

2

4

4

4

4

4

HL10 [NiL10N3] PNO 11

9

HL11 [ReL11OCl(OMe)] PNN 12

HL12

[PdL12Cl]

[PtL12Cl]

[NiL12(OCN)]

PNO

PNO

PNO

13

13

13

H2L13

[Mn(H2L13)(CH3COO)2]·CH3OH

[Cu(H2L13)](CH3COO)2]·H2O

[Pd(H2L13)(CH3COO)2]·CH3OH

PNNP

PNNP

PNNP

14

14

14

H2L14 ― ― 14

10

H2L15 ― ― 14

H2L16 ― ― 14

11

2.2. Biološka aktivnost derivata 2-(difenilfosfino)benzaldehida i njihovih kompleksa

Kompleksi metala sa multidentatnim ligandima derivatima

2-(difenilfosfino)benzaldehida, kojima je ispitivana biološka aktivnost prikazani su u

tabeli 2.

Tabela 2. Biološki aktivni derivati 2-(difenilfosfino)benzaldehida i njihovi kompleksi

Ligand Oznaka Kompleks Referenca

HL12

[PdL12Cl]

[PtL12Cl]

[NiL12(OCN)]

13

13

13

HL17 [Pd(HL17)Cl2]

15

HL8 [PdL8Cl]

[PtL8Cl]

10

10

L18

[PdL18Cl2]

[PtL18Cl2]

16

L19

[PdL19Cl2]

[PtL19Cl2]

16

12

U kompleksima [PdL12Cl], [PtL12Cl] i [NiL12(OCN)] deprotonovani ligand je

koordinovan tridentatno preko PNO donorskih atoma, dok četvrto koordinaciono mesto

zauzima hlorido ligand u kvadratno-planarnim kompleksima Pd(II) i Pt(II) i cijanatni anjon

u tetraedarskom Ni(II) kompleksu. Antibakterijska i antifungalna aktivnost liganda HL12 i

kompleksa [PdL12Cl], [PtL12Cl] i [NiL12(OCN)] na ispitivanim sojevima je slična onoj

koju pokazuju ampicilin i bifonazol. Aktivnost liganda se povećava vezivanjem za jon

metala, pri čemu nema značajnih razlika u aktivnosti kompleksa različitih metala [13].

Kvadratno-planarno okruženje oko Pd(II) u kompleksu [Pd(HL17)Cl2] formirano je

bidentatnom PN koordinacijom liganda HL17, dok treće i četvrto koordinaciono mesto

zauzimaju hloridni anjoni. Kompleksi [Pd(HL17)Cl2], [PdL12Cl] i [PtL12Cl] poseduju

jaku citotoksičnu aktivnost na ćelijske linije HeLa, B16, U2-OS i U2-OS/Pt koja je slična

referentnom jedinjenju cisplatinu (CDDP). Kompleksi [Pd(HL17)Cl2] i [PtL12Cl] imaju

jaku citotoksičnu aktivnost na sve ispitivane ćelijske linije, dok kompleks [PdL12Cl]

pokazuje jako citotoksično dejstvo samo na U2-OS i U2-OS/Pt ćelije. Kompleks

[Pd(HL17)Cl2] ima nešto manju citotoksičnu aktivnost na U2-OS i U2-OS/Pt u poređenju

sa CDDP. Ćelije U2-OS su osetljivije na kompleks [Pd(HL17)Cl2] nego ćelije U2-OS/Pt.

Kompleksi [PdL12Cl] i [PtL12Cl] ne pokazuju razliku u aktivnosti prema ćelijama U2-OS

i CDDP-rezistentnim ćelijama U2-OS/Pt, što ukazuje na mehanizam dejstva različit od

CDDP. Kompleks [Pd(HL17)Cl2] pokazuje sličan efekat na ćelije HeLa kao i cisplatin,

indukujući apoptozu praćenu zastojem u fazi S ćelijskog ciklusa. Kompleksi [PdL12Cl] i

[PtL12Cl] dovode do povećanja procenta ćelija u fazi sub-G1 i smanjenja procenta ćelija u

fazi G1, dok se procenat ćelija u fazama S i G2 značajno ne menja [15].

Citotoksičnost jedinjenja HL8 i kvadratno-planarnih kompleksa [PdL8Cl] i

[PtL8Cl] ispitana je na tumorskoj Hep-2 i normalnoj MRC-5 ćelijskoj liniji. Ćelije Hep-2

su znatno osetljivije na sva ispitivana jedinjenja od normalnih ćelija MRC-5. Najbolju

aktivnost na ćelije Hep-2, koja je slična aktivnosti oksaliplatina poseduju ligand HL8 i

kompleks [PtL8Cl] [10].

13

U kvadratno planarnim kompleksima [PdL18Cl2], [PtL18Cl2], [PdL19Cl2] i

[PtL19Cl2] fosfinski ligand je koordinovan bidentatno preko PN donorskih atoma, dok

preostala dva koordinaciona mesta zauzimaju hloridi. Kompleksi [PdL18Cl2], [PtL18Cl2],

[PdL19Cl2] i [PtL19Cl2] pokazuju citotoksičnu aktivnost na ćelijske linije MCF-7 i HT-29,

koja je bolja od aktivnosti cisplatina. Ligand L19 nije citotoksičan za ispitivane ćelijske

linije. Oba Pd(II) kompleksa su pokazala bolju aktivnost u odnosu na Pt(II) komplekse.

Ispitivani kompleksi Pt(II) i Pd(II) indukuju apoptozu kod ćelijskih linija MCF-7 i HT-29

[16].

14

3. EKSPERIMENTALNI DEO

3.1. Materijal i metode

IR spektri sintetisanih jedinjenja snimljeni su na Perkin-Elmer FT-IR 1725X

spektrometru ATR tehnikom u opsegu 4000–400 cm−1. Elementalna analiza (C, H i N) je

urađena standardnom mikrometodom na ELEMENTARVario ELIII C.H.N.S.O analizatoru.

Rezultati mikroanalize dati su u procentima (%). Maseni spektri su snimljeni na 6210 TOF

LC/MS spregnutim sa Agilent Technologies 1200 Series HPLC sistemom. 1H NMR (500

MHz), 13C NMR (125 MHz) i 2D NMR (COSY, HSQC) spektri liganda HL i kompleksa

[CoL2]BF4 su snimljeni na Bruker Avance 500 spektrometru u DMSO–d6 uz upotrebu

TMS kao internog standarda za 1H i 13C. 1H NMR (500 MHz), 13C NMR (125 MHz) i 2D

NMR (COSY, HSQC) spektri kompleksa [PdLCl], [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)]

snimljeni su na Bruker Avance 500 spektrometru u CDCl3 uz TMS kao interni standard za

1H i 13C. 1H NMR (500 MHz), 13C NMR (125 MHz) i 2D NMR (COSY, NOESY, HSQC,

HMBC) spektri 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]

difosfocinijum-diperhlorata snimljeni su na Bruker Avance 500 spektrometru u CD3CN uz

TMS kao interni standard za 1H i 13C. 31P NMR (202 MHz) spektar 5,5,11,11-tetrafenil-

5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata je snimljen

na Bruker Avance 500 spektrometru uz 85% fosfornu kiselinu kao eksterni standard.

1H NMR (200 MHz) i 13C NMR (50 MHz) spektri (1E)-[2-(difenilfosfino)benziliden]

hidrazina su snimljeni na Varian-Gemini 2000 spektrometru u CDCl3 uz TMS kao interni

standard za 1H i 13C. Svi spektri su snimljeni na sobnoj temperaturi. Hemijska pomeranja su

izražena u ppm (δ) vrednostima, a konstante kuplovanja (J) u Hz. Magnetna merenja

kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl izvedena su pomoću Quantum Design MPMS XL-5

SQUID magnetomera. DC merenja magnetizacije su sprovedena u funkciji temperature

(T = 2–300 K) u magnetnom polju od 1000 Oe (1 Oe = 1000/4π A/m). Merenje

magnetizacije u zavisnosti od jačine magnetnog polja je izvedeno na 2 K i pri polju do

15

50 kOe. Dobijeni podaci su korigovani za doprinos držača uzorka kao i za dijamagnetizam

uzorka procenjen na osnovu Pascal-ovih konstanti.

3.2. Sinteza etil-(2E)-2-[2-(difenilfosfino)benziliden]hidrazinkarboksilata (HL)

Smeša 0,14 g (0,48 mmol) 2-(difenilfosfino)benzaldehida i 0,05 g (0,48 mmol)

etil-karbazata je rastvorena zagrevanjem, u 25 mL etanola. pH reakcione smeše je podešen

na ~ 4 hlorovodoničnom kiselinom. Smeša je zagrevana 60 min na 56 oC. Iz reakcionog

rastvora na sobnoj temperaturi iskristalisali su bezbojni kristali. Prinos: 0,15 g (83%).

TT 164–166 oC. IR (cm−1): 3253, 3189, 3049, 2974, 1729, 1707, 1550, 1458, 1435, 1385,

1247, 1178, 1092, 1055, 763, 744, 696, 657, 499. HRMS (ESI) za C22H21N2O2P, nađeno

(m/z) za [M+H]+ 377,1384; izračunato (m/z) za [M+H]+ 377,1414. Rezultati NMR

spektroskopske karakterizacije su prikazani u poglavlju 4.

3.3. Sinteza Co(III) kompleksa ([CoL2]BF4)

Smeša 0,24 g (0,64 mmol) liganda HL i 0,13 g (0,38 mmol) Co(BF4)2∙6H2O je

rastvorena, zagrevanjem, u 25 mL etanola. Smeša je zagrevana 6 h na 56 oC. Boja rastvora

se promenila u tamnocrvenu. Tamnocrveni kristali su dobijeni stajanjem reakcionog

rastvora na sobnoj temperaturi. Prinos: 0,08 g (23%). IR (cm−1): 3079, 2981, 1507, 1480,

1429, 1379, 1337, 1060, 750, 701, 659, 611. Elementalna analiza za C44H40BCoF4N4O4P2,

nađeno: N 6,05, C 58,82, H 4,63, izračunato: N 6,25, C 58,95, H 4,50. Rezultati NMR


3.4. Sinteza Pd(II) kompleksa ([PdLCl])

Ligand HL 0,08 g (0,21 mmol) je rastvoren zagrevanjem u 20 mL etanola. Rastvor

K2[PdCl4] (0,07 g, 0,21 mmol) u 10 mL destilovane vode je dodat rastvoru liganda. Smeša

je zagrevana 2 h na 62 oC uz mešanje. Reakcioni rastvor je ostavljen na sobnoj temperaturi

nekoliko dana. Žuti monokristali su proceđeni i isprani etanolom. Prinos: 0,08 g (73%).

IR (cm−1): 3056, 3021, 2985, 2927, 1559, 1517, 1480, 1436, 1412, 1375, 1326, 1189, 1135,

16

1101, 1079, 1027, 1005, 900, 878, 754, 696, 598, 554, 527, 492, 459, 432. Elementalna

analiza za C22H20ClN2O2PPd, nađeno: N 5,50, C 50,92, H 3,85, izračunato: N 5,42,

C 51,08, H 3,90. Rezultati NMR spektroskopske karakterizacije su prikazani u poglavlju 4.

3.5. Sinteza Fe(III) kompleksa ([Fe(HL)2][FeCl4]2Cl)

Ligand HL 0,12 g (0,32 mmol) je rastvoren u 15 mL dihlormetana. Rastvor

FeCl3∙6H2O (0,09 g, 0,33 mmol) u 5 mL etanola je dodat u rastvor liganda. Reakciona

smeša je 6 h mešana na sobnoj temperaturi i nakon dodatka 10 mL n-heptana ostavljena na

–8 °C preko noći. Dobijeni su purpurnocrveni kristali pogodni za rendgensku strukturnu

analizu. Kristali su proceđeni i isprani n-heptanom. Prinos: 0,09 mg (49%). IR (cm−1):

3237, 3084, 3060, 2988, 2940, 2862, 1732, 1632, 1585, 1554, 1482, 1435, 1416, 1388,

1313, 1225, 1088, 1063, 1000, 924, 890, 867, 768, 746, 735, 695, 585, 536, 511.

Elementalna analiza za C44H42Cl9Fe3N4O4P2, nađeno: N 4,41, C 42,58, H 3,46, izračunato

N 4,52, C 42,64, H 3,42.

3.6. Sinteze Ni(II) kompleksa

3.6.1. Sinteza kompleksa [NiL(OCN)]

U rastvor 0,09 g (0,26 mmol) Ni(BF4)2∙6H2O i 0,10 g (0,26 mmol) liganda HL u

20 mL etanola dodato je 0,02 g (0,30 mmol) NaOCN. Reakciona smeša je 2 h zagrevana na

56 oC. Boja rastvora se promenila iz braon u narandžastocrvenu. Reakciona smeša je

ostavljena na sobnoj temperaturi, dok iz rastvora nisu iskristalisali crvenonarandžasti

kristali. Prinos: 0,06 g (48%). IR (cm−1): 3550, 3052, 3006, 2219, 1555, 1527, 1474, 1417,

1376, 1331, 1170, 1098, 1010, 879, 760, 700. Elementalna analiza za C23H20N3O3PNi,

nađeno: N 8,89, C 57,95, H 4,26, izračunato N 8,83, C 58,02, H 4,23. Rezultati NMR


17

3.6.2. Sinteza kompleksa [NiL(NCS)]

U rastvor 0,07 g (0,28 mmol) Ni(AcO)2∙4H2O i 0,10 g (0,27 mmol) liganda HL u

30 mL etanola dodato je 0,10 g (1,30 mmol) NH4NCS. Reakciona smeša je 2 h zagrevana

na 65 oC. Boja rastvora se promenila iz braon u narandžastocrvenu. Reakciona smeša je

ostavljena na sobnoj temperaturi, dok iz nje nisu iskristalisali narandžastocrveni kristali.

Prinos: 0,08 g (60%). IR (cm−1): 3055, 2982, 2090, 2017, 1521, 1479, 1429, 1375, 1337,

1099, 1003, 884, 748, 698. Elementalna analiza za C23H20N3O2PSNi, nađeno: N 8,52,

C 56,07, H 3,89, S 6,33, izračunato N 8,54, C 56,13, H 4,10, S 6,52. Rezultati NMR


3.6.3. Sinteza kompleksa [NiL(N3)]

U rastvor 0,12 g (0,35 mmol) Ni(BF4)2∙6H2O i 0,13 g (0,35 mmol) liganda HL u

50 mL metanola je dodato 0,10 g (1,54 mmol) NaN3. Reakciona smeša je 2 h zagrevana na

52 oC. Boja rastvora se promenila iz braon u purpurnocrvenu. Stajanjem na sobnoj

temperaturi iz rastvora kristališu purpurnocrveni kristali. Kristali nisu stabilni na vazduhu.

Prinos 0,09 g (54%). IR (cm−1): 3297, 3052, 2986, 2914, 2037, 1989, 1522, 1476, 1421,

1386, 1332, 1278, 1187, 1134, 1096, 1014, 938, 896, 778, 748, 694. Elementalna analiza za

C22H20N5O2PNi, nađeno: N 14,71, C 55,43, H 4,08, izračunato N 14,71, C 55,50, H 4,23.

Rezultati NMR spektroskopske karakterizacije su prikazani u poglavlju 4.

3.7. Sinteza 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]

difosfocinijum-diperhlorata (1)


2-(difenilfosfino)benzaldehidom

U rastvor koji sadrži 0,03 g (0,23 mmol) dihidrazida malonske kiseline i 0,15 g

(0,52 mmol) 2-(difenilfosfino)benzaldehida u metanolu (15 mL) dodate su četiri kapi

koncentrovane HClO4 i pH je podešen na 1,5−2. Nakon 6 h mešanja na 42 °C, formirao se

beli talog koji je proceđen i ispran hladnim metanolom. Monokristali jedinjenja 1 su

18

dobijeni prekristalizacijom iz acetonitrila, čiji pH je podešen na 4,6 pomoću CH3COOH.

Prinos: 29 mg (14,5%), TT 242 °C. 1H NMR (500 MHz, CD3CN) δ 6,47 (2H, m, H-N(1)),

6,75 (2H, m, H-C(6)), 7,18 (6H, m, H-(C14), H-(C24), H-(C7)), 7,63 (2H, kompleksan

signal, H-(C4)), 7,71 (2H, m, H-(C5)), 7,76 (4H, m, H-(C22), H-(C26)), 7,86 (4H, m, H-

(C12), H-(C16)), 7,92 (10H, m, H-(C3), H-(C13), H-(C15), H-(C23), H-(C25)); 13C NMR

(125 MHz, CD3CN) δ 73,5 (d, 1J = 58,9 Hz, C7), 117,8 (d, 2J = 3,12 Hz, C2, jednim delom

pod signalom rastvarača), 119,6 (d, 1J =79,0 Hz, C21), 122,4 (d, 1J = 92,9 Hz, C11), 130,2

(s, C4), 131,4 (m, C22, C26), 131,7 (m, C12, C16, C23, C25), 133,6 (m, C6), 135,2 (s, C5),

135,9 (m, C13, C15), 137,3 (m, C14, C24), 139,7 (m, C3), 142,0 (m, C1); 31P-NMR

(CD3CN) δ 28,21 (oznake atoma u NMR spektrima prikazane su na shemi 6); IR (cm−1):

3644, 2584, 3537, 3298, 2361, 1621, 1584, 1479, 1438, 1096, 752, 687, 620, 537, 505; MS

(ESI), nađeno (m/z) za C38H32N2P2 578,2024; izračunato (m/z) 578,2034. Elementalna

analiza za C38H34N2P2Cl2O9, nađeno: N 3,52, C 57,39, H 4,35, izračunato: N 3,52, C 57,37,

H 4,31.


2-(difenilfosfino)benzaldehidom u prisustvu Cd(ClO4)2·6H2O

U metanolni rastvor (15 mL) Cd(ClO4)2·6H2O (0,11 g, 0,26 mmol), dihidrazida

malonske kiseline (0,03 g, 0,23 mmol) i 2-(difenilfosfino)benzaldehida (0,15 g, 0,52 mmol)

dodate su četiri kapi koncentrovane HClO4 i rastvor je mešan 6 h na 42 °C. Beli talog koji

je nastao je proceđen i ispran hladnim metanolom. Monokristali jedinjenja 1 su dobijeni

prekristalizacijom iz acetonitrila, kome je pH podešen na 4,6 pomoću CH3COOH.

Prinos 33 mg (16,6%).

Beli talog koji je dobijen u ovoj sintezi prečišćavan je hromatografijom na koloni

silika-gela i eluiran gradijentom 10% do 50% acetonitrila u toluenu, pri čemu je izolovana

žuta čvrsta supstanca (1E)-[2-(difenilfosfino)benziliden]hidrazin (2). Prinos: 30 mg

(19,0%), TT 288 °C. 1H NMR (200 MHz, CDCl3) δ 7,06−7,28 (3H, m, H-(C4), H-(C11)),

7,31−7,64 (12H, m, H-(C5), H-(C6), H-(C9), H-(C10), H-(N2)), 8,25−8,31 (1H, m,

H-(C3)), 9,22 (1H, s, H-(C1)); 13C NMR (50 MHz, CDCl3) δ 159,2 (d, 3J = 6,4 Hz, C1),

19

137,6 (d, 1J = 6,4 Hz, C8), 133,0 (d, 2J = 11,9 Hz, C6), 132,6 (s, C7), 131,8 (s, C11), 131,4

(d, 2J = 10,0 Hz, C9), 130,5 (s, C2), 129,6 (d, 3J = 12,8 Hz, C5), 128,3 (s, C3), 128,3

(d, 3J = 12,8 Hz, C10), 127,7 (s, C4) (oznake atoma u NMR spektrima prikazane su na

shemi 6); IR (cm−1): 3446, 2365, 2254, 1436, 1183, 1109, 1054, 1028, 824, 761, 723, 692,

543. MS (ESI), nađeno (m/z) za C19H17N2P 304,11369; izračunato (m/z) 304,11295.

Elementalna analiza za C19H17N2P, nađeno: C 74,78, N 9,13, H 5,75, izračunato: C 74,99,

N 9,21, H 5,63.


