sistemas acarreadores de fÁrmacos -...
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SISTEMAS ACARREADORES DE FRMACOS
Dra. Ma. Josefa Bernad Bernad
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INTRODUCCIN
Grandes avances en la biologa molecular y celular
Interacciones a nivel celular y tisular
Macromolculas: Hormonas, proteinas, DNA, etcMacromolculas: Hormonas, proteinas, DNA, etc
Especificidad de la accin, evitando efectos secundarios(Frmacos antineoplsicos)
Niveles de frmacos ms o menos constantes
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Especificidad de la accin
Tres diferentes niveles de targeting:1.- Tejidos (hgado)2.- Poblacin especifica de clulas en un tejido
(hepatocitos)3.- Compartimientos intracelulares (lisosomas)
(Antimicrobianos)3-2-1: Mayor a menor complejidad3-2-1: Mayor a menor complejidad
Los vehculos deben ser capaces de interactuar selectivamente en el lugar indicado
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Liberacin adecuada del frmaco (Velocidad de liberacin)
Protenas y pptidos como agentes teraputicos
No va oral: Fcilmente degradados y desactivados por enzimas proteolticasPeso molecular muy grande para absorberse
Otras rutas (nasal, bucal): Baja y variable biodisponibilidadOtras rutas (nasal, bucal): Baja y variable biodisponibilidad
Ruta parenteral: Vida media muy corta. Inyeccin frecuente
Importancia del medio biolgico.- Interacciones con componentes celulares o clulas en si
Incompatibilidad del vehculo con el frmacoDesviacin del lugar de accin
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TIPOS DE VEHCULOS
1.- Ciclodextrinas
2.- Sistemas coloidales
2.1.- Emulsiones2.2.- Liposomas2.3.- Niosomas2.3.- Niosomas2.4.- Nanopartculas2.5.- Micropartculas
3.- Anticuerpos
4.- Eritrocitos resellados
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CICLODEXTRINAS
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FORMACIN DE COMPLEJOS DE INCLUSIN
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EQUILIBRIO EN DISOLUCIN
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PASOS DE LA COMPLEJACION
Salida de las molculas de agua de la cavidad de las ciclodextrinas
Prdida de la capa de hidratacin del husped Prdida de la capa de hidratacin del husped
Entrada del husped a la cavidad vacia
Liberacin de la energa de tensin del anillo
Restauracin de la estructura del disolvente
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METODOS DE PREPARACION
Preparacin de complejos en disolucin
- mezcla de disolventes - adicin del husped sobre unadisolucin de anfitrin
Preparacin en suspensin
Amasado
Fusin del husped
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INTERACCIONES CICLODEXTRINAS-HUSPED
Desplazamiento de las molculas de agua desde el interior de las CD
Liberacin de la tensin del anillo
Int. van der Waals
Int. electrostticas
Puentes de hidrgeno
Efecto solvofbico
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CARACTERIZACIN DE COMPLEJOS DE INCLUSIN
.- Difraccin de Rayos X de polvos
.- Espectroscopa de Infrarrojo
.- Resonancia Magntica Nuclear de slidos
.- Anlisis calorimtrico.- Anlisis calorimtrico
.- Espectroscopa de masas
.- Microscopa electrnica
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APLICACIONES
- Modelos enzimticos - Catalizadores- Modelos enzimticos - Catalizadores
- Tecnologa farmacutica - Alimentos y cosmtica
- Pesticidas - Biotecnologa
- Qumica analtica - Diagnstico
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Tecnologa Farmacutica
Formulacin de frmacos
- compuestos lquidos se pueden formular como slidos
- Forma de dosificacin slida
- compuestos lquidos se pueden formular como slidos- malos olores y sabores pueden ser evitados- compuestos incompatibles pueden ser mezclados- desintegracin fcil de los comprimidos
Forma de dosificacin lquida
- no es necesario usar disolventes orgnicos- irritacin local, hemlisis... son evitadas
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Proteccin de los ingredientes activos
- Oxidacin, luz- Destruccin, descomposicin por calor- Volatilidad y sublimacin
Tecnologa Farmacutica
Aumento de la estabilidad fsica y qumica
- Volatilidad y sublimacin
Eliminacin o reduccin de:- Olores y sabores- Contaminacin microbiolgica- Higroscopicidad
Ventajas tecnolgicas- Manejo de polvos- Reduce costos de almacenaje
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Optimizacin de la biodisponibilidad- aumento de la solubilidad y vel. de disolucin- disminuye la hidrofobicidad del frmaco
Tecnologa Farmacutica
disolucinrpida
F-CD
disociacin(muy rpida)
F-CD
F. absorbido
(muy rpida)
F+CD
Absorcin
F. absorbido
F
CDCD
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Disolucin controlada en el tracto gastrointestinal
Absorcin insignificante en forma intacta en el intestino
FARMACOCINTICA Y TOXICIDAD DE LAS CICLODEXTRINAS
Prcticamente el total de la CD es metabolizada por la microflora del colon
Los metabolitos primarios (maltosa, glucosa) siguen la misma ruta que el almidn
por la microflora del colon
Toxicidad
Crnica:
Aguda : LD50 = X
Nefrotoxicidad
Hemlisis
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100
125
150
175
200
-CD
-CDSolubilidad en agua g/100mlHidroxilos secundarios
Cavidad apolar
20 30 40 50 60 70 80 90
0
25
50
75
100
-CD
Temperatura C
Hidroxilos primarios
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AUMENTO DE LA SOLUBILIDAD DEL HUSPED
Violeta de genciana con hp--CD
Violeta de genciana con -CD
Violeta de genciana con hp--CD
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.- David C. Bibby et al.; Mechanisms by which cyclodextrins modify drug release from polymeric drug delivery systems; International Journal of Pharmaceutics 197 (2000) 111
.- Beatriz Pose-Vilarnovo et al.; Improvement of water solubility of sulfamethizole through its complexation with - and hydroxypropyl--cyclodextrin; Characterization of the interaction in solution and in solid state European Journal of Pharmaceutical Sciences 13 (2001) 325331.- Dominique Duchene , Denis Wouessidjewe, Gilles Ponchel; Cyclodextrins and carrier systems; Journal of Controlled Release 62 Cyclodextrins and carrier systems; Journal of Controlled Release 62 (1999) 263268.- Renata Kobetic et al. Study of the lorazepam: cyclodextrin inclusion complexes using electrospray ionization mass spectrometry. Tetrahedron Letters 42 (2001) 60776082
.- R. Ficarra et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 23 (2000) 3340 Study of b-blockers:b-cyclodextrins inclusion complex by NMR, DSC, X-ray and SEM investigation
.- G.N. Kalinkova . International Journal of Pharmaceutics 187 (1999) 115 Studies of beneficial interactions between active medicaments and excipients in pharmaceutical formulations
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SISTEMAS COLOIDALES
- Sistemas que presentan un tamao menor a 5 m
- Pueden clasificarse en:
- Emulsiones
- Partculas:- Partculas:- Nanopartculas
- Micropartculas
- Liposomas
- Niosomas
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Su xito en teraputica depende de:
su capacidad para mantenerse en la circulacin
Su capacidad de alcanzar las clulas o tejidos meta
Propiedades de superficie
Caracterizacin fsico-qumica : relacin con toma delfrmaco in Vitro por las clulas o las distribucin enlos tejidos
Distribucin en el organismo
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Obstculo: Rpido aclaramiento de las partculas coloidales por los macrfagos del sistema reticuloendotelial, principalmente en el hgado y en el bazo
Solucin
Modificacin del tamao de partculaModificacin del tamao de partcula
Modificacin de la carga de la superficie
Modificacin de la hidrofobicidad de la superficie
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ADMINISTRACIN DE SISTEMAS COLOIDALES
- Se reconocen como partculas extraas y soneliminadas de la circulacin por los macrfagos delSRE (hgado y bazo principalmente)
1.- A ms hidrfila sea la superficie menor es lainteraccin con muchos de los componentes delorganismo y por ello menor respuesta inmune.
Se puede evitar o disminuir
organismo y por ello menor respuesta inmune.
Tipo de superficieMaterial
Unin a Fibringeno (g/cm2)
ngulo de contacto
PolietilenoCarbon
9560
0.730.77
Hidrofbica
Hidroflica0.230.4
2215
PoliHEMACelofano
Brynda et al., J. Biomed. Mater. Res., 18, 685-593, 1984
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2.- No tener expresin de antgenos en la superficiey as no habr reconocimiento por anticuerpos
3.- No poseer lugares de unin para el C3b (sistema del complemento)
4.- Poseer caractersticas de superficie adecuadas 4.- Poseer caractersticas de superficie adecuadas para la unin con el componente H (sistema del complemento) -- ej: Alto contenido de grupos carboximetilo disminuye la activacin del sistema del complemento
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MATERIALES BIODEGRADABLES PARA LIBERACIN DE FRMACOS
.- Ni los materiales usados, ni sus metabolitos deben ser txicos.- Su degradacin debe ser suficientemente rpidaEjemplos:
Albmina srica bovinaGelatinaEtilcelulosaEtilcelulosaDerivados de dextranoPolmeros sintticos
.- Menos inmunognicos
.- Baratos y disponibles en grandes cantidades
.- Bien caracterizados
.- Relativamente txicos (Productos de degradacin: isobutanol,
formaldehido)
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Ejemplos:.- Poliesteres de cido lctico (PLA) y su
copolmero con cido gliclico (PLA/GA) (Una o dos semanas para degradarse)
.- Polmeros sintticos: Poliesteres (poli(cido hidroxibutrico)=PHB, su copolmero con hidroxi(cido valerinico)=PHB/HV), poliortoesteres, hidroxi(cido valerinico)=PHB/HV), poliortoesteres, polianhidridos y poliamidas)
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CMO CONSEGUIR ESPECIFICIDAD DEL LUGAR DE ACCIN?
1.- Campos magnticosMicroesferas de albumina cargadas con Fe3O4Problemas de toxicidad por acumulacin en hgadoWider et al, 1979, J. Pharm. Sci., 68, 79-82Wider et al, 1980, Cancer research, 40, 3512-3517
2.- Anticuerpos de origen humano para evitar efectos de rechazo
Problemas: se afecte la actividad del anticuerpo
3.- Residuos de azcar que pueden unirse a ciertos receptores de la superficie celular (lectinas)
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Coloides
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VENTAJAS DE LOS SISTEMAS COLOIDALES
.- Protegen al frmaco del anfitrin (degradacinenzimtica).
.- Protegen al anfitrin del frmaco (disminucin de efectossecundarios).
.- La velocidad de liberacin del frmaco puede seroptimizada en funcin de los requerimientosfarmacolgicos y farmacocinticos.
