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Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF Curso de Graduação em Medicina Disciplina: Microbiologia Docente: César Augusto Discentes: Carla Larissa Felipe Diego Juliana Conduru Lucas Torres Roberta Magalhães

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Page 1: Slides de Microbiologia

Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF

Curso de Graduação em MedicinaDisciplina: MicrobiologiaDocente: César Augusto

Discentes:

Carla Larissa

Felipe Diego

Juliana Conduru

Lucas Torres

Roberta Magalhães

Page 2: Slides de Microbiologia

TESTES SOROLÓGICOS

Page 3: Slides de Microbiologia

TESTES SOROLÓGICOS

• O que medem?

• Os Ac dirigidos contra antígenos microbianos específicos.

• A maioria consiste em ensaios em fase sólida.

• Objetivo da reação sorológica:

+

AGAG ACAC

Page 4: Slides de Microbiologia

ELISA ELISA

Page 5: Slides de Microbiologia

ELISA

ENZIME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY (enzimaimunoensaio)

Técnica de imunoensaio in vitro.PRINCIPIO BÁSICO: imobilização de um dos

reagentes em uma fase sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação da atividade enzimática e imunológica do anticorpo.

Page 6: Slides de Microbiologia

ELISA

Suporte sólido

Suporte sólido

Placas de microtitulação

Tubos

Poliestireno

Identifica e quantifica Ag ou Ac presente na amostra;

Page 7: Slides de Microbiologia

ELISA

Ag purificado;Ac purificado;Placa de poliestireno;Tampão de lavagem.Cromógeno.

Leitora de Elisa;

Elementos necessários:

Page 8: Slides de Microbiologia

ELISA

o INDIRETO: detecta Aco DIRETO OU SANDUICHE: detecta Ago COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo

peso molecular;o CAPTURA: detecta Acs (principalmente

IgM)

TIPOS:

Page 9: Slides de Microbiologia

.Lavagem para retirada de Ag livre:

.Lavagem para retirada de Ac não fixado:

.Adição do conjugado:

.Adição de soro-teste: (1) e (2) ELISA indireto

1. O Ag é add á placa e se adere à superficie dos poços.

Page 10: Slides de Microbiologia

.Lavagem para retirada de conjugado livre

.Adição de substrato e cromógeno que é ativado pela parte enzimática

do conjugado

.Positivo .Negativo

Page 11: Slides de Microbiologia

Aplicações do Elisa indireto:Exemplos : diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDSAplicações do Elisa indireto:Exemplos : diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS

Cont. negativo

Cut-off

Cont. positivo

Page 12: Slides de Microbiologia

ELISA sanduíche 1. Um Ac é add á placa e se

liga à sua superficie.

2. Lavagens são feitas para retirar os anticorpos livres.

3. Adição de solução-teste com Ag a ser pesquisado, e este, caso presente, se liga aos Ac nos poços.

4. Lavagem para retirada

do Ag não capturado

5. Adição de outro Ac marcado, nova lavagem e revelação

Page 13: Slides de Microbiologia

Aplicação do Elisa sanduíche

• Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos, nas fezes, na urina em secreções etc.

• Exemplos na medicina: Teste de gravidez (teste de detecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro.

Page 14: Slides de Microbiologia

ELISA por competição

1. Adição do Ac especifico aos micropoços da placa.

2. Lavagem para retirar os Ac livres

4. Lavagem para retirada de Ag não capturados.

3. Adição de Ag-teste:

Adição de Ag-marcado:

Competição para ligar Ac

Aplicação:

Na dosagem de hormônios, marcadores tumorais e ou-tras proteínas séricas. Nodiagnóstico sorológico de algumas doenças como SIDA/AIDS

Aplicação:

Na dosagem de hormônios, marcadores tumorais e ou-tras proteínas séricas. Nodiagnóstico sorológico de algumas doenças como SIDA/AIDS

5. Adição do substrato e do cromógeno. Caso o conjugado tenha se ligado aos Ac, ocorrera reação enzimática e o cromogeno será oxidado, havendo desenvolvimento de cor.

