slr0192 synechocystis sp. pcc 6803

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Zagreb, 2006. godina

Sunčica Bosak

Istraživanje funkcije gena slr0192

cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803

Diplomski rad

Ovaj rad, izrađen u Laboratoriju za elektronsku mikroskopiju,

Zavoda za molekularnu biologiju Instituta Ruđer Bošković u Zagrebu,

pod vodstvom doc. dr. sc. Hrvoja Fulgosija,

predan je na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta

Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja dipl. ing. biologije, smjer ekologija.

U grčkoj mitologiji postoji bog koji se zove Kairos. Simbolizira dobru priliku. To je

dugokosi mladić koji brzo protrči pokraj nas i moramo ga brzo zgrabiti za kosu ili će nam

nepovratno umaći, kao i dobra prilika koju simbolizira!

Da bi uspješno privela kraju svoj diplomski rad i te kako sam morala vježbati

«povlačenje kose u trku» u raznim prilikama.

Na uspješnom treningu mogu zahvaliti

mom mentoru doc.dr.sc. Hrvoju Fulgosiju koji mi je pružio priliku da dotrčim što kraćim

putem do samostalnosti. Njegovi korisni savjeti u pravom trenutku pomogli su mi da svoje

ideje provedem u djelo i uspješno dođem do cilja.

Zahvaljujem LJ.L.O. (Ljubaznom laboratorijskom osoblju) Laboratorija za elektronsku

mikroskopiju Instituta Ruđer Bošković (Snježani, Tihani, Morani, Kroati), svim ljudima, na

Institutu Ruđer Bošković i Biološkom odsjeku Prirodoslovno matematičkog fakulteta koji su

mi pomagali korisnim savjetima da u što kraćem roku pretrčim zadane rute bez suvišnog

zamaranja.

Svojoj mami koja je uvijek bila tu kad treba i na njezinoj nezamjenjivoj pomoći pri uređenju

teksta

te mojem dečku Marku koji je vrlo često trčao zajedno sa mnom i koji mi je bio velika

podrška.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Diplomski rad

Istraživanje funkcije gena slr0192

cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803

Sunčica Bosak

Institut Ruđer Bošković, Bijenička cesta 54, Zagreb U genomu cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803 identificiran je gen slr0192 koji kodira za hipotetski protein od 12 kDa. Analizom aminokiselinskog slijeda utvrđena je sličnost s funkcionalnim rodanaznim domenama iz drugih organizama. Cilj ovog rada je karakterizacija potencijalne rodanaze i određivanje njezine uloge in vivo u cijanobakteriji Synechocystis sp. U tu svrhu konstruiran je metodom insercijske inaktivacije mutantni soj s nefunkcionalnim genom slr0192. Uspješnost transformacije i potpune segregacije potvrđena je lančanom reakcijom polimerazom i metodom hibridizacije po Southernu. Namjera je bila utvrditi utjecaj nedostatka odgovarajućeg proteina na fiziologiju organizma usporedbom divljeg tipa i ∆slr0192 mutantnog soja analizom fotoautotrofnih krivulja rasta, elektronske mikroskopije stanica te snimanjem apsorpcijskog spektra i autofluorescencije klorofila. Utvrđena je i rodanazna aktivnost u sirovom staničnom proteinskom ekstraktu. Pokusi nisu pokazali značajnu razliku između divljeg i mutantnog tipa u normalnim uvjetima. Potencijalna uloga istraživana je i u uvjetima nedostatka sumpora. Primijećena je razlika u fenotipu, ali definiranje točne funkcije ostaje predmet budućih istraživanja. Raspravlja se o mogućoj ulozi slr0192 u metabolizmu sumpora.

(78 stranica, 26 slika, 6 tablica, 49 literaturna navoda, jezik izvornika: hrvatski) Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: Synechocystis sp. PCC 6803 / slr0192 / rodanaze / insercijska inaktivacija /

metabolizam sumpora / elektronska mikroskopija Voditelj: Dr. sc. Hrvoje Fulgosi, doc. Ocjenitelji: Dr. sc. Mirjana Kalafatić, prof. Dr. sc. Hrvoje Fulgosi, doc. Dr. sc. Mirjana Pavlica, izv. prof. Dr. sc. Mladen Krajačić, izv. prof. Zamjena: Dr. sc. Anđelka Plenković-Moraj, prof. Rad prihvaćen: 8. ožujka 2006.

BASIC DOCUMENTATION CARD University of Zagreb Faculty of Science Department of Biology Graduation Thesis

Investigation of slr0192 gene function

in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803

Sunčica Bosak

Ruđer Bošković Institute, Bijenička cesta 54, Zagreb In cyanobacterial genome of Synechocystis sp. PCC 6803 gene slr0192 that encodes putative 12 kDa protein has been identified. Sequence analysis showed similarity to the rhodanese-like domains from other organisms. The subject of this work has been the characterization of a potential rhodanese and the determination of its function in vivo in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. For that purpose the mutant strain with a disrupted gene slr0192 has been constructed by method of an insertional gene inactivation. Southern blot and polymerase chain reaction analysis showed that the mutant had completely segregated. The aim was to define the influence of the matching protein on the physiology of an organism by comparing mutant and wild type strains. Analysis of photoautotrophic growth curves, electron microscopy of the cells, apsorption spectra and chlorophyll autofluorescence did not show any significant difference between wild type strain and ∆slr0192 mutant under normal conditions. Rhodanese activities were obtained for crude enzyme extract of cyanobacterial cells. Potential role has been also examined under conditions of sulfur deprivation. Some difference in phenotype was noticed, but elucidating slr0192 exact role requires a further investigation. The possible role of gene product in sulfur metabolism of cyanobacteria is discussed.

(78 pages, 26 figures, 6 tables, 49 references, original in: Croatian language) Thesis deposited in Central biological library Key words: Synechocystis sp. PCC 6803 / slr0192 / rhodanese / insertional inactivation /

sulfur metabolism / electron microscopy Supervisor: Dr. Hrvoje Fulgosi, Asst. Prof. Reviewers: Dr. sc. Mirjana Kalafatić, Prof. Dr. Hrvoje Fulgosi, Asst. Prof. Dr. sc. Mirjana Pavlica, Assoc. Prof. Dr. sc. Mladen Krajačić, Assoc. Prof. Replacement: Dr. sc. Anđelka Plenković-Moraj, Prof. Thesis accepted: 8th March 2006

SADRŽAJ

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

BASIC DOCUMENTATION CARD

POPIS KRATICA

1. UVOD ....................................................................................................................................1

1.1. Fotosinteza ........................................................................................................................2

1.1.1. Raznolikost fotosintetskih organizama .................................................................2

1.1.2. Tijek svjetlosnih reakcija fotosinteze....................................................................6

1.2. Endosimbioza....................................................................................................................7

1.3. Synechocystis sp. PCC 6803 ...........................................................................................10

1.3.1. Cyanobacteria (= Cyanophyta)............................................................................10

1.3.2. Značajke cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803 kao modelnog organizma ............................................................................................................11

1.4. Sumporne transferaze – rodanaze ...................................................................................14

1.4.1. Općenito o rodanazama.......................................................................................14

1.4.2. Proteini s jednom rodanaznom domenom...........................................................16

1.4.2. Cijanobakterijska rodanaza slr0192 ....................................................................17

1.5. Cilj istraživanja ...............................................................................................................18

2. MATERIJALI I METODE ...............................................................................................19

2.1. Pokusni organizam i eksperimentalni uvjeti uzgoja........................................................20

2.1.1. Glicerinska kultura Synechocystis sp. PCC 6803................................................21

2.2. Kompjuterska analiza aminokiselinskog slijeda gena slr0192 .......................................23

2.3. Konstrukcija vektora za transformaciju pBsc0192K ......................................................24

2.4. Transformacija cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803 .........................................27

2.5. Provjera mutantnog genotipa ∆slr0192 Synechocystis sp. PCC 6803 ............................28

2.5.1. Izolacija DNA cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803 ..............................28

2.5.1.1. Lančana reakcija polimerazom cijanobakterijskih kolonija („colony PCR“) .......................................................................................28

