Sintezna biologija

od spreminjanja celične signalizacije do novih materialov

Roman Jerala

Kemijski inštitutFKKT UL

Kaj je sintezna biologija

• Načrtovanje in ustvarjanje novih bioloških funkcij in sistemov

• Inženiring bioloških sistemov

• “Celična tovarna“

Sintezna biologija kot biološko inženirstvo

Vede o življenju

BiotehnologijaGenetikaMikrobiologijaMolekulska medicina Molekulska biologija...

InženirstvoRačunalništvo...

sinteznabiologija

Dva temeljna pristopa sintezne biologije

Modularna osnova sintezne biologije

•Spreminjanje obstoječih bioloških sistemov

•Rekonstrukcija novih bioloških sistemov:

•Tvorba celotnega genoma•Sestavljanje najmanjših sistemov, ki se lahko podvajajo

Hierarhična zgradba in modularnost

geni, proteini

biokemijske reakcije

mreže biokemijskih reakcij

celice

tkiva, organizmi

elektronski elementi

vezja

moduli

računalniki

računalniška omrežja

BioBricks (BioKocke) kot modularni gradniki:- regulatorna zaporedja- zapisi za proteine

DNK kot navodilo za izvajanje celičnega programa

Modularna osnova sintezne biologije

2001 Določitev človeškega genoma

Določanje zaporedij DNK

Do 2011 načrtujejo določiti 1000 genomov 60x več kot v 25 letih skupaj

Poznamo genome >700 mikroorganizmov, >800 v delu

Rob Carlson The Pace and Proliferation of Biological Technologies

1980 1985 1990 1995 2000 2005 20100,01

0,1

1

10

100

1000

10000

100000

1000000

bp/$

year

gel: 3 bio $

capillary: 50 mio $

polony: 50 k$

lig. 5 k$

Church 2009

cost for human genome

Napredek zadnjih let:

10x povečanje/leto

Kemijska sinteza genov

Avtomatska sinteza določenega nukleotidnega zaporedja

1985 prvi sintetični gen v tedanji Jugoslaviji pr. 300 nukleotidov – danes ga za 250 € dobimo v dveh tednih

Danes s pomočjo robotov lahko sestavimo DNK velikosti več 10,000 nt

kemijska sintezaoligonukleotidov

parjenje

povezovanje

vstavitev v plazmid

vnos vcelico

Področja uporabe sintezne biologije

• diagnostika in zdravljenje bolezni• obnovljivi viri energije • novi materiali & bionanomateriali• procesiranje informacij• biosenzorji in bioremediacija okolja...

Sinteza zdravila proti malariji

artemisinin

250 milijonov okuženih1 milijon žrtev letno

Izolacija iz enoletnega pelina

visoka cena

Sintezna biologija za pripravo zdravil

Prenos biosintezne poti v bakterije pomočjo sintezne biologije

Sintezna biologija za pripravo zdravil

Obnovljivi viri energije iz biomase

CO2

celuloza sladkorji

gorivo

biomasa iz rastlin

pretvorba z mikroorganizmi

encimi

Sintezna biologija za obnovljive vire energije

Priprava goriva iz rastlinske biomase v bakterijah

Steen Nature 2010

Uporaba celic za procesiranje informacij

• DNK vsebuje gostoto informacije ~1 bit/nm3, kar je bistveno več kot obstoječi elektronski mediji

• DNK omogoči izvajanje logičnih operacij

Bio-fotolitografija

slikanje z bakterijami, bakterije se razporedijo glede na osvetljenost plošče

Sinhrona bakterijska uraDanino, Nature 2010

Bakterijski števec Friedland, Science 2009

Aktivacija celične signalizacije s svetlobo

Levskaya, Nature 2009

Dosežki sintezne biologije na Kemijskem inštitutu

• Sintezna imunologija:– Spreminjanje celične

signalizacije – detekcija virusa, spreminjanje celičnega odziva

– Priprava cepiv nove generacije

• Bionanotehnologija:– Priprava

nanomaterialov na osnovi DNK in peptidov

iGEMmednarodno tekmovanje gensko

spremenjenih strojev• 2004: srečanje petih ameriških ekip (MIT, BU,

Caltech, UT Austin, Princeton)

• 2005: prvo mednarodno srečanje: 13 ekip, 2 evropski (ETH in Cambridge), ni formalnih nagrad in sodnikov

• 2006: 37 ekip iz vsega sveta

• 2007: 54 ekip

• 2008: 84 ekip

• 2009: 121 ekip

Sodelujočih na iGEM: 8/10 najboljših; vse 3 nemške univerze med prvo stoterico.