Quanto maior a quantidade de antigeno-teste, < a possibilidade de ligação do Ag marcado e < a intensidade de cor emitida.

Quanto maior a quantidade de antigeno-teste, < a possibilidade de ligação do Ag marcado e < a intensidade de cor emitida.

Page 15: Slides de Microbiologia

ELISA de Captura

Pesquisa de IgM humana contra T.gondii:T.gondii:

-Poço revestido com IgG monoclonal contra IgM

humano

-Adição da amostra (contendo IgM)

-Lavagem para retirar o anticorpo não capturado

-Adição de Ag especifico marcado com enzimamarcado com enzima

-Lavagem

Page 16: Slides de Microbiologia

-Adição de cromógeno ( )

-Revelação: leitura em fotocolorímetro.

Utilização do ELISA captura:

Detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antígenos , em todas as doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento, como por exemplo na rubéola, toxoplasmose ou citomegalia da gestante.

Utilização do ELISA captura:

Detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antígenos , em todas as doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento, como por exemplo na rubéola, toxoplasmose ou citomegalia da gestante.

Infecções na fase aguda.

Page 17: Slides de Microbiologia

ELISA

• Alta sensibilidade Menor risco de falsos-negativos;

• Alta especificidade Menor risco de falso-positivo;

• Várias amostras simultaneamente;

• Rápido, simples, custo baixo a médio;

Vantagens:

Page 18: Slides de Microbiologia

ELISA

• Mão de obra especializada;

• Degradação de reagentes;

• Erros de pipetagem;

Desvantagens:

Page 19: Slides de Microbiologia

SDS - PAGESDS - PAGEEletroforese em gel de

poliacrilamida

Page 20: Slides de Microbiologia

SDS - PAGE

• SDS-PAGE é a abreviatura de dodecil-sulfato de sódio (SDS) de poliacrilamida (PAGE).

• É um método muito utilizado para a análise de massas moleculares de proteínas.

Page 21: Slides de Microbiologia

• As proteínas são misturadas ao detergente SDS, cuja função é desnaturar as proteínas e converte-las numa estrutura linear. O SDS, também, confere carga negativa às proteínas.

SDS - PAGE

Page 22: Slides de Microbiologia

SDS - PAGE

• As proteínas são aplicadas no topo de um gel de poliacrilamida.

• São submetidas a uma corrente elétrica, fazendo com que elas migrem através da malha de acrilamida em direção ao pólo positivo.

Page 23: Slides de Microbiologia

SDS - PAGE

• As proteínas menores migrarão mais rapidamente, enquanto que as maiores terão mais dificuldade em atravessar a malha do gel e, assim, se moverão mais lentamente.

Page 24: Slides de Microbiologia

SDS - PAGE

Page 25: Slides de Microbiologia

WESTERN BLOTWESTERN BLOT

Page 26: Slides de Microbiologia

WESTERN BLOT

• Western Blot é um método usado para detectar uma certa proteína em uma amostra, usando anticorpo específico para aquela proteína. Além disso, esta técnica também dá informação acerca do tamanho da proteína.

• Eletroforese de proteínas.• Identifica antígenos ou anticorpos.

Page 27: Slides de Microbiologia

WESTERN BLOT

Serve como teste confirmatório dos resultados obtidos em testes imunoenzimaticos.

Page 28: Slides de Microbiologia

WESTERN BLOT

Método de execução de Western Blot:Método de execução de Western Blot:

Page 29: Slides de Microbiologia

WESTERN BLOT

Page 30: Slides de Microbiologia

WESTERN BLOT

Técnica:

1) Preparo das amostras e eletroforese em gel (SDS-PAGE)

Page 31: Slides de Microbiologia

WESTERN BLOT

Técnica:

2) Transferência para a membrana (nitrocelulose ou PVDF)

Page 32: Slides de Microbiologia

WESTERN BLOT

Técnica:

3) Bloqueio da membrana e incubação com ac primário:

4) Incubação com ac secundário acoplado ao sistema de revelação:

Page 33: Slides de Microbiologia

WESTERN BLOT

Técnica:• A revelação pode ser feita com um substrato

colorimétrico (ex: TMB), que produzirá uma banda colorida.