2.5.1.2. Izolacija genomske DNA iz cijanobakterijskih kultura na pločama .......29

2.5.1.3. Izolacija genomske DNA iz cijanobakterijskih tekućih kultura..............30

2.5.2. Lančana rekcija polimerazom .............................................................................31

2.5.3. Elektroforetsko razdvajanje DNA molekula u agaroznom gelu .........................34

2.5.4. Metoda hibridizacije po Southern-u („Southern blotting“).................................35

2.5.4.1. Elektroforetsko razdvajanje u agaroznom gelu .......................................36

2.5.4.2. Inverzni prijenos fragmenata DNA iz gela na membranu.......................36

2.5.4.3. Obilježavanje DNA sonde digoksigeninom ............................................38

2.5.4.4. Test za provjeru obilježenosti DNA sonde digoksigeninom...................39

2.5.4.5. Hibridizacija ............................................................................................40

2.5.4.6. Detekcija..................................................................................................41

2.5.4.7. Uklanjanje DNA sonde s membrane .......................................................42

2.6. Osnovna fenotipska karakterizacija divljeg tipa i mutante ∆slr0192 Synechocystis sp. PCC 6803 ........................................................................................................................43

2.6.1. Fotoautotrofne krivulje rasta ...............................................................................43

2.6.2. Ekstrakcija proteina i određivanje rodanazne aktivnosti.....................................44

2.6.2.1. Ekstrakcija staničnih proteina..................................................................44

2.6.2.2. Određivanje rodanazne aktivnosti ...........................................................44

2.6.3. Snimanje apsorpcijskog spektra i autofluorescencije klorofila...........................46

2.6.4. Elektronska mikroskopija....................................................................................46

3. REZULTATI.......................................................................................................................48

3.1. Analiza aminokiselinskog slijeda slr0192 ......................................................................49

3.1.1. Homologija slr0192 i reprezentativnih rodanaza ................................................49

3.1.2. Analiza proteina s rodanaznom domenom iz Synechocystis sp. PCC 6803........50

3.2. Transformacija cijanobakterija........................................................................................52

3.3. Provjera mutantnog genotipa ∆slr0192 Synechocystis sp. PCC 6803 ............................54

3.3.1. Lančana rekcija polimerazom .............................................................................54

3.3.2. Metoda hibridizacije po Southernu .....................................................................55

3.4. Fotoautotrofne krivulje rasta ...........................................................................................58

3.5. Rodanazna aktivnost .......................................................................................................59

3.6. Apsorpcijski spektar stanica i autofluorescencija klorofila ............................................60

3.7. Elektronska mikroskopija................................................................................................62

3.8. Makroskopska opažanja preživljavanja stanica u kulturama bez dodatka sumpora u hranidbenoj podlozi.........................................................................................................64

4. RASPRAVA ........................................................................................................................66

4.1. Funkcija slr0192 kao sumporne transferaze - rodanaze..................................................67

4.2. Moguća uloga slr0192 u metabolizmu sumpora.............................................................69

5. ZAKLJUČAK .....................................................................................................................72

6. LITERATURA ...................................................................................................................74

POPIS KRATICA ADP adenozin difosfat

Arg arginin

ATP adenozin trifosfat

BLAST eng. basic local alignment search tool

bp eng. base pair ( broj parova baza)

CO2 ugljik(IV)-oksid

Cys cistein

dATP deoksiadenozin trifosfat

dCTP deoksicitidin trifosfat

deH2O destilirana voda

DDBJ DNA Data Bank of Japan

DNA eng. deoxyribonucleic acid (deoksiribonukleinska kiselina)

dGTP deoksigvanozin trifosfat

dNTP deoksiribonukleozid trifosfat

dTTP deoksitimidin trifosfat

dUTP deoksiuridin trifosfat

EDTA etilendiamintetraoctena kiselina

EMBL European Molecular Biology Laboratory

Gly glicin

H2 vodik

H2S sumporovodik

NAD+ nikotinamid adenin dinukleotid (oksidirana forma)

NADH nikotinamid adenin dinukleotid (reducirana forma)

NADP+ nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (oksidirana forma)

NADPH nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (reducirana forma)

NaOH natrijev hidroksid

O2 kisik

OD eng. optical density (optička gustoća)

ORF eng. open reading frame (otvoreni okvir čitanja)

pI izoelektrična točka

PS I fotosustav I

PS II fotosustav II

reH2O redestilirana voda

RNAza enzim ribonukleaza

RT eng. room temperature (sobna temperatura)

SDS natrijev dodecil-sulfat

sp. lat. species (vrsta)

TAE tris-acetatni-EDTA pufer

Tris 2-amino-2-(hidroksimetil)–1,3-propandiol

wt eng. wild type (divlji tip)

1. UVOD

1. Uvod

2

1.1. Fotosinteza

Fotosinteza je fizikalno-kemijski proces u kojem biljke, alge i fotosintetske bakterije

energiju Sunčevog zračenja pretvaraju u energijom bogate organske spojeve. Biljke, alge i

neke vrste bakterija fiksiraju ugljik(IV)-oksid iz atmosfere upotrebljavajući ga za sintezu

ugljikohidrata i pritom otpuštaju molekularni kisik (oksigena fotosinteza). Drugi tipovi

bakterija koriste svjetlosnu energiju za sintezu organskih spojeva, ali ne proizvode kisik

(anoksigena fotosinteza) (Whitmarsh i Govindjee 1995).

1.1.1. Raznolikost fotosintetskih organizama

Živi svijet možemo podijeliti u tri domene Archaea, Bacteria i Eucarya, koje su

porijeklom od zajedničkog pretka (Woese i sur. 1990). Povijesno, pojam fotosinteza je

primijenjen na organizme u domeni Bacteria (fotosintetske bakterije) i Eucarya (alge i biljke)

koji ovise o bakterioklorofilu ili klorofilu za pretvorbu svjetlosne u kemijsku slobodnu

energiju. Domena Archaea uključuje organizme poznate kao „halobakterije“, ekstremno

halofilne organizme (npr. Halobacterium halobium) koje sadrže pigment bakteriorodopsin.

Archaea pretvaraju svjetlosnu energiju u kemijsku, no taj se mehanizam fundamentalno

razlikuje od onog drugih fotosintetskih organizama jer nema oksidacijsko-redukcijskih

reakcija te ne mogu upotrebljavati CO2 kao izvor ugljika (Whitmarsh i Govindjee 1995).

Fotosintetski anoksigeni organizmi

Neke fotosintetske bakterije mogu upotrebljavati svjetlosnu energiju za dobivanje

elektrona iz drugih molekula, a ne samo iz vode. Anoksigena fotosinteza se pojavljuje unutar

domene Bacteria i ima predstavnike u 4 grupe: proteobakterije (gram negativne), zelene

sumporne, zelene filamentozne i gram pozitivne bakterije. Anoksigene fotosintetske bakterije

razlikuju se od oksigenih organizama po tome što svaka vrsta ima samo jedan tip reakcijskog

centra (Olson i Blankenship 2004). U nekima je on sličan fotosustavu I, u drugom fotosustavu

II, no niti jedan od njih nije sposoban dobivati elektrone iz molekula vode pa kod tih

organizama nema produkcije kisika. Umjesto toga one oksidiraju anorganske ili organske

tvari dostupne u njihovom okolišu. Unatoč tome, osnovni principi prijenosa energije su

jednaki. U reakcijskom centru sadrže bakterioklorofil, molekulu koja apsorbira svjetlost blizu

infracrvenog dijela spektra, između 700 i 1000 nm valne duljine. Nosači elektrona uključuju

kinone i citokrom b/c kompleks, a konačni produkt svjetlosnih reakcija su molekule ATP-a

nastale cikličkom fotofosforilacijom i NADH.

1. Uvod

3

Purpurne bakterije spadaju u gram negativne proteobakterije i dijele se na nesumporne

(npr. Rhodopseudomonas viridis) i sumporne (npr. Chromatium vinosum). Nesumporne

purpurne bakterije upotrebljavaju organske izvore elektrona kao što su malat ili sukcinat te

molekularni vodik (H2). Sumporne bakterije upotrebljavaju anorganski izvor elektrona kao što

je H2S. Reakcijski centar purpurnih bakterija sliči reakcijskom centru fotosustava II viših

biljaka. Molekule ATP-a nastale cikličkom fotofosforilacijom daju energiju za prijenos

elektrona od donora do molekule NADH.

Zelene sumporne bakterije (npr. Chlorobium thiosulfatophilum) mogu upotrebljavati

sumporne spojeve kao donore elektrona i organske donore vodika. Reakcijski centar im je

sličan reakcijskom centru fotosustava I i može reducirati NAD+ (NADP+) u NADH

(NADPH). Posjeduju klorosome, karakteristične antenske komplekse koji sadrže

bakterioklorofil i karotenoide te se nalaze na površini fotosintetskih membrana (slično

fikobilisomima kod cijanobakterija). Mogu fiksirati CO2 bez djelovanja enzima Rubisco

(ribuloza-1,5-difosfat-karboksilaza-oksigenaza) u obrnutom Krebsovom ciklusu.