2-(difenilfosfino)benzaldehidom u prisustvu Co(ClO4)2·6 H2O

U metanolni rastvor (10 mL) Co(ClO4)2·6H2O (0,09 g, 0,25 mmol), dihidrazida

malonske kiseline (0,03 g, 0,23 mmol) i 2-(difenilfosfino)benzaldehida (0,15 g, 0,52 mmol)

dodato je nekoliko kapi koncentrovane HClO4 i smeša je zagrevana 30 min na

53 °C uz mešanje. Formirao se braoncrveni talog u kome su bili i kristali jedinjenja 1.

Prinos u tragovima.

3.7.4. Sinteza jedinjenja 1 iz hidrazin-sulfata i 2-(difenilfosfino)benzaldehida

U metanolni rastvor (15 mL) (0,03 g, 0,23 mmol) hidrazin-sulfata i (0,15 g,

0,52 mmol) 2-(difenilfosfino)benzaldehida dodate su četiri kapi koncentrovane HClO4, tako

da je pH podešen na 1,5−2. Nakon mešanja smeše 3 h na 42 °C, dobijen je beli talog koji je

proceđen i ispran hladnim metanolom. Monokristali jedinjenja 1 su dobijeni

prekristalizacijom iz acetonitrila, kome je pH podešen na 4,6 pomoću CH3COOH.

Prinos: 38 mg (18,7%).

3.8. Rendgenska strukturna analiza

3.8.1. Rendgenska strukturna analiza liganda HL i kompleksa [CoL2]BF4

Kristalografska merenja su urađena na SMART APEX2 difraktometru na T = 293 K

pomoću MoKα zračenja (λ = 0,71073 Å) za Co(III) kompleks i na Siemens AED

20

difraktometru sa scintilacionim detektorom i CuKα zračenjem (λ = 1,54178 Å) za ligand

HL. Primenjene su Lorentz-ove, polarizacione i apsorpcione korekcije [17, 18]. Strukture

su rešene direktnim metodama pomoću SIR97 [19] i utačnjavane pomoću programa

SHELXL97 [20] u okviru programskog paketa WinGX [21]. Vodonikovi atomi su uneti u

izračunate pozicije nezavisno od NH vodonika u ligandu koji su nađeni na različitim

mapama i utačnjeni. Parametri anizotropnog pomeranja su utačnjeni za sve nevodonikove

atome. Anjon BF4– u Co(III) kompleksu je neuređen i modelovan je preko dve slike sa

0,7 : 0,3 populacijom. Vodonične veze su analizirane pomoću SHELXL97 [20], PARST97

[22] i programskih paketa Cambridge Crystallographic Data Centre [23, 24] za analizu

pakovanja u kristalu. U tabeli 3 su prikazani podaci o kristalnim strukturama i rezultati

određivanja strukture.

21

Tabela 3. Relevantni kristalografski podaci i podaci o utačnjavanju struktura liganda HL i

kompleksa [CoL2]BF4

HL [CoL2]BF4

Empirijska formula C44H42N4O4P2 C44H40N4O4P2CoBF4

Molarna masa/g mol–1 752,76 896,48

Temperatura/K 293(2) 293(2)

Kristalni sistem monoklinični monoklinični

Prostorna grupa I2/a P21/n

a/Å 24,584(3) 15,677(1)

b/Å 9,2487(4) 13,403(1)

c/Å 36,028(2) 19,949(2)

β/° 98,297(6) 93,012(1)

Zapremina/Å3 8106(1) 4185,9(6)

Z 8 4

µ/mm–1 1,347 0,553

F(000) 3168,0 1848,0

2Θ opseg za prikupljanje

podataka 7,26–139,84° 3,22–63,98°

Broj prikupljenih refleksija 14815 68322

Broj nezavisnih refleksija 7669 [R(int) = 0,0297] 13805 [R(int) = 0,0284]

Podaci/ograničenja/ parametri 7669 / 0 / 498 13805 / 0 / 569

Faktor slaganja, S 1,035 1,029

Finalno R1, wR2 [I>=2σ (I)] 0,0425; 0,1219 0,0386; 0,1053

Najveće ΔF max/min / e Å–3 0,51 / -0,28 0,57 / -0,45

22

3.8.2. Rendgenska strukturna analiza kompleksa [PdLCl] i [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl

Difrakcioni podaci su prikupljeni na T = 293 K pomoću MoKα zračenja

(λ = 0,71073 Å) na SMART APEX2 difraktometru. Primenjene su Lorentz-ove,

polarizacione i apsorpcione korekcije [17, 18]. Strukture su rešene direktnim metodom

pomoću SIR2004 [25] i utačnjene metodom najmanjih kvadrata na svim F2 pomoću

SHELXL-2013 [26] uključenog u programski paket WinGX [21]. Vodonikovi atomi su

smešteni na izračunatim položajima navođenjem na atome za koje su vezani. Parametri

anizotropnog pomeranja su utačnjeni za sve nevodonikove atome. FeCl4− anjoni kompleksa

[Fe(HL)2][FeCl4]2Cl su neuređeni i mogu biti modelovani preko dve slike sa 0,66 : 0,34

populacijom. Vodonične veze su analizirane sa SHELXL2013 [26] i PARST97

programima [22]. Za analizu kristalnog pakovanja korišćeni su programski paketi

Cambridge Crystallographic Data Centre [23, 24]. U tabeli 4 prikazani su kristalografski

podaci i rezultati određivanja strukture.

23

Tabela 4. Relevantni kristalografski podaci i podaci o utačnjavanju struktura [PdLCl] i

[Fe(HL)2][FeCl4]2Cl kompleksa

[PdLCl] [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl

Empirijska formula C22H20ClN2O2PPd C44H42Cl9Fe3N4O4P2



Kristalni sistem monoklinični monoklinični

Prostorna grupa C2/c P21/c

a/Å 25,076(4) 16,271(5)

b/Å 11,537(2) 14,606(5)

c/Å 16,279(2) 24,234(5)

β/° 114,925(2) 104,952(5)

Zapremina/Å3 4271(1) 5564(3)

Z 8 4

μ/mm–1 1,090 1,303

F(000) 2080,0 2508,0

2Θ opseg, ° 3,582 do 63,578 2,59 do 47,354

Prikupljene refleksije 34260 51058

Nezavisne refleksije 6935 [R(int) = 0,0365] 8380 [R(int) = 0,0668]

Podaci/ograničenja/parametri 6935 / 0 / 262 8380 / 9 / 681

Faktor slaganja, S 0,767 1,066

Finalno R1, wR2 [I>=2σ (I)] 0,0284; 0,0929 0,0944; 0,2932

Najveći ΔF max/min, e Å–3 0,40 / -0,64 2,54 / -0,81

24

3.8.3. Rendgenska strukturna analiza kompleksa [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)]

Difrakcioni podaci za monokristale kompleksa Ni(II) dobijeni su korišćenjem

MoKα zračenja (λ = 0,71073 Å) na SMART APEX2 ([NiL(OCN)] i [NiL(N3)]) i SMART

BREEZE ([NiL(NCS)]) difraktometru. Difrakcioni eksperiment je izveden na sobnoj

temperaturi (293 K) za [NiL(OCN)] i [NiL(NCS)], dok je za [NiL(N3)] izveden na 170 K u

cilju sprečavanja raspadanja kristala. Primenjene su Lorentz-ove, polarizacione i

apsorpcione korekcije [17, 18]. Strukture su rešene direktnom metodom pomoću SIR97

[19] i utačnjene metodom najmanjih kvadrata na svim F2 pomoću SHELXL97 [20]

uključenog u programski paket WinGX [21]. Vodonikovi atomi su uvedeni u izračunate

pozicije; parametri anizotropnog premeštanja su utačnjeni za sve nevodonikove atome.

Vodonične veze su analizirane pomoću programa SHELXL97 [20] i PARST97

[22], a za analizu kristalnog pakovanja korišćeni su programski paketi Cambridge

Crystallographic Data Centre [23, 24]. U tabeli 5 dati su kristalografski podaci i rezultati

određivanja strukture.

25

Tabela 5. Relevantni kristalografski podaci i podaci o utačnjavanju struktura Ni(II)

kompleksa

[NiL(OCN)] [NiL(NCS)] [NiL(N3)]

Empirijska formula C23H20N3NiO3P C23H20N3NiO2PS C23,5H26N5NiO3,5P

Molarna masa/g mol–1 476,08 492,16 524,16

Temperatura/K 293(2) 293(2) 170(2)

Talasna dužina/Å 0,71073 0,71073 0,71073

Kristalni sistem monoklinični monoklinični triklinični

Prostorna grupa P21/n P21/n P 1

Dimenzije jedinične ćelije

a = 10,529(5) Å

b = 13,797(5) Å

β = 97,052(5)°

c = 14,945(5) Å

a = 9,689(1) Å

b = 13,242(2) Å

= 104,725(2)°

c = 17,966(2) Å

a = 10,295(1) Å

α = 72,20(3)°

b = 10,715(2) Å

= 71,19(3)°

c = 12,555(1) Å

γ = 75,13(2)°

Zapremina/Å3 2154,6(15) 2229,4(5) 1228,9(9)

Z 4 4 2

μ/mm–1 1,005 1,061 0,892

Θ opseg za prikupljanje

podataka 2,02–29,25° 1,93–32,24° 1,77–31,68°

Prikupljene refleksije /

jedinstvene

31451/5855

[R(int) = 0,0307]

35850/7397

[R(int) = 0,0287]

18770/7635

[R(int) = 0,0372]

Podaci / ograničenja /

parametri 5855 / 0 / 280 7397 / 0 / 280 7635 / 9 / 330

Faktor slaganja, S 1,038 0,764 0,813

Finalno R1, wR2 [I>=2σ (I)] 0,0348; 0,1019 0,0377; 0,1474 0,0432; 0,1171

Najveće ΔF max/min/e Å–3 0,585 / -0,635 0,631 / -0,453 0,696 / -0,843

26


biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata (1) i 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-

tetrahidro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata monohidrata

(1×H2O)

Kristali 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]

difosfocinijum-diperhlorata (1) i 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-

biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata monohidrata (1×H2O) su snimljeni na

SuperNova difraktometru kapa-geometrije na T = 130(2) K pomoću CuKα zračenja

(λ = 1,5405 Å). Temperatura uzorka je kontrolisana pomoću Oxford Instruments

Cryosystem kompresora za azot. Intenziteti su korigovani za apsorpcione efekte [27].

Strukture su rešene direktnim metodama pomoću SHELXS-86 [28] i utačnjene metodom

najmanjih kvadrata pomoću SHELXL-97 [29]. Parametri anizotropnog pomeranja su

uključeni za nevodonikove atome. Za tercijarne i aromatične CH grupe pozicije

vodonikovih atoma su izračunate na standardizovanim rastojanjima od 1,00 i 0,95 Å,

redom. Položaji NH vodonika i vodonikovi atomi koji su deo C2 simetričnog molekula

vode određeni su iz razlike Fourier-ovih mapa i njihove dužine veza su standardizovane na

vrednosti od 0,92 i 0,85 Å, redom. Svi vodonikovi atomi smešteni su na izračunatim

položajima navođenjem na atome za koje su vezani sa izotropnim temperaturnim faktorima

20% većim od izotropnih ekvivalenata atoma za koji su H-atomi vezani. U završnim

koracima utačnjavanja strukture postalo je jasno da kristal jedinjenja 1 sadrži šupljine u

strukturi sa preostalom elektronskom gustinom od oko 0,7 e Å−3. Pretpostavljeno je da

zaostala elektronska gustina u šupljinama predstavlja atmosferske gasove. Primenom

programa SQUEEZE [30] na izračunavanje prisustva ove elektronske gustine nisu

pronađeni atomi gasa zarobljeni u kristalu. Program SQUEEZE je ukazao na prisustvo 8

šupljina zapremine po 34 Å3 koje sadrže 4 elektrona. Prisustvo šupljina može objasniti

manju gustinu jedinjenja 1 u odnosu na njegov hidratisani kristal 1×H2O (tabela 6).

Siemens [31] kompjuterski grafički program je korišćen za pripremu slika. Kristalografski

podaci i parametri utačnjavanja su dati u tabeli 6.

27

Tabela 6. Relevantni kristalografski podaci i podaci o utačnjavanju struktura 1 i 1×H2O

1 1×H2O

Hemijska formula C38H32N2P2·2(ClO4) C38H32N2P2·2(ClO4)·H2O



Kristalni sistem ortorombični monoklinični

Prostorna grupa Pbca C2/c

a, b, c/Å 17,9459(8); 15,9361(5);

24,9474(7)

18,3160(12); 18,9967(7);

12,3020(8)

α, β, γ/o 90; 90; 90 90; 123,050(9); 90

Zapremina/Å3 7134,6(4) 3587,8(4)

Z 8 4

μ/mm−1 2,97 2,98

Broj prikupljenih refleksija 25578 7694

Broj nezavisnih refleksija 7401 [R(int) = 0,071] 3169 [R(int) = 0,024]

R[F2 > 2σ(F2)], wR(F2), S 0,057; 0,140; 0,93 0,059; 0,169; 1,07

Broj parametara 469 240

Najveće ΔF max/min/e Å–3 0,54 / -0,39 0,47 / -0,61

28

3.9. Biološka aktivnost

3.9.1. Antimikrobna aktivnost

3.9.1.1. Antimikrobna aktivnost jedinjenja HL, [CoL2]BF4, [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl i

[PdLCl]

Antimikrobna aktivnost jedinjenja je ispitivana na Gram-pozitivnim sojevima

bakterija: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC

12228), Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Bacillus subtilis (ATCC 6633),

Gram-negativnim sojevima bakterija: Escherichia coli (ATCC 25922 i ATCC 10536),

Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883 i NCIMB 9111), Pseudomonas aeruginosa

(ATCC 27853 i ATCC 9027), Salmonella enterica (NCTC 6017) i sojevima gljiva:

Candida albicans (ATCC 10259 i ATCC 10231). Svi testovi su izvođeni u Müller Hinton-

ovom bujonu za bakterijske sojeve i Sabouraud-ovom dekstroznom bujonu za gljive.

Pripremljene su prekonoćne kulture svakog soja, i finalna koncentracija je podešena na

2×106 CFU/mL za bakterije i 2×105 CFU/mL za gljive. Ispitivana jedinjenja su rastvorena

u 1% dimetil-sulfoksidu (DMSO) i razblažena do najveće koncentracije. Dve serije

koncentracija jedinjenja su pripremljene na mikrotitar ploči sa 96-bunarčića u opsegu

koncentracija 31,25–1000 μg/mL. Rast mikroba je određen nakon 24 h inkubacije na 37 ºC

za bakterije i nakon 48 h inkubacije na 26 ºC za gljive. MIC (minimalna inhibitorna

koncentracija) je definisana kao najmanja koncentracija jedinjenja pri kojoj se ne može

uočiti vidljiv rast mikroorganizama.

3.9.1.2. Antimikrobna aktivnost Ni(II) kompleksa

3.9.1.2.1. Antifungalna aktivnost

Antifungalna aktivnost je ispitivana na gljivama Candida albicans (ATCC 10231) i

Saccharomyces cerevisiae (ATCC 9763) i na šest biljnih patogenih gljiva izolovanih sa

lekovitog bilja koje su dobijene od Instituta za istraživanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić”

29

(Beograd, Srbija): Trichoderma viride, Penicillium sp. (obe izolovane sa Calendulae flos),

Fusarium semitectum (izolovan sa Maydis stigma), F. proliferatum (izolovan sa

Calendulae flos), F. equiseti (izolovan sa Equiseti herba) i F. tricinctum (izolovan sa

Menthae folium i herba).

Sabouraud-ov dekstrozni agar (Institut za virologiju, vakcine i serume „Torlak”)

pripremljen je prema uputstvu proizvođača. U svaku sterilnu Petrijevu šolju (prečnik

90 mm) usuta su 22 mL prethodno pripremljene suspenzije agara i 100 μL suspenzije

gljiva.

Supstance HL, [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)] su rastvorene u DMSO, a

Ni(BF4)2·6H2O je rastvoren u vodi. Po 10 μL rastvora jedinjenja (100 μg jedinjenja po

disku) je naneto na diskove od filter-papira (8 mm prečnik) i rastvarač je isparen. Papirni

diskovi su stavljeni na agar sa zasejanim gljivama. Petrijeve šolje su inkubirane 48 h na

28 °C. Vodeni rastvori NaOCN, NH4SCN i NaN3 su naneti na diskove od filter-papira u

koncentraciji 8,8 μg/disk OCN–; 11,8 μg/disk SCN–; 8,8 μg/disk N3–; rastvarač je uparen, a

diskovi su stavljeni na agar pod istim uslovima kao i ispitivana jedinjenja.

Nistatin (Hemofarm, 30 mg aktivne supstance, disk prečnika 8 mm) je korišćen kao

pozitivna kontrola, dok je disk sa 10 μL DMSO korišćen kao negativni test. Zona inhibicije

je merena u milimetrima, uključujući disk [36, 37].

3.9.1.2.2. Antibakterijska aktivnost

Antibakterijska aktivnost je ispitivana na sedam različitih sojeva Gram-pozitivnih

bakterija: Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus flavus (ATCC 10240),

Streptosporangium longisporum (ATCC 25212), Micrococcus luteus (ATCC 4698),

Clostridium sporogenes (ATCC 19404), Kocuria rhizophila (ATCC 9341), Bacillus subtilis

(ATCC 6633) i pet različitih sojeva Gram-negativnih bakterija: Escherichia coli (ATCC

25922), Salmonella enteritica (ATCC 13076), Proteus vulgaris (ATCC 13315),

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) i Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031).

Antibakterijska aktivnost jedinjenja određena je disk-difuzionom metodom (NCCLS) [36].

30

Svi testovi su izvedeni u hranjivom agaru (HiMedia). U svaku sterilnu Petrijevu šolju

(prečnik 90 mm) usuta su 22 mL hranjivog agara i 100 μL suspenzije bakterija. Supstance

HL, [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)] su rastvorene u DMSO (1 mg/100 μL), a onda

je po 100 μL stavljeno na diskove od filter-papira (prečnik 8 mm) i rastvarač je uparen.

Niklova so Ni(BF4)2·6H2O je rastvorena u vodi i u količini od 1 mg naneta na disk od

filter-papira. Tetraciklin (Institut za virologiju, vakcine i serume „Torlak”), 30 μg po disku

(prečnik 8 mm) je korišćen kao pozitivna kontrola, dok su diskovi istog prečnika

impregnirani sa 100 μL DMSO korišćeni kao negativna kontrola. Diskovi od filter-papira

sa ispitivanim jedinjenjima stavljeni su na hranljivi agar. Petrijeve šolje su inkubirane 24 h

na 37 °C. Zona inhibicije je merena u milimetrima, uključujući disk.

3.9.2.Test na račićima Artemia salina

Kašičica liofilizovanih jaja Artemia salina je dodata u 0,5 L veštačke morske vode

koja sadrži nekoliko kapi suspenzije kvasca (3 mg suvog kvasca u 5 mL destilovane vode).

Suspenzija je termostatirana 48 h na 18–20 °C uz aeraciju i osvetljavanje. Larve račića su

korišćene za dalje eksperimente.

Ispitivane supstance su rastvorene u odgovarajućim rastvaračima: HL, [CoL2]BF4,

[NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)] u DMSO, Ni(BF4)2·6H2O i Co(BF4)2·6H2O u vodi,

(1E)-[2-(difenilfosfino)benziliden]hidrazin u hloroformu, 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-

tetrahidro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorat u acetonitrilu, a zatim

su u različitim količinama nanošene na diskove od filter-papira i rastvarač je uparen.

Papirni diskovi su stavljeni na dno epruveta u koje je dodato 5 mL veštačke morske vode i

oko 15–20 larvi račića. Epruvete su ostavljene 24 h na sobnoj temperaturi uz osvetljavanje,

nakon čega su prebrojani živi i mrtvi račići. Sva određivanja su rađena u triplikatu. LC50 je

definisan kao koncentracija supstance koja prouzrokuje smrt 50% račića.