Udeležba najuglednejših svetovnih univerz na iGEM

Projekt 2006 – zmanjšanje pretiranega imunskega odziva

Osnovni koncept:zmanjšanje pretiranega celičnega odziva

Sepso sproži pretiran vnetni odziv, ki ga sprožijo sestavine patigenih bakterij

200,000 žrtev letno v EU,ni učinkovitega zdravila

OkužbaCel

ični

odz

ivzmanjšanje odziva

Signalna pot TLR – odziv na bakterijsko infekcijo

NFκBP65

IκBα

NFκB P65/50

IKKβIKKγ

IKKα

MyD

88

DD

IRAK

TIR domena

DD domena

TRAF6TRAF6

TAB

2

Kinase

IRA

K1 P

P

PP

TAK1P

TAB1PTAK1

P

TAB1 P

PPTRAF6

Kinase

IRA

K1M

yD88

DD

MyD

88

DD

Kinase

IRA

K4

Kinase

IRA

K1

TRAF6

Uev1AUbc13

TAB2TAK1

P

P

TAB1 P

razgradnja

TRAF6

Uev1AUbc13

TAB2TAK1

P

P

TAB1P

MEKK3MEKK3

TLR

PAMPTLR TLR

jedro

Povzročitev imunskega odziva zaradi okužbe

vnetni posredniki

signalnaveriga

Model z dodano negativno povratno zanko

vnetni posredniki

signalnaveriga

zaviralec zaustavi pretiran odziv

Simuliran in eksperimentalno izmerjen odziv celic

Slovenska ekipa je v prvem nastopu osvojila Grand Prize.

detekcija virusne okužbe, ki je neobčutljiva za mutacije

Slovenski iGEM projekt 2007

Zdravila proti virusu HIV

Virus hitro mutira in postane odporen na zdravila

Problemi antivirusnih zdravil

Celice okužene z občutljivimi (rdeča) inodpornimi virusi HIV (zelena) pacienta z AIDS-om.

Mutacije!10 – 20% ljudi okuženih s HIV v Evropi in ZDA je okuženih z mutiranimi virusi

HAART – terapija s kombinacijo več zdravil

Cena

Doživljenska terapija

Stranski učinki zdravil

http://www.rhodes.edu/biology/glindquester/viruses/pagespass/hiv/attachment.jpg

FUNKCIJA 1:Vezava virusa povzroči heterodimerizacijo receptorja

Heterodimere lahko zaznamo preko cepljenih proteinov

• Cepljen ubikvitin– cepitev z lastno proteazo, ki je

specifična za ubikvitin– cepi na C-koncu ubikvitina

• Cepljena proteaza tobačnega virusa (TEV) protease system – cepi na zelo definiranem mestu

Virusni senzor na osnovi dimerizacije

CD4

prepisovanje protivirusnih obrambnih genov (e.g. interferon, ApoBec...)

fuzija receptorja z deli TEV proteaze

HIV-I virus

cepitev membranskega sidra (TEV substrate

CCR5

aktivirana TEV proteaza

T7 RNAPNLS signal

premik v jedro

Testiranje na celičnih kulturah pokaže uspešno delovanje

kontrola + gp120 + psevdovirus

Membranskalokalizacija

Citosolnalokalizacija

Citosolna lokalizacija

Povezava dveh korakov: aktivacija celic na osnovi TEV-T7

kontrola + gp120 + HIV psevdovirus

FUNKCIJA 2: aktivnost HIV proteaze

HIV proteaza prepozna specifičnomesto za cepitev:

SQNY↓PIVQ

aktivnost HIV proteaze se pojavi v poznem stadiju okužbe.

Sistem za zaznavanje virusa na osnovi aktivnosti HIV proteaze

prepisovanje obrambnih protivirusnih genov (e.g. interferon, ApoBec...)

T7 RNAP

T7 RNAP

substrat za HIV proteazoHIV-I proteaza

NLS signal

premik v jedro

membransko sidro

HIV proteaza povzroči premik fluorescentnega reporterja v jedro

kontrola + HIV proteaza

lokacija na membrani

lokacija v jedru

Aktivacija celic na osnovi aktivnosti HIV proteaze

kontrola + HIV proteaza

Ogled spletne strani iz 78 držav

http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Ljubljana

Odmevnost projekta v svetu

Odmevi

Sintetično cepivo proti bakteriji Helicobacter pylori

iGEM2008

Helicobacter pylori• Stopnja okuženosti po svetu je

okrog 50 %

• Poglavitni vzrok želodčne razjede ter raka na želodcu

• 7 milijonov obolelih vsako leto, >600,000 žrtev, v Sloveniji >400 primerov želodčnega raka letno

• Na voljo še ni učinkovitega cepiva

NFκBP50/52

E. coli

Aktivacija celice:•kemokini•citokini•interferon...