Zelene filamentozne bakterije (npr. Chloroflexus aurantiacus) su pokretne, termofilne,

nesumporne bakterije koje također sadrže klorosome. Imaju sličan reakcijski centar

purpurnim bakterijama uz neke sitne razlike (sličan fotosustavu II viših biljaka). Čini se da

njihov mehanizam fiksiranja CO2 ne uključuje niti Calvinov niti obrnuti Krebsov ciklus.

Heliobakterije (npr. Heliobacterium mobilis) pripadaju u gram pozitivne bakterije.

Imaju sličan reakcijski centar fotosustavu I, no on sadrži drugi tip pigmenta od ostalih

bakterija, bakterioklorofil g.

Oksigeni fotosintetski organizmi

Proces fotosinteze u svim biljkama i algama, kao i u određenim tipovima fotosintetskih

bakterija, čine svjetlosne reakcije ili primarni procesi i reakcije u tami ili sekundarni procesi

(Calvinov ciklus). Svjetlosne reakcije odvijaju se u tilakoidnim membranama, a uključuju

fotolizu vode, linearni (neciklički) i ciklički tok elektrona. Svjetlosnim reakcijama nastaju O2

te NADPH i ATP koji služe kao donori elektrona, odnosno kao izvori energije za redukciju

CO2 u ugljikohidrate reakcijama u tami. U lipidni dvosloj tilakoidnih membrana uklopljeni su

proteinski kompleksi koji sudjeluju u prijenosu elektrona (Slika 1.).

1. Uvod

4

Ti integralni membranski kompleksi su:

• Fotosustav I (PS I) u čijem se reakcijskom središtu nalazi molekula klorofila a koja

maksimalno apsorbira tamnocrvenu svjetlost valne duljine 700 nm (P700). Tom je

fotosustavu pridružen LHCI (eng. light harvesting complex I), antenski kompleks

izgrađen od apoproteina koji vežu molekule klorofila a i b i molekule karotenoida.

Antenski kompleks prenosi svjetlosnu energiju do P700.

• Fotosustav II (PS II) u svom reakcijskom središtu sadrži molekulu klorofila a koja

maksimalno apsorbira crvenu svjetlost valne duljine 680 nm (P680). Tom je fotosustavu

pridružen LHCII (eng. light harvesting complex II) koji prenosi svjetlosnu energiju do

P680.

• Citokrom b6-f kompleks, koji povezuje PS I i PS II, izgrađuje ga osam ili devet različitih

polipeptidnih podjedinica s nekoliko prostetičkih grupa: citokrom f; citokrom b6, Rieske

željezo-sumporni protein, podjedinica IV, četiri mala polipeptida od 3,2 – 4,2 kDa.

Ponekad je kompleksu pridružen i deveti polipeptid (FNR) (Zhang i Cramer 2004).

• ATP-sintaza katalizira fosforilaciju molekula ADP-a u ATP koristeći energiju

pohranjenu u protonskom elektrokemijskom potencijalu tilakoidne membrane.

Cijanobakterije (Cyanophyta) su fotosintetski prokariotski organizmi koji proizvode

kisik. Glavna razlika njihovog fotosintetskog aparata i onog u kloroplastima je u sustavu

antena. Posjeduju specijalizirane proteinske komplekse fikobilisome (Slika 1.) koji su vezani

na stromalnoj strani fotosintetske membrane i djeluju tako da usmjeravaju pobudnu energiju

prema reakcijskom centru fotosustava II (Olson i Blankenship 2004). Oni predstavljaju

pomoćne antenalne komplekse koji apsorbiraju onaj dio spektra koji ne mogu karotenoidi i

klorofil a (zeleni dio, od 550 do 600 nm). Sastavljeni su od fikobiliproteina, proteinskih

podjedinica koje sadrže kovalentno vezane kromofore, strukture otvorenog prstena poznate

kao bilini. Razlikujemo plave fikobiline, fikocijanine (PC) koji maksimalno apsorbiraju pri

valnoj duljini svjetlosti od 625 do 630 nm i zajedno s klorofilom a daju cijanobakterijama

karakterističnu plavozelenu boju te alofikocijanine (AP) s maksimumom apsorpcije pri 650

nm. Neke cijanobakterije sadrže fikoeritrine (PE) i fikoeritrocijanine, crvene fikobiline koji

maksimalno apsorbiraju pri 570 do 580 nm. Prijenos pobudne energije zbiva se kroz seriju

fikobiliproteina s maksimumom apsorpcije na progresivno sve većim valnim duljinama

(PE → PC → AP → klorofil a). Cijanobakterije ne posjeduju klorofil b. Ostali biokemijski

procesi se zbivaju kao i u kloroplastima.

1. Uvod

5

Proklorofiti (Prochlorophyta) su prokarioti srodni cijanobakterijama koji ne posjeduju

fikobilisome, no imaju klorofil a i b. (Whitmarsh i Govindjee 1995).

Fotosintetski eukarioti (alge i biljke) posjeduju plastide (kloroplaste, rodoplaste,

feoplaste), stanične organele u kojima se odvija proces fotosinteze.

Slika 1. Shematski prikaz proteinskih kompleksa uključenih u svjetlosne reakcije fotosinteze. PS I:

fotosustav I; PS II: fotosustav II; PQ: plastokinon; PQH2: reducirani plastokinon; cit b6-f: citokrom b6-f

kompleks; FeS: željezo-sumporni protein; PC: plastocijanin; Fd: ferodoksin; FNR: ferodoksin-NADP+

reduktaza, fikobilisom: pomoćni antenski kompleks prisutan samo kod cijanobakterija i crvenih algi, AP:

alofikocijanin; PC: fikocijanin; PE: fikoeritrin. Strelicama su prikazane svjetlosne reakcije fotosinteze

opisane pod 1.1.2.

1. Uvod

6

1.1.2. Tijek svjetlosnih reakcija fotosinteze

Prvi potrebni korak za pretvorbu svjetlosne energije u kemijsku na tilakoidnim

membranama je pretvorba energije fotona svjetlosti u energiju pobuđenog stanja u antenskom

kompleksu koja će biti prenesena do reakcijskog centra. Primarni fotokemijski događaj je

prijenos elektrona iz pobuđenog reakcijskog središta P680 do akceptora elektrona, feofitina,

čime P680 prelazi u snažan oksidans, P680+. P680+ se reducira u stanje prije apsorpcije fotona

pomoću proteinskog kompleksa nazvanog OEC (eng. oxygen evolving complex), koji sadrži

4 atoma mangana. Ukupni rezultat fotolize vode na OEC je prijenos 4 elektrona do P680+,

otpuštanje protona u lumen tilakoida i oslobađanje O2. Elektron kojeg je prihvatila molekula

feofitina prenosi se na molekulu plastokinona QA trajno vezanu na polipeptid D2 fotosustava

II, koja ga potom predaje drugoj molekuli plastokinona, QB . Ta molekula ostaje vezana na

polipeptidu D1 fotosustava II sve dok se potpuno ne reducira, za što su potrebna dva elektrona

i dva protona. Potpuno reducirana molekula plastokinona QB, plastokinol, difundira u lipidni

matriks tilakoidne membrane i predaje elektrone citokrom b6-f kompleksu. Citokrom b6-f

kompleks predaje elektrone molekuli plastocijanina koja ga povezuje s PS I. Osim što služi

kao poveznica između dva fotosustava, taj kompleks ima važnu funkciju stvaranja

transmembranske pH razlike prijenosom H+ iona iz strome u lumen. Tako se stvara

elektrokemijski potencijal potreban ATP-sintazi za stvaranje molekula ATP-a. Prijenos

elektrona s reduciranog plastocijanina na P700+ omogućava reakcijskom središtu PS I da,

kada se ponovno osvijetli, posluži kao donor elektrona za redukciju NADP+ u NADPH.

Osvjetljavanjem fotosustava I P700 prelazi u pobuđeno stanje iz kojeg se izbacuje elektron

bogat energijom. Taj elektron, nakon niza prenositelja, prihvaća molekula feredoksina te ga

predaje feredoksin-NADP+ reduktazi (FNR) koja, elektronima primljenim od dvije molekule

feredoksina, reducira NADP+ u NADPH.

Opisani proces naziva se linearni prijenos elektrona jer se elektroni ne vraćaju u

reakcijsko središte već se pohranjuju u molekuli NADPH.