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LIMITACIONES DE LOS SISTEMAS COLOIDALES
.- Mtodos de preparacin
.- Susceptibilidad al SRE
.- Acceso limitado a clulas no fagocitarias
.- Inmunogeneicidad
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MODIFICACIN DE LOS VEHCULOS
.- Modificacin de la superficie por adsorcin de polmeros
.- Recubrimiento con poloxamero y poloxamina
.- Recubrimiento con fenoles alquil polioxylados
.- Recubrimiento con fosfolpidos.- Recubrimiento con fosfolpidos
.- Recubrimiento con compuestos etoxilados
.- Irradiacin gama
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Modificacin de la superficie por adsorcin de polmeros
Hidrofbica Hidroflica
1.- Modificacin qumica1.1.- Introduccin de grupos funcionales (OH, COOH)1.2.- Unin de PEG
Problemas de toxicidadAbuchowski et al, 1977, J.Bio.Bhem., 252, 3578-3581
Problemas de toxicidad
2.- Adsorcin de polmeros.- El polmero no debe desorberseej: Poloxamina 908,
Ts no inicos: nonilfenol etoxilado ( EO Afinidad)Poloxameros (Polioxietileno-Polipropileno)
Eficacia de adsocin fuerzas conductorasKromberg et el, 1984, J.Coloid. Interf. Sci.,102, 418-423
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Recubrimiento con poloxmero y poloxamina
Poloxmeros (EO)n- (PO)m- (EO)n
Poloxaminas(EO)n- (PO)m
(EO)n- (PO)mN-CH2-CH2-N
(PO)m- (EO)n
(PO)m- (EO)n
Afinidad
Peso Molecular
Grupos EO
Grupos PO
Tiempo de incubacin
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Recubrimiento con fenoles alquil polioxylados
R
O(CH2-CH2-O)n-1 CH2CH2OH
Mayor hidrofobicidad que poloxmeros y poloxaminas
Mayor capacidad de adsorcin
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Recubrimiento con fosfolpidos
Bajo aclaramiento por el SRE
Alta lipofobicidad
Tipo de fosfolpido Espesor de la capa ()
Infusol (60-80% PC) 33.7Infusol (60-80% PC)
NC 95 (90-96% PC)
DPPC
PG-huevo (96-98% PCH)
PE-soya (92.2% PEH)
33.7
43.4
36.2
23.7
36.4
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Recubrimiento con compuestos etoxilados
Monoglicridos etoxilados (serie Targat)Aceites de castor (serie Targat R)Esteres de cidos grasos sorbitan etoxilados (Tween)
.- A mayor proporcin de parte hidrofbica mayor unin.- A mayor proporcin de parte hidrofbica mayor unin
.- A ms puntos de unin menor problema de desorcin
.- A mayor nmero de grupos EO mayor hidrofilicidad de la superficie
.- A ms insaturaciones mayor adsorcin
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Irradiacin gama
Degradacin de las cadenas y entrecruzamiento
Disminucin de la hidrofobicidad
Susceptibilidad a adsorcin de polmeros hidroflicos
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CARACTERIZACIN DE LOS VEHCULOS
.- Determinacin del tamao de partcula
.- Determinacin de la carga
.- Determinacin del potencial zeta
.-Determinacin de la hidrofobicidad de la superficie
.- Anlisis qumico de la superficie
.- Determinacin de la temperatura de floculacin crtica
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Determinacin del tamao de partcula
Influye en la distribucin en el organismoMayor a 6m mayor que el dimetro de los capilares(LD50 ratas=154000/g para 13.5m y 705/G para 90.7m)
A mayor tamao de partcula mayor aclaramiento por el SRE
Mtodos: Espectroscopa de correlacin fotnicaDifraccin de lserMicroscopa electrnica
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Espectroscopa de correlacin fotnica
.- Determinacin del tamao medio de partcula
Basada en dispersin de luz lser
Aplicable para partculas entre 5nm y 3 m
.- Distribucin del tamao de partcula
.- Espesor de la capa de recubrimiento de partculaspequeas
.- Dar seguimiento al proceso de agregacin-deagregacin en suspensiones
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Difractometra laser
Rango de medida: 0.1 m a 100 m
LASER
Detector
Rayo laser 12
1.- ngulo de difraccin grande para pequeas partculas2.- ngulo de difraccin pequeo para partculas grandes
Patrones de difraccin de luz nicos para cada tamao de partcula
Ventajas: Puede medir cualquier dispersin transparenteOtros necesitan electrolitos (agregacin departculas o coalescencia de gotas pordisminucin del potencial zeta)
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Microscopa electrnica
Solo puede usarse para muestras slidas
Solucin: Congelar rpidamente y evaporar para aislar las partculas que hay en la dispersin
Diferencias en funcin del mtodo:
Distribucin del tamao de partcula
Tamao de partcula
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Microscopa electrnica
200 000X
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Determinacin de la carga (Potencial Zeta)
Unin de partculas a macrfagos:
1.- Mediada por receptores a inmunoglobulinas(Berken et al., 1966, J. Exp. Med., 123, 119-144)
2.- Mediada por receptores a sistema del complemento(Mantovani et al., 1972, J. Exp. Med., 135, 780-792)(Mantovani et al., 1972, J. Exp. Med., 135, 780-792)
3.- Mediada por interacciones hidrofbicasEj: Globulos rojos
(+neurominidasa o polilisina)
GR sin carga, > Interaccin con macrfagos (in vitro)(Capo et al., 1981, Immunol. Comm., 10, 35-43)
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CargaProceso de dispersin de las partculas en aguaGrupos cargados en la superficieAdsorcin de iones del medio de dispersin
Qu es el potencial zeta?
Una partcula (o lquido disperso) suspendido en un fluidoUna partcula (o lquido disperso) suspendido en un fluidoEs rodeado por una capa de iones con una carga especfica. Esta capa es rodeada por otra capa, ms difusa que la primera, y que tambin tiene su carga elctrica. La diferencia de carga entre la primera capa y el bulto de la disolucin es el potencial zeta.
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Cmo medir el potencial Zeta?Velocidad de las partculas en un campo elctrico
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Para que sirve el potencial zeta?
Cuando iones o polmeros se adsorben en una partcula, su carga de la superficie vara y por lo tanto su estabilidad. As la medida del potencial zeta nos va a dar una medida de la aglomeracin.
Prcticamente todos los coloides acuosos son negativos, -14 a 30 mV. A ms negativo la estabilidad negativos, -14 a 30 mV. A ms negativo la estabilidad aumenta, esto se consigue por la adicin de electrolitos anionicos. Si el potencial es 30 mVo menos, la repulsin es suficiente para conferir una gran estabilidad y entre 45 y 70, la estabilidad est asegurada.
Para conseguir aglomeracin es necesario que el potencial zeta sea cercano a cero, lo cual se consigue adicionando electrolitos catinicos.
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Rayo laser Luz dispersada
Partculas Luz dispersada
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Partculas no recubiertas-Partculas cubiertas
Espesor de la capa de recubrimiento-plano de corte
Caractersticas de esta capa
Cambios en el potencial zeta
Concentracin de iones
Tipo de sales
Extensin de la disociacin inica
Interaccin de las partculas con los iones
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Determinacin de la hidrofobicidad de la superficie
Determinacin de la adsorcin de polmeros en la superficie
> hidrofobicidad de la superficie> unin de polmeros
Interaccin de vehculos con clulas
Partculas hidrofbicas>unin a los fagocitos
>fagocitosis
Distribucin de las partculas en el organismo
Partculas hidrofbicasAdsorcin de IgG
Unin a los receptores Fc de los fagocitos
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Mtodos
Unin de rosa de Bengala
Se incuban las partculas con rosa de bengala durante 3 hSe centrifugan por 1 2 h a 20,000 r.p.m.Se determina espectrofotometricamente el sobrenadante
60(
g/m
g)
50PS-0.06
(
0 10 20 30 40 50
0
10
20
30
40
50
PS-0.9
PS-0.14
PS-0.06
Co
nce
ntr
aci
n d
e R
B a
dso
rbid
a
Concentracin de RB ( g/ml)
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Cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC)
Columna cromatogrfica
Interacciones hidrofbicas(Matriz neutra hidrofbica)
Separacin de sustancias
.- Hidrofobicidad del soluto
.- Hidrofobicidad de la columna
.- Interacciones soluto-disolvente
.- Interacciones entre el disolvente (Efecto salting-out Cl-, PO43-y salting-in Ca2+, Ba2+)
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Ejem: PS-COOH y PS-OH SefarosaSin necesidad de un detergente
Otra columna
Poloxamina 908, Poloxmero 338 y 407< hidrofobicidad
Reducen fagocitosis
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Particin entre dos fases acuosas
HeptanoBencenoEter
Disoluciones de polmeros
Polipropilen glicolPolietilen glicolAlcohol ppolivinlicoMetilcelulosa
Sistema Octanol-agua
EterFenolAcetonaAguaSales-agua
MetilcelulosaHidroxipropil dextranoDextranoCarboximetil dextranoSulfato de dextrano
Sistema 16% de dextrano 20 ---- 12% PEG 2000
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Anlisis qumico de la superficie
Deteccin de contaminantes en la superficie de la partcula
Explicacin de fenmenos observados en la modificacin superficial del vehculo
Distribucin in vivoDistribucin in vivo
Espectroscopa fotoelectrnica de Rayos X (XPS o ESCA)Espectroscopa de masas Ion esttico secundario (SSIMS)
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Determinacin de la temperatura crtica de floculacin (TCF)
Recubrimiento con polmeros sobre una partcula
Estabilizacin de la partcula
Cantidad de polmero adsorbido por unidad de superficieCantidad de polmero adsorbido por unidad de superficieEspesor de la capa de polmero
Peso molecular del polmeroAfinidad por la superficie
TemperaturaConcentracin de electrolitos en el medio de dispersin
Solvencia del grupo estabilizante en el disolvente
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TCF: Temperatura a la cual las partculas comienzan aflocular y precipitan
Medida de estabilidad y de hidrofilicidad de la superficie
TCF-Temperatura de punto de nube(Grupos OE expuestos al medio)
ptica Detector
Computadora
Bao termostatado
Control de temperatura
Celda con muestra
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VEHCULOS MODELO NO-BIODEGRADABLES
Evitar solapamiento de efectos
Qu deben cumplir estos modelos?