31

3.9.3. Citotoksična aktivnost

3.9.3.1. Ćelijska kultura

Epitelne ćelije humanog plućnog adenokarcinoma (A549), ćelije humanog kancera

dojke (MDA-MB-361), tumorske ćelije epitela poreklom iz humanog karcinoma grlića

materice (HeLa), humane ćelije melanoma (FemX), humane ćelije kancera debelog creva

(LS-174) i humani fetalni fibroblasti pluća (MRC-5) su uzgajane kao monoslojna kultura u

hranljivoj podlozi (RPMI 1640), dok su humane ćelije leukemije (K562) uzgajane u

suspenziji. Podloga RPMI 1640 u prahu je nabavljena od proizvođača Sigma Aldrich Co.

Hranljiva podloga RPMI 1640 je pripremljena u sterilnoj dejonizovanoj vodi u koju su

dodati penicilin (192 IU/mL), streptomicin (200 µg/mL), 4-(2-hidroksietil)piperazin-1-

etansulfonska kiselina (HEPES) (25 mM), L-glutamin (3 mM) i 10% toplotom inaktivirani

serum govečeta (FCS) (pH 7,2). Ćelije su uzgajane na 37 ºC u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2

kao dvonedeljna supkultura.

3.9.3.2. MTT test

Citotoksičnost kompleksa [CoL2]BF4, [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)],

liganda HL, kobaltove soli, niklove soli i cisplatina, određena je korišćenjem MTT

(3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum-bromid) (Sigma) testa [32]. Ćelije HeLa,

FemX, LS-174, A549, MDA-MB-361 i MRC-5 su zasejane na pločama sa 96 bunarčića u

hranljivoj podlozi i uzgajane 24 h. Ćelije K562 su zasejane 2 h pre tretmana. Osnovni

rastvori ispitivanih agenasa koncentracije 10 mM su napravljeni u DMSO i docnije

razblaživani sa hranljivom podlogom do željenih finalnih koncentracija (u opsegu do

100 µM). Osnovni rastvor cisplatina (CDDP) koncentracije 10 mM napravljen je u 0,9%

NaCl i docnije razblažen hranljivom podlogom do željene finalne koncentracije (u opsegu

do 100 µM). Rastvori različitih koncentracija ispitivanih jedinjenja su dodati u bunarčiće,

dok je u kontrolne bunarčiće dodata samo hranljiva podloga. Svi uzorci su rađeni u

triplikatu. Hranljiva podloga sa odgovarajućom koncentracijom agensa, ali bez ćelija je

korišćena kao slepa proba takođe u triplikatu.

32

Ćelije su sa ispitivanim jedinjenjima inkubirane 48 h na 37 ºC, u atmosferi vazduha

sa 5% CO2, zasićenog vodenom parom. Posle inkubacije, 20 µL MTT rastvora (5 mg/mL u

rastvoru PBS, pH 7,2) je dodato u svaki bunarčić. Uzorci su inkubirani 4 h na 37 ºC u

atmosferi vazduha sa 5% CO2, zasićenog vodenom parom. Kristali nastalog formazana su

rastvoreni u 100 µL 10% natrijum-dodecil-sulfata (SDS) u 0,01 M HCl. Apsorbancija je

određivana na ThermoLabsystems 408 Multiskan EX 200–240 V posle 24 h na talasnoj

dužini od 570 nm. Koncentracija IC50 (µM) je definisana kao koncentracija jedinjenja koja

dovodi do 50% inhibicije ćelijskog preživljavanja i ona je određena sa dijagrama ćelijskog

preživljavanja.

3.9.4. Analiza ćelijskog ciklusa

Kvantitativna analiza distribucije faza ćelijskog ciklusa je izvedena protočnom

citometrijskom analizom sadržaja DNA na fiksiranim HeLa ćelijama, posle bojenja sa

propidijum-jodidom (PI) [33]. Ćelije su zasejane sa gustinom 2×105 ćelija/bunarčić na ploči

sa 6 bunarčića i uzgajane u hranljivoj podlozi. Posle 24 h ćelije su izložene ispitivanim

kompleksima [CoL2]BF4, [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)] u koncentracijama koje

odgovaraju 0,5×IC50, IC50 i 1,5×IC50 (određenim za 48 h tretman). Kontrolne ćelije su

inkubirane samo u hranljivom medijumu, a kao referentno jedinjenje korišćen je cisplatin.

Posle kontinualnog tretmana od 24 i 48 h ćelije su sakupljene tripsinizacijom, isprane dva

puta sa ledenim PBS, i fiksirane 30 min u 70% EtOH. Posle fiksiranja ćelije su isprane

ponovo sa PBS, i inkubirane sa ribonukleazom A (1 mg/mL) 30 min na 37 °C. Ćelije su

zatim obojene sa PI (koncentracije 400 µg/mL) 15 min pre analize na protočnom citometru.

Distribucija faza ćelijskog ciklusa je analizirana na FASC Calibur Becton Dickinson

protočnom citometru pomoću softvera Cell Quest Pro.

3.9.5. Test za apoptozu

Indukcija apoptoze kompleksom [CoL2]BF4 i cisplatinom (CDDP) na HeLa

ćelijama je ispitana pomoću Aneksin V–FITC pribora za detekciju apoptoze

(BD Biosciences Cat. No. 65874x, Pharmingen San Diego, CA, USA). In vitro određivanje

33

apoptoze tumorskih ćelija urađeno je na sledeći način: 1×106 HeLa ćelija/mL je tretirano sa

0,5×IC50 i IC50 koncentracijama kobalt(III) kompleksa i CDDP 48 h. Posle tretmana ćelije

su isprane dva puta sa hladnim PBS i onda su resuspendovane u 200 µL pufera za vezivanje

aneksina (10 mM HEPES/NaOH pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2). 100 µL rastvora

(1 × 105 ćelija) je prebačeno u kivetu od 5 mL za protočni citometar, a zatim je dodato

2,5 µL Aneksin V–FITC i 2,5 µL PI. Ćelije su blago vorteksovane i inkubirane 15 min na

25 oC u mraku. Posle toga je u svaku ependorf-kivetu dodato 400 µL pufera za vezivanje

aneksina nakon čega je pripremljeni rastvor analiziran na FACS Calibur Becton Dickinson

protočnom citometru uz pomoć kompjuterskog softvera Cell Quest Pro.

3.9.6. Ispitivanje interakcija sa DNA

3.9.6.1. Ispitivanje interakcija sa dvolančanom zatvorenom cirkularnom plazmidnom

DNA

Plazmid pUC18 je dobijen transformacijom klona Escherichia coli RR1 (pUC18,

2686 baznih parova, Sigma-Aldrich, USA) u elektrokompetentni E. coli DH5α soj prema

protokolu za uzgajanje kulture E. coli u LB medijumu na 37 oC elektroporacijom preko

noći pomoću „Gene Pulser” (Bio-Rad) [34]. Plazmidna DNA iz klonova E. coli je

izolovana modifikovanom metodom alkalne lize [35] i prečišćena pomoću „JetStar” pribora

(Genomed) na anjon-izmenjivačkoj koloni. Posle finalnog ispiranja sa ledenim 70%

etanolom, talozi DNA su osušeni na vazduhu i konačno resuspendovani u 150 μL sterilne

H2O i čuvani na -20 oC. Koncentracija plazmidne DNA (213 ng/μL pUC18) određena je

merenjem apsorbancije DNA rastvora na 260 nm. Jedna optička jedinica odgovara

50 μg/mL dvolančane DNA.

Plazmidna DNA je inkubirana 4 min na 95 oC, nakon čega je inkubirana na 4 oC

sledećih 20 min. Zatim je po 213 ng (0,13 pmol) pUC18 u 20 μL reakcione smeše u TS

puferu (20 mM Tris 20 mM NaCl, pH 7,92), inkubirano sa različitim koncentracijama

kompleksa [CoL2]BF4 (1,5 h) i 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-

biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata (2 h) na 37 oC.

34

Plazmid pUC19 (2686 baznih parova, molekulska masa 1,74·106 Da, izolovan iz

E. coli) je nabavljen od Fermentas Life Sciences (EU). Plazmid pUC19 (0,5 µg) u

reakcionoj smeši zapremine 20 μL u TS puferu (20 mM Tris 20mM NaCl, pH 7,9) je

inkubiran sa različitim koncentracijama Ni(II) kompleksa na 37 oC u toku 1,5 h. Kontrolni

uzorak je pripremljen sa 3 µL DMSO umesto kompleksa.

Reakcione smeše su vorteksovane s vremena na vreme. Reakcija je završena

kratkim centrifugiranjem na 10000 rpm i dodatkom 7 μL pufera za nanošenje uzoraka

(0,25% bromfenol-plavo, 0,25% ksilen-cijanol FF i 30% glicerol u TAE puferu, pH 8,24

(40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA)). Uzorci su podvrgnuti elektroforezi na 1% agaroznom

gelu (Amersham Pharmacia-Biotech, Inc) pripremljenom u TAE puferu pH 8,24.

Elektroforeza je izvedena pri konstantnom naponu (80 V) u trajanju od 1,5 h (dok boja

bromfenol-plavo nije prešla preko 75% gela). Posle elektroforeze, gel je bojen 30 min sa

vodenim rastvorom etidijum-bromida (0,5 μg/mL), ispran vodom, ostavljen da stoji još

10 min u vodi, a zatim ponovo ispran vodom. Fragmenti DNA su vizuelizovani pod UV

svetlom na 312 nm.

3.9.6.2. Interakcije sa linearnom dvolančanom DNA

U eksperimentima je korišćena linearna dvolančana lambda DNA bakteriofaga

(cl857 Sam7, 48502 baznih parova molekulske mase 31,5·106 Da) izolovana iz E. coli

W3110 (Thermo Scientific, USA). Koncentracija i čistoća DNA su potvrđene

spektrofotometrijski. Za analizu agaroznom elektroforezom, 0,3 µg lambda DNA

(0,01 pmol) je inkubirano sa 5 nmol, 10 nmol i 15 nmol kompleksa [CoL2]BF4 kao što je

opisano za plazmidnu DNA. Za UV–Vis spektrofotometrijsku analizu po 500 µL rastvora

lambda DNA (0,5 pmol) je inkubirano u TS puferu 2 h na 37 °C, vorteksovano s vremena

na vreme, sa različitim koncentracijama kompleksa [CoL2]BF4 (5 mM osnovni rastvor u

DMSO). UV–Vis spektri su snimljeni na Shimadzu 1800 UV/Visible spektrofotometru.

35

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Sinteze

U reakciji 2-(difenilfosfino)benzaldehida i etil-karbazata u etanolu na pH ~ 4

dobijen je ligand etil-(2E)-2-[2-(difenilfosfino)benziliden]hidrazinkarboksilat (HL)

(shema 1).

Shema 1. Sinteza etil-(2E)-2-[2-(difenilfosfino)benziliden]hidrazinkarboksilata HL

Oktaedarski kompleks Co(III) ([CoL2]BF4) je dobijen direktnom sintezom iz

Co(BF4)2·6H2O i liganda HL (shema 2).

Shema 2. Sinteza Co(III) kompleksa [CoL2]BF4

36

Kvadratno-planarni kompleks Pd(II) ([PdLCl]) je dobijen u reakciji supstitucije

K2[PdCl4] i liganda HL (shema 3).

Shema 3. Sinteza Pd(II) kompleksa [PdLCl]

Oktaedarski kompleks Fe(III) ([Fe(HL)2][FeCl4]2Cl) je dobijen direktnom sintezom

u reakciji FeCl3∙6H2O i liganda HL (shema 4).

Shema 4. Sinteza Fe(III) kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl

Sinteza Ni(II) kompleksa sa HL ligandom i monodentatnim pseudohalogenidima

prikazana je na shemi 5. U kvadratno-planarnim Ni(II) kompleksima deprotonovani enolni

tautomer liganda je tridentatno koordinovan za metal, dok četvrto koordinaciono mesto

zauzimaju monodentati: cijanat, tiocijanat ili azid. Prisustvo acetatnih jona, NaOCN ili

NaN3 omogućava deprotonovanje liganda, a koordinacija pseudohalogenida na četvrtom

koordinacionom mestu dovodi do formiranja stabilnih kompleksa. Stabilni kompleksi

37

Ni(II) nisu dobijeni u reakciji HL liganda sa Ni(BF4)2·6H2O u molskom odnosu 2 : 1, kao

ni u reakciji HL liganda sa NiCl2·6H2O u molskom odnosu 1 : 1.

Shema 5. Sinteza Ni(II) kompleksa [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)]

U cilju sinteze kondenzacionog proizvoda 2-(difenilfosfino)benzaldehida i

dihidrazida malonske kiseline, ispitivane su reakcije ovih jedinjenja pod različitim

uslovima. Optimalno pH za ovaj tip kondenzacije je tipično 4 [38], ali su pokušaji sinteze

željenog jedinjenja na ovom pH bili neuspešni. Pošto prisustvo elektron-donorske

difenilfosfino grupe u aromatičnom aldehidu smanjuje elektrofilnost karbonilnog ugljenika,

a elektron odvlačeće grupe smanjuju baznost i nukleofilnost azotovog atoma u dihidrazidu

malonske kiseline, reakcija 2-(difenilfosfino)benzaldehida i dihidrazida malonske kiseline u

molskom odnosu 2 : 1 je izvedena u metanolu pod znatno kiselijim uslovima (pH 1,5–2),

38

pri čemu je dobijen 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo

[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorat (1) u prinosu 14,5% (shema 6).

Shema 6. Mehanizam formiranja 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-

biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata

39

U pokušajima sinteze kompleksa Cd(II) i Co(II) templatnom sintezom, polazeći od

odgovarajućih perhlorata (Cd(ClO4)2·6H2O ili Co(ClO4)2·6H2O),

2-(difenilfosfino)benzaldehida i dihidrazida malonske kiseline u molskom odnosu 2 : 2 : 1

u metanolu na pH 1,5−2, dobijeno je jedinjenje 1. U prisustvu Co(II) jona u reakcionom

rastvoru, dobijeni su anhidrovani kristali jedinjenja 1 u tragovima. Kada su Cd(II) joni

prisutni u reakcionom rastvoru, posle rekristalizacije iz acetonitrila dobijen je 1×H2O u

prinosu 16,6%, što ukazuje na to da joni kadmijima nemaju značajan uticaj na reakciju.

Procedura prečišćavanja jedinjenja 1 hromatografijom na koloni silika gela bila je

neuspešna; glavni proizvod koji je izolovan bilo je jedinjenje 2 u prinosu od 19,0%.

Razmatrajući mehanizam formiranja jedinjenja 1, pretpostavili smo da dihidrazid malonske

kiseline podleže degradaciji do hidrazina pod primenjenim eksperimentalnim uslovima,

zbog koordinacije jona metala (Lewis-ova kiselina) za slobodni elektronski par karbonilnog

kiseonika. Metalni joni u perhloratima su jake Lewis-ove kiseline zahvaljujući izrazitoj

delokalizaciji negativnog naelektrisanja na perhloratnom anjonu [39]. Nastali hidrazin

reaguje sa 2-(difenilfosfino)benzaldehidom, dajući jedinjenje 1. Sa ciljem da se potvrdi ova

pretpostavka, izvedena je reakcija 2-(difenilfosfino)benzaldehida i hidrazin sulfata u

metanolu na pH 1,5−2 u prisustvu perhlorne kiseline pri čemu je dobijeno jedinjenje 1 u

prinosu 18,7%. Pretpostavljeni reakcioni mehanizam za ovu kondenzaciju prikazan je na

shemi 6. U ovu reakciju su uključeni aldehid i hidrazin, koji in situ formiraju hidrazon,

reakcija se nastavlja adicijom nukleofilnog fosfora, ciklizacijom, eliminacijom hidrazina i

adicijom drugog atoma fosfora na endociklični hidrazon pri čemu nastaje konačni proizvod.

Mada je literatura koja opisuje ovaj tip reakcija oskudna, podatak o nukleofilnoj adiciji

fosfina na ugljenik-azot dvostruku vezu [40] i transhidrazonaciji [41] se može naći u

literaturi. Postoji veoma mali broj strukturnih analoga jedinjenja 1. Najsličnije mu je

ciklično jedinjenje sa nepremošćenim osmočlanim-prstenom, 5,6,11,12-tetrahidro-

5,5,11,11-tetrafenildibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-dibromid, koje je dobijeno

intermolekulskom ciklizacijom dva molekula [2-(brommetil)fenil]difenilfosfina [42].

40

4.2. Opis kristalnih struktura

4.2.1. Rendgenska strukturna analiza liganda HL

Ligand HL kristališe sa dva nezavisna molekula u asimetričnoj jedinici

monoklinične I2/a prostorne grupe (slika 1). Poređenje njihovih geometrija sa prosečnim

vrednostima nađenim u literaturi za slična jedinjenja pomoću programa Mogul [43]

pokazalo je da molekulske strukture uočene kod liganda u čvrstom stanju nisu neuobičajene

i da mala razlika u konformacijama ukazuje na fleksibilnost slobodnog liganda.

Slika 1. Molekulske strukture i oznake dva konformera uočena u kristalnoj strukturi HL.

Na slici u sredini prikazano je preklapanje ove dve strukture. Termalni elipsoidi su

prikazani sa 50% verovatnoće

Strukture sa Z’>1 zapravo predstavljaju raspodelu konformera male energije

prisutnih u rastvoru i kinetički zamrznutih u kristalu [44, 45]. Dva konformera se malo

razlikuju u orijentaciji aromatičnih prstenova, orijentaciji terminalnih metil grupa u odnosu

na NNHCOOCH2 i u vrednosti torzionog ugla C5–C6–C7–N1 = 31° i

C27–C28–C29–N3 = -6°. U oba slučaja iminski azot je nasuprot fosforovog atoma, ali se

orijentacija može promeniti rotacijom oko C6–C7 veze u pravcu stvaranja PN helatnog

sistema. Ligand pokazuje konformaciono preuređenje oko C6–C7 veze nakon

koordinovanja.

41

4.2.2. Rendgenska strukturna analiza kompleksa [CoL2]BF4

U kobalt(III) kompleksu dva deprotonovana molekula liganda koordinovana su za

atom metala tako da daju geometriju deformisanog oktaedra koordinacijom preko PNO

donorskih atoma koje čine fosfor, iminski azot i karbonilni kiseonik (slika 2). Tabela 7

prikazuje relevantne parametre vezivanja u kompleksu. Osim malog produženja Co–P

rastojanja, preostale dužine veza nisu značajno različite od prosečnih uočenih kod sličnih

sistema. Koordinovanje za metal dovodi do promene uglova između atoma liganada tako da

je ugao između atoma fosfora, C7 i C29 veći nego prosečni, dok su uglovi N–C=O manji

nego obično, što je utvrđeno poređenjem sa sličnim sistemima pomoću programa Mogul

[43]. Rastojanje C–O za keto kiseonik je nešto duže što znači da je negativno naelektrisanje

delokalizovano preko više atoma, kao u acetonatima. Slika 2 pokazuje mesta maksimalnog

napona u kompleksu. Oktaedarski kompleks je mer konfiguracije (ravni koje su definisane

donorskim PNO atomima svakog od liganada su međusobno normalne) sa približnom C2

simetrijom molekula, a koordinacija dovodi do formiranja dva šestočlana Co–P–C–C–C–N

i dva petočlana Co–N–N–C–O prstena. Ovi prstenovi su praktično planarni, sa

amplitudama odstupanja bliskim nuli: 0,03 Å za prsten koji sadrži P1, 0,16 za onaj sa P2,

0,07 za prsten sa O3 i 0,19 za onaj koji uključuje O1. P2 i O1 su atomi koji najviše

odstupaju od planarnosti. Dve helatne ravni, koje sadrže atome P–N–O–Co su praktično

normalne (diedarski ugao = 87°). Oktaedarski kompleksni katjon se može uporediti sa

kompleksom koji sadrži sličan ligand kao što je bis(2-(difenilfosfino)benzaldehid-

benzoilhidrazon)gvožđe(III) jon [5] čija se struktura gotovo preklapa sa strukturom Co(III)

kompleksa. Druga dva slična oktaedarska kompleksa opisana u literaturi su

bis(2-(difenilfosfino)benzaldehid-benzoilhidrazon)gvožđe(II)-tetrahloroferat(III)-hlorid [5]

i bis(2-(difenilfosfino)benzaldehid-benzoilhidrazon)rutenijum(II) dimetil-sulfoksid-solvat

monohidrat [4], ali u ovim slučajevima helatni sistemi su znatno manje planarni. BF4−

anjon je orijentaciono neuređen oko atoma bora i pakovanje u kristalu ne pokazuje nijedan

značajan strukturni motiv.