Ciklički prijenos elektrona je također prisutan u određenim uvjetima. Feredoksin

umjesto FNR predaje elektrone natrag do citokrom b6-f kompleksa, koji ih prenosi opet

plastocijaninu kako bi poslužili za regeneraciju P700. Takav tok elektrona služi za nastajanje

dodatne količine ATP-a djelovanjem ATP sintaze jer mu je rezultat povećavanje protonskog

elektrokemijskog potencijala.

1. Uvod

7

1.2. Endosimbioza

Nastanak staničnih organela i postanak eukariotske stanice jedan je od najvećih

događaja tijekom evolucije živih organizama. Smatra se da je eukariotska stanica nastala

nizom neovisnih simbiotskih događaja. Prihvaćeno je od niza autora da su mitohondriji

porijeklom od α-proteobakterija, a kloroplasti porijeklom od slobodno-živućih fotosintetskih

prokariotskih organizama koji su ušli u endosimbiontski odnos s eukariotskim domaćinom

(Allen 2003). Mereschkovsky (1905) je poznat po tome da je prvi predstavio hipotezu da su

plastidi nastali od endosimbiontskih cijanobakterija tada poznatih kao modrozelene alge.

Hipoteza je dobila potvrdu od biokemijskih dokaza i elektronske mikroskopije koji su

pokazali da organeli sadrže DNA, RNA i ribosome. 1970. godine Lynn Margulis je objavila

knjigu „Porijeklo eukariotskih stanica“ i zaslužna je za prihvaćanje endosimbiotske teorije od

većine znanstvenika (Doolitle i sur. 2003).

Najveći dio molekularno genetičkih dokaza je u skladu s monofiletičkim porijeklom

plastida po kojem je početna točka u nastanku svih tipova plastida jedinstveni simbiontski

događaj koji uključuje fotosintetizirajućeg prokariota i nefotosintetizirajućeg eukariota koji je

već sadržavao mitohondrije (Douglas i Raven 2003). Po toj hipotezi plastidi algi koje

pripadaju odjelima Glaucophyta (npr. Cyanophora paradoxa), Rhodophyta i Chlorophyta

(prema tome i svih biljaka) su primarni plastidi izvedeni iz tog jedinstvenog

endosimbiontskog događaja. Ostali plastidi su rezultat sekundarnih ili tercijarnih

endosimbioza zelenih ili crvenih jednostaničnih algi i različitih fagotrofnih eukariota. Kod

pripadnika odjela Euglenophyta, Chlorarachniophyta Dinophyta, Cryptophyta,

Heterokontophyta, Haptophyta nalazimo plastide s tri ili četiri membrane i ostatke jezgre

eukariotskog endosimbionta („nukleomorf“) što su dokazi nezavisnih endosimbiontskih

događaja koji su doveli do nastanka tih različitih vrsta organizama.

Za današnje prokariotske fotosintetske organizme kao što su cijanobakterije i

proklorofiti vjeruje se da su u srodstvu s prokariotskim endosimbiontom od kojeg kloroplasti

vuku svoje porijeklo. Usporedba kloroplastnih i cijanobakterijskih genoma te biokemijskih

procesa unutar toga dobra je metoda za rasvjetljavanje njihovih međusobnih odnosa. 1986.

godine sekvencioniranjem genoma kloroplasta duhana (Nicotiana tabacum L.) i mahovine

(Marchantia polymorpha L.), filogenetski udaljenih vrsta, utvrđeno je da ti genomi sadrže

blizu 120 gena (Rochaix 2004). Plastom (plastidni genom) crvene alge Porphyra je među

najvećima, kodira više od 200 proteina, a genom organela glaukofitne alge Cyanophora

paradoxa, cijanela, oko 130 proteina. Genom cijanobakterije Synechocystis sp. kodira 3 168

1. Uvod

8

proteina i njihova usporedba nam otkriva da plastomi sadrže samo 1 – 5 % gena u usporedbi s

cijanobakterijama (Martin i Herrmann 1998). Na razini proteoma situacija je malo drugačija,

pretpostavlja se da su plastidi zadržali mnogo više od svoje bakterijske biokemije nego što se

to može pretpostaviti iz njihovog genetičkog materijala, pa se procjenjuje da u plastidima

svoju funkciju ima oko 2 000 različitih proteina (Martin i Herrmann 1998). To se može

objasniti endosimbiontskim prijenosom gena iz organela u jezgru. Tijekom evolucije organeli

prenose svoje gene u jezgru, ali su u mogućnosti primiti njihove produkte uz pomoć

mehanizama prepoznavanja, tranzitnih peptida, i mehanizama unosa koje su postupno razvili

(Heins i Soll 1998). Postoje kompleksi proteina na vanjskoj i unutrašnjoj ovojnici kloroplasta

koji omogućuju organelu da preuzme citoplazmatske prekursore i potom otpusti polipeptide u

stromu i matriks. Pretpostavlja se da su kanali koji originalno postoje u cijanobakterijskoj

plazmatskoj membrani i vanjskom lipopolisaharidnom omotaču ojačani da bi stvorili sustav

koji bi premještao proteine u endosimbiont. Na taj su način organeli opskrbljeni potrebnim

genskim produktima iako je većina gena premještena u jezgrin genom (Heins i Soll 1998).

Nekoliko gena koji su pripadali cijanobakterijskom pretku plastida su se potpuno

izgubili. Razlog za to leži u činjenici da njihovi produkti nisu potrebni u simbiozi ili da se

njihovi duplikati već nalaze u genomu domaćina. Među onima koji postaju nepotrebni su geni

za peptidoglikansku stijenku, jer ulaskom u simbiozu bakterija dobiva zaštitu od domaćina. Ti

su se geni zadržali u genomu cijanela, plastida glaukofitne alge Cyanophora paradoxa, jer

oko tog organela još uvijek postoji zaštitna stijenka, no kod ostalih plastida su nestali.

Neke analize pokazuju da je oko 4 500 gena unutar genoma biljke Arabidopsis, ili 18 %

ukupnog genoma, preuzeto od fotosintetskog prokariotskog pretka plastida (Douglas i Raven

2003). Postoji mnogo hipoteza koje objašnjavaju razloge prijenosa gena u jezgru. Ekonomska

hipoteza nudi kao objašnjenje neekonomičnost održavanja više odvojenih genoma s

pripadajućim replikacijskim, transkripcijskim i translacijskim aparatom. Druga hipoteza kaže

da prijenos gena iz organela u jezgru pruža selektivnu prednost u odnosu na ostanak u

plastomu jer je u jezgri smanjena vjerojatnost mutacija pod utjecajem slobodnih radikala koji

nastaju kao nusproizvodi redoks reakcija unutar organela. Treća hipoteza je tzv. Mullerov

zapinjač (eng. ratchet) (Muller 1964) prema kojoj se letalne mutacije brže nakupljaju u maloj,

reproduktivno izoliranoj, klonalnoj populaciji kao što su organeli unutar stanice. Ulaskom

funkcionalnih gena u jezgrin genom dobivaju mogućnost rekombinacije i s time znatnu

evolucijsku prednost. Nedostatak ove teorije je da se čini da je broj mutacija manji u

kloroplastima nego u jezgri (Race i sur. 1999).

1. Uvod

9

Čini se da je prijenos gena između organela i jezgre poseban slučaj horizontalnog

prijenosa i nikakav mehanizam nije trenutačno poznat koji bi u potpunosti objasnio njegovu

selektivnost (Allen 2003). Činjenica jest da su organeli zadržali određene gene. Postoji

hipoteza da smo svjedoci zadnjih stadija u polaganom evolucijskom neselektivnom prijenosu

gena u jezgru i da će u budućnosti svi plastidni geni završiti u jezgri. Suprotna njoj je hipoteza

o „zamrznutoj nesreći“ koja kaže da je evolucijski proces prijenosa gena naglo prekinut,

možda zbog različitosti genetičkog koda (utvrđeno kod mitohondrija). Možda je razlog u

nemogućnosti unošenja nekih proteina u jezgru koji zahtijevaju kofaktore za pravilno

funkcioniranje ili su hidrofobni pa postoji prednost njihovog kodiranja unutar organela.

„Lock-in“ hipoteza kaže da osnovne komponente kompleksa građenih od više podjedinica

moraju biti sintetizirane de novo unutar pravog staničnog odjeljka ili oni mogu završiti

ugrađeni na pogrešno mjesto (npr. E.R. ili plazmatsku membranu). Allen (2003) postavlja

hipotezu da je funkcija genoma unutar organela zadržavanje gena za čiju je ekspresiju bitno

da su pod direktnom regulatornom kontrolom redoks stanja njihovih genskih produkata. Svaki

genetički sustav organela sadrži DNA, RNA i sve komponente potrebne za replikaciju,

transkripciju i translaciju proteina kodiranih unutar njega. Osim toga sadrži i gene koji

kodiraju za proteine s funkcijama u elektronskom transportu i događajima u fotosintezi.