• A revelação pode ser feita com um substrato quimioluminescente (ex. ECL), que produzirá uma banda colorida

Page 34: Slides de Microbiologia

WESTERN BLOT

Resumo:

Page 35: Slides de Microbiologia

Aplicação em diagnósticos médicos:

• A técnica western blot tem sua aplicação muito importante em diagnósticos médicos, o qual ajuda na detecção dos anticorpos, produzidos por nós, de varias doenças, como por exemplo a AIDS, a doença da Vaca Louca e outras.

WESTERN BLOT

Page 36: Slides de Microbiologia

Conclusão:

• O Western Blot é o exame mais especifico para a detecção de proteínas virais.

• Esse método utiliza eletroforese em gel para obter o resultado esperado.

• Ele é muito utilizado em testes imunoenzimáticos.• Utilizado em exames confirmatórios de doenças,

como a doença da vaca louca e doença de Lyme.• A técnica Western Blot foi e é para a medicina um

grande avanço, pois através deste podemos dizer com precisão resultados de doenças como a AIDS entre outras.

WESTERN BLOT

Page 37: Slides de Microbiologia

AGLUTINAÇÃOAGLUTINAÇÃO

Page 38: Slides de Microbiologia

AGLUTINAÇÃO

• Consiste na formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contém determinados antígenos em sua superfície.

Page 39: Slides de Microbiologia

Dois estágios:

1º - Ag + Ac

2º - Agregados

• Começam concomitantemente• Um demora mais que o outro

AGLUTINAÇÃO

1º 2º

Page 40: Slides de Microbiologia

AGLUTINAÇÃO

Pode ocorrer com partículas:

• Naturais; • Inertes;

De acordo com o tipo de partícula são classificadas:

• Aglutinação direta;• Aglutinação indireta.

Page 41: Slides de Microbiologia

AGLUTINAÇÃO

• Sensibilidade;

• Concentração de anticorpos.

Fatores que interferem na formação de agregados:

• Tipo de anticorpo;

• Temperatura;

• pH;

• Enzimas.

Page 42: Slides de Microbiologia

AGLUTINAÇÃO

Aplicação:• Diagnóstico laboratorial de doenças:

- Virais;- Bacterianas;- Auto-imunes;- Hormonais;

• Tipagem sanguínea.

Page 43: Slides de Microbiologia

• Utilizam-se partículas antigênicas insolúveis na sua forma íntegra ou fragmentada.

• Hemácias: tipagem de grupos sanguíneos ABO e Rh.

• Bactérias, espiroquetas, protozoários: teste de Widal (salmoneloses), teste de Wright (brucelose), teste de Weil-Felix (Rickettiose), teste de aglutinação para leptospirose, toxoplasmose e tripanossomíase.

Page 44: Slides de Microbiologia

Teste de inibição de hemaglutinação direta• Capacidade que certos antígenos têm de,

espontaneamente, aglutinarem certos tipos de hemácias.

Anticorpos + partículas virais = inibição

• Útil para detectar Ac contra o vírus da rubéola, do sarampo, da influenza, dentre outros.

Page 45: Slides de Microbiologia

As hemácias ou partículas inertes podem se sensibilizar por:

• Adsorção passiva;• Adsorção via agentes químicos;• Conjugação do antígeno.

Devido à grande variedade de antígenos que podem ligar-se à células ou partículas, sua aplicação é bem variada.