42

Slika 2. Molekulska struktura [CoL2]BF4 kompleksa, sa oznakama i termalnim elipsoidima

datim sa 50% verovatnoće. Fenil grupe vezane za atome fosfora su izostavljene radi

preglednosti slike i samo su ipso ugljenikovi atomi zadržani.

43

Tabela 7. Najznačajnije dužine veza (Å) i uglovi (°) za [CoL2]BF4 kompleks

Dužine veza

Co1–P1 2,2541(4) Co1–O3 1,928(1)

Co1–P2 2,2405(4) Co1–N1 1,914(1)

Co1–O1 1,927(1) Co1–N3 1,915(1)

Uglovi između veza

P1–Co1–P2 99,42(2) O3–Co1–N1 88,08(5)

P1–Co1–O1 173,42(3) O3–Co1–N3 83,23(5)

P1–Co1–O3 87,36(3) N1–Co1–N3 168,24(5)

P1–Co1–N1 95,85(4) Co1–P1–C2 110,94(5)

P1–Co1–N3 91,66(4) Co1–P1–C11 121,00(5)

P2–Co1–O1 87,11(3) Co1–P1–C17 111,18(5)

P2–Co1–O3 173,10(3) Co1–P2–C24 111,42(5)

P2–Co1–N1 92,50(4) Co1–P2–C33 114,32(5)

P2–Co1–N3 95,19(4) Co1–P2–C39 115,51(5)

O1–Co1–O3 86,14(4) Co1–O1–C8 108,43(9)

O1–Co1–N1 82,92(4) Co1–O3–C30 107,95(9)

O1–Co1–N3 88,60(5) Co1–N1–N2 112,71(9)

Co1–N1–C7 133,4(1) Co1–N3–N4 112,47(9)

Co1–N3–C29 133,7(1)

44

4.2.3. Rendgenska strukturna analiza kompleksa [PdLCl]

Kompleks Pd(II) kristališe u monokliničnoj C2/c prostornoj grupi. U neutralnom

kompleksu [PdLCl], deprotonovani ligand HL je tridentatno koordinovan preko atoma

fosfora P1, iminskog azota N1 i estarskog karbonilnog kiseonika O1. Slika 3 prikazuje

molekulsku strukturu sa oznakama. Kvadratno-planarno okruženje oko atoma paladijuma je

kompletirano hloridnim anjonom trans u odnosu na azot, sa Pd–Cl rastojanjem od

2,2989(3) Å. Koordinacijom liganda formiraju se po jedan šestočlani i petočlani helatni

prsten. Ovi helatni prstenovi su planarni sa odstupanjem do 0,04 Å. Ceo skelet liganda,

osim dva fenila vezana preko C11 i C17, koplanaran je sa koordinacionom ravni

paladijuma sa odstupanjem do 0,07 Å. Poređenje dužina i uglova veza pomoću programa

Mogul pokazalo je da se vrednosti ne razlikuju značajno od prosečnih vrednosti kod sličnih

sistema [43]. Analiza dužina veza u okviru helatnog sistema ukazuje na značajan karakter

dvostruke veze za C7–N1 vezu (1,2865(2) Å), vezu jednostrukog karaktera za N1–N2

(1,3923(2) Å), dok N2–C8 (1,3029(2) Å) i C8–O1 (1,2622(1) Å) veze imaju više

delokalizovanu prirodu.

Slika 3. Molekulska struktura [PdLCl] kompleksa sa oznakama atoma i termalnim

elipsoidima datim sa 50% verovatnoće.

45

4.2.4. Rendgenska strukturna analiza kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl

Kompleks [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl kristališe u monokliničnoj prostornoj grupi P21/c i

sastoji se iz mer-[Fe(HL)2]3+ katjona, dva [FeCl4]

− kompleksna anjona i jednog hlorida.

Kompleksni katjon čine dva neutralna HL liganda tridentatno koordinovana preko PNO

atoma za Fe(III) jon (slika 4); iako ovakva koordinacija dovodi do hiralnosti, struktura u

čvrstom stanju je centrična, pa je kristal racemat. Kompleks pokazuje nekristalografsku

simetriju oko ose pseudo-drugog reda koja polovi O1–Fe–O3 i P1–Fe–P2 uglove.

Rastojanja Fe–P (2,234(1) i 2,232(1) Å) su kraća od uobičajenih kako je pokazao Mogul

pregled geometrija [43], ali su u saglasnosti sa onima uočenim za slične komplekse [5].

Geometrija helatnih sistema za neutralni ligand HL pokazala je izražen dvostruki karakter

veze za C7–N1 i C29–N3 (1,2759(2); 1,2844(2) Å), jednostruku N–N vezu (1,4025(4);

1,3996(2) Å), i lokalizovanu dvostruku vezu C=O grupe (C8–O1 = 1,2310(4),

C30–O3 = 1,2302(4) Å), kao i duže C8–N2(H) i C30–N4(H) (1,3369(3), 1,3506(2) Å) veze

u odnosu na one uočene za kompleks [PdLCl]. Kao i kod neutralnog [PdLCl] kompleksa i

ovde PNO koordinacija generiše dva helatna prstena, koji su planarni u granici od 0,06 Å,

ali nisu idealno koplanarni jedan u odnosu na drugi i formiraju diedarski ugao od 8° u oba

slučaja. Prema tome, ukupan skelet dva liganda je malo savijen i odstupa od planarnosti za

0,9 Å. Interesantno je uporediti ovaj kompleks sa kompleksom [Fe(HPNO)2]3+

(HPNO = 2-(difenilfosfino)benzaldehid-benzoilhidrazon) [5], koji se razlikuje od

kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl samo u supstituentu na estarskom kraju i ima identičan

način koordinacije. U ovom slučaju ukupna planarnost dva liganda je izraženija, dok su

helatni prstenovi manje planarni.

46

Slika 4. Molekulska struktura i oznake atoma za [Fe(HL)2]3+ katjon kompleksa

[Fe(HL)2][FeCl4]2Cl. Termalni elipsoidi su prikazani sa 50% verovatnoće. Fenil grupe

vezane za atom fosfora preko C11, C17, C33 i C39 nisu prikazane na slici.

U kristalnom pakovanju se uočava neuređena distribucija dva [FeCl4]− anjona koji

pokazuju poziciono neuređenje (66 : 34) sa inverzijom tetraedarskog motiva oko atoma

gvožđa, koji je razdvojen preko dva veoma bliska mesta. Ovo ukazuje na slabo učešće ovih

jona u supramolekulskoj mreži; zapravo, u pakovanju dominiraju Kulonove interakcije, dok

su NH grupe kompleksnog katjona usmerene prema dvama hloridima jednog [FeCl4]−

anjona (N4–H…Cl2=3,379(1) Å, 140(1)°; N2–H…Cl4 (i)=3,379(1) Å, 140(1)°,

i = 1-x,1/2+y,1/2-z).

4.2.5. Rendgenska strukturna analiza Ni(II) kompleksa

Kompleksi [NiL(OCN)] i [NiL(NCS)] kristališu u monokliničnom P21/n sistemu,

dok kompleks [NiL(N3)] kristališe u trikliničnom sistemu, P 1 prostornoj grupi. U svim

strukturama koordinacija oko metalnog jona je kvadratno-planarne geometrije, tri

koordinaciona mesta zauzima PNO sistem donorskih atoma koji čine atom fosfora, iminski

azot i karbonilni kiseonik, dok četvrto koordinaciono mesto zauzima monodentatni ligand

47

koji je različit u svakom kompleksu: u [NiL(OCN)] cijanat je koordinovan za metal preko

atoma kiseonika; u [NiL(NCS)] tiocijanat je koordinovan za nikl preko atoma azota, dok je

u [NiL(N3)] azid koordinovan za metal (slika 5).

Sva tri kompleksa imaju neznatno deformisanu kvadratno-planarnu geometriju, sa

uglovima N1–Ni1–O1 = 83,62° ([NiL(OCN)]), 84,17° ([NiL(NCS)]), 83,90° ([NiL(N3)]) i

N1–Ni1–P1 = 94,45° ([NiL(OCN)]), 95,74° ([NiL(NCS)]), 94,09° ([NiL(N3)]) koji su deo

petočlanog i šestočlanog helatnog prstena; prsten N1–N2–C8–O1–Ni1 je uvek strogo

planaran, dok prsten N1–C7–C1–C2–P1–Ni1 ima konformaciju koverte sa atomom fosfora

na vrhu, što je zajednička karakteristika sa sličnim sistemima [1,2,6,8,9].

Slika 5. Ortep slike kompleksa [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)]

48

U tabeli 8 su prikazani relevantni parametri vezivanja za sve sintetisane Ni(II)

komplekse. Dužine veza i uglovi su veoma slični i ne razlikuju se značajno od prosečnih

vrednosti uočenih kod sličnih sistema, sa izuzecima koji odgovaraju kvadratno-planarnim

strukturama sa Ni–L’ (L’ = cijanat, tiocijanat i azid) vezama. U slučaju kompleksa

[NiL(OCN)], kvadratno-planarni Ni–OCN sistemi nisu pronađeni u CSD; kvadratno-

planarni Pt-cijanat kompleks (CSD refkod BAWXEE) ima kraće O3–C23 (Δ = 0,112 Å) i

duže C23–N3 (Δ = 0,044 Å) veze, kao i veći ugao metal–O3–C23 (Δ = 16,95°). Pretraga

urađena u slučaju kompleksa [NiL(NCS)] je pokazala da je veza imeđu nikla i azota u

tiocijanatnom ligandu nešto kraća od prosečne vrednosti nađene u literaturi za 85 poznatih

kvadratno-planarnih Ni–NCS sistema (prosečna vrednost je 1,871 Å), dok je ugao

Ni1–N3–C23 nešto manji (prosečna vrednost je 172°). U literaturi je pronađeno trideset

Ni–N3 struktura koje su uporedive sa kompleksom [NiL(N3)] kod kojih nisu uočene

značajne razlike u dužinama veza, dok je ugao Ni1–N3–N4 u kompleksu [NiL(N3)] manji

od prosečnog (124°).

Štaviše, ova tri kvadratno-planarna kompleksa su uporediva sa jednim koji ima

sličan, ali neutralan ligand, (2-(difenilfosfino)benzaldehid-benzoilhidrazon-N,P)-acetil-

paladijum(II)-trifluorometansulfonat (CSD refkod BAGPAB) [3]. U kompleksima

[NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)], kao posledica deprotonovanja hidrazida, dolazi do

produženja C8–O1 veze i skraćenja N2–C8 veze u odnosu na neutralni slobodni HL ligand.

49

Tabela 8. Dužine veza (Å) i uglovi (°) za [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)]

komplekse

[NiL(OCN)] [NiL(NCS)] [NiL(N3)]

Ni(1)-O(3) 1,851(2) Ni(1)-N(3) 1,845(2) Ni(1)-N(3) 1,8818(19)

Ni(1)-O(1) 1,9111(14) Ni(1)-O(1) 1,888(1) Ni(1)-O(1) 1,9141(15)

Ni(1)-N(1) 1,8763(16) Ni(1)-N(1) 1,868(2) Ni(1)-N(1) 1,8793(18)

Ni(1)-P(1) 2,1342(8) Ni(1)-P(1) 2,1375(5) Ni(1)-P(1) 2,1277(6)

O(3)-Ni(1)-O(1) 92,02(7) N(3)-Ni(1)-O(1) 91,13(7) N(3)-Ni(1)-O(1) 91,73(8)

O(3)-Ni(1)-N(1) 175,18(7) N(3)-Ni(1)-N(1) 174,94(8) N(1)-Ni(1)-N(3) 175,37(8)

N(1)-Ni(1)-O(1) 83,62(6) O(1)-Ni(1)-N(1) 84,17(7) N(1)-Ni(1)-O(1) 83,90(7)

O(3)-Ni(1)-P(1) 90,23(6) N(3)-Ni(1)-P(1) 89,16(6) N(3)-Ni(1)-P(1) 89,93(6)

O(1)-Ni(1)-P(1) 168,64(4) O(1)-Ni(1)-P(1) 173,10(5) O(1)-Ni(1)-P(1) 169,19(5)

N(1)-Ni(1)-P(1) 94,45(5) N(1)-Ni(1)-P(1) 95,74(5) N(1)-Ni(1)-P(1) 94,09(6)

C(17)-P(1)-C(11) 106,20(7) C(17)-P(1)-C(11) 108,01(8) C(17)-P(1)-C(11) 105,83(10)

C(2)-P(1)-C(17) 104,68(8) C(17)-P(1)-C(2) 106,10(9) C(2)-P(1)-C(17) 105,53(10)

C(2)-P(1)-C(11) 104,81(8) C(11)-P(1)-C(2) 106,55(9) C(2)-P(1)-C(11) 105,60(10)

C(17)-P(1)-Ni(1) 120,49(6) C(17)-P(1)-Ni(1) 113,70(6) C(17)-P(1)-Ni(1) 120,44(7)

C(11)-P(1)-Ni(1) 106,43(6) C(11)-P(1)-Ni(1) 109,21(7) C(11)-P(1)-Ni(1) 105,30(7)

C(2)-P(1)-Ni(1) 113,04(6) C(2)-P(1)-Ni(1) 112,92(6) C(2)-P(1)-Ni(1) 113,02(7)

C(8)-O(1)-Ni(1) 107,84(11) C(8)-O(1)-Ni(1) 108,5(1) C(8)-O(1)-Ni(1) 107,98(13)

C(8)-O(2)-C(9) 118,49(17) C(8)-O(2)-C(9) 115,9(2) C(8)-O(2)-C(9) 117,69(18)

C(7)-N(1)-Ni(1) 133,64(12) C(7)-N(1)-Ni(1) 133,3(1) C(7)-N(1)-Ni(1) 133,47(16)

N(2)-N(1)-Ni(1) 113,24(11) N(2)-N(1)-Ni(1) 113,2(1) N(2)-N(1)-Ni(1) 113,05(13)

C(8)-N(2)-N(1) 108,44(14) C(8)-N(2)-N(1) 107,9(1) C(8)-N(2)-N(1) 108,73(18)

C(23)-O(3)-Ni(1) 147,6(2) C(23)-N(3)-Ni(1) 169,4(2) N(4)-N(3)-Ni(1) 120,42(17)

50

Strukturna analiza pakovanja u kristalima kompleksa [NiL(OCN)] nije pokazala

prisustvo jakih intermolekulskih interakcija, pakovanje omogućavaju CH∙∙∙N, CH∙∙∙O i

CH∙∙∙C kontakti. Atom azota cijanatnog liganda je uključen u dve CH∙∙∙N interakcije sa dva

molekula kompleksa (dC∙∙∙N = 3,359(3) Å i dC∙∙∙N = 3,400(5) Å).

U strukturi kompleksa [NiL(NCS)] formira se interesantan supramolekulski motiv

između dva susedna molekula kompleksa. Dva molekula kompleksa poseduju centar

simetrije, motiv čine četiri interakcije, pri čemu su kontakti C6–H∙∙∙O2 (dC∙∙∙O = 3,372(2) Å)

i C7–H∙∙∙N2 (dC∙∙∙N = 3,669(2) Å) dva puta ponovljeni (slika 6).

Slika 6. Interakcije između susednih molekula kompleksa [NiL(NCS)].

Dve CH∙∙∙S interakcije (dC∙∙∙S = 3,850(3) Å i dC∙∙∙S = 3,547(3) Å) se javljaju između

terminalnog atoma sumpora izotiocijanatnog liganda i aromatičnog prstena dva različita

molekula kompleksa, takođe sličan kontakt je pronađen i između karbonilnog kiseonika

vezanog za atom nikla i aromatičnog CH (dC∙∙∙O = 3,317(2) Å).

Kompleks [NiL(N3)] kristališe zajedno sa molekulima rastvarača u odnosu

kompleks : MeOH = 1 : 1,5. Jednom od dva molekula rastvarača metil grupa se poklapa sa

centrom simetrije, što generiše dve hidroksilne grupe sa zauzećem 0,5.

51

Molekuli metanola učestvuju u formiranju dve vodonične veze (slika 7): prvu čine

OH grupa molekula metanola sa potpunom zauzećem i amidni azot kompleksa:

O3–H3∙∙∙N2 (O3∙∙∙N2 = 2,869(4) Å, 166,2(3)°); dok drugu čine atom kiseonika O100 sa

delimičnom zauzećem i O3 atom iz dva različita molekula metanola: O100–H100∙∙∙O3

(O3∙∙∙O6 = 2,70(1) Å, 147(5)°).

Slika 7. Vodonične veze sa molekulima metanola u kompleksu [NiL(N3)].

Pakovanje u kristalima azido kompleksa je prikazano na slici 8 sa koje se vidi da se

molekuli rastvarača nalaze u kanalima između molekula kompleksa. Na sobnoj temperaturi

kristali [NiL(N3)] nisu stabilni na vazduhu, verovatno zbog tendencije molekula metanola

da napuste strukturu.

52

Slika 8. Pakovanje u kristalima kompleksa [NiL(N3)].


biiminodibenzo[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata (1)

Anhidrovani (jedinjenje 1) i hidratisani (jedinjenje 1×H2O) kristali su ispitivani

rendgenskom strukturnom analizom. Dobijeni rezultati su prikazani na slici 9, koja

pokazuje dikatjonski motiv, heteroanalog biciklo[3.3.2]dekana, zajednički za obe ispitivane

kristalne strukture.

53

Slika 9. Prikaz difosfocinijum-katjona prisutnog u kristalima anhidrovanog i hidratisanog

jedinjenja 1. Termalni elipsoidi su prikazani sa 30% verovatnoće. Pošto prikazani

molekulski katjon ima osu simetrije drugog reda, oznake prikazuju samo simetrijski

nezavisan deo molekula.

Molekulski katjon 1 formalno poseduje osu simetrije drugog reda i sadrži dva

stereocentra (C7 i njegov simetrijski ekvivalent, slika 9) oba su iste konfiguracije (R za

katjon prikazan na slici 9). Molekuli su hiralni, ali njihovi kristali, koji su centrosimetrični

nisu. Štaviše, molekulski katjon 1×H2O (prikazan na slici 9) ima C2 simetriju u čvrstom

stanju dok onaj u jedinjenju 1 ima samo približnu C2 simetriju (slika 10). U tabeli 9 su

prikazani relevantni parametri vezivanja za jedinjenja 1 i 1×H2O.

54

Slika 10. Izgled molekulskog katjona 1 koji je prisutan u anhidrovanim kristalima.

Termalni elipsoidi su prikazani sa 40% verovatnoće.

Konformacija katjona je gotovo ista u hidratisanom i anhidrovanom kristalu; oba

sedmočlana prstena zauzimaju deformisanu konformaciju uvrnute stolice, dok je

konformacija osmočlanog prstena uvrnuta lađa. Ova konformacija dovodi do diedarskih

uglova od 82,07(9) u 1 i 82,37(10)° u 1×H2O između benzenovih prstenova kondenzovanih

sa osmočlanim prstenom. Konformacija N–N mosta je gotovo stepeničasta, H–N–N–H

torzioni uglovi su −34 i −31°, u 1 i 1×H2O, tim redom. Rastojanja P···P su 3,9911(10) i

4,0136(14) Å, za 1 i 1×H2O, redom, a unutar prstena C–P–C uglovi su veći: 115,38(14),

113,79(14) za 1 i 114,38(13)° za 1×H2O, nego preostali valentni uglovi na fosforu, koji su

u opsegu od 103,79(14) do 114,32(16)°, tako da je prosečna vrednost 108,3(3,5)°. Bez

sumnje, sistem prstenova nameće planarnost, tako da su vrednosti valentnih uglova

P–C*–N unutar prstena 112,3(2), 113,2(2) i 112,1(2)°. Dužina veze P–C (P–C(sp3)

prosečna vrednost 1,865(2) Å, P–C(sp2) prosečna vrednost 1,801(4) Å) pokazuje male

devijacije od standardnih vrednosti prikazanih u Internacionalnim kristalografskim

tablicama [46].