Važno je to da je zadržavanje tih gena rezultat selekcijskog pritiska unutar evolucijskog

procesa.

Navedena povezanost prokariota kao što su cijanobakterije i proklorofiti s kloroplastima

algi i biljaka, kao i postojanje homolognih gena u tim organizmima pruža mogućnost njihove

primjene u istraživanju procesa koji se odvijaju u plastidima.

1. Uvod

10

1.3. Synechocystis sp. PCC 6803

1.3.1. Cyanobacteria (= Cyanophyta)

Cijanobakterije ili nekadašnje modrozelene alge pripadaju prokariotskim organizmima,

domeni Bacteria. Postoje jednostanični i kolonijalni oblici (pravilne, nepravilne i nitaste

kolonije). Stanična stijenka građena je od 4 sloja. Čvrstoću joj pruža mureinski ili

peptoglikanski sloj (kao kod ostalih bakterija) koji čine polimeri N-acetil-glukozamina i

N-acetil-muraminske kiseline. Ti su polimeri međusobno povezani preko N-acetil-

muraminske kiseline kratkim peptidima. Taj sloj sadrži pore kroz koje komuniciraju

citoplazme susjednih stanica. S vanjske strane mureinskog sloja nalazi se lipopolisaharidni

sloj i sluzavi sloj građen od proteinskih fibrila. S unutrašnje strane nalazi se plazmatska

membrana. Cijanobakterije posjeduju i sustav fotosintetskih tilakoidnih membrana koji je

složen i višeslojan, većinom s pravilno poredanim lamelama u koncentričnim krugovima na

periferiji citoplazme. Uz tilakoide su raspoređeni fikobilisomi. Inkluzije unutar stanica mogu

biti: karboksisomi koji sadrže enzim Rubisco (1,5-bifosfat karboksilazu-oksigenazu),

cijanoficinska zrnca koja su skladišta dušika u stanici (unutar njih se nalaze polipeptidi

aminokiselina arginina i asparagina), polifosfatne granule (volutin) i cijanoficejski škrob

nakupljen u zrncima između tilakoida koja se mogu vidjeti samo elektronskim mikroskopom

(Viličić 2002). Neke vrste cijanobakterija imaju sposobnost fiksacije dušika koja se odvija u

posebnim stanicama, heterocistama (sadrže enzim nitrogenazu). Postoji 5 morfološki

odvojenih grupa cijanobakterija (Rippka i sur. 1979). Među njima je red Chroococcales čije

stanice su kuglaste ili eliptične, pojedinačne ili u kratkim nizovima od po dvije stanice.

Postoje još redovi Oscillatoriales, Pleurocapsales, Nostocales i Stigonematales.

Zemljina starost se procjenjuje na preko 4,5 milijardi godina, a nastanak života na njoj

prije 3,5 – 3,8 milijardi godina jer se smatra da su u to vrijeme bili prisutni svi osnovni

biokemijski putovi (Nisbet i Sleep 2001). Početak fotosinteze se također procjenjuje na

razdoblje prije 3,5 milijardi godina. To je temeljeno na kemijskim markerima kao što su

podaci o odnosu izotopa ugljika (13C/12C) u sedimentnom organskom ugljiku (kerogenu) koji

pružaju dokaz za njegovu biološku fiksaciju. Spojevi pod imenom 2-metilhopanoidi kao

kemijski dokazi te fosilni ostaci u obliku stromatolita ukazuju na to da su cijanobakterije

postojale prije 2,5 – 2,6 milijardi godina. Stromatoliti (grč. στρώµα = pokrivač, λίθος =

kamen) su slojevite strukture koje se sastoje od izmjeničnih slojeva mikroorganizama i

sedimenta. Gotovo uvijek sadrže filamentozne fotosintetske bakterije i/ili cijanobakterije.

1. Uvod

11

Postoji kontinuirani fosilni zapis stromatolita od 2,8 milijardi godina do danas s dokazima i

ranijih struktura datirane starosti 3,2 i 3,5 milijarde godina (Olson i Blankenship 2004). Za

cijanobakterije se smatra da su bili prvi organizmi koji su proizvodili kisik na Zemlji,

pretpostavlja se da su evoluirale u vodi i atmosferi bez O2. Na početku, kisik oslobođen

njihovim djelovanjem je reagirao s željeznim ionima u oceanima i nije otpuštan u atmosferu.

Geološki dokazi upućuju da je to prestalo prije oko 2,5 milijarde godina i da je Zemljina

atmosfera tada postala aerobna (Hoek i sur. 1995). Otpuštanje kisika u atmosferu zahvaljujući

cijanobakterijama je imalo jedinstven utjecaj na daljnji razvitak života i one su, do pojave

čovjeka i njegove tehnologije, od svih grupa organizama možda imale najveći utjecaj na

oblikovanje ekoloških uvjeta na Zemlji. Naučile su se prilagoditi svim ekološkim uvjetima

tako da ih možemo naći u najrazličitijim staništima, od arktičkih i antarktičkih uvjeta do

vrućih izvora zahvaljujući njihovom vrlo fleksibilnom metabolizmu.

1.3.2. Značajke cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803 kao modelnog

organizma

Synechocystis sp. PCC 6803 taksonomski pripada u odjel Cyanophyta, razred

Cyanophyceae, red Chroococcales. To je jednostanična kokoidna cijanobakterija koja nema

sposobnost fiksiranja dušika, nema plinskih vakuola i sveprisutni je stanovnik slatkih voda.

Dijeli se binarnom diobom u dvije ili tri sukcesivne ravnine. Genetički materijal nalazi joj se

na 6 do 12 kopija genoma i 7 plazmida. Na osnovi GC sadržaja mnogi kultivirani sojevi

Synechocystis sp. se mogu klasificirati u tri grupe: morska grupa, grupa niskog GC sadržaja i

grupa visokog GC sadržaja (Ikeuchi i Tabata 2001). Soj PCC 6803 pripada zadnjoj grupi čiji

su članovi izolirani iz slatkih voda i imaju mogućnost fakultativne heterotrofije. Filogenetsko

stablo temeljeno na 16S rRNA sljedovima upućuje na bolju povezanost vrsta visokog GC

sadržaja s vrstom Microcystis aeruginosa, koja je jednostanična okrugla cijanobakterija s

plinskim vakuolama, nego s ostalim Synechocystis grupama. Soj PCC 6803 je izolirao R.

Kunisawa 1968. godine iz slatkovodnog jezera u Kaliforniji te je pohranjen u Pasteur Culture

Collection (PCC). Postoji četiri vrste kultura podsojeva cijanobakterije Synechocystis sp.:

„PCC“, “ATCC“, “GT“ i „Kazusa“ koje su sve izvedeni laboratorijski sojevi iz originalnog

soja. U početku se vjerovalo da su to iste kulture i sve su svrstane pod brojem 6803, no ipak ta

četiri laboratorijska soja pokazuju određenu razliku u fenotipu (Slika 2.).

1. Uvod

12

Jedan reprezentativni klon GT soja je uspostavljen radi potrebe sekvenciranja njegovog

genoma („Kazusa“ soj) dok su ostali održavani i prenošeni bez daljnjih manipulacija.

Održavanje ovih sojeva u kulturama ili pod različitim laboratorijskim uvjetima moglo je

dovesti do spontanih mutacija i nenamjernog selekcijskog pritiska, imajući kao posljedicu

primjetljive varijacije u svakom laboratorijskom soju. Neke od tih razlika su očite fenotipske

razlike, a neke su na razini genetičkog materijala. Važno je uzeti u obzir mogućnost

spontanog stvaranja mutacija u laboratorijskim kulturama pri izvođenju fenotipskih analiza

regulatornih gena pri različitim eksperimentalnim uvjetima.

Postoje tri glavna razloga zašto je cijanobakterija Synechocystis sp. PCC 6803 postala

jedan od najpopularnijih organizama za genetičke i fiziološke studije fotosinteze. Prvi je

razlog njene popularnosti taj što može rasti i u odsutnosti svjetla ako joj se ponudi

odgovarajući izvor reduciranog ugljika. Ima sposobnost fotoautotrofnog, miksotrofnog i

heterotrofnog rasta što omogućuje istraživanje procesa fotosinteze stvaranjem vijabilnih

mutanata kojima je inaktiviran inače esencijalan gen u tom procesu (Ikeuchi i Tabata 2001).