.- Disponibles en diferentes tamaos de partcula.- Disponibles en diferentes tamaos de partcula
.- Partculas con diferentes propiedades de superficie
.- Posibilidad de modificar la superficie
.- No interferir con la distribucin en el organismo
.- Poblacin monodispersa
.- Sin contaminacin por tensoactivos
.- No variabilidad entre lotes
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VEHCULOS POLIMRICOS BIODEGRADABLES
Polmero degradado ms rpidamente in vivo que in vitro
Naturales:
.- Albmina (Burger et al., 1985, Int. J. Pharm., 23, 333-344)
.- Polisacridos (Artursson et al., 1987, J. Pharm. Sci., 76, 127-133)
.- Gelatina (Yoshioka et al., 1981, Int. J. Pharm., 81, 131)
Mal caracterizados
Reacciones adversas
Disponibilidad limitada y caros
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Sintticos
.- Polialquilcianoacrilatos (Verdun et al., 1986, J. Controlled Re., 3, 205-210)
.- Poli (cido lctico) = PLA
.- Copolmero Poli (cido lctico) cido gliclico = PLA/GA
.- Copolmero Poli (cido lctico) poli (cido hidroxibutrico)
.- Poliesteres (Poli cido -mlico)(Braud et al., 1985, Polym. Bull., 13, 293-299)(Braud et al., 1985, Polym. Bull., 13, 293-299)
.- Poliortoesteres(Heller et al., 1985, Methods in enzimology., vol. 112, Academic Press, 422-435)
.- Polianhidridos(Mathiowitz et al., 1987, J. Controlled Rel., 5, 13-22)
.- Qumicamente bien definidos
.- No reacciones inmunolgicas
.- Relativamente ms baratos
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Polialquilcianoacrilatos
.- Liberan productos de degradacin txicos
.- Pueden usarse para liberar frmacos citotxicos
PLA y PLA/GA HO-CH-COOH
CH3
cido lctico (D o L)
HO-CH2-COOHcido gliclico
HO-(CH2-CO-O-CH-CO-O)n-H
.- No txicosProductos de degradacin de los carbohidratos.- Usados en la formulacin de pptidos (Sanders et al., 1985, J. Controlled Rel., 2, 187-195), antibiticos (Ikada et al., 1985, J. Controlled Rel., 2, 179-186), corticoides (Spilizewski et al., 1985, J. Controlled Rel., 2, 197-203), etc.
cido lctico (D o L)
CH3
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.- Degradacin hidroltica no enzimtica
.- Tiempo de degradacin:PLA = 1 aoPLA/GA al 50% = 3-6 semanasPHB
HO-(CH-CH2-CO-O)n-H
CH3
Puede ser:.- Aislado de ciertas bacterias mediante disolventes.- Aislado de ciertas bacterias mediante disolventes.- Sintetizado qumicamente
Desventajas:.- Muy cristalino (tamao y forma de partcula).- No absorbe agua, degradacin hidroltica en
superficie
Solucin:Copolimerizacin con -hidroxivalerato
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Produccin de vehculos
Emulsificacin - Evaporacin
Beck et al., 1980, Contracept. Deliv. Syst., 1, 79-86
1.- Se disuelve el polmero en un disolvente orgnico2.- Se dispersa en un medio acuoso con untensoactivo para estabilizar la emulsin o/w3.- Se sonica para disminuir el tamao de partcula3.- Se sonica para disminuir el tamao de partcula4.- Se evapora el disolvente
De qu depende el tamao y la distribucin del tamao de
partcula?
.- Mtodo de emulsificacin
.- Tipo y concentracin de tensoactivo
.- Viscosidad de la fase acuosa
.- Relacin fase orgnica/fase oleosa
.- Tipo d disolvente orgnico
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.- Concentracin de polmero en la fase orgnica
.- Tipo de polmero
.- Peso molecular del polmero
.- Velocidad de agitacin en la pre-emulsificacin
.- Tiempo e intensidad de sonicacin
.- Velocidad de evaporacin del disolvente (presin y temperatura )
Koosa, 1989, PhD thesis, Nottinghan University
10 12 14 16 18 20
170
180
190
200
210
220
230
240
250
Tam
ao d
e p
art
cula
(nm
)
2 2Contenido de CH Cl (%v/v )
0 10 20 30 40 50 600
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Tam
ao d
e p
art
cula
(m
)Temperatura de evaporacin (C)
Purificacin: dilisis o centrifugacin
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Carga de frmaco en sistemas coloidales
Tipo de partcula
Tamao de
partcula (m)
% de frmaco
incorporado
PHB-prednisolona
0.45 29.8
11.14 37.6
25.20 46.8
PHB-tetracaina
0.25 14.5
5.45 19.140
50
60
70
80
90
100
110
1:1 Frmaco:Polmero
1:21:41:6
1:8
Liberacin de prednisolona desde partculas de PHB
% li
bera
do
tetracaina 5.45 19.1
PLA-prednisolona
4.35 27.4
26.00 37.2
PLA-tetracaina
0.36 55.6
11.72 47.5
0 400 800 1200 1600 2000-10
0
10
20
30
% li
bera
do
Tiempo (min)
Koosha et al., 1988, Acta Pharm. Tecnol., 34, 24S
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CULTIVOS CELULARES COMO PRUEBA DE EFICACIA
1.- Afinidad de los vehculos por diferentes poblacionesde clulas.
2.- Toxicidad de los sistemas coloidales(liposomas,Juliano et al., 1985, Biochim. Biophys. Acta, 812, 42-48; microesferas, Edman et al., 1984, J. Pharm. Sci., 73, 153-48; microesferas, Edman et al., 1984, J. Pharm. Sci., 73, 153-156; en funcin de sus propiedades fisicoqumicas, Mulleret al, 1988, Archiv der pharmazie, 321, 681)
3.- Fagocitosis en funcin de las propiedades desuperficie (Davis et al., 1985, Int. J. Pharm., 23, 69-77)
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Fagocitosis
Cultivo celular
Adicin de partculas e incubacin por 90 minutos
Tincin con Giemsa
Observacin microscpica
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Agente de recubrimiento
Espesor de la capa
Actividad fagoctica
Ninguno 0 100
Poloxmero 108 58 100.4
Poloxmero 188 76 95.4
Poloxmero 217 58 87.6
Poloxmero 235 35 86.5
Poloxmero 237 80 83.5Poloxmero 237 80 83.5
Poloxmero 335 53 66.7
Poloxmero 288 130 56.5
Poloxmero 238 132 47.0
Poloxmero 338 158 36.7
Poloxmero 407 154 21.6
Poloxamina 908 134 69.5
-
Toxicidad
Medida de la enzima intracelular Lactato deshidrogenasa (LDH)
Se libera al daarse la membrana celular
80
100
% de LDH liberado
LDH liberado despus de 1 hrLDH liberado despus de 24 hr
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.100
20
40
60
% de LDH liberado
Concentracin de Poloxmero 184 %
-
DISTRIBUCIN IN VIVO DE LOS VEHCULOS
Se determina por centelleo gama
Se marca la forma de dosificacin a seguir con un istopo radioactivo
La unin debe ser muy fuerte para no La unin debe ser muy fuerte para no hacer un seguimiento del istopo
Capaz de estudiar in vivo procesos dinmicos
-
Experimental
Se etiquetan las partculas con 131I
Se adiciona NaI-131 a las partculasSe irradia la suspensin por 1-2 das
Se dializan las partculas (Quitar I libre)
30-40% de eficacia en partculas pequeas (60-140 nm)
10% de eficacia para 910 nm
-
Partculas sin modificar Partculas coloidales especficas
Partculas coloidales Partculas coloidales (emulsiones)
-
Partculas de 142 nm no recubiertas
Partculas de 142 nm recubiertas con poloxamina 908
-
DISTRIBUCININ VIVO
CARACTERSTICAS DE SUPERFICIE DEL VEHCULO
Poloxamina 908 Circulacin sangunea
Consideraciones:Tamao de partculaEspesor del recubrimientoHidrofobicidad de la superficie
Poloxamina 908 Circulacin sanguneaPoloxmero 407 Mdula sea
Mayor hidrofobicidad del poloxmero
Adsorcin de opsoninas especficas de los fagocitos de la mdula sea
-
DISEO RACIONAL DE VEHCULOS DE FRMACOS
Es necesario conocer:
.- Mtodos para producir vehculos biodegradables
.- Poder modificarlos para no ser txicos
.- Poder caracterizarlos en funcin de su distribucin .- Poder caracterizarlos en funcin de su distribucin in vivo
Para evitar el reconocimiento por el SER:
.- Vehculos no cargados
.- Superficie hidroflica
-
Cmo conseguirlo?
.- Modificacin qumica
.- Adsorcin de polmeros:.- Polioxietileno-polipropileno (Poloxmero y poloxamina).- Nonilfenol polioxietilado (Antarox, Gafat).- Alcohol de cidos grasos polioxietilados.- Alcohol de cidos grasos polioxietilados
(Tween).- Fosfolpidos
Caracterizacin de partculas:
.- Tamao .- Hidrofobicidad superficial
.- Carga .- Composicin qumica de la superficie
.- Reduccin de carga .- Efecto estabilizante del polmero
.- Interacciones con componentes del plasma .-
-
Tamao:PCSDifractometra laserMicroscopa electrnica
Carga:Anemometra doppler laser
Interaccin con componentes del suero (opsonizacin):Interaccin con componentes del suero (opsonizacin):Medida de la carga en suero
Hidrofobicidad de la superficieMedidas de adsorcin (Rosa de Bengala)Cromatografa de interaccin hidrofbicaParticin entre dos fases acuosas
Anlisis qumico:Espectrometra de masas de iones secundarios
-
CONCLUSIONES
1.- Los vehculos no deben estar cargados
2.- La superficie debe ser hidroflica
3.- La superficie debe de ser no activante
4.- Las cadenas de oxido de etileno dan estas caractersticas
5.- La adsorcin de componentes del suero debe ser baja
6.- El espesor del recubrimiento debe ser mnimo (no da estabilizacin)
7.- El tamao de la partcula no importa si la superficie es la adecuada
8.- Todos los requerimientos deben de cumplirse simultneamente
-
EMULSIONES
Se preparan fcilmente
Son reproducibles
Se pueden preparar a gran escala
Diferentes caractersticas segn:Fase oleosaTensoactivos
Pueden ser estables por varios aos
Precaucin: Evitar gotas mayores de 5 m
-
Influencia del tipo de tensoactivo
220
240
260
280Tamao de gota (nm)
Polaxmero 188Polaxmero 388Polaxamina 908Polaxmero 407
0 1 2 3 4 5 6 7140
160
180
200
220
Tamao de gota (nm)
Concentracin de surfactante (%peso/V)
-
Caracterizacin
.- Tamao y carga de las gotas
Resultados
.- A mayor cantidad de tensoactivo, menor tamao de las gotasgotas
.- Al disminuir las gotas se observa polidispersabilidadSe ampla la distribucin de tamao de partcula
.- La concentracin ptima de tensoactivo es del 2-3 %(Partculas de 180 nm, distribucin estrecha del tamao
de partcula)
-
Estabilidad
.- pH, viscosidad, conductividad
.- Estudios de estabilidad acelerada.- Agitacin a temperatura ambiente a una frecuencia determinada.- Agitacin o almacenamiento a altas temperaturas (40 60 C)temperaturas (40 60 C).- Ciclos de congelacin.- Adicin de electrolitos
Precaucin: Tipo de frmacoAdicin de electrolitos en el medioPresinNmero de ciclosViscosidad
-
.- AgitacinGran energa cintica a las partculas
Sobrepasan la repulsin electrostticaCoalescencia
.- TemperaturaDisminucin de la viscosidad
Menor rigidez de la capa de tensoactivo
.- Ciclos de congelacinElimina la repulsin electrosttica
CoalescenciaImportante: velocidad de congelacin
temperatura de congelacintiempo de almacenamientonmero de ciclos
-
Influencia del nmero de ciclos
80
100
120Tamao mximo ( m)
Lecitina de huevo 1Lecitina de huevo 2
0 2 4 6 8 100
20
40
60
Tamao mximo (
Nmero de ciclo
-
.- Adicin de electrolitosSe disminuye el potencial Zeta
Coalescencia
Ejem.: -50 mV 0 mV +10 mV 0 mV3-5 mM/l
Ca2+
Ca2+ 100 mM/l
Ca2+
16
18
20
0 10 20 30 40 500
2
4
6
8
10
12
14
16
Tam
ao m
xi
mo (
m)
Tiempo (horas)
PoloxaminaLecitina de huevo 1Lecitina de huevo 2
-
Conclusiones
La emulsificacin debe llevarse a cabo por microfluidificacin
A bajas [tensoactivo] (0.5%) 250-290 nm y a altas (7%) 150nm
ptimas: 2-3% Distribucin estrecha de tamao de partcula y ptimas: 2-3% Distribucin estrecha de tamao de partcula y poca poblacin mayor de 5m
Los mejores tensoactivos: Poloxmero 188, 338 y 407
-
.- Lundberg, BB. Mortimer, BC. Redgrave, TG. Submicron lipid emulsions containing amphipathic polyethylene glycol for use as drug-carriers with prolonged circulation time. International Journal of Pharmaceutics. 134(May 28): p 119-127. 1996..- Nomura, T. Koreeda, N. Yamashita, F. Takakura, Y. Hashida, M. Effect of particle size and charge on the disposition of lipid carriers after intratumoral injection into tissue isolated tumors. Pharmaceutical Research. 15(Jan): p 128-132. 1998..- Lundberg, BB. Griffiths, G. Hansen, HJ. Conjugation of an anti B cell lymphoma monoclonal antibody, LL2, to long circulating drug carrier lipid emulsions. Journal of Pharmacy & Pharmacology. 51(Oct): p 1099-1105. emulsions. Journal of Pharmacy & Pharmacology. 51(Oct): p 1099-1105. 1999..- Okochi, H. Nakano, M. Basic studies on formulation, method of preparation and characterization of water-in-oil-in-water type multiple emulsions containing vancomycin. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 44(Jan): p 180-186. 1996..- Kurihara, A. Shibayama, Y. Mizota, A. Yasuno, A. Hisaoka, M. et al. Enhanced tumor delivery and antitumor activity of palmitoyl rhizoxin using stable lipid emulsions in mice. Pharmaceutical Research. 13(Feb): p 305-310. 1996.