55

Tabela 9. Dužine veza (Å) i valencioni uglovi (°) za jedinjenja 1 i 1×H2O *.

1 1×H2O

Dužine veza

N1—N2 1,450 (4) N1—N1i 1,450 (5)

N1—C7 1,450 (4) N1—C7 1,459 (4)

N2—C8 1,456 (4) N1—C7 1,459 (4)

P1—C8 1,866 (3) P1—C7 1,862 (3)

P1—C12 1,805 (3) P1—C1 1,802 (3)

P1—C31 1,806 (3) P1—C21 1,800 (3)

P1—C21 1,797 (3) P1—C11 1,793 (3)

P2—C7 1,866 (3) P1—C7 1,862 (3)

P2—C41 1,808 (3) P1—C1 1,802 (3)

P2—C61 1,799 (4) P1—C21 1,800 (3)

P2—C51 1,796 (3) P1—C11 1,793 (3)

Valencioni uglovi

N2—N1—C7 109,0 (3) N1i—N1—C7 109,2 (2)

N1—N2—C8 108,8 (3) N1i—N1—C7 109,2 (2)

C12—P1—C8 113,79 (14) C1—P1—C7 114,38 (13)

C12—P1—C21 109,88 (15) C1—P1—C11 111,58 (14)

C12—P1—C31 107,59 (16) C1—P1—C21 107,72 (14)

C21—P1—C31 106,58 (15) C11—P1—C21 105,72 (13)

C21—P1—C8 114,32 (16) C11—P1—C7 112,83 (14)

C31—P1—C8 104,04 (15) C21—P1—C7 103,79 (14)

C41—P2—C7 115,38 (14) C1—P1—C7 114,38 (13)

C41—P2—C51 113,09 (15) C1—P1—C11 111,58 (14)

C41—P2—C61 105,35 (17) C1—P1—C21 107,72 (14)

C51—P2—C61 106,51 (16) C11—P1—C21 105,72 (13)

C51—P2—C7 111,73 (17) C11—P1—C7 112,83 (14)

C61—P2—C7 103,69 (16) C21—P1—C7 103,79 (14)

* Zatamnjene vrednosti napisane kurzivom su simetrijski generisane. Simetrijski kodovi: (i) −x, y, −z + 1/2.

56

Pakovanje u kristalu uglavnom određuju jonske interakcije i vodonične veze. Parametri

vodoničnog vezivanja prikazani su u tabeli 10, a šema vodoničnog vezivanja prikazana je

na slikama 11 i 12.

Tabela 10. Parametri vodoničnog vezivanja za jedinjenja 1 i 1×H2O

D–H (Å) D…A (Å) H…A (Å) D-H…A (o) Simetrijske

operacije na A

1

N1–H1A···O3 0,92 2,966(4) 2,19 142 1,5-x, -0,5+y, z

N2–H2···O1 0,92 2,959(5) 2,15 146 0,5+x, 0,5-y, 1-z

1×H2O

N1–H1···O1W 0,92 2,944(4) 2,23 134

N1–H1···O1 0,92 3,231(3) 2,54 132 -0,5+x, 0,5-y, -0,5+z

O1W–H1O···O4 0,85 3,238(3) 2,42 162 -0,5+x, 0,5+y, -1+z

U jedinjenju 1, vodonične veze su dvocentrične NH···O tipa i formiraju se sa

perhloratnim grupama kao akceptorima, dok su u hidratisanim kristalima vodonične veze

OH···O tipa. U 1×H2O kristalima NH grupa (i njen simetrijski ekvivalent u odnosu na osu

drugog reda) formiraju trocentrične vodonične veze doniranjem svojih protona

kiseonikovim atomima perhlorata i vode, a molekul vode je donor perhloratnom kiseoniku.

57

Slika 11. Vodonične veze u kristalima strukture 1.

Dok su u anhidrovanim kristalima uočene diskretne supramolekulske jedinice

formirane vodoničnim vezivanjem molekula oko centara inverzije (slika 11), u 1×H2O

dodavanje molekula vode omogućava pružanje vodonično vezanih molekula u vidu traka

koje se prostiru duž c-pravca i sastoje se od spojenih prstenova koje formiraju molekuli

vodonično vezani oko centara inverzije povezanih translacijom (slika 12).

58

Slika 12. Vodonične veze u kristalima strukture 1×H2O.

4.3. IR spektri

4.3.1. IR spektar kompleksa [CoL2]BF4

U spektru kompleksa [CoL2]BF4 se javlja nova traka na 1507 cm−1 koja potiče od

ν(-O–C=N) deprotonovanog hidrazidnog motiva, umesto trake karbonila nekoordinovanog

liganda na 1707 cm−1. U koordinovanom ligandu hidrazidni azot je deprotonovan i kao

posledica delokalizacije elektrona C=O veza ima delimično karakter jednostruke veze, a

C–N veza ima delimično karakter dvostruke veze. Vibracija B–F veze je na 1060 cm−1 u

spektru kompleksa [CoL2]BF4 i ona potiče od tetrafluoroboratnog anjona iz spoljašnje sfere

kompleksa.

59

4.3.2. IR spektar kompleksa [PdLCl]

U IR spektru kompleksa [PdLCl] uočava se nova traka na 1517 cm−1, koja potiče

od ν(−O–C=N) vibracije deprotonovanog hidrazona. Takođe, traka na 1550 cm−1 koja

potiče od [ν(C=N)] nekoordinovanog liganda je pomerena na 1480 cm−1. U IR spektrima

kompleksa [PdLCl] kao i liganda HL pozicija trake koja odgovara ν(C–P) vibraciji je

nepromenjena (1435 cm−1 u spektru HL, 1436 cm−1 u spektru kompleksa [PdLCl]).

4.3.3. IR spektar kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl

U IR spektru kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl vibracija karbonilne grupe se javlja

na 1632 cm−1, dok je traka na 1554 cm−1 koja potiče od imino grupe [ν(C=N)] samo malo

pomerena u poređenju sa istom vibracijom nekoordinovanog liganda. U IR spektru

kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl se uočava traka koja potiče od slabe N–H vibracije

istezanja na 3237 cm−1 što ukazuje na koordinaciju liganda u neutralnom obliku.

U IR spektrima kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl kao i liganda HL položaj trake koja

odgovara ν(C–P) vibraciji je nepromenjen (1435 cm−1 u spektru HL, 1435 cm−1 u spektru

kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl).

4.3.4. IR spektri Ni(II) kompleksa [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)]

U IR spektrima Ni(II) kompleksa javlja se nova traka (1527 cm−1 za [NiL(OCN)],

1521 cm−1 za [NiL(NCS)], 1522 cm−1 za [NiL(N3)]), koja potiče od ν(-O–C=N)

deprotonovanog hidrazida, umesto trake karbonilne grupe nekoordinovanog liganda na

1707 cm−1. U IR spektru kompleksa [NiL(OCN)] postoji traka na 2219 cm−1 koja potiče od

koordinovanog cijanatnog anjona. Traka na 2090 cm−1 u spektru kompleksa [NiL(NCS)]

potiče od ν(CN) vibracija NCS grupe koordinovane preko atoma azota. U IR spektru

kompleksa [NiL(N3)] javlja se traka na 2038 cm−1 koja odgovara koordinovanom azidnom

anjonu [47].

60

4.4. NMR spektri

4.4.1. NMR spektri kompleksa [CoL2]BF4

Iz 1H-NMR spektra kompleksa [CoL2]BF4 (tabela 11) vidi se da je ligand

koordinovan u monodeprotonovanom obliku, pošto signal hidrazida NH na 11,20 ppm

nedostaje. Koordinacija preko iminskog azota je potvrđena iz 1H-NMR spektra na osnovu

položaja signala vodonikovog atoma sa iminskog ugljenika na 8,99 ppm koji je pomeren ka

nižem polju u odnosu na odgovarajući signal u ligandu (8,71 ppm). U 1H-NMR spektru

kompleksa [CoL2]BF4 hemijska pomeranja aromatičnih protona imaju veće vrednosti, što

je posledica smanjenja elektronske gustine koordinacijom fosfora za metalni jon. Signali

metilenske i metil grupe iz alkoholnog dela estra su na 4,10, odnosno 1,19 ppm u ligandu, i

na 3,65, odnosno 0,91 ppm u kompleksu.

Koordinacija preko N1 dovodi do pomeranja ka nižem polju hidrazonskog ugljenika

C3 (141,6 ppm u spektru HL; 155,4 ppm u spektru kompleksa [CoL2]BF4), i

para-ugljenika C7 (129,2 ppm u spektru HL; 133,7 ppm u spektru kompleksa [CoL2]BF4)

(tabela 12). Postoji jako pomeranje ka nižem polju karbonilnog ugljenika C14 kao

posledica koordinacije za Co(III), signal je pomeren sa 153,4 ppm u spektru HL na

170,3 ppm u spektru kompleksa [CoL2]BF4. Posledica koordinacije preko atoma fosfora je

pomeranje ka nižem polju ugljenika koji su para u odnosu na fosfor (C6, C13).

61

Tabela 11. 1H-NMR spektri za ligand HL i kompleks [CoL2]BF4 (oznake atoma odgovaraju onim prikazanim na shemi 1)

Asignacija

Hemijsko pomeranje (ppm), multiplicitet,

broj H-atoma, konstanta kuplovanja J (Hz)

za ligand HL

Asignacija

Hemijsko pomeranje (ppm), multiplicitet,

broj H-atoma, konstanta kuplovanja J (Hz)

za kompleks [CoL2]BF4

C1 1,19 (t, 3H, J = 7,1 Hz) C1 0,91 (t, 3H, J = 7,0 Hz )

C2 4,10 (q, 2H, J = 7,0 Hz) C2

C2’

3,47 (m, 1H)

3,69 (m, 1H)

C3 8,71 (s, 1H) C3 8,99 (s, 1H)

C5 6,80 (m, 1H) C5 7,17 (m, 1H)

C6 7,31 (dt, 1H, J = 7,5 Hz J = 1,0 Hz) C6 7,51 (m, 1H)

C7 7,41 (m, 1H) C7 7,86 (m, 1H)

C8 7,94 (m, 1H) C8 8,05 (m, 1H)

C11 7,20 (m, 4H) C11

C11’

7,22 (m, 2H)

6,96 (m, 2H)

C12 7,41 (m, 4H) C12

C12’

7,33 (m, 2H)

7,11 (m, 2H)

C13 7,41 (m, 2H) C13

C13’

7,51 (m, 1H)

7,41 (m, 1H)

N2 11,20 (s, 1H)

62

Tabela 12. 13C-NMR spektri za ligand HL i kompleks [CoL2]BF4 (oznake atoma

odgovaraju onim prikazanim na shemi 1)

Asignacija

13C-NMR hemijsko

pomeranje (ppm),

konstanta kuplovanja,

J (Hz) za ligand HL

Asignacija

13C-NMR hemijsko

pomeranje (ppm) za

kompleks [CoL2]BF4

C1 14,5 C1 14,0

C2 60,5 C2 65,4

C3 141,6 C3 155,4

C4 135,5 J = 10,0 Hz C4 136,2

C5 132,9 C5 135,3

C6 129,6 C6 131,8

C7 129,2 J = 15,0 Hz C7 133,7

C8 125,5 J = 3,8 Hz C8 136,5

C9 135,6 J = 18,8 Hz C9 136,1

C10 138,0 J = 18,8 Hz C10 136,1

C11 133,5 J = 20,0 Hz C11

C11’

133,8

132,9

C12 128,8 J = 7,5 Hz C12

C12’

128,1

129,0

C13 129,1 C13 130,9

C14 153,4 C14 170,3

63

4.4.2. NMR spektri kompleksa [PdLCl]

Signal slobodnog liganda HL koji se uočava na 11,20 ppm ne postoji u 1H NMR

spektru kompleksa [PdLCl], što ukazuje na koordinaciju liganda u deprotonovanom obliku

(tabela 13). U 1H NMR spektru kompleksa [PdLCl] signali većine aromatičnih protona su

pomereni ka nižem polju, čemu je uzrok koordinacija preko atoma fosfora. Signal

azometinskog vodonikovog atoma je pomeren ka višem polju u spektru kompleksa

[PdLCl] zbog koordinacije iminskog azota. Kiseonikov atom iz etoksi grupe nije uključen

u koordinaciju pošto su signali metilenske i metil grupe iz alkoholnog dela estra minimalno

pomereni ka nižem polju u 1H NMR spektru kompleksa.

Iz 13C NMR spektra (tabela 14) može se videti da dolazi do izrazitog pomeranja ka

nižem polju signala karbonilnog ugljenika zbog koordinacije za Pd(II). Signali većine

aromatičnih ugljenikovih atoma su pomereni ka nižem polju, dok su signali ugljenikovih

atoma direktno vezanih za fosfor pomereni ka višem polju zbog koordinacije atoma fosfora

za jon metala. Signal iminskog ugljenikovog atoma C3 je pomeren ka nižem polju u

spektru kompleksa [PdLCl] što ukazuje na koordinaciju iminskog azota.

Poređenjem 1H NMR i 13C NMR spektara HL i kompleksa [PdLCl] može se

zaključiti da je ligand koordinovan u deprotonovanoj formi kao tridentat preko atoma

fosfora, iminskog azota i karbonilnog kiseonikovog atoma, s obzirom na to da postoje

velike promene u hemijskim pomeranjima signala iminskog, aromatičnog i karbonilnog

dela molekula i male promene hemijskih pomeranja metilenske i metil grupe alkoholnog

dela estra.

64

Tabela 13. 1H NMR spektralni podaci za ligand HL i kompleks [PdLCl] (oznake atoma


Asignacija Hemijsko pomeranje (ppm), multiplicitet, broj H-atoma,

konstanta kuplovanja J u Hz

HL [PdLCl]

C1 1,19 (t, 3H, J = 7,1 Hz) 1,30 (t, 3H, J = 10,0 Hz)

C2 4,10 (q, 2H, J = 7,0 Hz) 4,27 (q, 2H, J = 10,0 Hz)

C3 8,71 (s, 1H) 8,05 (d, 1H, J = 5,0 Hz)

C5 6,80 (m, 1H) 7,26 (m, 1H)

C6 7,31 (dt, 1H, J = 7,5 Hz,

J = 1,0 Hz) 7,44 (m, 1H)

C7 7,41 (m, 1H) 7,55 (m, 1H)

C8 7,94 (m, 1H) 7,63 (m, 1H)

C11 7,20 (m, 4H) 7,44 (m, 4H)

C12 7,41 (m, 4H) 7,65 (m, 4H)

C13 7,41 (m, 2H) 7,55 (m, 2H)

N2 11,20 (s, 1H)

65

Tabela 14. 13C NMR spektralni podaci za ligand HL i kompleks [PdLCl] (oznake atoma


Asignacija Hemijsko pomeranje (ppm), konstanta kuplovanja J u Hz

HL [PdLCl]

C1 14,5 14,8

C2 60,5 63,6

C3 141,6 143,5

C4 135,5 (J = 10,0 Hz) 137,2 (J = 17,5 Hz)

C5 132,9 134,6 (J = 2,5 Hz)

C6 129,6 131,2 (J = 7,5 Hz)

C7 129,2 (J = 15,0 Hz) 135,0 (J = 8,8 Hz)

C8 125,5 (J = 3,8 Hz) 133,0 (J = 2,5 Hz)

C9 135,6 (J = 18,8 Hz) 117,1 (J = 55,0 Hz)

C10 138,0 (J = 18,8 Hz) 127,5 (J = 63,8 Hz)

C11 133,5 (J = 20,0 Hz) 129,0 (J = 12,5 Hz)

C12 128,8 (J = 7,5 Hz) 133,9 (J = 12,5 Hz)

C13 129,1 132,1 (J = 2,5 Hz)

C14 153,4 173,3

66

4.4.3. NMR spektri Ni(II) kompleksa [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)]

Iz 1H NMR spektara Ni(II) kompleksa (tabela 15) može se uočiti da je ligand

koordinovan u monodeprotovanom obliku, pošto se u spektrima kompleksa ne javlja signal

vodonikovog atoma hidrazida na 11,20 ppm. U 1H NMR spektrima Ni(II) kompleksa

hemijska pomeranja većine aromatičnih protona imaju veće vrednosti, zbog smanjenja

elektronske gustine, što je posledica koordinacije liganda za jon metala. Signal

azometinskog vodonikovog atoma je pomeren ka višem polju u svim kompleksima zbog

koordinovanja iminskog azota. Signali metilenske i metil grupe iz alkoholnog dela estra su

vrlo malo pomereni ka nižem polju u spektrima kompleksa, što ukazuje na izostanak

koordinacije kiseonikovog atoma alkoksi grupe.

67

Tabela 15. 1H NMR spektralni podaci za HL, [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)] (oznake atoma odgovaraju onim

prikazanim na shemi 1)

Asignacija Hemijsko pomeranje (ppm), multiplicitet, broj H-atoma, konstanta kuplovanja J u Hz

HL [NiL(OCN)] [NiL(NCS)] [NiL(N3)]

C1 1,19 (t, 3H, J = 7,1 Hz) 1,29 (t, 3H, J = 7,0 Hz) 1,29 (t, 3H, J = 7,0 Hz ) 1,31 (s, 3H)

C2 4,10 (q, 2H, J = 7,0 Hz) 4,22 (q, 2H, J = 7,0 Hz) 4,20 (q, 2H, J=7,0 Hz) 4,25 (d, 4H, J = 6,5 Hz)

C3 8,71 (s, 1H) 7,89 (s, 1H) 7,92 (s, 1H) 7,92 (s, 1H)

C5 6,80 (m, 1H) 7,26 (m, 1H) 7,28 (m, 1H) 7,25 (d, 1H, J = 10,0 Hz)

C6 7,31 (dt, 1H, J = 7,5 Hz,

J = 1,0 Hz)

7,38 (dt, 1H, J = 7,5 Hz,

J = 0,5 Hz)

7,41 (t, 1H, J = 7,0 Hz) 7,36 (s, 1H)

C7 7,41 (m, 1H) 7,61 (m, 1H) 7,64 (m, 1H) 7,59 (s, 1H)

C8 7,94 (m, 1H) 7,43 (m, 1H) 7,45 (m, 1H) 7,42 (s, 1H)

C11 7,20 (m, 4H) 7,78 (t, 4H, J = 10,5 Hz) 7,76 (d, 4H, J = 6,0 Hz) 7,74 (s, 4H)

C12 7,41 (m, 4H) 7,52 (t, 4H, J = 8,0 Hz) 7,56 (m, 4H) 7,51 (s, 4H)

C13 7,41 (m, 2H) 7,61 (m, 2H) 7,62 (m, 2H) 7,58 (s, 2H)

N2 11,20 (s, 1H)

68

Iz 13C NMR spektara (tabela 16) može se uočiti da je kod svih kompleksa ligand

koordinovan za jon metala preko atoma fosfora, iminskog azota (N1) i karbonilnog

kiseonika. Koordinacija preko N1 dovodi do pomeranja ka nižem polju signala iminskog

ugljenika C3. Kao posledica koordinacije preko atoma fosfora signali ugljenikovih atoma

koji su direktno vezani za fosfor su pomereni ka višem polju. Koodinacija preko atoma

fosfora dovodi do smanjenja elektronske gustine na aromatičnim ugljenikovim atomima od

kojih je većina pomerena ka nižem polju. U 13C NMR spektrima uočava se izrazito

pomeranje signala karbonilnog ugljenikovog atoma C14 ka nižem polju, koje je posledica

koordinovanja za Ni(II) jon.

69

Tabela 16. 13C NMR spektralni podaci za HL, [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)]

(oznake atoma odgovaraju onim prikazanim na shemi 1).