Drugi je razlog da je zahvaljujući radu Sergeja Shestakova i suradnika u Moskvi te

Johna Williamsa iz SAD-a 1982. prepoznata njena sposobnost spontane transformacije.

Sposobnost spontane transformacije kod Synechocystis sp. se postiže uzimanjem DNA

molekula iz okolnog medija tipom IV pilusa i ugradnjom u genom domaćina dvostrukom

Slatkovodno jezero Oakland, Kalifornija

izolirao R.Kunisawa 1968. god.

Berkeley 6803: „sporadična pokretljivost“

PCC 6803: „pokretnost“

ATCC 27184: „nepokretnost“

PCC-P/PCC-N: „pozitivna i negativna fototaksija“

GT: „tolerantnost na glukozu“

„Kazusa“: potpuna genomska sekvenca

WL

Slika 2. Povijest laboratorijskih sojeva Synechocystis sp. PCC 6803 (Ikeuchi i Tabata 2001).

1. Uvod

13

homolognom rekombinacijom. „Tip IV pili“ je općeniti pojam za strukture uključene u

patogenezu, pokretljivost i/ili transformaciju u nekih gram negativnih bakterija (Ikeuchi i

Tabata 2001). Integriranje strane DNA u genom homolognom rekombinacijom omogućilo je

ciljanu zamjenu gena. Insercijskom inaktivacijom ili delecijom stvorene su i analizirane

mutante kojima nedostaju specifični geni.

Možda je najvažniji treći razlog što je to prvi fotoautotrofni organizam s određenim

cjelokupnim nukleotidnim slijedom (Kaneko i sur. 1996). Točna veličina njegovog genoma

iznosi 3 573 470 baznih parova s prosječnim GC sadržajem 47,7 %. Kombinacijom

kompjutorskog predviđanja i traženja sličnosti s genima u ostalim genomima dodijeljene su

potencijalne protein-kodirajuće regije i utvrđeno je 3 168 potencijalnih gena. Usporedbom

potencijalnih proteinskih sekvenci s drugim genomima procijenjena je funkcija za polovicu,

1 416 proteina (45 %). Druga polovica, više od 1 000 proteina ili sliči drugim proteinima

nepoznate funkcije (11 %) ili uopće ne sliči proteinima iz drugih organizama (44 %) u vrijeme

objavljivanja podataka (Kaneko i sur. 1996). Cjelokupni nukleotidni slijed dostupan je na

stranici CyanoBase (http://www.kazusa.or.jp/cyano/cyano.html), uz pristup posebnim bazama

podataka CyanoGenes i CyanoMutants. One su namijenjene prikupljanju dodatnih

informacija dobivenih eksperimentalnim putem o funkcijama potencijalnih gena.

Danas su na istoj internetskoj stranici dostupne i genomske sekvence sljedećih

cijanobakterija: Synechococcus sp. WH 8102, Thermosynechococcus elongatus BP–1

(jednostanična termofilna cijanobakterija), Gloeobacter violaceus PCC 7421 (soj koji ne

posjeduje tilakoide već su fikobilisomi vezani na plazmatskoj membrani), 3 soja

Prochlorococcus marinus (MED4, MIT9313, SS120) i Anabaena sp. PCC 7120 (nitasta

cijanobakterija koja ima sposobnost fiksacije dušika u heterocistama) koje su sekvencionirane

od 2001. do 2003. Usporedba strukture genoma različitih vrsta cijanobakterija je obećavajuća

metoda u nalaženju gena koji su specifični za pojedinu vrstu i može poslužiti kao sredstvo za

proučavanje filogenetskih odnosa i evolucije pojedinih vrsta.

1. Uvod

14

1.4. Sumporne transferaze – rodanaze

1.4.1. Općenito o rodanazama

Sumporne transferaze su enzimi koji kataliziraju prijenos atoma sumpora s donorske

molekule na tiofilni akceptor (Papenbrock i Schmidt 2000). Najbolje istražene sumporne

transferaze su rodanaze (tiosulfat: cijanid sumporne transferaze ili TST; EC 2.8.1.1) koje

kataliziraju prijenos atoma sumpora s tiosulfata na cijanid in vitro, pri čemu nastaju sulfit i

netoksični tiocijanat (Slika 3.). Sumpornim transferazama pripadaju i 3-merkaptopiruvat-

cijanid sumporne transferaze (MST; EC 2.8.1.2) koje kataliziraju sličnu reakciju koristeći 3-

merkaptopiruvat kao donor sumpora (Bordo i Bork 2002).

Rodanazne domene su strukturalni moduli koji se pojavljuju u sve tri domene živog

svijeta: Archaea, Bacteria i Eucarya. One se pojavljuju u tri oblika: kao tandemska

ponavljanja s karboksi-terminalnom (C-terminalnom) domenom koja nosi aktivno mjesto s

cisteinskim ostatkom, kao proteini s jednom domenom ili u kombinaciji s različitim

proteinskim domenama.

Poznate su kristalne strukture dviju rodanaza. Prva otkrivena i najbolje istražena je

goveđa rodanaza koja je prisutna u mitohondrijima goveđe jetre. Druga je izolirana iz dušik-

fiksirajuće bakterije Azotobacter vinelandii i njena je trodimenzionalna struktura homologna

goveđoj. Oba enzima posjeduju dvije identično smotane domene, C i N terminalnu domenu,

Slika 3. Shema reakcije prijenosa atoma sumpora katalizirane rodanazom. Kataliza se odvija putem

mehanizma dvostruke zamjene uključujući stvaranje međuprodukta (Rod-S) koji sadrži atom sumpora

kovalentno vezan na katalitički cisteinski ostatak.

1. Uvod

15

od kojih je svaka izgrađena od oko 120 aminokiselinskih ostataka. U aktivnom mjestu C-

terminalne domene nalazi se aminokiselina cistein, ključna u rodanaznom katalitičkom

mehanizmu, koja je prva od šest aminokiselina koje čine petlju smotanu u katalitički džep

enzima. U aktivnom mjestu N-terminalne domene cistein je zamijenjen aspartatom ili

glicinom. Uloga te domene nije još u potpunosti razjašnjena, no vjeruje se da ona ne

posjeduje nikakvu katalitičku funkciju. Inaktivne rodanazne domene nađene su i kao N-

terminalne domene u jednoj trećini poznatih dvojako-specifičnih fosfataza (Cdc25 fosfataze) i

nekoliko ubikvitin proteinskih hidrolaza, a smatra se da imaju regulatornu ulogu vjerojatno

povezanu sa signalnim procesima (Bordo i Bork 2002).

Aktivne rodanazne domene su, radi vrlo slične trodimenzionalne strukture i identičnog

položaja sačuvanog cisteinskog ostatka, vjerojatno evolucijski povezane s katalitičkim

domenama Cdc25 fosfataza (Hoffmann i sur. 1998). Ovi enzimi imaju ulogu u regulaciji

staničnog ciklusa eukariota, djelujući indirektno aktiviranjem ciklin-ovisne kinaze. Najveća

strukturna razlika između rodanaza i Cdc25 fosfataza je dužina petlje u aktivnom mjestu

katalitičke domene. Ta je petlja u fosfataza izgrađena od sedam aminokiselinskih ostataka,

zbog čega je katalitički džep enzima širi i može prihvatiti atom fosfora koji ima nešto veći

Van der Waalsov radijus od atoma sumpora (Bordo i Bork 2002).

Rodanazne domene, katalitičke ili inaktivne se često povezuju s drugim proteinskim

domenama kao u proteinima uključenim u biosintezu tiamina, tiouridina ili molibdopterina.

Sulfurtransferazna aktivnost je dokazana in vitro za rodanaznu domenu enzima ThiI bakterije

Escherichia coli (Palenchar i sur. 2000).

Specifična biološka uloga rodanaza još nije u potpunosti utvrđena zbog nemogućnosti

utvrđivanja njihovih supstrata in vivo. Za aktivno mjesto se pretpostavlja da igra ključnu

ulogu u prepoznavanju supstrata i katalitičkoj aktivnosti. Pretpostavljene funkcije uključuju

ulogu u mehanizmu cijanidne detoksifikacije kod goveđe rodanaze (Sorbo 1955) i bakterije

Pseudomonas aeruginosa (Cipollone 2004), uključenost u metabolizam selena (Ogasawara i

sur. 2001), formiranje prostetičkih skupina u željezno-sumpornim proteinima kao što je

ferodoksin (Pagani i sur. 1984) i ulogu u biosintezi cisteina (Donadio i sur. 1990).