Page 46: Slides de Microbiologia

Teste de hemaglutinação passiva

• Após a sensibilização das hemácias com a concentração adequada de antígenos, são suspensas em solução estabilizadora, para evitar reações inespecíficas sem diminuir a capacidade de aglutinação específica.

Page 47: Slides de Microbiologia

Teste em placas:

• Pequena quantidade de reagente;• + : formação de tapete em “V”• - : sedimentação em “botão”

Page 48: Slides de Microbiologia

Teste de inibição da hemaglutinação passiva

• Sensível e específico na detecção de pequenas quantidades de antígenos solúveis ou anticorpos que competem com a substância homóloga com que a hemácia foi sensibilizada.

Depende:

• Concentração do antígeno;• Afinidade pelos sítios de ligação de combinação.

Page 49: Slides de Microbiologia

• Especificidade;

• Pouca quantidade de antígeno;

Aplicação:• Detecção de antígenos na hepatite e hemofilia.

Page 50: Slides de Microbiologia

AGLUTINAÇÃO

Teste de aglutinação do látex:• O látex é utilizado como suporte na adsorção de

proteína solúvel e antígenos polissacarídicos, funcionando como sistema indicador da reação Ag + Ac.

Aplicação:• Pesquisa de Ag ou Ac;• Fator reumatóide (Ac IgM).

Page 51: Slides de Microbiologia

Detecção do fator reumatóide:

• Ac IgG adsorvidos às partículas de látex;

• Reação com o fator reumatóide;

• Aglutinação;

AGLUTINAÇÃO

Page 52: Slides de Microbiologia

CITOMETRIA DE FLUXOCITOMETRIA DE FLUXO

Page 53: Slides de Microbiologia

CITOMETRIA DE FLUXO

• Técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo.

Page 54: Slides de Microbiologia

CITOMETRIA DE FLUXO

Tecidos pesquisados:• Sangue• Urina• Exsudatos• Bile• Lavado brônquico • Fezes• Biopsias

Page 55: Slides de Microbiologia

CITOMETRIA DE FLUXO

A técnica:• As células e outras partículas passam por um feixe de

luz de único comprimento de onda, geralmente um laser, e dispersam essa luz em comprimentos diferentes a depender da morfologia da célula. Detectores localizados em frente ao feixe (Forward Scatter, FSC) e perpendiculares a ele (Side Scatter, SSC) identificam os diferentes comprimentos de onda e os transmitem para computadores para digitalização das informações.

Page 56: Slides de Microbiologia
Page 57: Slides de Microbiologia
Page 58: Slides de Microbiologia

CITOMETRIA DE FLUXO

Page 59: Slides de Microbiologia

• É possível identificar antígenos virais dentro e sobre a superfície de células infectadas e detectar ácidos nucléicos virais.

• Detecta-se também imunoglobulinas específicas, caracterizando o micróbio. Utiliza-se adição de microesferas que se ligam ao antígeno do micro-organismo e de fluorocromos aos anticorpos.

CITOMETRIA DE FLUXO

Diagnóstico:

Page 60: Slides de Microbiologia

• HIV• Vírus sincicial respiratório • Trypanosoma cruzi • Leishmania chagasi • Mycobacterium tuberculosis • Cryptosporidium hominis e C. parvum

CITOMETRIA DE FLUXO

Diagnóstico:

Page 61: Slides de Microbiologia

REFERÊNCIAS

FERREIRA, Antonio Walter; ÁVILA, Sandra do Lago Moraes de. Diagnóstico laboratorial: avaliação de métodos de diagnóstico das principais doenças infecciosas e parasitárias e auto-imunes. correlação clínico-laboratorial. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. 443 p. ISBN 8527706296

http://www.ufrgs.br/leo/eletroforese/policrilamida.htm, acesso em 14 de novembro de 2012

http://imunologiahematologia.wordpress.com/2010/06/14/sds-page, acesso em 14 de novembro de 2012

http://www.youtube.com/watch?v=J5qPKK0GGDo acesso em 19 de novembro de 2012.