Asignacija 13C NMR hemijsko pomeranje (ppm), konstanta kupolovanja, J u Hz

HL [NiL(OCN)] [NiL(NCS)] [NiL(N3)]

C1 14,5 14,7 14,8 14,8

C2 60,5 64,4 64,7 64,2

C3 141,6 149,1 149,5 148,8

C4 135,5

(J = 10,0 Hz) 136,1 134,3

136,4

(d, J = 3,8 Hz)

C5 132,9 133,9 133,2 134,1

C6 129,6 130,6

(d, J = 4,4 Hz) 131,1 130,4

C7 129,2

(J = 15,0 Hz) 132,9 132,4 131,9

C8 125,5

(J = 3,8 Hz)

134,1

(d, J = 8,0 Hz) 133,5

134,0

(d, J = 8,1 Hz)

C9 135,6

(J = 18,8 Hz)

118,5

(d, J = 45,0 Hz) 118,0

118,7

(d, J = 45,0 Hz)

C10 138,0

(J = 18,8 Hz)

126,4

(d, J = 57,5 Hz) 125,9

126,2

(d, J = 55,0 Hz)

C11 133,5

(J = 20,0 Hz) 133,4 (d, J = 9,4 Hz) 133,5 133,5 (d, J = 9,9 Hz)

C12 128,8

(J = 7,5 Hz)

129,3

(d, J = 10,2 Hz) 129,5

129,3

(d, J = 10,2 Hz)

C13 129,1 132,1 132,4 132,8

C14 153,4 173,2 173,5 173,1

C(OCN) 135,9

C(SCN) 134,0

70

4.4.4. NMR spektri 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo

[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata (1)

Molekulski katjon 1 poseduje tri vrste NMR aktivnih jezgara: 1H, 13C i 31P. NMR

spektri 1×H2O snimljeni su u CD3CN. Rezultati dobijeni iz 1D NMR spektara su bili

nedovoljni za rešavanje strukture, pošto su signali u 1H NMR spektru bili kompleksni

multipleti koji su se preklapali. Dodatni podaci su dobijeni iz 2D NMR eksperimenata:

COSY, NOESY, HSQC i HMBC. Ne postoji razlika između struktura određenih na osnovu

rezultata rendgenske strukturne analize i onih dobijenih NMR spektroskopijom, što ukazuje

na stabilnost jedinjenja 1 u rastvoru CD3CN. Značajne korelacije uočene u NOESY spektru

su prikazane na slici 13.

Slika 13. Značajne korelacije uočene u NOESY spektru jedinjenja 1.

71

4.5. Magnetna merenja za kompleks [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl

Rezultati magnetnih merenja su dati na slici 14, na kojoj je prikazana temperaturna

zavisnost efektivnog magnetnog momenta μeff = (8χT)1/2 i inverzne magnetne

susceptibilnosti (1/χ) po molu Fe(III) kompleksa. Može se uočiti da između 300 i 5 K, μeff

ima nepromenjenu vrednost od 8,2 μB dok na veoma niskim temperaturama slabo opada.

Takođe, inverzna magnetna susceptibilnost pokazuje linearnu zavisnost od temperature, što

potvrđuje paramagnetna svojstva ovog kompleksa u celom temperaturnom opsegu. Na

osnovu Curie-Weiss-ovog zakona dobijena je vrednost magnetnog momenta 8,2 μB i

vrednost Weiss-ove konstante θ = 0 K.

Izmerena vrednost efektivnog magnetnog momenta se slaže sa μ = 8,54 μB, koja se

očekuje za dva visokospinska Fe3+ jona (S = 5/2) i jedan niskospinski Fe3+ jon (S = 1/2).

Ovi spinovi su pripisani tetraedarskom Fe(III) jonu iz dve [FeCl4]− jedinice i jednom

niskospinskom Fe(III) jonu iz oktaedarskog katjona [Fe(HL)2]3+. Niskospinsko stanje

[Fe(HL)2]3+ ukazuje na jako ligandno polje fosfinskog liganda.

Slika 14. Temperaturna zavisnost inverzne magnetne susceptibilnosti i efektivnog

magnetnog momenta za kompleks [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl.

72

4.6. Biološka aktivnost

4.6.1. Biološka aktivnost kompleksa [CoL2]BF4

4.6.1.1. Antimikrobna aktivnost

Kompleks [CoL2]BF4 pokazuje izrazitu aktivnost na Gram pozitivne bakterije,

mnogo veću nego što je aktivnost HL i Co(BF4)2∙6H2O, a sličnu aktivnosti cefotaksima.

Aktivnost Co(III) kompleksa na Gram negativne bakterije je umerena, ali je veća od

aktivnosti liganda i kobaltove soli. Kompleks i ligand su neaktivni na oba soja C. albicans

(tabela 17).

4.6.1.2. Test na račićima Artemia salina

Biološka aktivnost [CoL2]BF4 i HL je testirana na račićima Artemia salina. Test na

račićima Artemia salina je pokazao umerenu aktivnost za [CoL2]BF4 sa LC50 3,20 mM.

Ligand HL i Co(BF4)2·6H2O nisu pokazali aktivnost.

73

Tabela 17. Minimalne inhibitorne koncentracije ispitivanih jedinjenja na odabrane

mikroorganizme.

Mikroorganizam HL

MIC (mM)

[CoL2]BF4

MIC (mM)

Co(BF4)2∙6H2O

MIC (mM)

Cefotaksim

MIC (mM)

Nistatin

MIC (μM)

Staphylococcus

aureus

ATCC 25923

1,328 0,070 0,734 0,027 n.i.

Staphylococcus

epidermidis

ATCC 12228

1,328 0,070 0,367 0,027 n.i.

Kocuria

rhizophila

ATCC 9341

1,328 0,035 0,367 0,027 n.i.

Bacillus subtilis

ATCC 6633 1,328 0,070 0,183 0,027 n.i.

Escherichia coli

ATCC 25922 >1,328 0,279 0,367 0,007 n.i.

Klebsiella

pneumoniae

ATCC 13883

1,328 0,139 0,734 0,007 n.i.

Pseudomonas

aeruginosa

ATCC 27853

>1,328 0,139 0,367 0,027 n.i.

Candida

albicans

ATCC 10259

>1,328 >0,558 0,183 n.i. 0,216

Candida

albicans

ATCC 10231

>1,328 >0,558 0,183 n.i. 0,540

n.i.–nije ispitano

74

4.6.1.3. Citotoksična aktivnost

Citotoksična aktivnost kompleksa [CoL2]BF4, liganda i Co(BF4)2·6H2O je određena

MTT testom posle 48 h tretmana tri tumorske ćelijske linije (HeLa, FemX i

LS-174) i jedne normalne ćelijske linije (MRC-5). Rezultati su prikazani u tabeli 18 u vidu

IC50 vrednosti.

Tabela 18. In vitro citotoksična aktivnost [CoL2]BF4

IC50 ± SD (µM)

HeLa

FemX

LS-174

MRC-5

HL

58,28 ± 0,23

>100

>100

>100

[CoL2]BF4

4,90 ± 0,08

6,45 ± 1,85

7,42 ± 2,45

7,42 ± 0,05

Co(BF4)2·6H2O

72,04 ± 6,83

82,11 ± 2,95

94,29 ± 5,05

77,27 ± 1,29

CDDP

7,79 ± 2,32

10,77 ± 0,88

22,41 ± 7,18

30,26 ± 2,98

Kompleks pokazuje izrazitu citotoksičnu aktivnost, koja je približno dva puta veća

od aktivnosti cisplatina na tumorske ćelije epitela poreklom iz humanog karcinoma grlića

materice (HeLa) i humane ćelije melanoma (FemX) i skoro tri puta veća na humane ćelije

kancera debelog creva (LS-174), sa IC50 vrednostima u opsegu od 4,90 ± 0,08 µM (HeLa)

do 7,42 ± 2,45 µM (LS-174). Selektivnost na HeLa ćelije je uočena kako u odnosu na druge

tumorske ćelijske linije tako i u odnosu na normalnu ćelijsku liniju. Ligand, koji je testiran

u opsegu koncentracija do 100 µM, pokazao je aktivnost samo na HeLa ćelije

75

(IC50 vrednost 58,28 ± 0,23 µM), koja je dvanaest puta manja od aktivnosti kompleksa.

So kobalta(II) pokazuje citotoksičnu aktivnost, ali u mnogo manjem obimu u poređenju sa

kobaltovim kompleksom. Rezultati su prikazani u vidu IC50 vrednosti koje su određene na

osnovu dijagrama ćelijskog preživljavanja (slika 15). Vrednosti IC50 su srednja vrednost

dva do tri eksperimenta, a svaki eksperiment je izveden sa po tri probe.

Slika 15. Dijagrami ćelijskog preživljavanja HeLa, FemX, LS-174 i MRC-5 ćelija posle

48 h kontinualnog tretmana ligandom (HL), Co(III) kompleksom ([CoL2]BF4) i

kobaltovom soli.

76

4.6.1.4. Ćelijski ciklus

Efekat kobalt(III) kompleksa na napredovanje ćelijskog ciklusa HeLa ćelija je

ispitivan protočnom citometrijom nakon kontinualnog tretmana od 24 i 48 h, bojenjem sa

propidijum-jodidom (PI) [33]. Dobijeni rezultati prikazani na slici 16 pokazuju da

kobalt(III) kompleks dovodi do smanjenja procenta ćelija u G1 i malog povećanja procenta

ćelija u S fazi ćelijskog ciklusa, bez značajnog povećanja apoptotičke frakcije ćelija

(sub-G1 frakcija) posle 24 h kontinualnog dejstva agensa. Treatman ispitivanim

kompleksom u trajanju od 48 h pokazao je da su ćelije koje su preživele tretman sposobne

da uspostave normalan ćelijski ciklus, što ukazuje na to da ispitivani kompleks reverzibilno

interaguje sa DNA, za razliku od cisplatina koji dovodi do znatno trajnijih poremećaja u

ćelijskom ciklusu.

4.6.1.5. Test za apoptozu

Sposobnost kobalt(III) kompleksa i CDDP da indukuju ćelijsku smrt apoptozom je

određena bojenjem HeLa ćelija tretiranih ispitivanim jedinjenjima sa dve boje, aneksin

V–FITC i propidijum-jodidom, i analizom rezultata dobijenih protočnom citometrijom.

Tretman sa 0,5×IC50 i IC50 koncentracijama kobalt(III) kompleksa i cisplatina u trajanju od

48 h indukuje sličan procenat apoptotičkih ćelija za obe koncentracije kompleksa bez

razlike između dve koncentracije (od 20% do 27%), slika 17.

77

Slika 16. Efekat [CoL2]BF4 i CDDP na progresiju ćelijskog ciklusa HeLa ćelija nakon 24 i

48 h inkubacije sa koncentracijama ispitivanih kompleksa koje odgovaraju 0,5×IC50 i IC50.

Kontrola su netretirane ćelije (inkubirane samo sa hranljivom podlogom).

78

Slika 17. Reprezentativni dijagrami raspodele tačaka dobijeni protočnom citometrijom

aneksin-V–FITC/PI obeleženih HeLa ćelija, koje su netretirane (kontrola) ili tretirane

kompleksom [CoL2]BF4 i CDDP u koncentracijama koje odgovaraju 0,5×IC50 i IC50.

FITC(-)/PI(-)(donji levi kvadrant) su intaktne ćelije, FITC(+)/PI(-) (donji desni kvadrant)

su rane apoptotičke ćelije, FITC(+)/PI(+) (gornji desni kvadrant) su kasne apoptotičke ili

nekrotične ćelije i FITC(-)/PI(+) (gornji levi kvadrant) su nekrotične ćelije.

79

4.6.1.6. Interakcije Co(III) kompleksa sa DNA

Efekti Co(III) kompleksa na superuvijenu DNA su ispitani na plazmidu pUC18 u

TS puferu, pH 7,9, agaroznom gel elektroforezom (slika 18). Rezultati pokazuju da ne

dolazi do prekida lanca DNA sa povećanjem koncentracije kompleksa (slika 18, trake 2, 3 i

4). Prekidi plazmidne DNA ne predstavljaju način dejstva Co(III) kompleksa, tj. kompleks

ne pokazuje nukleaznu aktivnost.

Slika 18. Agarozna gel-elektroforeza ne pokazuje promene u elektroforetskoj mobilnosti

superuvijene forme (FI) i otvorene cirkularne forme (FII) DNA plazmida pUC18

(0,13 pmol, traka 1) posle inkubacije (1,5 h na 37 oC) sa 5 nmol, 10 nmol i 15 nmol Co(III)

kompleksa (trake 2, 3 i 4). Kontrolni uzorak: pUC18 (213 ng) sa DMSO (3μL) (traka 5).

U cilju daljeg ispitivanja nukleazne aktivnosti Co(III) kompleksa, ispitivane su

interakcije kompleksa sa nativnom linearnom dvolančanom lambda DNA bakteriofaga koja

je tretirana kompleksom na 37 oC u trajanju od 1,5 h. Sa elektroforegrama prikazanog na

slici 19 može se uočiti da kompleks ne pokazuje primetnu nukleaznu aktivnost. Vezivanje

kompleksa za DNA dovodi do „razmazivanja” DNA na gelu (trake 2–4). Uočene promene

na DNA su koncentraciono zavisne.

80

Slika 19. Agarozna gel elektroforeza linearne dvolančane lambda DNA (0,01 pmol,

traka 1) posle inkubacije (1,5 h na 37 oC) sa 5 nmol, 10 nmol i 15 nmol Co(III) kompleksa

(trake 2, 3 i 4).

Spektroskopske metode su upotrebljene u cilju daljeg razjašnjavanja interakcija

kompleksa sa lambda DNA bakteriofaga. Elektronski apsorpcioni spektri kompleksa u

puferskom rastvoru u odsustvu i prisustvu lambda DNA su dati na slici 20.

Slika 20. Elektronski apsorpcioni spektri različitih količina Co(III) kompleksa u TS puferu

posle inkubacije (1,5 h na 37 oC) u odsustvu (linije) i prisustvu (krugovi) lambda DNA

(0,49 pmol).

81

Sa slike se uočavaju minimalne promene u apsorpcionim spektrima, koje ukazuju na

to da ne dolazi do vezivanja kompleksa za lambda DNA. Ova zapažanja su u skladu sa

rezultatima eksperimenata analize ćelijskog ciklusa i apoptoze.

4.6.2. Biološka aktivnost kompleksa [PdLCl] i [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl

4.6.2.1. Antimikrobna aktivnost

Antimikrobna aktivnost liganda HL i kompleksa [PdLCl] i [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl je

ispitivana na četiri soja Gram-pozitivnih, četiri soja Gram-negativnih bakterija i jednom

soju gljiva mikrodilucionom metodom. Rezultati (tabela 19) su pokazali da je na svim

sojevima antimikrobno dejstvo kompleksa izraženije u odnosu na soli (FeCl3∙6H2O i

K2[PdCl4]) ili ligand. Antibakterijska aktivnost kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl je veća od

aktivnosti kompleksa [PdLCl]. Kompleks [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl je pokazao umerenu

aktivnost na Gram pozitivne bakterije Staphylococcus aureus, Kocuria rhizophila i Bacillus

subtilis, kao i na Gram negativne bakterije Pseudomonas aeruginosa i Salmonella enterica.

Slaba inhibitorna aktivnost je uočena na Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli i

Klebsiella pneumoniae. Kompleks [PdLCl] je pokazao najbolju, ali ipak slabu aktivnost na

S. epidermidis i S. enterica. Za sve ostale bakterijske sojeve MIC vrednosti su mnogo veće

od onih za cefotaksim.

Antifungalna aktivnost oba kompleksa je bolja od aktivnosti liganda, ali su MIC

vrednosti mnogo veće od onih za amfotericin. Kompleks [PdLCl] je pokazao veću

aktivnost prema Candida albicans od kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl.

82

Tabela 19. Antimikrobna aktivnost liganda HL i kompleksa [PdLCl] i

[Fe(HL)2][FeCl4]2Cl (MIC (mM)).

Mikroorganizam [PdLCl] [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl HL Cefotaksim Amfotericin B

Staphylococcus

aureus

ATCC 25923

0,967 0,202 1,328 0,027 n.i.

Staphylococcus

epidermidis

ATCC 12228

0,483 0,101 1,328 0,007 n.i.

Kocuria

rhizophila

ATCC 9341

0,967 0,101 1,328 0,055 n.i.

Bacillus subtilis

ATCC 6633 0,967 0,202 2,657 0,027 n.i.

Escherichia coli

ATCC 10536 0,967 0,202 2,657 0,014 n.i.

Klebsiella

pneumoniae

NCIMB 9111

0,967 0,202 1,328 0,007 n.i.

Pseudomonas

aeruginosa

ATCC 9027

0,967 0,202 1,328 0,027 n.i.

Salmonella

enterica

NCTC 6017

0,483 0,202 1,328 0,055 n.i.

Candida albicans

ATCC 10231 0,242 0,404 1,328 n.i. 0,007

n.i.–nije ispitano

83

4.6.3. Biološka aktivnost Ni(II) kompleksa

4.6.3.1. Antifungalna aktivnost

Antifungalna aktivnost je ispitivana na osam vrsta gljiva disk difuzionom metodom.

Rezultati su prikazani u tabeli 20. Ligand i svi kompleksi su pokazali značajnu aktivnost pri

koncentraciji 100 μg/disk na Candida albicans i Saccharomyces cerevisiae, pri čemu su

kompleksi bili aktivniji. Antifungalni efekti kompleksa na C. albicans bili su izraženiji

nego efekti niklove soli ili soli koje sadrže odgovarajući anjonski ligand. Kompleksi i

ligand su takođe aktivni i na neke biljne patogene gljive. Treba imati u vidu da prečnik

zone inhibicije zavisi od difuzije u agaru i da su kompleksi slabo rastvorni u vodi, što

ukazuje na to da je njihov antifungalni efekat izraženiji nego onaj za soli dobro rastvorne u

vodi, koje brzo difunduju u agaru. Sa druge strane, rezultati ukazuju na mogućnost da se

deo aktivnosti može pripisati transportu aktivnih jona kroz ćelijsku membranu; neutralni

lipofilni kompleks može lako proći kroz membranu i relativno slabo vezan monodentatni

anjon se može osloboditi u ćeliji. Ovakav mehanizam odgovara azido kompleksu

([NiL(N3)]), ali je manje verovatan za cijanato ([NiL(OCN)]) i izotiocijanato

([NiL(NCS)]) kompleks, pošto odgovarajuće soli ne pokazuju aktivnost na većinu

tretiranih sojeva.

4.6.3.2. Antibakterijska aktivnost

Antibakterijska aktivnost je ispitivana na sedam Gram-pozitivnih i pet

Gram-negativnih bakterijskih sojeva disk difuzionom metodom. Rezultati su prikazani u

tabeli 21. Za razliku od antifungalnih efekata, antibakterijska aktivnost je slaba, ligand i dva

kompleksa su neaktivni, dok je aktivnost azido kompleksa manja nego aktivnost niklove

soli.

84

Tabela 20. In vitro antifungalna aktivnost (mm) jedinjenja (koncentracija 100 μg/disk).

- nema aktivnosti a koncentracija 30µg/disk

F. semitectum F. tricinctum C. albicans S. cerevisiae F. equiseti T. viride F. proliferatum Penicillium sp.

HL - 9 9 9 - 10 - -

[NiL(OCN)] - - 10 10 12 12 - -

[NiL(NCS)] - 9 11 10 - 12 - -

[NiL(N3)] - 10 11 9 - 10 - 28

Ni(BF4)2·6H2O - - 9 10 12 9 - -

NaOCN - - - - - - - 10

NH4SCN - - 9 - - - - 16

NaN3 - 9 10 9 22 12 - 26

Nistatin a 28 80 30 54 80 38 30 38

85

Tabela 21. In vitro antibakterijska aktivnost (mm) jedinjenja (koncentracija 1 mg/disk).

HL [NiL(OCN)] [NiL(NCS)] [NiL(N3)] Ni(BF4)2·6H2O Tetraciklina

S. aureus - - - - 18 24

M. flavus - - - 9 14 27

S. longisporum - - - 9 14 24

M. luteus - - - 9 14 25

C. sporogenes - - - 9 14 24

K. rhizophila - - - 9 14 23

B. subtilis - - - - - 25

E. coli - - - 9 16 26

S. enterica - - - 10 14 25

P. vulgaris - - - 9 16 26

P. aeruginosa - - - 9 12 25

K. pneumoniae - - - 10 14 23

- nema aktivnosti a koncentracija 30 µg/disk

86

4.6.3.3.Test na račićima Artemia salina

Biološka aktivnost jedinjenja HL, [NiL(OCN)], [NiL(NCS)], [NiL(N3)] ispitana je

na račićima A. salina. Rezultati su prikazani u tabeli 22 kao LC50 vrednosti. Postoji

značajna razlika u aktivnosti ova tri kompleksa, najaktivniji je kompleks [NiL(N3)], koji je

oko 60 puta aktivniji od najmanje aktivnog kompleksa [NiL(NCS)].