Često su različiti proteini koji posjeduju rodanazne domene kodirani različitim genima

unutar istog genoma, što ukazuje na njihove različite biološke uloge. Tako npr. genom

bakterije E. coli K12 sadrži 8 ORF-ova čiji proteini imaju aktivnu rodanaznu domenu s

potencijalno katalitičkim cisteinskim ostatkom na aktivnom mjestu.

1. Uvod

16

1.4.2. Proteini s jednom rodanaznom domenom

Sekvenciranjem nekoliko prokariotskih genoma utvrđeno je da su geni koji kodiraju za

proteine s jednom rodanaznom domenom široko rasprostranjeni među bakterijama. Te

domene imaju vrlo različite aminokiselinske sljedove. U COG bazi podataka (eng. cluster of

homologous groups) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG) postoji 41 protein svrstan u grupu

COG0607 (rodanazama srodne sumporne transferaze). Reprezentativni predstavnik ove grupe

proteina je 12 kDa protein E. coli GlpE, član sn-glicerol 3-fosfatnog regulona. Nedavna

strukturalna karakterizacija i biokemijska analiza (Ray i sur. 2000, Spallarosa i sur. 2001)

pokazala je da in vitro GlpE može reagirati kao rodanaza katalizirajući, iako s niskom

učinkovitošću, prijenos sumpora od tiosulfata do cijanida.

Osim GlpE jedino je periplazmatska sulfidna dehidrogenaza s rodanaznom domenom iz

bakterije Wollinella succinogenes opisana kao polisulfid: cijanid sulfurtransferaza (Klimmek i

sur. 1998). Proteini koji sadrže jednu rodanaznu domenu povezani su sa specifičnim stresnim

uvjetima kao što je slučaj kod PspE (phage-shock protein E) proteina E. coli (Adams i sur.

2002). Pretpostavljena je i uloga proteina s jednom rodanaznom domenom kao stres proteina

povezanih s procesom starenja listova nekih biljnih vrsta kao što su A. thaliana i N. tabacum

(Bordo i Bork 2002).

1. Uvod

17

1.4.3. Cijanobakterijska rodanaza slr0192

Po nomenklaturi koja se upotrebljava za identifikaciju gena u bazi podataka Cyanobase

prvo slovo „s“ označava vrstu, Synechocystis sp. Drugo slovo označava dužinu samog gena,

„l“ se dodjeljuje dužima od 100 kodona, a „s“ kraćima od 100 kodona. Treće slovo

predstavlja smjer transkripcije na kružnoj mapi genoma, „r“ za desno, „l“ za lijevo. Broj je

dodijeljen prema redoslijedu mogućih ORF-ova (Eaton-Rye 2004).

U genomu cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803 identificiran je otvoreni okvir

čitanja (ORF) kojemu je dodijeljena oznaka slr0192. Produkt ORF slr0192 je hipotetski

protein kojem je u bazi podataka InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/) identificirana

funkcionalna domena slična rodanazi.

Od proteina koji pokazuju sličnost s rodanazama kod cijanobakterija karakteriziran je

jedino rhdA cijanobakterije Synechococcus sp. PCC 7492. To je periplazmatski protein koji je

uključen u transport sulfata i zabilježeno je da se akumulira tijekom nestašice sumpora

(Laudenbach i sur. 1991).

Slika 4. Prikaz okruženja gena slr0192. Prikazani ORF-ovi se nalaze u istom smjeru transkripcije.

Pridružene funkcije na temelju sličnosti s proteinima iz drugih genoma su slijedeće. slr0191 – pojačivač amidaza, slr0193 – RNA vezujući protein, – riboza 5-fosfat izomeraza, slr0195 – hipotetski protein,

slr0196 – nepoznata funkcija, slr0197 – „competence“ protein.

1. Uvod

18

1.5. Cilj istraživanja

Fotosintetski prokariotski organizmi imaju jednostavniji genetički sustav nego alge i

više biljke pa ih je radi toga lakše genetički modificirati. To je razlog za upotrebu različitih

vrsta cijanobakterija kao modela za bolje razumijevanje fotosintetskih procesa u biljaka na

temelju evolucijske teorije o endosimbiotskom postanku biljne stanice. Modifikacijama

proteina na razini gena istražuje se povezanost između molekularne strukture i bitnih

mehanizama u fotosintezi i metabolizmu fototrofnih organizama.

U sklopu istraživanja područja regulacije procesa fotosinteze u genomu biljke

Arabidopsis thaliana identificiran je gen At4g01050. Pretpostavlja se da je njegov proteinski

produkt lokaliziran u kloroplastima i povezan s regulacijskim mehanizmima. Protein ima

jednu inaktivnu rodanaznu domenu, koju izgrađuje 121 aminokiselinski ostatak i u kojoj je

cistein, ključan za katalitičku rodanaznu aktivnost, zamijenjen aspartatom (Pantoja i sur.

2005).

U nedostatku eksperimentalnih informacija o ulozi aktivnih i inaktivnih rodanaznih

domena u fotosintetskim organizmima pristupilo se istraživanju funkcije rodanaza u

fotosintetskih prokariota. Cilj je ovog rada je karakterizacija potencijalne rodanaze i

određivanje njezine uloge in vivo u cijanobakteriji Synechocystis sp. PCC 6803.

U tu svrhu, metodom insercijske inaktivacije stvorene su mutante s nefunkcionalnim

genom slr0192. Namjera je bila utvrđivanje potencijalnog karakterističnog fenotipa

mutantnog soja i istraživanje utjecaja nedostatka odgovarajućeg proteina na fiziologiju

organizma usporedbom divljeg tipa i mutante u različitim eksperimentalnim uvjetima.

2. MATERIJALI I METODE

2. Materijali i metode

20

2.1. Pokusni organizam i eksperimentalni uvjeti uzgoja

Kao pokusni organizam u ovom radu koristila sam dva laboratorijska soja divljeg tipa

cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803, fenotipski različita, koji su u daljnjem tekstu

označeni kao „ruska“ i „japanska“ linija.

Divlji tip cijanobakterije Synechocystis sp. kao i njene mutante za gen slr0192 uzgajane

su na temperaturi od 30 °C uz prozračivanje sterilnim zrakom (0,035 % CO2) i konstantno

osvjetljenje bijelim fluorescentnim žaruljama (OSRAM L 20 W/22 R weiss de luxe) s

fotosintetski aktivnim zračenjem 20 – 30 µmolfotona m–2 s–1. Intenzitet svjetla je izmjeren

pomoću uređaja "Hansatech Quantitherm light meter", Velika Britanija. Uzgoj u tekućoj

hranidbenoj podlozi BG–11 odvijao se u modificiranim staklenim Erlenmayer tikvicama od

300 ml i Erlenmayer tikvicama od 100 ml za tekuće kulture bez prozračivanja zrakom. U

staklenim petrijevim zdjelicama cijanobakterije su rasle na krutoj hranidbenoj podlozi BG–11,

volumena oko 50 ml, omotanim parafilmom da bi se smanjila dehidracija i kontaminacija

podloge (Eaton-Rye 2004). Kada je bilo potrebno, u podlogu je dodan antibiotik kanamicin u

konačnoj koncentraciji 25 µg ml–1 i uklonjen sumpor zamjenom odgovarajućih komponenata

u hranidbenoj podlozi. Sastav korištenih hranidbenih podloga prikazan je u tablici 1. i 2.

Slika 5. Uzgoj kultura cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803.


21

Redovito sam provjeravala čistoću kultura pod svjetlosnim mikroskopom te

nasađivanjem po 1 ml kulture na ploče s LB hranidbenom podlogom bez dodatka antibiotika i

njihovom inkubacijom 24 sata na 37 °C. Kao mjeru broja stanica u kulturi i pojedinih faza

rasta uzela sam optičku gustoću na 730 nm (OD730nm) koja se nalazi u infracrvenom dijelu

spektra gdje gotovo nema apsorpcije pa je to ustvari mjera raspršivanja svjetlosti na

stanicama, a ne apsorbancija. Mjerila sam je spektrofotometrom ULTROSPEC 2100 pro

UV/Vis Amersham Pharmacia Biotech, SAD. OD730 nm od 0,25 odgovara broju od 1 × 108

stanica ml–1 (Eaton-Rye 2004). OD730nm ne smije prijeći 2,0, ako će kulture služiti za daljnju

upotrebu (stanice su tada na kraju stacionarne faze rasta).

Sva presađivanja kultura stanica primjenom klasičnih mikrobioloških tehnika i sve

eksperimentalne postupke izvodila sam u komori s horizontalnim strujanjem sterilnog zraka

(„laminaru“).