Izogibanje imunskega sistema

Flagelin

H. pylori

TLR5 ne prepozna flagelina H. pylori

FlagelinTLR5

Himerni flagelin

Brez aktivacije

H. pylori FlaAE. coli FliC Himerni flagelin

Antigene lastnosti, protitelesa, T-celični odziv

Aktivacija prirojene imunosti

Sestava sintetičnega cepiva

Variabilna domena flagelina H.pylori

H. pylori antigen(npr. UreB)

proteinski antigeni (aktivacija adaptivne imunosti)

Aktivacija prirojene imunosti (TLR5)

prirojen imunski odziv

pridobljen imunski odziv (proti antigenom H.pylori)

Priprava treh oblik cepiva

Proteinsko cepivo

Modificirane bakterijeDNK cepivo

CMV-HF-UreB..Antigen

HFss

CMV

Celični in humoralni imunski odziv

Prezentacija antigena, aktivacija citokinov, ... DC, makrofagi…

activationNFκBP50/52

TLR5

himerni flagelin-H. pylori antigen

DNK cepivo

Tkivo

DNKcepivo

Himerni flagelin se mora izločiti, daaktivira TLR5.

Transaktivacija TLR5 prekoizločenega flagelina sosednjih celic.

Cell, cotransfected with TLR5and DNK vaccine

DNK cepivo - rezultati

Učinkovitost cepiva in vivo

Močna imunoreaktivnost seruma imuniziranih miši (HF-MULTI).

Serum imuniziranih živali (MULTI) prepozna žive bakterije

0

0,5

1

1,5

2

2,5

62,5 250 1000 4000 16000

IgG

(OD

450

nm

)

redčitve

immunized mice

Relative flourescence intensity

Relative flourescence intensity

3 tedni!

neg. kontrola

Sekundarna protitelesa na H. pylori

HF-serum na H. pylori

[Nanomateriali]

Biološki sistemi so nanosistemi,ki dejansko delujejo !

Ali znamo sestaviti novenanostroje in nanostrukture ?

Nanomateriali imajo številne prednosti.Večinoma so pripravljeni iz anorganskih ali organskih materialov enega tipa – relativno enostavne strukture.

[kontrola sestavljanja struktur iz DNK]

S pomočjo parjenja baz lahko kontrolirano povezujemo verige DNK

[geometrijski liki iz DNK]

Rothemund, Nature 2006He et al., Nature 2008, ChemComun 2006

[bolj kompleksne sestavljene strukture]

[Nano zemljevid Slovenije iz DNK]

100 nm

Miha Jerala, Gimnazija VičIva Hafner Bratkovič, KI

Sestavljen iz 7249 nt dolgega DNK genoma bakteriofaga M13 ter 227 sintetičnih oligonukleotidov

[primerjava DNK in polipeptidov kot gradnikov nanostruktur]

DNK polipeptidivsebuje 4 nukleotide s podobnimi

lastnostmi -vsebujejo 20 AK z različnimi

kemijskimi lastnostmi +se lahko zvije v določene 3D

strukture +/-se lahko zvijejo v določene 3D

strukture +v naravi shranjuje informacije

-v naravi gradijo strukture in

funkcionalne “naprave” +lahko se programira (W-C bazni pari)

+

informacija kodira strukturo na

kompleksen način -

intro

[obvite polipeptidne vijačnice kot gradniki]

obvite vijačnice s paralelno ali antiparalelno orientacijo

stabilnost in specifičnost parjenja –izbrani AK ostanki na določenih mestih ponovitev heptad = dva zavoja vijačnice

1 nm/heptado

Stabilizira: hidrofobni AK ostanki na

mestih a in d – tvorba jedra nasprotni naboji na mestih

e in g

Destabilizira: ostanki polarnih AK (Asn) na

mestih a ali d enak naboj na mestih e in g

Mesta b, c in f: poljuben izbor aminokislin – uvedemo želene funkcije

[interakcije: načrtovanje stabilnosti obvitih vijačnic]

[kaj lahko sestavimo z obvitimi vijačnicami? ]

Z uporabo peptidov, sestavljenih iz dveh vrst komplementarnih vijačnic, lahko sestavimo le linearne strukture: tvorba fibril.

[uporaba treh segmentov namesto dveh ]

Za tvorbo 2D ali 3D struktur potrebujemo vsaj 3 različne, med seboj komplementarne vijačne segmente.