-
LIPOSOMAS
Introduccin
Se descubrieron en 1960
Hasta 1992 se han publicado 15000 artculos y se hanregistrado 1000 patentes
Se han usado como modelos de membranas celulares ycomo sistemas de liberacin de frmacos
Se definen como vesculas de diferentes tamaos,formadas por una o ms capas concntricas defosfolpidos y que presentan en su interior una cavidadhidroflica
-
Clasificacin
Segn sus propiedades estructurales:
MLV Vesculas grandes multicapas, > 0.5 m
OLV Vesculas oligocapas, 0.1-1 m
UV Vesculas unicapa, cualquier tamao
SUV Vesculas unicapa pequeas, 20-100 nm (*)
MUV Vesculas unicapa de tamao medio
LUV Vesculas unicapa grandes, > 100 nm (**)
GUV Vesculas unicapa gigantes, > 1 m
MVV Vesculas multivesiculares, > 1 m
-
Segn el mtodo de preparacin:
REV: Vesculas uni u oligocapa hechas por evaporacin en fase reversa
MLV-REV: Vesculas multicapa hechas por evaporacin en fase reversa
SPLV: Vesculas estables pluricapa
FATMLV: MLV congeladas-descongeladas
VET. Vesculas preparadas por extrusin
FPV: Vesculas preparadas por French press
FUV: Vesculas preparadas por fusin
-
DRV: Vesculas de deshidratacin-rehidratacin
BSV: Bubblesomas (Talsma et al., J. Pharm. Sci., 1994)
Los liposomas son diferentes segn:
.- Tipo de lpidos usados
.- Tcnica de preparacin
.- Condiciones de preparacin
Influencia sobre:
.- Proceso de opsonizacin
.- Perfil de perdida
.- Disposicin en el cuerpo
.- Vida media del liposoma
-
SUV LUV MLV MVV
OLV MLV: MLV-REV, SPLV
-
Mecanismo de formacin
Diferentes tipos de molculas pueden formar liposomasFosfolpidosEsteroles (colesterol)etc.
Caracterstica general: MOLCULAS AMPIFLICAS
Parte hidroflica: Interacciona con el medio acuoso
Parte hidrofbica: Se esconde del medio acuoso
Empaquetamiento
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Israelachvili et al, Q. Rev. Biophys., 13, 121-200, 1980
Israelachvili, Intermolecular and surface forces,New surface forces,New York: Academic Press
-
Parmetro crtico de empaquetamiento
p = v / a0lc
v = Volumen molecular de la parte hidrofbica
a0 = rea superficial ptima por molcula enla interfase hidrocarbono-agua
lc = Espesor crtico medio para la reginhidrocarbonada. Debe ser menor que lahidrocarbonada. Debe ser menor que lalongitud mxima de la cadena lipdicaextendida
Excepciones:.- Cambios en el pH o temperatura cambian estado de agregacin.- Los agregados pueden interactuar entre ellos.- Puede haber mezclas de lpidos No prediccin
-
Ejemplos:.- Lisofosfatidilcolina
Bicapas (Unin con cidos grasos)Micelas
.- Fosfatidiletanolamina
Micelas invertidas Bicapas (Mezcla con colesterol)
Estabilidad:Estabilidad:Teora elstica de curvatura
La energa de una bicapa en vescula es mayor que la de bicapas apiladas
Metastables
-
La formacin de vesculas es conducida por:1.- Unin desfavorable de la parte hidrofbica con el disolvente2.- Unin favorable de la parte polar con el disolvente3.- Energa de curvatura elstica
Importante:
Cristal lquidoTcGel (Ms rgida, menos permeable) Cristal lquido
Tc: Temperatura de transicin
Depende de:Longitud de la cadena aclicaGrado de saturacinGrupo polar
-15 C lecitina de huevo 50 C diestearoilfosfatidilcolina
Gel (Ms rgida, menos permeable)
-
Materias primas
O CH2
CH2
CH2
N
Me
Me
Me
+
Grupo fosfatidil Cabeza Nombre
O
O
O
O
O
PO O
O CH2
CH2
NH3+
NH +
Colina
Etanolamina
OH
OH
O
OH
OH
OH
O CH
NH3+
COO-
O CH2
CH2 CH2
OHOH
O H
Glicerol
cido
Inositol
Serina
-
Fosfolpidos ms usualmente utilizados:
1.- F. NaturalesYema de huevo
Soya
2.- F. Naturales modificadosPC insaturados PC saturados
3.- F. Semisintticos
Cis
3.- F. SemisintticosCambios de las cadenas aclicas
4.- F. SintticosCitas 35 y 36
5.- F. Con grupos no naturalesPEG: Aumentan el tiempo de circulacinCitas 37 a 40
-
5.- F. Con grupos no naturalesProtenas: especificidad en el lugar de accin
-
Tcnicas de preparacin
Mechanical methodsa. Vortexing or hand shaking of phospholipid dispersions (MLV)b. "Microfluidizer" technique (mainly SUV)c. Bubbling inert gas through aqueous phospholipid dispersions(MLV, LUV)d. . High shear homogenization (mainly SUV)
Methods based on replacement of organic solvent(s) byaqueous mediaaqueous mediaa. Removal of organic solvent(s) before hydration (MLV, OLV,SUV)b. Reverse-phase evaporation (LUV, OLV, MLV)c. Use of water immiscible solvents: ether and petroleumetherinfusion (solvent vaporization) (MLV, OLV, LUV)d. Use of water miscible solvents such as ethanol injection (MLV,OLV,SUV)
-
Methods based on detergent removal by
a. Gel exclusion chromatography (SUV)
b. "Slow" dialysis (LUV, OLV, MLV)
c. Fast dilution (LUV, OLV)
d. Miscellaneous related techniques (MLV, OLV, LUV, SUV)
Methods based on size transformation and fusion Methods based on size transformation and fusion
a. Spontaneous fusion of SUV in the gel phase (LUV)
b. Freeze-thawing (MLV)
c. Freeze-drying (MLV)
d. Dehydration of SUV followed by rehydration with or without sizing
e. Ca2+ ion induced fusion (LUV, OLV, MLV)
f. Detergent-induced growth (LUV, OLV)
-
Generalidades:Los lpidos deben de ser hidratadosHomogeneicidad de tamaoMolculas no encapsuladas deben de ser eliminadas
-
1.- Hidratacin
a. Mtodos mecnicosSe hidratan por agitacin los lpidos, sobre una superficie de vidrio y organizados en capa fina, depositados desde una disolucin orgnica.
Extrusin a baja presin, homogeneizacin a alta velocidad o ultrasonicacin se usa para disminuir el tamaotamao
b. M. Basados en el reemplazamiento de disolventes orgnicos por medios acuososSe inyecta el disolvente orgnico con los lpidos en una fase acuosa y el primero se va evaporando continuamente (alta eficiencia de encapsulacin, 50%)
-
Se hace una emulsin w/o y esta se incorpora en unaw/o/w (baja eficacia)
c. M. Basados en la eliminacin del detergente
Se disuelven los lpidos en presencia de tensoactivosy luego se eliminan stos por diferente tcnicas (bajay luego se eliminan stos por diferente tcnicas (bajaeficacia de encapsulacin, gran posibilidad deincorporar protenas en la membrana, formacin deinmunoliposomas)
-
d. M. Basados en la transformacin de tamao y fusinAl sonicar fosfolpidos hay defectos en la membrana,al trabajar por encima de su Tc se evitan y causanfusin, dando LUV con una distribucin amplia
Citas 91-99
e. M. Basados en ajuste de pHDispersin de cido fosfatdico/fosfatidilcolina concambio de pH (baja eficacia, heterogeneidad y altoscambio de pH (baja eficacia, heterogeneidad y altoscostos)
-
2. Distribucin de tamao
a. Sin homogeneizacin de tamao
El tamao va a depender de los parmetroscontrolables del mtodo empleado (Dispersin 0.2 m)
b. Con homogeneizacin de tamao
.- Ultracentrifugacin
.- Cromatografa de permeacin en gel (tamao deporo)
.- Sonicacin
.- Homogeneizacin a alta velocidad
.- Extrusin a baja presin (Membranas depolicarbonato y presiones de 1 MPa)
< 0.2 m
-
3.- Eliminacin de material no encapsulado
Puede causar efectos no deseados
Para eliminarlo:
Dilisis y ultrafiltracin: Paso a travs de membranas
Ultracentrifugacin: Centrifugacin a altas velocidadesUltracentrifugacin: Centrifugacin a altas velocidades
Cromatografa de permeacin en gel: Tienen que pasar los liposomas grandes,la encapsulacin se da en ciertas condiciones
Reacciones de intercambio inico: Resinas que interaccionen con el material a eliminar
-
Interacciones liposomas-soluto
1.- Interaccin soluto-bicapa y permeabilidad de la bicapa
Rigidez y carga de la bicapa Props. FQ del soluto
Fzas: Electrostticas, VW, efecto hidrofbico
Tipos de frmacos:Tipos de frmacos:
Muy solubles en agua: Agua atrapada en el interior del liposoma
Solubles en agua: Agua atrapada y solubilidad en la bicapa
Insolubles en agua: Solubilidad en la bicapa
-
2.- Liberacin dirigida
Evitar los lisosomas de la clula
2.1.- Controlada por la composicin de la bicapa
Colesterol o gel: Liberacin lenta
Cristal lquido o sin colesterol: Biodegradacin rpida
2.2.- Dependiente del pH
cido olico + dioleoilfosfatidiletanolamina: a pH < 6.5 cido olico + dioleoilfosfatidiletanolamina: a pH < 6.5 se protona el cido y se desestabiliza la membrana
2.3.- Desestabilizacin por eliminacin de componentes de la bicapa
Colesterol puede ser sustituido por componentes del suero; Otros pueden ser eliminados de la mb al adicionar al medio una sustancia con afinidad hacia ellos
-
2.4.- Activacin del sistema del complemento
Inmunoliposomas
Interaccin Ac-Ag
Se activa la cascada del S.Complemento
2.5.- Desestabilizacin de liposomas por la temperatura
T Cristal lquido GelTc Cristal lquido Gel
Gran permeabilidad de la membrana
-
Cmo mejorar la eficacia de carga?