Tabela 22. Toksični efekat (prikazan kao LC50 vrednost u mM) jedinjenja na Artemia

salina

Jedinjenje LC50 (mg/disk)

HL 0,55 ± 0,05

[NiL(OCN)] 0,08 ± 0,01

[NiL(NCS)] 0,81 ± 0,05

[NiL(N3)] 0,014 ± 0,001

Ni(BF4)2·6H2O 0,12 ± 0,01

4.6.3.4.Citotoksična aktivnost

4.6.3.4.1. MTT test

Citotoksična aktivnost ispitivanih kompleksa Ni(II), liganda HL i niklove soli

određena je MTT testom nakon 48 h tretmana šest tumorskih ćelijskih linija (A549,

MDA-MB-361, HeLa, FemX, LS-174 i K562) i jedne normalne ćelijske linije (MRC-5).

Rezultati su prikazani u tabeli 23 kao IC50 vrednosti, koje su određene sa dijagrama

ćelijskog preživljavanja. Vrednosti IC50 predstavljaju srednju vrednost za dva do tri

eksperimenta, a svaki eksperiment je izveden u triplikatu.

87

Ligand HL pokazuje umerenu aktivnost samo na dve ćelijske linije. Svi kompleksi

pokazuju aktivnost na sve ćelijske linije i aktivniji su od liganda. Treba istaći da azido

kompleks [NiL(N3)] pokazuje aktivnost sličnu cisplatinu na K562 ćelije leukemije.

Citotoksičnost kompleksa [NiL(N3)] je približno četiri puta veća na ćelijsku liniju K562

nego na normalne ćelije MRC-5 za razliku od cisplatina koji pokazuje sličnu citotoksičnost

na obe ćelijske linije. Svi kompleksi su toksičniji na ćelije K562 nego na druge ćelijske

linije. Među kompleksima [NiL(N3)] ima najveću citotoksičnost na ćelije K562 i

MDA-MB-361, [NiL(NCS)] na ćelijsku liniju LS-174 i [NiL(OCN)] na normalne ćelije

MRC-5, dok se u slučaju ostalih ćelijskih linija ne uočava značajna razlika u aktivnosti.

88

Tabela 23. In vitro citotoksična aktivnost Ni(II) kompleksa

IC50 ± SD (µM)

A549 MDA-MB-361 K562 HeLa FemX LS-174 MRC-5

HL >100 >100 41,8±3,7 58,3±0,2 >100 >100 >100

[NiL(OCN)] 43,7± 3,3 76,2±5,5 25,0±0,9 31,4±3,3 41,8±4,8 93,3±3,8 32,2±5,6

[NiL(NCS)] 56,1±3,3 79,4±8,3 29,9±1,8 43,6±1,9 40,5±2,0 71,8±0,7 62,0±5,9

[NiL(N3)] 45,2±0,9 38,8±3,7 14,4±3,7 35,5±2,5 34,5±8,1 78,1±0,3 55,5±2,4

Ni(BF4)2·6H2O 77,6±8,6 97,4±2,3 90,2±3,3 >100 >100 >100 >100

CDDP 17,2±0,7 14,7±1,2 13,0±1,8 7,8±2,3 10,8±0,9 22,4±7,2 14,2±2,8

89

4.6.3.4.2. Analiza ćelijskog ciklusa

Ćelijski ciklus ćelija HeLa tretiranih ispitivanim niklovim kompleksima i

cisplatinom analiziran je protočnom citometrijom nakon bojenja sa propidijum-jodidom

[33]. Ćelije su kontinuirano izložene dejstvu različitih koncentracija ispitivanih kompleksa

u trajanju od 48 h (0,5×IC50, IC50 i 1,5×IC50).

Rezultati su prikazani na slici 21 i pokazuju da svi ispitivani kompleksi već pri

najmanjim koncentracijama koje odgovaraju 0,5×IC50 dovode do poremećaja progresije

ćelijskog ciklusa, koji su izraženiji pri povećanju koncentracije agenasa. Referentno

jedinjenje, cisplatin, u skladu sa ranije publikovanim rezultatima [15] indukuje povećanje

procenta ćelija u fazi sub-G1, smanjenje procenta ćelija u fazama G1 i G2 i zastoj ćelijskog

ciklusa u fazi S. Svi ispitivani kompleksi Ni(II) dovode do povećanja procenta ćelija u fazi

sub-G1 i smanjenja procenta ćelija u fazi G1 u poređenju sa kontrolom. Kompleksi

[NiL(NCS)] i [NiL(N3)] indukuju povećanje procenta ćelija u fazama S i G2 samo pri

najvišim koncentracijama (1,5×IC50).

Slika 21. Efekat Ni(II) kompleksa i CDDP na progresiju ćelijskog ciklusa ćelija HeLa

nakon 48 h inkubacije.

90

4.6.3.5. Ispitivanje interakcija Ni(II) kompleksa sa DNA

Sposobnost kompleksa [NiL(OCN)], [NiL(NCS)] i [NiL(N3)] da izazovu cepanje

dvolančane plazmidne DNA ispitivana je agaroznom gel-elektroforezom. Ovim testom

moguće je ispitati da li dolazi do cepanja lanca DNA praćenjem konverzije netretirane

superuvijene forme (F I) plazmidne DNA u otvorenu cirkularnu formu (F II) i linearnu

formu (F III). Kao što se vidi na slici 22 (linija P), plazmid pUC19 se sastoji uglavnom od

F I. Dodatkom kompleksa [NiL(OCN)] plazmidu, superuvijena DNA se pretvara u

cirkularnu FII i linearnu FIII formu na koncentraciono zavisan način (slika 22a, linije 1−5).

Formiranje linearne forme napreduje sa povećanjem koncentracije kompleksa [NiL(OCN)]

do 2 mM (linija 4), a pri maksimalnoj primenjenoj koncentraciji od 3 mM (linija 5) dolazi

do ’’razmaza’’ traka superuvijene i linearne forme DNA, što ukazuje na to da kompleks

[NiL(OCN)] poseduje nukleaznu aktivnost. Jedinjenje [NiL(N3)] ima slabiju nukleaznu

aktivnost (slika 22b, linije 6−10) od [NiL(OCN)]. Maksimalni efekat cepanja se javlja pri

koncentraciji kompleksa od 3 mM (linija 10). Kompleks [NiL(NCS)] pokazuje najveću

aktivnost (slika 22c). Već pri koncentraciji od 0,5 mM kompleks [NiL(NCS)] dovodi do

prevođenja plazmidne DNA u linearnu formu FIII (linija 11) i sa povećanjem koncentracije

do 2 mM dolazi do povećanja ’’razmaza’’ DNA traka (linije 12–14). Pri najvećoj

koncentraciji od 3 mM (linija 15), gotovo sva plazmidna DNA je uništena. Ovi rezultati

ukazuju na to da je oštećenje DNA jedan od uzroka aktivnosti ovih kompleksa.

91

Slika 22. Agarozna gel-elektroforeza plazmida pUC19 u TS puferu nakon tretmana Ni(II)

kompleksima: (a) [NiL(OCN)] − koncentracija 0,5 mM (traka 1), koncentracija 1 mM

(traka 2), koncentracija 1,5 mM (traka 3), koncentracija 2 mM (traka 4) i koncentracija

3 mM (traka 5) (b) [NiL(N3)] − koncentracija 0,5 mM (traka 6), koncentracija 1 mM


3 mM (traka 10) (c) [NiL(NCS)] – koncentracija 0,5 mM (traka 11), koncentracija 1 mM


3 mM (traka 15); P – kontrola pUC19 DNA.

4.6.4. Biološka aktivnost 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo

[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata (1) i (1E)-[2-(difenilfosfino)benziliden]hidrazina

(2)

4.6.4.1. Test na račićima Artemia salina

Biološka aktivnost jedinjenja 1 i 2 je ispitana na račićima Artemia salina. Jedinjenje

1 je pokazalo dobru aktivnost (LC50 52,7 μM), dok je aktivnost jedinjenja 2 bila umerena sa

LC50 3,82 mM.

4.6.4.2. Interakcije 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo

[b,f][1,5]difosfocinijum-diperhlorata sa DNA

Sposobnost 5,5,11,11-tetrafenil-5,6,11,12-tetrahidro-6,12-biiminodibenzo[b,f][1,5]

difosfocinijum-diperhlorata (1) da izazove prekide na dvolančanoj plazmidnoj DNA

92

ispitivana je agaroznom gel-elektroforezom Dobijeni rezultati su prikazani na slici 23.

Povećanje koncentracije jedinjenja 1 dovodi do prelaska superuvijene forme (F I) i

otvorene cirkularne forme (F II) plazmidne DNA u linearnu formu (F III). Primećena je još

jedna forma DNA, koja ima najmanju mobilnost, a čija količina se povećava sa povećanjem

koncentracije jedinjenja 1. Cepanje DNA koje prouzrokuje ispitivano jedinjenje je

verovatno posledica njegovih različitih strukturnih svojstava: pozitivno naelektrisanje

omogućava elektrostatičke interakcije sa DNA, osmočlani makrociklus se može vezati u

brazdi DNA, dok je P, N-acetal reaktivni centar koji može dovesti do kovalentne

modifikacije DNA.

Slika 23. Agarozna gel-elektroforeza DNA plazmida pUC18. pUC18 (213 ng) (traka 1) i

pUC18 (213 ng) u prisustvu 5 nmol, 10 nmol, 15 nmol, 20 nmol, 25 nmol i 30 nmol

jedinjenja 1 (trake 2, 3, 4, 5, 6 i 7), pUC18 (213 ng) sa acetonitrilom (6μL) (traka 8).

93

5. ZAKLJUČAK

U ovom radu je opisana sinteza, karakterizacija i biološka aktivnost Co(III), Fe(III),

Pd(II) i Ni(II) kompleksa sa kondenzacionim proizvodom 2-(difenilfosfino)benzaldehida i

etil-karbazata. Strukture kompleksa Co(III), Fe(III), Pd(II), Ni(II) i liganda u čvrstom stanju

određene su na osnovu rezultata elementalne analize, IR spektroskopije i rendgenske

strukturne analize. Detaljniji uvid u strukturne karakteristike Fe(III) kompleksa dala su

magnetna merenja. Strukture kompleksa Co(III), Pd(II), Ni(II) i liganda u rastvoru

određene su NMR spektroskopijom.

Kompleks Co(III) se sastoji iz kompleksnog katjona i BF4- anjona. U kompleksnom

katjonu dva deprotonovana molekula liganda su tridentatno koordinovana za jon metala

preko atoma fosfora, iminskog azota i karbonilnog kiseonika, tako da daju geometriju

distorgovanog oktaedra. Kompleks Fe(III) se sastoji iz oktaedarskog katjona koji čine dva

neutralna molekula liganda koordinovana tridentatno preko PNO atoma za Fe(III) jon, dva

[FeCl4]− kompleksna anjona i jedan hloridni anjon. Magnetna merenja su pokazala da je

oktaedarski kompleksni katjon niskospinski (S=1/2) dok su dva tetredarska [FeCl4]– anjona

visokospinska (S=5/2). Kvadratno-planarni kompleksi Pd(II) i Ni(II) su neutralni sa

deprotonovanim molekulom liganda koordinovanim tridentatno preko atoma fosfora,

iminskog azota i karbonilnog kiseonikovog atoma, dok četvrto koordinaciono mesto

zauzima hlorid u slučaju Pd(II) ili pseudohalogenidni anjon (azid, cijanat ili tiocijanat) u

slučaju Ni(II) kompleksa.

Kompleks Co(III) je pokazao izrazitu citotoksičnu aktivnost na testiranim ćelijskim

linijama sa selektivnošću na HeLa ćelije. Ispitivani kobalt(III) kompleks dovodi do

smanjenja procenta ćelija u G1 i malog povećanja procenta ćelija u S fazi ćelijskog ciklusa,

bez značajnog povećanja apoptotičke frakcije ćelija (frakcija sub-G1). Za razliku od

cisplatina efekat na progresiju ćelijskog ciklusa je privremen, ćelije koje su preživele

tretman sposobne su da uspostave normalan ćelijski ciklus. Visoka citotoksičnost

kobalt(III) kompleksa i male perturbacije ćelijskog ciklusa, umeren potencijal indukcije

94

eksternalizacije fosfatidilserina i minimalne spektralne i elektroforetske promene ukazuju

na to da DNA nije meta odgovorna za citotoksičnost ovog kompleksa.

Svi kompleksi Ni(II) pokazuju citotoksičnu aktivnost na svim testiranim ćelijskim

linijama. Aktivnost svih kompleksa je najveća na leukemijsku ćelijsku liniju K562.

Naročito veliku aktivnost na ovu ćelijsku liniju pokazuje azido kompleks, čija je aktivnost

slična aktivnosti cisplatina. Treba istaći da je aktivnost azido kompleksa na ćelije K562

mnogo veća nego citotoksičnost na normalnu ćelijsku liniju MRC-5, dok cisplatin ne

pokazuje razliku u citotoksičnosti između ove dve ćelijske linije. Kompleksi utiču na

distribuciju faza ćelijskog ciklusa (povećanje procenta ćelija u fazi sub-G1 i smanjenje

procenta ćelija u fazi G1) i dovode do oštećenja DNA.

Kompleks Co(III) pokazuje izrazitu aktivnost na Gram pozitivne bakterije

(sličnu cefotaksimu), dok je aktivnost na Gram negativne bakterije umerena. Kompleks

Co(III) je neaktivan na C. albicans. Antimikrobno dejstvo kompleksa Fe(III) i Pd(II) je

izraženije u odnosu na soli (FeCl3∙6H2O i K2[PdCl4]) ili ligand. Antibakterijska aktivnost

kompleksa Fe(III) je veća od aktivnosti kompleksa Pd(II). Antifungalna aktivnost oba

kompleksa je bolja od aktivnosti liganda, ali su MIC vrednosti mnogo veće od onih za

amfotericin. Kompleks Pd(II) je pokazao veću aktivnost prema C. albicans od kompleksa

Fe(III). Svi kompleksi Ni(II) su pokazali značajnu antifungalnu aktivnost, koja je veća od

aktivnosti liganda. Kompleksi su neelektroliti što omogućava lakši transport nikla i

pseudohalogenida kroz biološke membrane. Samo azido kompleks poseduje antibakterijsku

aktivnost. Iz rezultata antimikrobne aktivnosti ispitivanih kompleksa jasno se vidi da

naelektrisanje i geometrija kompleksa utiču na njihovo selektivno antimikrobno dejstvo.

Oktaedarski kompleksi Co(III) i Fe(III) koji su elektroliti imaju izraženiju antibakterijsku

aktivnost, dok su kvadratno-planarni kompleksi Pd(II) i Ni(II) koji su neelektroliti bolji

antifungalni agensi.

U ovom radu je opisana i jednostavna metoda za sintezu racemskog hidrazinom

premošćenog difosfonijum jedinjenja, koje je analog biciklo[3.3.2]dekana. Iako je reakcioni

prinos mali, struktura jedinjenja, koje poseduje jedan osmočlani prsten, dva fosfonijum

katjonska centra, biimino most, hiralnost molekula i dva benzenova prstena kondenzovana

95

za osmočlani prsten koji se nalaze u međusobno normalnim ravnima je neuobičajena.

Struktura ovog jedinjenja određena je na osnovu rezultata elementalne analize, masene

spektrometrije, IR i NMR spektroskopije i rendgenske strukturne analize. Ovo jedinjenje

pokazuje značajnu aktivnost u testu na račićima A. salina i dovodi do prekida plazmidne

DNA.

96

6. REFERENCE

[1] A. Bacchi; M. Carcelli, M. Costa, P. Pelagatti, C. Pelizzi, G. Pelizzi, Gazz. Chim. Ital.

124, 429 (1994).

[2] A. Bacchi, M. Carcelli, M. Costa, A. Fochi, C. Monici, P. Pelagatti, C. Pelizzi, G.

Pelizzi, L.M.S. Roca, J. Organomet. Chem. 593–594, 180 (2000).

[3] P. Pelagatti, A. Bacchi, M. Carcelli, M. Costa, H–W. Frühauf, K. Goubitz, C. Pelizzi,

M. Triclistri, K. Vrieze, Eur. J. Inorg. Chem. 2002, 439 (2002).

[4] P. Pelagatti, A. Bacchi, M. Balordi, S. Bolaño, F. Calbiani, L. Elviri, L. Gonsalvi, C.

Pelizzi, M. Peruzzini, D. Rogolino, Eur. J. Inorg. Chem. 2006, 2422 (2006).

[5] P. Pelagatti, A. Bacchi, M. Balordi, A. Caneschi, M. Giannetto, C. Pelizzi, L. Gonsalvi,

M. Peruzzini, F. Ugozzoli, Eur. J. Inorg. Chem. 2007, 162 (2007).

[6] P. Pelagatti, A. Bacchi, C. Bobbio, M. Carcelli, M. Costa, C. Pelizzi, C. Vivorio,

Organometallics 19, 5440 (2000).

[7] P. Pelagatti, A. Bacchi, C. Bobbio, M. Carcelli, M. Costa, A. Fochi, C. Pelizzi, J. Chem.

Soc., Dalton Trans., 1820 (2002).

[8] A. Bacchi, M. Carcelli, M. Costa, A. Leporati, E. Leporati, P. Pelagatti, C. Pelizzi, G.

Pelizzi, J. Organomet. Chem. 535, 107 (1997).

[9] P. Pelagatti, A. Bacchi, M. Carcelli, M. Costa, A. Fochi, P. Ghidini, E. Leporati, M.

Masi, C. Pelizzi, G. Pelizzi, J. Organomet. Chem. 583, 94 (1999).

[10] M.M. Đorđević, D.A. Jeremić, M.V. Rodić, V.S. Simić, I.D. Brčeski, V.M. Leovac,

Polyhedron 68, 234 (2014).

[11] S.B. Novaković, G.A. Bogdanović, I.D. Brčeski, V.M. Leovac, Acta Crystallogr. C

65, 263 (2009).

[12] A. Barandov, U. Abram, Z. Anorg. Allg. Chem. 633, 1897 (2007).

[13] V. Radulović, A. Bacchi, G. Pelizzi, D. Sladić, I. Brčeski, K. Andjelković, Monatsh.

Chem. 137, 681 (2006).

[14] M.S.S. Adam, A.D.M. Mohamad, O.M. El-Hady, Monatsh. Chem. 145, 435 (2014).

[15] N. Malešević, T. Srdić, S. Radulović, D. Sladić, V. Radulović, I. Brčeski, K.

Anđelković, J. Inorg. Biochem. 100, 1811 (2006).

97

[16] W.M. Motswainyana, M.O. Onani, A.M. Madiehe, M. Saibu, N. Thovhogi, R.A.

Lalancette, J. Inorg. Biochem. 129, 112 (2013).

[17] SAINT: SAX, Area Detector Integration, Siemens Analytical instruments INC.,

Madison, Wisconsin, USA.

[18] SADABS: Siemens Area Detector Absorption Correction Software, G. Sheldrick,

1996, University of Goettingen, Germany.

[19] Sir97: A new Program for Solving and Refining Crystal Structures – A. Altomare,

M.C. Burla, M. Cavalli, G. Cascarano, C. Giacovazzo, A. Gagliardi, A.G. Moliterni, G.

Polidori, R. Spagna, 1997, Istituto di Ricerca per lo Sviluppo di Metodologie

Cristallografiche CNR, Bari.

[20] Shelxl97. Program for structure refinement. G. Sheldrick, University of Goettingen,

Germany, 1997.

[21] L.J. Farrugia, J. Appl. Crystallogr. 32, 837 (1999).

[22] M. Nardelli, J. Appl. Crystallogr. 28, 659 (1995).

[23] F.H. Allen, O. Kennard, R. Taylor, Acc. Chem. Res. 16, 146 (1983).

[24] I.J. Bruno, J.C. Cole, P.R. Edgington, M. Kessler, C.F. Macrae, P. McCabe, J.

Pearson, R. Taylor, Acta Crystallogr. B 58, 389 (2002).

