sistemas de clonagem em eucariotos e procariotos · lise alcalina: obtenção de dna plasmidial....
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Sistemas de clonagem em eucariotos e procariotos
Profa. Dra. Irene Soares ([email protected])FCF/USP - 2010
Isolamento de DNA
Clonagem de DNA
Transformação pelo DNA
Seleção e análise derecombinantes
Expressão de proteínasrecombinantes
Purificação de proteínasrecombinantes
Aplicações da tecnologiado DNA recombinante
Ferramentas básicas
• Gene de interesse
• Célula hospedeira (bactérias)
• Vetores de clonagem e expressão
• DNA ligases
• Enzimas de restrição
• Aparato de eletroforese de DNA
• Sondas de DNA, Primers
• DNA genômico
• cDNA
• Produto de PCR
• Gene sintético
Podem ser utilizados para construção de Bibliotecas de DNA
Isolamento de DNA
Vetores de clonagem
• Plasmídios: fragmentos de até 10 Kb
• Fago lambda: fragmentos de 5-20 Kb
• Cosmídios: fragmentos de 20-50 Kb
• BAC (Bacterial Artificial Chromosomes): 100-500 Kb
• YAC (Yeast Artificial Chromosomes): 100 Kb – 1Mb
De 1.000 até 20.000 pares de bases
Gene que codifica resistência a antibiótico
Origem de replicação
DNAexógeno
PlasmídioscomerciaispUCpGEMpMOS
Regiãopromotora
Componentes de um plasmídio
Sítio de Clonagem
DNA genômico, cDNA,Produto de PCR, Gene sintético
Sítio de Clonagem(polilinker)
Plasmídio para clonagem de produtos de PCR
Ligação
Plasmídio linearizadoDNA ligase
Plasmídios recombinantesDNA cromossômico
Gene a se clonado
Transferência do plasmídio para uma linhagem de bactéria
Métodos de Transformação pelo DNA
Tratamento comCloreto ou Fosfato de Cálcio
Transformaçãodireta por eletroporação
Bactérias(Escherichia coli)
Incubação no gelo
Choque térmico (42ºC)
E. coli competente
+ DNA plasmidial
Métodos de seleção de recombinantes(bactérias transformadas)
Bactérias: Baseado na resistência a antibiótico
BactériaSEM DNA plasmidial
BactériaCOM DNA plasmidial
Plasmídioreligado
(sem inserto)
Plasmídiocom inserto
IPTG + X-gal
Seleção azul e branca
Gene lacZ
Inserto
Colônias brancas
Não há expressão da -galactosidase
Gene lacZ
Colônias azuis
Expressão da-galactosidase
Seleção com sondas de DNA
Cultura bacteriana: E. coli contendo o plasmídioFase estacionária (overnight)
Lise alcalina:
Obtenção de DNA plasmidial
Enzima Sítio de restrição Fonte
EcoRI G AATT C Escherichia coli RY13C TTAA G
NcoI C CATG G Nocardia corallinaG GTAC C
XbaI T CTAG A Xantomonas badriiAGATC T
SmaI CCC GGG Serratia marcescensGGG CCC
Análise de restrição
3 - OH
5 - fosfato
3 - OH
5 - fosfato
Gel de agarose
Eletroforese em gel de agarosecorado com brometo de etídeo
(exposto a luz UV)
Eletroforese em gel de agarose
HindIII
Plasmídionão digerido
Plasmídio
Inserto
(-)
ATGAGGGCATCCATCTTTCTCGCTCTTGCCATTCTCGTTATTACCGTTGTCGCTGCCCCTACCGATGATAAGGGACCTGAGGATCTGAAG90
TACTCCCGTAGGTAGAAAGAGCGAGAACGGTAAGAGCAATAATGGCAACAGCGACGGGGATGGCTACTATTCCCTGGACTCCTAGACTTC
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Mapeamento de restrição
TG40
G G G G TA C A TG50
C T C T C A C G T G60
T T G CT GCAG T70
C A T G G C A T C C80
C G C A A A C A C A90
Sequenciamento do DNA
Bactérias, levedurasou baculovirus
Produção doantígeno in vitro
Transformação
Purificação
Expressão de proteínas recombinantes
Sistemas heterólogos de expressão
• Bactérias: Escherichia coli
• Leveduras: Sacharomyces cerevisiae,
Pichia pastoris
• Células de inseto (infectadas com baculovirus)
• Células de mamíferos
• Plantas
• Animais
Elementos genéticos essenciais em um vetor de expressão
Vetores indutíveis por IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)
Na ausência de IPTG Na presença de IPTG