1.- Carga Pasiva
Se atrapa el frmaco en la formacin de liposomas
Volumen capturado (l/mol lpido): Agua encapsulada por mol de lpido.
Eficiencia de encapsulacin: Fraccin de soluto encapsulada por el liposomas
2.- Carga Activa
Permiten cargar los liposomas despus de la formacin del mismo, manteniendo su integridad.
Se atrapa el frmaco en la formacin de liposomas o en una etapa de debilitacin de la membrana.
-
2.1.- Gradiente de pHSe puede encapsular frmacos inicos
manteniendo un gradiente de pH en la bicapa
-
2.2.- Carga de cationes metlicos
Se hacen lipoflicos los cationes al acomplejarse con un vehculo lipoflico (quinolato).
En el interior del liposoma hay un agente quelante con gran afinidad por el catin metlico y eso direcciona el compuesto hacia el interior del liposoma
-
Estabilidad de liposomas
1.- Estabilidad qumica
1.1. Hidrlisis de las uniones ster
Factores que le afectan: Temperatura, pH, rigidez de la bicapa, fuerza inica
-
1.2.- Peroxidacin lipdica de fosfolpidos
Cadenas aclicas poliinsaturadas
Oxidacin
Perxidos cclicos, hidroperoxidos, malondialdehido, alcanos
Cambios en la permeabilidad de la membranaCambios en la permeabilidad de la membrana
Solucin: Ausencia de metales pesados, adicin de antioxidantes (-tocoferol), agentes complejantes (EDTA)
Precaucin: Irradiacin gama
-
2. Estabilidad fsica
2.1.- Perdida de carga.- Depende de la composicin de la bicapa y de las propiedades FQ del frmaco.- Colesterol: estabiliza la bicapa.- Estado de gel es ms estable que Cristal lquido
2.2.- Agregacin: Formacin de grandes unidades de material liposmico, formadas por liposomas
2.3.- Fusin: Formacin de nuevas estructuras coloidales
-
3. Aumento de la vida de los liposomas
Finalidad: Distribucin adecuada en el organismo
3.1.- Seleccin de los componentes de la bicapa
.- Bajas temperaturas y pH = 6-7
.- Cadenas lipdicas saturadas.- Cadenas lipdicas saturadas
.- Adicin de antioxidantes y eliminacin de oxigeno.- Colesterol.- Elegir bicapas en estado gel (DSPC).- Evitar agregacin y fusin mediante cargas en la superficie
-
3.2.- Liofilizacin
.- Crioprotectores: Sacaridos, proteinas, aa y polialcoholes.
Forman estructuras vtreas amorfas en las cuales se incluye el liposoma y se protege del crecimiento cristalino
Forman una capa de hidratacin que evita la desestabilizacin por perdida del agua de hidratacindesestabilizacin por perdida del agua de hidratacin
.- Naturaleza de la bicapa
La temperatura de la transicin de fase puede variar
.- Parmetros tecnolgicos: Tiempo, velocidad y temperatura de congelacin
-
Caracterizacin
1.- QumicaCromatografa (TLC, GLC, HPLC) Separar componentesDeteccin y cuantificacin: ndice de refraccin, dispersinde luz, ionizacin por flama
2.- Fsica.- Determinacin del tamao
Microscopa electrnica: tincin negativa y criofijacinMicroscopa electrnica: tincin negativa y criofijacinUltracentrifugacin
.- Nmero de capas y morfologa internaMicroscopa electrnica31P-NMR: reacciones con metales o productos coloreados
.- Carga = Potencial Zeta
.- Fluidez de la bicapaTcnicas de polarizacin por fluorescencia (Pegan
molculas en la interfase lpido-agua)
-
Preparaciones estriles y libres de pirgenos
1.- Esterilizacin por calorPerdida de retencin y degradacin qumica
2.- Esterilizacin por Rayos gamaRptura qumica de los fosfolpidos
3.- Esterilizacin por filtracinConsiderar liposomas mayores de 0.2 m
4.- Procedimientos de produccin aspticosSistemas caros y especificaciones difciles de encontrar
-
Aplicaciones teraputicas
1.- Nuevos sistemas de liberacin va parenteralIV: Aclaramiento por el SER (liposomas estabilizados)IP, IM y Subcutanea: sistemas depot de lenta liberacin
.- Estabilizacin de liposomas: Incorporacin de componentes naturales hidroflicos (gangliosidos, componentes naturales hidroflicos (gangliosidos, fosfatidilinositol, PEG = Stealth) Circulacin prolongada extravasacin efecto terapetico
.- Liberacin de proteinas y pptidos: Nz lbil y eliminacin sistmica
Discontinuidades en la membrana por interacciones de la bicapa con las proteinas
-
.- Liposomas funcionalizados: superficie modificada para interaccionar con ciertos tipos de clulas o tejidos (Ac, glicoproteinas, etc.). Estimulacin del Sistema inmunitario
2.- Liberacin tpica de liposomas: Ocular y drmica
.- Liberacin controlada de frmacos
.- Especificidad de accin
.- Matriz solubilizante
.- Mejorar la penetracin
Ejem: Liposoma-gangliosido-carbacol: adhesin a cornea
Esteroides en piel
-
3.- Liberacin pulmonar
Alternativa a la administracin sitmica de antiasmticos y antialrgicos.
.- Aumentan solubilizacin de frmcos en el aerosol
.- Son biodegradables. Se evitan efectos secundarios
Precaucin: Tamao de las gotas
4.- Sistemas de liberacin oral
Tracto gastrointestinal: pH extremo, altas concentraciones de Ts (sales biliares), altas concentraciones de enzimas
Uso: estabilidad en el tracto GI e interaccin con la pared intestinal
-
Pruebas clnicas
.- 1976. Liposomas-bleomicina 111In Cncer
.- 1976. Liposomas-amiloglicosida glicognesis
.- Terapa antifngica: Anfotericina B
.- Anticancerigenos: .- Anticancerigenos: Doxorubicina. Tripptido muramilOtros compuestos
.- Vacunas: malaria
.- Artritis intraarticular
-
Conclusiones
.- Los liposomas se pueden incorporar en formas farmacuticas.- Se han estandarizado mtodos analticops para caracterizarlos.- Se ha conseguido carga adecuada y retencin prolongada.- Se ha desarrollado adecuado equipo de manufactura.- Ha habido gran avance en el desarrollo de liposomas de larga circulacin.- Se han producido vacunas.- Se han empleado en terapia gnica.- Se est estudiando su uso para liberacin de proteinas
.- Campo multidisciplinario Mayores logros
-
De Oliveira, MC. Dubernet, C. Paternostre, M. Fattal, E. Ollivon, M. et al. pH-sensitive liposomes as a carrier for oligonucleotides (ODN): development of a new methodology to follow physicochemical changes along with pH of native and ODN loaded liposomes. S.T.P. Pharma Sciences. 11(1): p 103-107. 2001.
Monem, AS. Ali, FM. Ismail, MW. Prolonged effect of liposomes encapsulating pilocarpine HCl in normal and glaucomatous rabbits. International Journal of Pharmaceutics. 198(Mar 30): p 29-38. 2000
Hattori, Y. Kawakami, S. Yamashita, F. Hashida, M. Controlled biodistribution of galactosylated liposomes and incorporated probucol in biodistribution of galactosylated liposomes and incorporated probucol in hepatocyte selective drug targeting. Journal of Controlled Release. 69(Dec 3): p 369-377. 2000.
Pavelic, Z. Skalko-Basnet, N. Jalsenjak, I. Liposomes containing drugs for treatment of vaginal infections. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 8(4): p 345-351. 1999
Lambros, MP. Schaffer, F. Blackstock, R. Murphy, JW. Liposomes, a potential immunoadjuvant and carrier for a cryptococcal vaccine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 87(Sep): p 1144-1148. 1998.
-
NIOSOMAS
Vesculas formadas principalmente por Ts no inicos
Presentan mayor estabilidad que los liposomas
Ts usados: poliglicerol alquil-teres, glucosil alquil-teres, teres alquil-teres, teres corona y polioxietilen alquil-teres y steres
Se introducen ts cargados para aumentar la estabilidad
% colesterol
-
Tensoactivos y Consideraciones geomtricas
steres: .- Se degradan en presencia de esterasas en trigliceridos y cidos grasos..- Son menos txicos que los teres
-
.- Gran importancia del rea interfacial (A) por molcula de tensoactivo
A > 3Vc / lc
Vc = volumen del hidrocarbonolc = Mxima longitud alcanzable del hidrocarbono
Micelas esfricas
A > 2Vc / lc Micelas en barraA > 2Vc / lc Micelas en barra
A > Vc / lc Vesculas
Al aumentar la concentracin de tensoactivos:.- Vesculas Capas.- Micelas en barra Fase hexagonal.- Micelas esfricas Fase hexagonal o
cbica
-
Formacin de vesculas
Tensoactivo EO3 EO5 EO7
C10 + - -
C12 + - -
C14 + + -
C16 + sep. fase + lig.viscosa + viscosa
C16EO3 , C18EO3, C16EO5 y C18EO5 : Gel a temperatura ambiente, desestabilizan la suspensin
C10EO5 y C12EO5: cabezas hidroflicas voluminosas
Solucin: colesterol
C16 + sep. fase + lig.viscosa + viscosa
C18 + sep fase + sep. fase - lig. viscosa
-
Transiciones gel-lquido
FluorometraFluidez depende de: Grupo hidroflico
Longitud de la cadena alqulicaContenido de colesterol
Parmetros:Dw: refleja la mobilidad de las cadenas alqulicasc: grado de orientacin de las cadenas
-
Preparacin de vesculas
Mtodos
1.- M. De inyeccin de ter: se disuelven los ts en dietil-eter y se inyectan lentamente a 60C en la fase acuosa.
LUV Presencia de ter
2.- M. De agitacin manual: se disuelven los ts en dietil-eter, se evapora con rotavapor y se hidrata a 50-60C con agua.se evapora con rotavapor y se hidrata a 50-60C con agua.
LUV
3.- Sonicacin: Se adiciona ts en agua y se sonica. SUV. > 100nm
4.- M. De Handjami-Vila: Se mezclan ts y activo en agua, se homogeniza por homogeneizacin o ultracentrifugacin
-
5.- Evaporacin en fase reversa: Se disuelve el ts en una mezcla de cloroformo-buffer fosfatos, se sonica y se evapora con rotavapor. Se forma un gel, se hidrata y se contina la evaporacin.
T > 60 C: SUV LMV > 1m
Agitacin: LMV SUV
Eficacia de atrapamiento
.- Depende del mtodo de preparacin
.- Inyeccin de ter > agitacin manual
.- > [colesterol] > atrapamiento
.- > longitud de cadena > atrapamiento
.- > carga > atrapamiento
-
Toxicidad
Disminucin de la frecuencia del ritmo cliliar de la traquea:
Niosomas en estado gel < txicos que cristal lquido
Proliferacin de queratinocitos
steres < txicos que teres steres < txicos que teres (Degradacin enzimtica)
-
Aplicaciones teraputicas
Administracin intravenosa
Doxorubicina: Niosomas de C16G3 con y sin colesterol, 800-1000 nm, mtodo de agitacin manual.