[kombinacija oligomerizacijske domene inobvite vijačnice]

oligomerizacijska domena (≥3) + segment, ki tvori antiparalelno obvito vijačnico

mreža s porami , definiranimi z dolžino in lastnostmi segmenta, ki tvori obvito vijačnico

segment, ki tvori antiparalelno obvito vijačnico

gradnik:

p53 tetramerizacijska domena

[sestavljanje proteinske mreže]

[sestavljanje proteinske mreže]

Pore: velikost pore določa dolžina segmenta, ki tvori obvito vijačnico kemijske lastnosti pore določajo AK ostanki na povšini obvite vijačnice

[sestavljanje proteinske mreže]

Pore: velikost pore določa dolžina segmenta, ki tvori obvito vijačnico kemijske lastnosti pore določajo ak ostanki na povšini obvite vijačnice

[ultrafiltracija čez polipeptidno membrano]

Odstranjevanje virusov:

Only 0.22um PVDF Filter

0.22um PVDF Filter with protein membrane

PVDF filter with 0.22 um pores

PVDF filter with 0.22 um pores

Proteinmembrane

Možnosti uporabe: naprave za filtracijo in ločevanje, kataliza.

[gradniki za tvorbo 2D in 3D struktur]

a b a’

+ heterodimer

a a’

b

2x homodimer

Samosestavljanje: 1 paralno homodimerni in 2 heterodimerna segmenta

[kako sestaviti kocko iz ene vrste polipeptidov?]

a b a’

[samosestavljanje v heksagonalno mrežo – gradniki so enaki kot pri kocki]

a b a’

[druge kombinacije: segmenti iz treh ali več obvitih vijačnic]

Primer: trije homodimeri se lahko zvijejo v tetraeder, kocko ali planarno mrežo

A B C

C – antiparalelni homodimeriiz obvitih vijačnic: segment C-C

B– antiparalelni homodimeriiz obvitih vijačnic: segment B-B

A – antiparalelni homodimeriiz obvitih vijačnic: segment A-A

[eksperimentalni rezultati]

190 200 210 220 230 240 250 260-60-40-20

020406080

100120140

P1 P2 P1+P2

Ellip

ticity

(mde

g)

Wavelength (nm)

P1 P2

P1-P2 heterodimer

Le pari heterodimernih vijačnih segmentov lahko tvorijo obvite vijačnice.

200 210 220 230 240 250 260

-10

-5

0

5

10

Elli

ptic

ity (m

deg)

Wavelength (nm)

K2:P1 GCN P2

[samosestavljiva polipeptidna mreža]

napoved

Posnetek TEM: samosestavljen K2

rezultat !!!

[nanokocka sestavljena iz peptidov]

Posnetek TEM: samosestavljena struktura iz peptida K2 pri nizki koncentraciji

To je prvi primer mrež ali 3D struktur, zgrajenih na osnovi obvitih vijačnic!

Ozka grla SBOrodjaBolj zmogljiva kemijska sinteza (rezvoj 2.generacije

DNK sintetizatorjev)Modularnost, standardizacijaAvtomatizacija sestavljanja genomov (laboratorij na

čipu)

Razumevanje osnov delovanja bioloških sistemov

Razumevanje celice kot kompleksnega sistema (sistemska biologija)

Razumevanje zvitja proteinov in njihovih interakcij

Prihodnost sintezne biologije

• Aplikacije v bližnji prihodnosti– obnovljivi viri energije– napredni (nano)biomateriali– medicinske aplikacije– industrijska biosinteza

• Raziskave bioloških sistemov s sintezno biologijo– Sinteza celotnih genomov bakterij in njihova aktivacija– Identifikacija minimalnega genoma– de novo programiranje genoma

[think outside the box !]

Meje potencialov uporabe sintezne biologije v nanotehnologiji postavljajo samo naše razumevanjenaravnih principov in ustvarjalnost.

Σ

Škatla je šele začetek...

Nominacija Team Slovenija za World Technology Award

Pretekli dobitniki:

Craig Venter, Sir John Sulston, Tim Berners Lee, Mark Zuckerberg,Michael Graetzel, Burt Rutan,

Google, Sony, Genentech,IBM, Space-X, Weizmanov inštitut…

Ekipe 2006-2009

MentorjiMojca Benčina (KI), Monika Ciglič (KI), Karolina Ivičak (KI), Nina Pirher (KI), Gabriela Panter

(KI), Mateja Manček Keber (KI), Marko Dolinar(FKKT), Simon Horvat (BF), Roman Jerala (KI, FKKT)

2008Eva Čeh, BFVid Kočar, FKKTKatja Kolar, FKKTAna Lasič, MFJan Lonzarić, FKKTJerneja Mori, BFAnže Smole, BF

2006Monika Ciglič, BFOta Fekonja, BFJernej Kovač, FKKTAlja Oblak, BFJelka Pohar, BFMatej Skočaj, BFRok Tkavc, BF

2007Marko Bitenc, BFPeter Cimermančič, FKKTRok Gaber, BFSaša Jereb , FKKTKatja Kolar, FKKTAnja Korenčič, FKKTAndrej Ondračka, FKKT

2008Sabina Božič, FKKTNika Debeljak, BFTibor Doles, BFUrška Jelerčič;FMFAnja Lukan, FKKTŠpela Miklavič, BFMarko Verce, BF