Operon Lac
Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em fusão com GST
Promotor Lac:Expressão em bactéria na presença de IPTG
Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em fusão com His-tag
• Bactéria: Escherichia coli (diversas linhagens)• Vantagens: fácil manipulação, rápido crescimento,
alto rendimento de proteínas e baixo custo• Otimização da expressão:
- Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperaturade indução
- Utilização de cepas de bactérias códon plus
Expressão de proteínas recombinantesem bactérias
Considerações gerais:
• Desvantagens:Formação de corpos de inclusão proteínas insolúveis e não funcionais- Solubilização - “Refolding” de proteínas
• Proteínas de fusão- Melhoram a solubilidade- Facilitam a purificação
Expressão de proteínas recombinantesem bactérias
Considerações gerais:
Proteínas solúveis
Corpos de inclusão
Cultura de bactérias (E. coli)
Indução com IPTGFase log: DO=0,4-0,6nm
Lise(cong./descong., sonicação, French press)
Purificação
Expressão da Proteína recombinante
Avaliar em SDS-PAGE: extrato total, precipitado e sobrenadante
Padronizar: Tempo, temperatura,curva-dose resposta de IPTG
Eletroforese de proteínas emgel de poliacrilamida
PM 1 2 3
116,0
66,2
45,0
35,0
25,0
18,4
Análise da expressão da proteína recombinante em SDS-PAGE
1. Extrato total (lisado bacteriano)2. Sobrenadante 3. Precipitado (corpos de inclusão)
Métodos de detecção de clones recombinantes
• Reconhecimento por anticorpos específicos
(ou anti-GST, anti-His)
• Função da proteína (ensaio enzimático)
• Seleção por PCR
Métodos de purificação de proteínas recombinantes
• Afinidade• Troca iônica• Fase reversa• Gel filtração
Extrato bacteriano
1ª. Etapa de purificação
Etapas de purificação de proteínas recombinantes
Etapa final depurificação
Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em leveduras
(Pichia pastoris)
• Leveduras: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris
• Otimização da expressão:
- Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperaturade indução
- Otimização do códon: mutagênese
• Vantagens (Pichia pastoris): altos níveis de expressão, modificações pós-traducionais (glicosilação, pontes dissulfeto), secreção da proteína
Considerações gerais:
Expressão de proteínas recombinantes em leveduras
Aplicações da tecnologiado DNA recombinante: terapêutica
- Hormônio de crescimento humano e bovino (somatotrofina);- Insulina humana;- Calcitonina;- LH-RH- Somatostatina;- Gonadotrofina coriônica (HCG) e sérica (PMSG);- LH - Hormônio luteinizante bovino e suíno;- FSH – Hormônio folículo estimulante humano e bovino;- IGF-I (Fator de crescimento insulina dependente);- Interferon alfa, Interferon beta e Interferon gama -Toxina Botulinica;- Eritropoietina;- Glucagon- Fatores de coagulação: VIII e IX
Aplicações da tecnologiado DNA recombinante: diagnóstico laboratorial
- HIV, HCV, HBV, HEV, HTLV, EBV, CMV, Rubéola
- H. pylori, Mycobacterium tuberculosis, Treponema
pallidum, Chlamydia
- Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi
Antígeno S
Purificação
Levedura
Vetor Vacina
Gene Ag S
Proteína
Aplicações da tecnologiado DNA recombinante: vacinas
Hepatite B
Pichia pastoris ouHansenula polymorpha
Aplicações da tecnologiado DNA recombinante: vacinas
Engerix-B SmithKline Beecham/US
Recombivax HB Merck/USA
GenHevac B Pasteur/France
Instituto Butantan
Aplicações da tecnologiado DNA recombinante: vacinas
Os subtipos 16 e 18 estão implicados como causa de 70% dos cânceres de colo de útero
HPV HPV
Dept. of ImmunologyWalter Reed Army Institute of ResearchWashington, DC