Disolucin de frmaco
Niosomas
Estiboglucinato de sodio: (leishmaniasis).
Distribucin del frmaco segn la composicin del vehculo y comparado con su administracin sin vehculo
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Administracin oral
Metotrexato
47.5:47.5:5
60:30:5C16G3 + colesterol + dicetilfosfato
Mtodo de agitacin manual + sonicacin, 100nm
> Concentracin en hgado, cerebro y sangre que el metotrexato solo.
No diferencias entre los dos tipos de niosomas
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Administracin transdrmica
Se evita efecto de primer paso
Lenta velocidad de penetracin. Estrato corneo es la barrera
Comparacin C18EO3 (gel) con C12EO3 (cristal lquido)Comparacin C18EO3 (gel) con C12EO3 (cristal lquido)
> Flujo de estradiol en cristal lquido
Penetracin individual de los componentes o de las vesculas
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1 2
3
Niosomas de estradiol a diferentes tiempos, despus de su administracin en piel(estrato corneo)
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Hu, C. Rhodes, DG. Proniosomes: novel drug carrier preparation. International Journal of Pharmaceutics. 185(Aug 5): p 23-35. 1999.
Carter, KC. Dolan, TF. Alexander, J. Baillie, AJ. McColgan, C. Visceral leishmaniasis: drug carrier system characteristics and the ability to clear parasites from the liver, spleen and bone marrow in Leishmania parasites from the liver, spleen and bone marrow in Leishmania donovani infected BALB/c mice. Journal of Pharmacy & Pharmacology. 41(Feb): p 87-91. 1989
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NANOPARTCULAS
-
Partculas coloidales slidas en el rango de tamaos 10 - 1000 nm
Estn hechas de material macromolecular en el cual el frmaco est disuelto, atrapado o encapsdulado y al cual puede ser adsorbido o unido.
Polmeros biodegradables
Tamao de partcula < de 4 m (dimetro de los capilares)
Eleccin de polmero, tamao y mtodo de preparacin
Bioaceptabilidad del polmeroPropiedades fisicoqumicasMeta teraputica
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Mtodos de preparacin
Polimerizacin en emulsin
.- Se disuelve el monmero en un disolvente por medio de un ts.
.- Se polimeriza Th de polimerizacin en gotasTh de polimerizacin en micelasTh de polimerizacin en micelasTh de polimerizacin en disolvente
.- Precipitacin
PM: 1000 Da polialquilcianoacrilato4 x 105 Da Polimetilmetacrilato
Tamao: 100 nm Densidad: 1 g/cm3
1 particula: 1000 5 x 105 macromolculas
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Polimerizacin en una fase acuosa continua
Polimetilmetacrilato
.- Se biodegradan muy lentamente (respuesta inmune deseada, vacunas)
.- Metilmetacrilato (monmero) S = 1.5%
.- Radiacin de alta energa (R-) (El PM dp de la [monmero])
.- Iniciacin qumica (peroxodisulfato de amonio o de potasio) + calor.- Iniciacin qumica (peroxodisulfato de amonio o de potasio) + calor(PM aumenta con la [monmero]) y disminuye con el aumento de temperatura y la [iniciador]
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Tamao de partcula (nm)
Concentracin de metil metacrilato (mM)
10 33.7 80 156.25
65 85 65 85 65 85 65 85
Peroxodisulfato de potasio (mM)
65 85 65 85 65 85 65 85
0.3 85 72 129 128 181 170 256 2621.65 98 88 151 169 212 193 248 2483.0 92 72 135 149 223 177 250 258
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Polialquilcianoacrilato
.- Son degradadas rpidamente (se eliminan del cuerpo en pocos das)
.- Solubilidad = 0.05-7%
(Agitacin constante para mantener disperso el monmero en agua)
.- Polimerizacin inicia con bases (-OH- del agua o frmacos)
y finaliza con H+. Nanopartculas pequeas
Aglomeracin(estabilizantes)
Difcil predecir tamao de partcula
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HO- + CH2=CCN
CO2RHO-CH2-C-
CN
CO2RPolimerizacin
HO CH2-C CH2-C-H+
HO-CH2-C H
CN CN CN
n+1
HO CH2-C CH2-C
CO2R nCO2R CO2R
Fin de la polimerizacin
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Copolmeros acrlicos
.- Se usaron los siguientes monmeros: metilmetacrilato, 2 hidroxietil metacrilato, cido metacrlico, etilenglicol dimetil acrilato, acrilamida, N,N dimetilenacrilamida.
.- Irradiacin gama o iniciacin qumica
Poliestireno
.- No biodegradable
60-360 nm
.- Poco soluble Uso de tensoactivos
Polivinilpiridina
.- Polimerizacin en mezclas agua/metanol o agua/acetona
.- Disoluciones con agentes de entrecruzamiento (Poli-oxido de etileno o NN bis-metilenacrilamida)
.- El tamao de partcula dp de [monmero] y cantidad de disolvente orgnico. (160-250 nm)
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Poliacroleina
.- Activacin por R- o por condiciones bsicas (NaOH)
.- El tamao se controla con el tipo y concentracin de tensoactivo (40-8000nm)
Poliglutaraldehido
.- Policondensacin aldlica o monmero de glutaraldehido a pH alcalino.
.- El tamao de partcula se controla con la concentracin de monmero (a <
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Polimerizacin en emulsin en una fase orgnica continua
.- Se uso para polialquilacrilatos y polialquilcianoacrilatos
.- Se disuelven los monmeros en fase orgnica o en fase acuosa y con tensoactivos se incorporan en fase orgnica.
.- Se obtienen nanocpsulas (a veces): el frmaco se disuelve en la fase acuosa y se adicionan ts para hacer una emulsin a la cual se le adiciona el monmero que migra a la gota y polimeriza rpidamente en medio bsico, dejando en el interior polimeriza rpidamente en medio bsico, dejando en el interior una disolucin acuosa separada del medio por una capa polimrica
Polimerizacin interfacial
.- Se consiguen nanocpsulas
Poli (Na,Ne-l-lisinadiiltereftaloil)
.- Se aplica una diferencia de potencial entre ambas fases y cuando este reduce la ts interfacial a cero hay emulsificacin
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Polialquilcianoacrilato
.- Se adiciona monmero y frmaco en la fase oleosa y se aaden lentamente a una fase acuosa con tensoactivos.
.- El contacto con los OH-, inician la polimerizacin y se forman las nanocpsulas
Deposicin de disolvente
.- Se disuelve el polmero y un ts en acetona
.- Se le adiciona el frmaco y se pone la mezcla en agua con ts.
.- Evaporacin de la acetona y parcial eliminacin del agua
.- Formacin de nanocpsulas
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Evaporacin de disolvente
.- Se disuelve el polmero y el frmaco en un medio orgnico.
.- Se emulsifica en agua
.- Se evapora por calor o bajas presiones
.- El tamao de partcula depende del tamao de la gota
Velocidad de agitacin, tipo y cantidad de ts, la viscosidad de los medios y la temperatura
Ejemplos: cido polilctico, poli (-hidroxibutirato), chitosan
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Desolvatacin desde una disolucin orgnica de polmeros
(Nanopartculas poliacrlicas)
.- Se adicionan los polmeros, copolmeros y frmaco en un disolvente orgnico miscible con el agua.
.- Se adicionan al agua
.- Se observa formacin de nanopartculas (90-205 nm) y gran eficacia de atrapamiento.
Emulsin oleosa (Nanoparticulas de albumina)
.- Se disuelve el frmaco y el polmero en agua y se emulsiona en una fase oleosa.
.- Las gotas pueden ser endurecidas por entrecruzamiento con aldehidos o por desnaturalizacin a altas temperaturas.
.- Si gelatina, la desnaturalizacin se da a bajas temperaturas
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Unin de frmacos a nanopartculas
.- Las nanopartculas se pueden producir en presencia del frmaco o adsorberlo despus a las nanopartculas vacias.
.- Si est presente:Acoplamiento covalente al polmeroFormacin de una dispersin o disolucin slida
.- Si se adiciona despus:Unin covalenteAdsorcin: en superficie o formacin de dispersin slida
Tipo de unin:Diferente mecanismo y velocidad de liberacin
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Caracterizacin de nanopartculas
1.- Fisicoqumica
Parmetro Mtodo
Tamao de partcula Espectrometra de correlacin fotnicaMicroscopa electrnica de transmisinMicroscopa electrnica de barrido (SEM)SEM combinada con espectrometra de energa dispersiva de Rayos-X
Peso Molecular Cromatografa en gel
Densidad Picnometra de compresin de helio
Cristalinidad Difraccin de Rayos-XCristalinidad Difraccin de Rayos-XCalorimetra de barrido diferencial
Carga superficial ElectroforesisAnemometra laser Dopler
Hidrofobicidad Cromatografa de interaccin hidrofbicaMedidas de ngulo de contacto
Propiedades de superficie Espectrometra de masas de iones secundarios estticos
Anlisis de elementos en la superficie ESCA (Espectroscopia fotoelectrnica de Rayos-X para anlisis qumico
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2.- Anlisis de carga de frmaco
.- Separacin de las partculas por ultracentrifugacin o ultrafiltracin.
.- Disolucin de las nanopartculas
.- Cuantificacin
(Puede resultar una cuantificacin erronea)
.- Filtracin por gel.- Filtracin por gel
(Puede haber liberacin del frmaco)
3.- Degradacin de las nanopartculas
.- Erosin del polmero
.- Ruptura del ster formando un cido polimrico soluble
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Degradacin de nanopartculas de albmina
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4.- Liberacin de frmacos
.- Puede ocurrir por:
1.-Desorcin de la superficie
2.-Difusin a travs de la matriz
3.-Difusin a travs de la
.- Se mide:
1.- Celdas de difusin
2.- Tcnicas de dilisis
3.- Ultracentrifugacin3.-Difusin a travs de la pared
4.-Erosin de la matriz
5.- Proceso combinado de erosin-difusin
4.- Ultrafiltracin
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Aplicaciones de las nanopartculas
Citostticos
Antiinfecciosos
Pptidos
Administracin peroralAdministracin peroral
Administracin oftlmica
Antiinflamatorios
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Nanotubos de carbn
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Nanopartculas de 5 nm, ejem: anticuerpos
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Arangoa, MA. Ponchel, G. Orecchioni, AM. Renedo, MJ. Irache, JM. et al. Bioadhesive potential of gliadin nanoparticulate systems. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 11(4): p 333-341. 2000
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MICROPARTCULAS
Partculas pequeas, del orden de micras, que sirven paraTransportar frmacos.