[25] M.C. Burla, R. Caliandro, M. Camalli, B. Carrozzini, G.L. Cascarano, L. De Caro, C.

Giacovazzo, G. Polidori, R. Spagna, Sir2004: A Program For Automatic Solution and

Refinement of Crystal Structures 2004, Istituto di Ricerca per lo Sviluppo di Metodologie

Cristallografiche CNR, Bari.

[26] G. Sheldrick, Shelxl2013. Program for structure refinement, University of Goettingen,

Germany, 2013.

[27] Oxford Diffraction CrysAlis CCD and CrysAlisRED including ABSPACK, Version

1.171 Oxford Diffraction, Oxfordshire, England, 2000.

[28] G.M. Sheldrick, Acta Crystallogr. A 46, 467 (1990).

[29] G.M. Sheldrick, Acta Crystallogr. A 64, 112 (2008).

[30] A.L. Spek, PLATON, A Multipurpose Crystallographic Tool; Utrecht University:

Utrecht, The Netherlands, 2010.

[31] XP, Siemens Analytical X-ray Instruments Inc. Madison, Wisconsin, USA, 1990.

98

[32] R. Supino, Methods in molecular biology, u: S. O'Hare, C.K. Atterwill, In Vitro

Toxicity Testing Protocols, Humana Press, New Jersey, 1995, str. 137–149.

[33] M.G. Ormerod, Analysis of DNA-general methods, u: M.G. Ormerod, Flow

Cytometry, a Practical Approach, Oxford University Press, New York, 1994, str. 119–125.

[34] W.J. Dower, J.F. Miller, C.W. Ragsdale, Nucleic Acid Res. 16, 6127 (1988).

[35] H.C. Birnboim, J. Doly, Nucleic Acid Res. 7, 1513 (1979).

[36] NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) Performance

standards for antibacterial disk susceptibility test, Approved Standard M2-A6, 6th ed.

Wayne, PA, 1997.

[37] P.A. Kethcum, Microbiology: Concept and Applications, John Wiley and Sons, New

York, USA, 1988.

[38] K. Anđelković, D. Sladić, A. Bacchi, G. Pelizzi, N. Filipović, M. Rajković, Transition

Met. Chem. 30, 243 (2005).

[39] R. Dalpozzo, G. Bartoli, L. Sambri, P. Melchiorre, Chem. Rev. 110, 3501 (2010).

[40] B.B. Ben-Aroya, M. Portnoy, Tetrahedron Lett. 41, 6143 (2000).

[41] H. Bhutani, S. Singh, K.C. Jindal, A.K. Chakraboti, J. Pharm. Biomed. Anal. 39, 892

(2005).

[42] G. Maerkl, Z. Naturforsch. 18b, 84 (1963).

[43] I.J. Bruno, J.C. Cole, M. Kessler, J. Luo, W.D.S. Motherwell, L.H. Purkis, B.R. Smith,

R. Taylor, R.I. Cooper, S.E. Harris, A.G. Orpen, J. Chem. Inf. Comput. Sci. 44, 2133

(2004).

[44] H.B. Bürgi, J.D. Dunitz, Acc. Chem. Res. 16, 153 (1983).

[45] G.R. Desiraju, Cryst. Eng. Comm. 91, 91 (2007).

[46] A.J.C. Wilson, Ed. International Tables for Crystallography; Kluwer Academic

Publishers: Dordrecht, The Netherlands, 1995; Volume C, str. 796–811.

[47] K. Nakamoto, Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds,

Wiley-Interscience, New York, 2009.

99

7. PRILOG

Slika P1. 1H NMR spektar liganda HL.

Slika P2. 13C NMR spektar liganda HL.

Slika P3. COSY spektar liganda HL.

Slika P4. DEPT spektar liganda HL.

Slika P5. HSQC spektar liganda HL.


Slika P7. MS spektar liganda HL.

Slika P8. IR spektar liganda HL.

Slika P9. 1H NMR spektar kompleksa [CoL2]BF4.

Slika P10. 13C NMR spektar kompleksa [CoL2]BF4.

Slika P11. COSY spektar kompleksa [CoL2]BF4.

Slika P12. DEPT spektar kompleksa [CoL2]BF4.

Slika P13. HSQC spektar kompleksa [CoL2]BF4.

Slika P14. IR spektar kompleksa [CoL2]BF4.

Slika P15. 1H NMR spektar kompleksa [PdLCl].


Slika P17. 13C NMR spektar kompleksa [PdLCl].


Slika P19. COSY spektar kompleksa [PdLCl].


Slika P21. HSQC spektar kompleksa [PdLCl].


100

Slika P23. IR spektar kompleksa [PdLCl].

Slika P24. IR spektar kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl.

Slika P25. 1H NMR spektar kompleksa [NiL(OCN)].

Slika P26. 13C NMR spektar kompleksa [NiL(OCN)].

Slika P27. COSY spektar kompleksa [NiL(OCN)].

Slika P28. HSQC spektar kompleksa [NiL(OCN)].


Slika P30. IR spektar kompleksa [NiL(OCN)].

Slika P31. 1H NMR spektar kompleksa [NiL(NCS)].

Slika P32. 13C NMR spektar kompleksa [NiL(NCS)].

Slika P33. COSY spektar kompleksa [NiL(NCS)].

Slika P34. HSQC spektar kompleksa [NiL(NCS)].


Slika P36. IR spektar kompleksa [NiL(NCS)].

Slika P37. 1H NMR spektar kompleksa [NiL(N3)].

Slika P38. 13C NMR spektar kompleksa [NiL(N3)].

Slika P39. COSY spektar kompleksa [NiL(N3)].

Slika P40. HSQC spektar kompleksa [NiL(N3)].


Slika P42. IR spektar kompleksa [NiL(N3)].

Slika P43. 1H NMR spektar jedinjenja 1.

Slika P44. 13C NMR spektar jedinjenja 1.

Slika P45. DEPT spektar jedinjenja 1.

Slika P46. COSY spektar jedinjenja 1.

101

Slika P47. NOESY spektar jedinjenja 1.

Slika P48. HSQC spektar jedinjenja 1.

Slika P49. HMBC spektar jedinjenja 1.


Slika P51. 31P NMR spektar jedinjenja 1.

Slika P52. MS spektar jedinjenja 1.

Slika P53. IR spektar jedinjenja 1.








102

Slika P1. 1H NMR spektar liganda HL.

103

Slika P2. 13C NMR spektar liganda HL.

104

Slika P3. COSY spektar liganda HL.

105

Slika P4. DEPT spektar liganda HL.

106


107


108

Slika P7. MS spektar liganda HL.

109

Slika P8. IR spektar liganda HL.

110

Slika P9. 1H NMR spektar kompleksa [CoL2]BF4.

111

Slika P10. 13C NMR spektar kompleksa [CoL2]BF4.

112

Slika P11. COSY spektar kompleksa [CoL2]BF4.

113

Slika P12. DEPT spektar kompleksa [CoL2]BF4.

114

Slika P13. HSQC spektar kompleksa [CoL2]BF4.

115

Slika P14. IR spektar kompleksa [CoL2]BF4.

116


117

Slika P16. 1H NMR spektar kompleksa [PdLCl]

118


119


120


121


122


123


124

Slika P23. IR spektar kompleksa [PdLCl].

125

Slika P24. IR spektar kompleksa [Fe(HL)2][FeCl4]2Cl.

126

Slika P25. 1H NMR spektar kompleksa [NiL(OCN)].

127

Slika P26. 13C NMR spektar kompleksa [NiL(OCN)].

128

Slika P27. COSY spektar kompleksa [NiL(OCN)].

129


130


131

Slika P30. IR spektar kompleksa [NiL(OCN)].

132

Slika P31. 1H NMR spektar kompleksa [NiL(NCS)].

133

Slika P32. 13C NMR spektar kompleksa [NiL(NCS)].

134

Slika P33. COSY spektar kompleksa [NiL(NCS)].

135


136


137

Slika P36. IR spektar kompleksa [NiL(NCS)].

138

Slika P37. 1H NMR spektar kompleksa [NiL(N3)].

139

Slika P38. 13C NMR spektar kompleksa [NiL(N3)].

140

Slika P39. COSY spektar kompleksa [NiL(N3)].

141


142


143

Slika P42. IR spektar kompleksa [NiL(N3)].

144


145


146


147

Slika P46. COSY spektar jedinjenja 1.

148

Slika P47. NOESY spektar jedinjenja 1.

149

Slika P48. HSQC spektar jedinjenja 1.

150


151


152

Slika P51. 31P NMR spektar jedinjenja 1.

153


154


155


156


157


158


159


160


161

Slika P60. IR spektar jedinjenja 2

162

BIOGRAFIJA

Milica Milenković je rođena 1. 10. 1985. godine u Kikindi, Republika Srbija. Osnovnu

školu i srednju medicinsku školu je završila u Leskovcu. Hemijski fakultet Univerziteta u

Beogradu, studijsku grupu hemija je upisala 2004. godine. Diplomirala je 2009. godine sa

prosečnom ocenom 9,53 i ocenom 10 na diplomskom ispitu: „In vitro ispitivanje

interakcija DNA i dinuklearnog kompleks Cd(II) sa N’,N’2-bis[(1E)-1-(2-

piridil)etiliden]propandihidrazidom”. Hemijski fakultet Univerziteta u Beogradu, studijsku

grupu biohemija je upisala 2005. godine. Diplomirala je 2012. godine sa prosečnom

ocenom 9,71 i ocenom 10 na diplomskom ispitu: „Ispitivanje antitumorske aktivnosti

kompleksa Co(III) sa etil-(2E)-2-[2-(difenilfosfino)benziliden]hidrazinkarboksilatom”.

Doktorske studije na Katedri za opštu i neorgansku hemiju, Hemijskog fakulteta

Univerziteta u Beogradu upisala je 2009. godine kod mentora dr Katarine Anđelković,

redovnog profesora. Od 2009. do 2011. godine je radila kao istraživač pripravnik u

Inovacionom centru Hemijskog fakulteta. Od 2011. godine zaposlena je na Hemijskom

fakultetu Univerziteta u Beogradu kao asistent na Katedri za opštu i neorgansku hemiju.

Dobitnik je specijalnog priznanja Srpskog hemijskog društva za 2010. godinu za izuzetan

uspeh u toku studija na Hemijskom fakultetu Univerziteta u Beogradu. Fond Nenada M.

Kostića nagradio ju je za najbolji diplomski rad iz oblasti hemijskih nauka u periodu od

1.04.2012. do 31.03. 2013. godine.

Objavljeni i saopšteni radovi koji čine deo disertacije:

Radovi u vrhunskim međunarodnim časopisima (M21):

1. M. Milenković, A. Bacchi, G. Cantoni, J. Vilipić, D. Sladić, M. Vujčić, N. Gligorijević,

K. Jovanović, S. Radulović, K. Anđelković

163

Synthesis, characterization and biological activity of three square-planar complexes of

Ni(II) with ethyl (2E)-2-[2-(diphenylphosphino)benzylidene]hydrazinecarboxylate and

monodentate pseudohalides

Eur. J. Med. Chem. 68, 111–120, 2013.

IF (2013)=4,071; 8/58; Hemija, medicinska; ISSN 0223-5234.

Radovi u istaknutim međunarodnim časopisima (M22):

1. M. Milenković, B. Warzajtis, U. Rychlewska, D. Radanović, K. Anđelković, T. Božić,

M. Vujčić, D. Sladić

Synthesis, Spectral and Solid State Characterization of a New Bioactive Hydrazine Bridged

Cyclic Diphosphonium Compound

Molecules 17, 2567–2578, 2012.

IF (2012)=2,679; 18/57; Hemija, organska; ISSN 1420-3049.

2. M. Milenković, A. Bacchi, G. Cantoni, S. Radulović, N. Gligorijević, S. Aranđelović, D.

Sladić, M. Vujčić, D. Mitić, K. Anđelković

Synthesis, characterisation and biological activity of Co(III) complex with the condensation

product of 2-(diphenylphosphino)benzaldehyde and ethyl carbazate

Inorg. Chim. Acta 395, 33–43, 2013.

IF (2013)=2,041; 20/45; Hemija, neorganska i nuklearna; ISSN 0020-1693.

3. M. Milenković, G. Cantoni, A. Bacchi, V. Spasojević, M. Milenković, D. Sladić, N.

Krstić, K. Anđelković

Synthesis, characterization and antimicrobial activity of Pd(II) and Fe(III) complexes with

ethyl (2E)-2-[2-(diphenylphosphino)benzylidene]hydrazinecarboxylate

Polyhedron, 80, 47–52, 2014.


164

Radovi saopšteni na skupovima međunarodnog i nacionalnog značaja štampani u

izvodu

1. D. Sladić, M.Milenković, J. Vilipić, M. Vujčić, S. Radulović, K. Anđelković,

Cytotoxic and antimicrobial activity of three square-planar Ni(II) complexes with

ethyl (2E)-2-[2-(diphenylphosphino)benzylidene]hydrazinecarboxylate and different

monodentate pseudohalides

COST Action CM1106, Chemical Approaches to Targeting Drug Resistance in Cancer

Stem Cells, 2nd Working Group Meeting, 2013, Warsaw, Poland, Book of Abstracts P14,

page 53.

2. M. Milenković, J. Vilipić, B. Čobeljić, M. Jeremić, K. Anđelković, D. Sladić

Antimicrobial activity of three square-planar complexes of Ni(II) with ethyl (2E)-2-[2-

(diphenylphosphino)benzylidene]hydrazinecarboxylate and monodentate pseudohalides

ICOSECS 8, 8th International Conference of the Chemical Societies of the South-East

European Countries Belgrade, Serbia (2013) Book of Abstracts, p. 79.

3. M. Milenković, G. Cantoni, A. Bacchi, D. Sladić, K. Anđelković

Three square-planar complexes of Ni(II) with ethyl (2E)-2-[2-

(diphenylphosphino)benzylidene]hydrazinecarboxylate and monodentate pseudohalides

XX Conference of the Serbian Crystallographic Society, 13–15 June 2013. Avala,

Belgrade, Book of Abstracts, page 44.

4. K. Anđelković, M. Milenković, A. Bacchi, D. Sladić, D. Mitić, S. Aranđelović, M.

Vujčić

Synthesis, characterization and biological activity of Co(III) complex with the condensation

product of 2-(diphenylphosphino)benzaldehyde and ethyl carbazate

11th European Biological Inorganic Chemistry Conference, Granada, Spain 2012. Book of

abstract P-18.

165

5. K. Anđelković, M. Milenković, D. Sladić

Synthesis, characterisation and biological activity of a biologically active bridged

diphosphonium compound

Thirteenth Annual Conference ‘’YUCOMAT 2011’’, Herceg Novi, Montenegro, 2011.

Book of Abstracts P.S.E. 1.

Ostali naučni radovi:

1. M. Milenković, A. Pevec, I. Turel, M. Vujčić, M. Milenković, K. Jovanović, N.

Gligorijević, S. Radulović, M. Swart, M. Gruden-Pavlović, K. Adaila, B. Čobeljić, K.

Anđelković

Synthesis, characterization, DFT calculation and biological activity of square-planar Ni(II)

complexes with tridentate PNO ligands and monodentate pseudohalides. Part II

Eur. J. Med. Chem. 87, 284–297, 2014.

IF (2013)=4,071; 8/58; Hemija, medicinska; ISSN 0223-5234.

2. K. Adaila, M. Milenković, A. Bacchi, G. Cantoni, M. Swart, M. Gruden-Pavlović, M.

Milenković, B. Čobeljić, T. Todorović, K. Anđelković

Synthesis, characterization, DFT calculations and antimicrobial activity of Pd(II) and

Co(III) complexes with the condensation derivative of

2-(diphenylphosphino)benzaldehyde and Girard’s T reagent

J.Coord.Chem. 67, 3633–3648, 2014.


3. M. Vujčić, M. Lazić, M. Milenković, D. Sladić, S. Radulović, N. Filipović, K.

Anđelković

A Comparative Study of DNA Binding and Cell Cycle Phase Perturbation by the Dinuclear

Complex of Cd(II) with the Condensation Product of 2-Acetylpyridine and Malonic Acid

166

Dihydrazide N',N'2 -bis[(1E)-1-(2-pyridyl)ethylidene]propanedihydrazide

Journal of Biochemical and Molecular Toxicology 25, 175–182, 2011.

IF (2013)=1,646; 221/290; Biohemija i molekularna biologija; ISSN 1095-6670.

Ostali radovi saopšteni na skupovima međunarodnog i nacionalnog značaja štampani

u izvodu:

1. B. Janović, K. Adaila, M. Milenković, B. Čobeljić, K. Anđelković, M. Vujčić

DNA interaction of biologically active square-planar Ni(II) complexes

12th International Conference on Fundamental and Appliedd Aspects of Physical

Chemistry, Belgrade, 2014., Book of Abstracts, p. 1025.

2. Milica R. Milenković, B. R. Čobeljić, K. Adaila, M. T. Milenković, K. K. Anđelković

Synthesis, characterization and antimicrobial activity of Co(III) and Pd(II) complexes with

2-(diphenylphosphino)benzaldehyde Girard T hydrazone chloride

Sixteenth Annual Conference ‘’YUCOMAT 2014’’, Herceg Novi, Montenegro, Septembre

1-5, 2014. Book of Abstracts P.S.A. 6. p 111.

3. B. Čobeljić, A. Pevec, I. Turel, M. Milenković, K, Anđelković

Square-planar complexes of Ni(II) with 2-(diphenilphosphino) 4-phenylsemicarbazone

21st conference of the Serbian crystallographic society, 2014, Užice, Srbija, Book of

Abstracts, pp 66-67.

4. Dušan Sladić, Milica Milenković, Božidar Čobeljić, Katarina Jovanović, Siniša

Radulović, Katarina Anđelković

Synthesis, characterization and biological activity of three square-planar Ni(II) complexes

with 2-(diphenylphosphino)benzaldehyde 4-phenylsemicarbazone

167

COST Action CM1106, Chemical Approaches to Targeting Drug Resistance in Cancer

Stem Cells, 2nd Working Group Meeting, 2014, Budapest, Hungary Book of Abstracts

P26, page Π/101.

5. Miroslava Vujčić, Milica Milenković, Dušan Sladić, Katarina Anđelković

DNA binding of a dinuclear Cd(II) complex with N’,N’2-bis[(1E-1-(2-pyridil)ethylidene]

propanedihydrazide

47th Meeting of the Serbian Chemical Society, Belgrade, Serbia, 2009 Book of Abstracts

p.68.

Прилог 1.

Изјава о ауторству

Потписани-a ______________________

број индекса _______________________________

Изјављујем

да је докторска дисертација под насловом

резултат сопственог истраживачког рада,

да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена

за добијање било које дипломе према студијским програмима других

високошколских установа,

да су резултати коректно наведени и

да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину

других лица.

Потпис докторанда

У Београду, _________________

_________________________

Прилог 2.

Изјава o истоветности штампане и електронске верзије

докторског рада

Име и презиме аутора _________________________________________________

Број индекса _________________________________________________________

Студијски програм ____________________________________________________

Наслов рада _________________________________________________________

Ментор _____________________________________________________________

Потписани/а ________________________________________

Изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској

верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног

репозиторијума Универзитета у Београду.

Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања

доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране

рада.

Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне

библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у

Београду.


У Београду, ________________________

_________________________

Прилог 3.

Изјава о коришћењу

Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални

репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под

насловом:

која је моје ауторско дело.

Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном

за трајно архивирање.

Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета

у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу

лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла.

1. Ауторство

2. Ауторство - некомерцијално

3. Ауторство – некомерцијално – без прераде

4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима

5. Ауторство – без прераде

6. Ауторство – делити под истим условима

(Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис

лиценци дат је на полеђини листа).


У Београду, ________________________

____________________

1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела,

и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или

даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих

лиценци.

2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно

саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од

стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну

употребу дела.

3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање,

дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или

употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране

аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу

дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим

права коришћења дела.

4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате

умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе

име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се

прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не

дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада.

5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно

саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу,

ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце.

Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела.

6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.

sinteza i karakterizacija kompleksa prelaznih metala … sinteza i karakterizacija kompleksa...

Documents