.- Microesferas: micropartculas que contienen el frmaco disperso o disuelto en la matriz polimrica
.- Microcpsulas: micropartculas que mantienen el frmaco en su interior y estn rodeadas por una capapolimrica
Pueden ser preparadas a partir de diferentes materiales y sus caractersticas fsicas dependern del uso que se pretende. La eleccin del material depende de:
.- Frmaco
.- Destino
.- Enfermedad
.- Duracin de accin
.- Toxicidad de la materia prima
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Preparacin
La tcnica utilizada va a depender de:.- Naturaleza del material
.- Naturaleza del frmaco
.- Tamao deseado
.- Especificaciones de carga y liberacin.- Especificaciones de carga y liberacin
Generalidades:.- Polimerizacin de monmeros
.- Precipitacin por reemplazamiento del disolvente
.- Dispersin del material por homogeneizacin-emulsificacin
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Aceite de oliva
muy puroDisolucin acuosa de
albmina ms el frmaco
Agitar en frascos
ajustados con aspas
Emulsin
aceite-agua
Entrecruzado con
glutaraldehido 1-5%
Microesferas qumicamente
estabilizadas
Calor
100-160 C
Microesferas
estabilizadas por calor
-
Disolucin acuosa de
estabilizante en 0.01 N de
HCl ms el frmaco
Monmero de alquilcianoacrilato
adicionado gota a gota Formacin del polmero al
agitar 2 h a temperatura
ambiente
Nanopartculas de
polialquilcianoacrilato en suspensin
Ajuste de pH,
filtrado y
liofilizacin
polialquilcianoacrilato en suspensin
Nanopartculas de
polialquilcianoacrilato en polvo
-
Polihidroxibutirato en
disolvente orgnico
Surfactante en disolucin
acuosa
Sonicacin
Evaporacin del
Emulsin agua en aceite
Evaporacin del
disolvente
Microesferas de PHB en suspensin
filtrado y liofilizacin
Microesferas de PHB en polvo
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Micropartculas de polibutil-2-cianoacrilato por SEM
-
Carga y liberacin de frmacos
Para que las micropartculas sean efectivas deben de:
.- Llevar suficiente carga de frmaco
.- Liberarlo segn un perfil de tiempo determinado
Incorporacin:
.- Durante el proceso de manufacturaAlta eficacia de carga y liberacin lenta
.- Posterior a la manufacturaBaja eficacia de carga y liberacin rpida
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Problemtica: Efecto burst = liberacin de la carga en los estadios iniciales de la administracin
Soluciones:.- Entrecruzamiento de la matriz polimrica.- Recubrimiento con polmeros.- Unin covalente entre el polmero y el frmaco
Posibles mecanismos de liberacin:.- Difusin.- Desorcin.- Erosin.- Biodegradacin.- Combinacin de todos ellos
Importancia en ladistribucin delfrmaco en el organismo
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Usos en teraputica
.- Evitar la accin del organismo sobre el frmaco(degradacin) o evitar la accin del frmaco sobre elorganismo (toxicidad).
.- Liberacin controlada: aplicacin nasal y ocular, etc.
.- Especificidad de accin.- Especificidad de accinAntineoplsicos
Artritis reumatoide (Liberacin compartimental)
Liberacin en el pulmn
-
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ANTICUERPOS
.- El uso de anticuerpos especficos como vehculos hace que el frmaco se encuentre en > proporcin en el lugar de accin y en menor concentracin a nivel sistmico.
.- Tcnicas para obtencin de anticuerpos: hibridoma
.- Unin frmaco-Anticuerpo
CovalenteNo covalente
Prdida de actividad o disminucin de la misma, as como problemas de paso de membranas
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ELECCIN DE ANTICUERPOS
.- Debe ser altamente especfico
.- Poseer gran afinidad para unirse con las clulas correspondientes
.- Fciles de preparar
.- Ac monoclonales: si hay modificacin de su actividad, su .- Ac monoclonales: si hay modificacin de su actividad, su eficiencia va a bajar
.- Ac policlonales: mayor actividad hacia diferentes antgenos
ELECCIN DE FRMACOS
.-El frmaco debe de tener un grupo funcional al cual se pueda unir el anticuerpo, sin prdida de actividad farmacolgica.
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CONJUGACIN CON FRMACOS
.- Normalmente se usa una molcula de unin para conseguir la interaccin del frmaco con el anticuerpo.
Dextrano: .- Es barato, no degradable, muy soluble, no txico.- Se le adicionan grupos funcionales para poder servir
como puentecomo puenteDextrano + NaIO4Dextrano + hidrazida
cido poli-glutmico.- No es txico
Oxidacin (-CHO)
D-hidrazida
PG-hidrazidaPG + hidrazida
(-COOH)
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Ejemplos:
.- Conjugados de daunomicina y adriamicina
Unin va dextrano oxidado a Ac monoclonales y policlonales contra AFP de rata (-fetoproteina segregada por clulas hepticas cancerosas)
Tanto frmaco como Ac mantienen su actividadTanto frmaco como Ac mantienen su actividad
.- Conjugados de cis-platino
Buscar en la red, poner alguna otra cita sobre anticuerpos como vehculos
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.- Tsunoda, S. Tsutsumi, Y. Nakagawa, S. Mayumi, T. Targeting therapy using a monoclonal antibody against tumor vascular endothelium. Yakugaku Zasshi - Journal of the Pharmaceutical Society of Japan. 120(Mar): p 256-264. 2000. AN: 38-05408.- Panpitpat, C. Thisyakorn, U. Chotpitayasunondh, T. Furer, E. Cryz, SJ. et al. Elevated levels of maternal antitetanus toxin antibodies do not suppress the immune response to a Haemophilus influenzae type b polyribosylphosphate-tetanus toxoid conjugate vaccine. Bulletin of the World Health Organization. 78(3): p 364-371. 2000.World Health Organization. 78(3): p 364-371. 2000..- Lundberg, BB. Griffiths, G. Hansen, HJ. Conjugation of an anti B cell lymphoma monoclonal antibody, LL2, to long circulating drug carrier lipid emulsions. Journal of Pharmacy & Pharmacology. 51(Oct): p 1099-1105. 1999..- Rehlaender, BN. Cho, MJ. Antibodies as carrier proteins. Pharmaceutical Research. 15(Nov): p 1652-1656. 1998..- Normand-Sdiqui, N. Akhtar, S. Oligonucleotide delivery: uptake of rat transferrin receptor antibody (OX-26) conjugates into an in vitro immortalized cell line model of the blood-brain barrier. International Journal of Pharmaceutics. 163(Mar 18): p 63-71. 1998.
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CLULAS ROJAS
Pueden ser abiertas y reselladas para introducir molculas y no sufren variaciones en su estructura.
Son especficas para clulas eritrofagocitarias ejem: enfermedad de Gaucher (glucocerebsidos)
Su comportamiento en circulacin es idntico que el de GR sin modificar.GR sin modificar.
La liberacin del frmaco se dar por:Solubilidad lipdicaTransporte por difusin facilidad o t. Activo
Sistemas de liberacin controlada: depende de la concentracin alcanzada en plasma segn su velocidad de liberacin
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PROCEDIMIENTOS DE CARGADO
1.- Ruptura reversible de la membrana por fuerzas osmticas
.- Dilucin del medio externo = hipotonicidad[NaCl] = 0.55% - 0.33% (100% lisis)Clulas jovenes + resistentesClulas venosas lisan antes que arterialesGhost: lavado antes de resellar
.- DilisisSe colocan las clulas en una bolsa de dilisis frente a un medio hipotnico
.- Dilucin pre-hinchamientoSe suspenden en un medio hipotnico (no se rompen, solo se hinchan) y luego se rompen con lamnima cantidad de medio hipotnico (GR cas integro en su contenido intracelular)
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2.- Aumento de la permeabilidad de la membrana mediantevoltaje (pulso elctrico)
Se puede controlar nmero y tamao de poros en el GR.Se pueden producir clulas anormales que son eliminadas por el SER (pulsos excesivos).
.- Procedimiento iso-inicoAdicin de penetrantes (glicol)
3.- Fusin con otras clulasSi el frmaco est en el interior, pasar al citoplasmadel GR.Si el frmaco est en la membrana, quedar en la membrana del GR.
4.- EndocitosisVacuolas en el citoplasma. Si es hipertnico hay shock osmtico y el frmaco queda libre.
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RESELLADO
Medio hipotnico: claro
Medio isotnico: turbio
Eritrocitos abiertos
Eritrocitos resellados
Medio hipotnico
+ sales+ sales
Medio isotnico
Incubacin a 37 C por 30-60 min
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PROPIEDADES DE ERITROCITOS RESELLADOS
1.-Prdida de la [componentes citoplasticos] normal
2.- Unin de Ac a los GR
3.- Dao qumico de la membrana
4. Alteraciones en los lpidos de membrana4. Alteraciones en los lpidos de membrana
Ejem: Si 1mM de Ca2+ es presente durante la lisis, se pierde la asimetra normal de los fosfolpidos.
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USOS TERAPUTICOS
.- Liberacin de frmacos a clulas fagocitariasEjem: leishmaniasis Formicina A
.- Vehculo para enzimas y proteinas
.- Liberacin prologada de frmacosEjem: Artritis CorticosteroidesEjem: Artritis Corticosteroides
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TERAPIA GNICA
Es la introduccin de material exgeno (natural orecombinante) en sujetos humanos para corregirdeficiencias celulares expresadas en el nivel fenotpico."
Es una estrategia teraputica basada en la modificacindel repertorio gentico de clulas somticas mediante ladel repertorio gentico de clulas somticas mediante laadministracin de cidos nucleicos y destinada a curartanto enfermedades de origen hereditario como adquirido.
Es la transferencia de material gentico nuevo a clulasde un individuo dando lugar a un beneficio terapeticopara el mismo.
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Aos 70s:
.- Se desarrolla la tecnologa de clonacin de genes
.- Surge el concepto de la transferencia de informacingentica como un utensilio para la prctica clnica
(Sin la capacidad de aislar y replicar secuenciasgenticas definidas, sera imposible producir materialpurificado para uso clnico)
La terapia gnica se presenta como una promesa terapetica de utilidad en todo tipo de patologas.
Terapia gnica:.- Avances del conocimiento en Biologa Molecular,
Gentica , Virologa, Bioqumica, y Biofsica entre otras.
purificado para uso clnico)
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Primera meta para este tipo de terapia:
.- los desordenes genticos.
Fin de la manipulacin gentica:
.- En pacientes con defectos genticos simples, tales como la hemofilia, lo nico que se requiere es una fbrica de protenas para producir suficiente factor de fbrica de protenas para producir suficiente factor de coagulacin circulante para ser efectivo fisiolgicamente.
.- En enfermedades como el cncer es necesario, inicialmente, conseguir especificidad hacia las clulas malignas, ya que deberan usarse sistemas teraputicos que no requieran el tratamiento posterior de defectos somticos resultantes como reacciones adversas.
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Problemas:
Dificultad de liberar los genes en el lugar adecuado y controlar su expresin
Solucin:
Se consideran diferentes tipos de vehculos que sean capaces de acarrear el material gentico a su lugar de accin. A esos vehculos se les conoce como vectores.de accin. A esos vehculos se les conoce como vectores.
Puede llevar a una serie de riesgos potenciales ( insercin de mutagnesis que puede degenerar en cncer y viremia)
Paso limitante:
Eficiencia de la transferencia gnica y duracin de la expresin del gen teraputico.
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Los factores a considerar en un vector:.- Eficacia de la transferencia del gen.- Duracin de la expresin del gen.- Capacidad para repartir la dosificacin.- Capacidad para dirigirse a las clulas apropiadas
y evitar las inapropiadas.
Los factores desconcertantes que puedan aparecer:.- Incluyen la incapacidad del vector para entrar o
integrarse en los cromosomas celularesintegrarse en los cromosomas celulares.- El cierre de los promotores transcripcionales, .- La prdida del ADN introducido.- La destruccin de las clulas tratadas .- La neutralizacin del vector insertado o del
producto gnico.
Eleccin del vector
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MTODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES
1.- Retrovirus
2.- Adenovirus
3.- Virus adeno-asociados
4.- Otros virus4.- Otros virus
5.- Sistemas no virales5.1. Transferencia gnica mediada por receptores5.2. DNA desnudo5.3. Partculas de DNA condensadas5.4. Inyeccin libre de agujas5.5. Electroporacin5.6. Bombardeo de partculas5.7. Liposomas
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DISEO DE VECTORES
Los vectores vricos estn hechos al menos de dos componentes: el genoma vrico modificado y la estructura del virin que lo rodea.
Se debe discapacitar el crecimiento del virus en las clulas diana mientras se mantiene su capacidad para desarrollarse en forma de vector.en forma de vector.
De esta forma, podemos considerar que los cidos nucleicos del vector comprenden dos elementos: esas secuencias vricas esenciales que permanecen y la unidad de transcripcin para el gen exgeno.
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Pelcula de funcionamiento de los vectores
Funcionamiento de los vectoresFuncionamiento de los vectores
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1.- Retrovirus
Son los vectores ms ampliamente usados
Son derivados del virus de la leucemia murina Moloney
Ventajas:.- Integra el DNA en el anfitrin, sin aparente patogeneidad..- Pueden alcanzarse de moderados a altos tters.- Pueden alcanzarse de moderados a altos tters.- Pueden ser infectadas un amplio rango de clulas.- Se pueden insertar en el vector genes grandes
Inconvenientes:.-Se requiere divisin celular para integrarse.-Sus titers son bajos comparados con virus DNA (adenovirus y herpex virus)
.- Se inserta en el genoma aleatoriamente, pudiendo causar mutaciones.
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Los retrovirus:
.- contienen ARN de cadena sencilla como genoma viral
.- el ARN vrico se transcribe a la inversa para producir ADN de cadena doble (gracias a la accin del enzima reversotranscriptasa)
.- el ADN que se integra en el genoma de la clula .- el ADN que se integra en el genoma de la clula hospedadora se expresa en perodos prolongados. Resultado, las clulas infectadas vierten virus de forma constante sin dao aparente en la clula hospedadora. El genoma viral es pequeo (aproximadamente 10 kilobases) y comprende tres genes que codifican:
La mayora de los retrovirus se pueden integrar slo en clulas que se replican (uso resringido)
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Ciclo vitalEntrada del retrovirus en la clula: .- El virus encuentra una clula con una molcula de superficie llamada CD4. .- Una o mas de las molculas GP120 del virus, se unen fuertemente a las molculas de CD4 en la superficie celular. .- Las membranas del virus y de la clula se unen.- Tras la fusin, el RNA del virus, las protenas y enzimas son liberadas al interior de la clula.
Transcripcin inversa: La transcriptasa inversa del VIH convierte el RNA Transcripcin inversa: La transcriptasa inversa del VIH convierte el RNA viral en DNA, forma en que estn los genes de la clula husped.
Integracin: El DNA recin hecho del virus, entra en el ncleo de la clula, donde ser insertado en el DNA husped con la ayuda de la integrasa del virus (provirus).
Transcripcin: Fabricacin de nuevas partculas virales.
Traduccin: Sintesis de las protenas estructurales
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Ensamblaje y salida: Las protenas nucleares recin sintetizadas, los enzimas y el RNA se agrupan en el interior de la membrana celular, mientras las protenas de la envuelta viral se van agregando. Se forma una partcula viral inmadura y sale de la clula, adquiriendo una cubierta que incluye tanto protenas celulares como vricas. Durante esta parte de del ciclo, el virus todava no es infeccioso. Las largas cadenas de protenas y enzimas son digeridas en pequeos segmentos por una enzima llamada proteasa. Tras este paso ya tenemos partculas infectivas.
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2.- Adenovirus
Los adenovirus comprenden una gran clase de virus no desarrollados que contienen ADN lineal de cadena doble.El genoma del adenovirus es ms grande ( sobre 35 kilobases ), y su organizacin es ms compleja que la de retrovirus.
Las principales ventajas:.- son capaces de transferir el gen episomal de forma .- son capaces de transferir el gen episomal de forma eficiente en una amplia cantidad de clulas y tejidos.- son fciles de producir en grandes cantidades
La principal desventaja:es que la respuesta del hospedador al virus parece limitar la duracin de la expresin y la capacidad de repetir la dosis, al menos con altas dosis de vectores de primera generacin.
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3.- Virus adeno-asociados
El AAV es un virus muy pequeo, muy simple, no autnomo, que contiene ADN lineal de cadena sencilla. El virus requiere la coinfeccin con adenovirus u otros para replicarse.
La organizacin del genoma es extremadamente simple, comprendiendo slo dos genes:comprendiendo slo dos genes:
La ventaja potencial:
capaz de una expresin a largo plazo en clulas que no se dividen,
Su principal limitacin:son difciles de desarrollar en grandes cantidades
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4.- Otros virus
HERPESVIRUS
El virus presenta un material gentico compuesto por ADN bicatenario lineal de 100 a 250 Kb.
El potencial de estos virus como vectores gnicos:
.- la habilidad de llevar grandes secuencias de ADN extrao insertadas
.- su habilidad para establecer infecciones latentes de larga duracin en las cuales el genoma del virus existe como un episoma con efectos no aparentes en la clula hospedadora .
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5.- Sistemas no virales
Ventajas:
.- Flexibles con respecto al tamao de DNA a transportar.
.- Bajos costos.- Bajos costos
.- Gran seguridad
.- Facilidad para ensamblar el material de transferencia (reacciones qumicas)
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5.1. Transferencia gnica mediada por receptores
.- Se transplanta al transportador de los ligantes, unas molculas que sern reconocidas por los receptores presentes en el tipo celular elegido (azcares, pptidos, hormonas, etc.)
.- Son capaces de sustituir por una interaccin transportador/clula muy especfica, la no especfica debida a las cargas inicas.
.- Endocitosis : El interior del endosoma se acidifica progresivamente y luego se fusiona con otra clase de vescula llamada lisosoma (lo luego se fusiona con otra clase de vescula llamada lisosoma (lo evaden por unas molculas llamadas fusiogenas) .
.-El ADN penetra en el ncleo durante la divisin celular, cuando se rompe la envoltura nuclear.
.- En las clulas en reposo solo pasan, por difusin (< 9 nm). 9- 25 nm. pueden penetrar en el ncleo valindose de los poros de la membrana nuclear.
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5.2. DNA desnudo
Por este mtodo el ADN o ARN puro circular y cerrado covalentemente es directamente inyectado dentro del tejido deseado.
As el mtodo de inyeccin de ADN directamente es simple, econmico, y un procedimiento que no es txico comparado con la entrega mediante virus. con la entrega mediante virus.
El potencial para llevar largas construcciones de ADN es tambin ventajoso.
Los niveles y persistencia de la expresin de genes es probablemente demasiado corta (das) .
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5.3. Partculas de DNA condensadas
Se condensa DNA con polmeros catinicos por medio de Interacciones electrostticas.
Se protege el DNA de la degradacin
Polmeros usados: Polilisina, polietilen imina y oligopptidos
Uso principalmente in vitro
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5.4. Electroporacin
.- Aplicacin de un campo elctrico sobre la membrana dela clula meta.
.- Ruptura de la membrana y entrada del DNA al citoplasma
.- Usos in vitro
.- rea novedosa in vivo
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5.5. Bombardeo de partculas
.- Dos equipos:
.- Basado en He a alta presin
.- Basado en lquidos a alta presin
.- Mtodo efectivo de transferir genes tanto in vitro como in
vivo .
.- El plsmido de ADN es primero revestido sobre su superficie de gotas de 1 a 3 micras de dimetro de oro o tungsteno. Estas partculas son aceleradas por una descarga elctrica de un aparato o por un pulso de gas y son " disparadas" hacia el tejido.
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.- Un acercamiento menos invasivo es por el bombardeo directo de partculas en la piel.
.- Se supera la barrera de la membrana celular. Sin embargo, caractersticas de rigidez de los diferentes tejidos, la procedencia del ADN extrao, y la capacidad de transcripcin intrnseca conducen a grandes variaciones en transcripcin intrnseca conducen a grandes variaciones en la eficiencia de la expresin de los genes en conjunto.
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5.7. Liposomas
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MOLECULAR MEDICINE TODAY,
JULY 1999 (VOL. 5); Gene therapy
using HVJ-liposomes: the best of both
worlds?; Yasufumi Kaneda, Yoshinaga Saeki and Ryuichi MorishitaMorishita
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Liposomas catinicos
.- ADN (carga negativa) + lpidos catinicos (+)
.- Lpidos catinicos (+) + la superficie celular (una red de cargas negativas debido a los residuos del cido silico).
.- Vector catinico/ ADN tienden a agregarse: 50 a 150 nm
.- Condensacin controlada del ADN
.- Formacin de partculas que encerrarn una sola molcula de ADN. (20 nm)
.- Paso a los compartimentos vasculares, as como la penetracin en las clulas y su ncleo..
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Lpidos monocatinicos:
.- DOTMA (N(1-(2,3-dioleyloxy)-propyl)-NNN-trimethylammonium chloride).
.-Pptidos policatinicos de segunda generacin como DOPSA (2,3-dioleyloxy-N-(2(sperminecarboxamido) ethyl)-NN-dymethyl-1-propanaminium trifluoroacetate)
Resultado:
Captura del 100% de los complejos estables de polinucletidos, y por atraccin de cargas y por propiedades de fusin, los lpidos pueden absorberse a la membrana celular y entregar el cido nucleico directamente dentro del citoplasma, evitando la ruta de degradacin lisosomal.
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ESTRATEGIAS TERAPUTICAS
Estrategias in vitro
.- obtencin previa de clulas del paciente procedentes de un tejido u rgano de inters.
.- disgregacin de las mismas y su mantenimiento en condiciones de cultivo de tejidos in vitro
.- transfeccin por el " gen teraputico" utilizando para ello un vector adecuado.
.- Las clulas son amplificadas y recolectadas con el fin de ser reimplantadas al paciente..
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Estrategias in vivo
.- administracin sistemtica de la construccin gnica de inters.
.-Vector que facilite el proceso de transferencia del gen y permita la entrada y localizacin intracelular del mismo, de tal forma que ste resulte en un gen funcionante.
.- Es importante recurrir a vectores con destinos especficos dentro del organismo lo cual permite la entrega celular selectiva del gen en un determinado rgano o tejido, sin requerir para ello procedimientos traumticos o quirrgicos.
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TERAPIA GNICA IN VIVO O IN VITRO ?
La decisin depende de:
.- los rasgos fisiolgicos del tejido diana daado
.- la naturaleza del tejido con respecto a los genes que deben ser transferidos
.- la facilidad para transferir los genes dentro de las clulas
.- la habilidad para llegar hasta ese tejido diana
.- su respuesta frente al mtodo de transfeccin, etc.
Errores in vitro-in vivo