2.1.1. Glicerinska kultura Synechocystis sp. PCC 6803

100 ml tekuće kulture cijanobakterija u logaritamskoj fazi rasta (OD730 ~ 0,9)

centrifugirala sam 15 min 3000×g/ 4 °C. Talog sam resuspendirala u 2 ml svježe BG–11

tekuće podloge i 0,5 ml suspenzije stanica dodala u Eppendorf tubice. U svaku tubicu sam

dodala 0,5 ml sterilnog 50 % glicerina, dobro promiješala pomoću vrtložne miješalice i

pohranila na –80 °C. U slučaju upotrebe, te kulture treba otopiti polako u hladnoj vodi te

sterilno prenijeti u 100 ml tekuće podloge BG–11. Nakon 2 do 3 dana cijanobakterijska

kultura je spremna za daljnja istraživanja.

Tablica 1. LB (Luria–Bertani) hranidbena podloga.

g L–1

pepton 10

ekstrakt kvasca 5

NaCl 10

agar1 15

*Dodati sve u 950 ml deH2O, namjestiti pH otopine na 7,0 pomoću NaOH i dodati 1. Nadopuniti do 1 L s deH2O i sterilizirati u autoklavu na 120 °C 20 min.


22

Tablica 2. Sastav BG–11 podloge (Stanier i sur. 1971).

1111 1000 × A5 minerali u

tragovima g L

–1

2222 100 × BG–11 g L

–1

H3BO3 2,86 NaNO3 149,6

MnCl2 × 4H2O 1,81 MgSO4 × 7H2O 7,5

ZnSO4 × 7H2O 0,222 CaCl2 × 2H2O 3,6

Na2MoO4 × 2H2O 0,39 limunska kiselina C6H7O8 0,6

CuSO4 × 5H2O 0,079 0,5 M EDTA, pH 8,0 0,55 ml L–1

Co(NO3)2 × 6H2O 0,0494 1000 × A5 minerali u tragovima 100 ml L–1

3333 1 × BG–11 tekuća podloga ml L–1

4444 BG–11 kruta podloga ml L–1

100 × BG–11 10 A

1 M Tris-Cl, pH 8,0 5 100 × BG–11 10

189 mM Na2CO3 1 1 M Tris-Cl, pH 8,0 5

175 mM K2HPO4 1 189 mM Na2CO3 1

175 mM K2HPO4 1

H2O 500

Fe × NH3 × C6H8O7

(željezo-amonij-citrat, smeđi) (6 mg ml–1) 1

1

B

H2O 500

bacto-agar 1,5 g L–1

Fe × NH3 × C6H8O7

(željezo-amonij-citrat, smeđi) (6 mg ml–1)1

1

0,5 M Na2S2O3 × 5H2O 2 10

nadopuniti s H2O do 1 L i sterilizirati u autoklavu na 120 °C 20 min, nakon što se temperatura otopine spusti na 60 °C dodati 1

sterilizirati u autoklavu odvojeno A i B na 120 °C 20 min, nakon što se temperatura spusti na 60 °C pomiješati i dodati 1 i 2

*Za uzgoj mutanata u podloge je dodan kanamicin, kao selektivni biljeg u konačnoj koncentraciji 25 µg ml–1. **Podloge bez sumpora su pripremljene tako da su u �� umjesto ZnSO4 × 7H2O i CuSO4 × 5H2O dodani ZnCl2 i CuCl, u 2222 je MgSO4 × 7H2O zamijenjen s MgCl2 × 6H2O sve u istim molarnim omjerima, a iz 4444 je izostavljen Na2S2O3 × 5H2O.


23

2.2. Kompjuterska analiza aminokiselinskog slijeda gena slr0192

Pretraživanje mogućih lokalnih sravnjenja gena slr0192 s izvedenim aminokiselinskim

sljedovima sadržanim u bazi podataka genoma Synechocystis sp. napravila sam uz pomoć

programa BLASTP koji je dostupan na stranici http://www.kazusa.or.jp/cyano/blast.html.

Višestruko sravnjenje slr0192 i reprezentativnih rodanaza iz različitih organizama

napravila sam uz pomoć CLUSTALW 1.8 programa (http://www.ebi.ac.uk/clustalw.html),

dok sam višestruko sravnjenje sljedova s rodanaznom domenom iz genoma Synechocystis sp.

napravila uz pomoć programa T-Coffee (http://www.ch.embnet.org/software/TCoffee.html).

Izgled višestrukih sravnjenja aminokiselinskih sljedova uređen je pomoću programa

BOXSHADE 3.21 (http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html).

Za predviđanje molekularnih težina i izoelektričnih točki različitih proteina koji sadrže

rodanaznu domenu, a kodirani su različitim otvorenim okvirima čitanja unutar genoma

Synechocystis sp., upotrijebila sam program ProtParam (http://www.expasy.org/cgi-

bin/protparam.html).

Moguću prisutnost transmembranskih domena u analiziranim ORF-ovima utvrdila sam

pomoću programa TMPRED (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html).

Restrikcijske karte nukleotidnih sljedova napravila sam pomoću programa

WEBCUTTER (http://searchlauncher.bcm.tcm.edu/seq-util/seq-util.html).


24

2.3. Konstrukcija vektora za transformaciju pBsc0192K

Osnova tvorbe inaktivacijske (eng. „knock out“) mutante je zamjena cijanobakterijskog

gena s izmijenjenom kopijom istog gena. Izmjena je napravljena ubacivanjem kazete za

rezistenciju na antibiotik kanamicin unutar ORF-a slr0192, odnosno insercijskom

inaktivacijom tog gena. Nukleotidnom slijedu slr0192 moguć je pristup preko baze podataka

CyanoBase (http://www.kazusa.or.jp/cyano/cyano.html) i u bazi podataka

DDBJ/EMBL/GenBank pod pristupnim brojem BAA10411.

ORF slr0192 je smješten između 2 724 075 i 2 724 419 nukleotida na genomu

Synechocystis sp. i veličina mu iznosi 345 pb. Za konstrukciju inaktivacijske mutante

umnoženi su i dodatni bočni sljedovi nukleotida s lijeve i desne strane između 2 723 675 i

2 724 639 nukleotida (964 pb). Unutar te regije ne postoje odgovarajuća mjesta

prepoznavanja za restrikcijske endonukleaze pa su ona uvedena pomoću početnica. Prvo je

konstruirana Lslr0192 regija pomoću početnica:

P1: slr0192 EcoRI

5' GGA ATT CGG ACT TCA CCA CTA TTT ACG 3'

P2: slr0192 BamHI RE

5' CGG GAT CCG CAA ACT CGC TCA AGG ATA G 3'.

Zatim je konstruirana regija Rslr0192 pomoću početnica:

P3: slr0192 BamHI FO

5' CGG GAT CCT ATC CTT GAG CGA GTT TGC 3'

P4: slr0192 XbaI

5' GCT CTA GAA CCT CCG GGG ATA TTT TCT G 3'

Kanamicinska kazeta KanR (slijed nukleotida koji kodira za enzim aminoglikozid 3'

fosfotransferazu zajedno s vlastitim promotorom) veličine 1 264 pb je izrezana iz plazmida

pUC4K (Tn903) (pristupni broj u bazi DDBJ/EMBL/GenBank X06404) pomoću restrikcijske

endonukleaze BamHI i unešena između Lslr0192 i Rslr0192 regije u umjetno stvoreno

BamHI mjesto (Slika 6.). Sva kloniranja su izvršena u vektoru pBluescript (Stratagene, La

Jolla, CA).

Stvorene su dvije inačice plazmida pBluescript s kanamicinskom kazetom u dvije

orijentacije: pBsc0192K (+) „forward“ i pBsc0192K (–) „reverse“ (Slika 7.). Orijentacija je

provjerena pomoću restrikcije s endonukleazom HindIII jer je mjesto njegovog cijepanja

prisutno i u KanR kazeti i u višestrukom mjestu za kloniranje plazmida pBluescript (Slika 8.).


25

Slika 6. Shematski prikaz insercijske inaktivacije gena slr0192. Unutar slijeda nukleotida koji se sastoji od gena slr0192 te lijevog i desnog bočnog slijeda, unešena je Kan

R kanamicinska kazeta (slijed

nukleotida koji kodira za enzim aminoglikozid 3' fosfotransferazu sa promotorom).

Slika 7. Shematski prikaz plazmidnog vektora pBsc0192K. Rslr0192 i Lslr0192 sljedovi nukleotida

ugrađeni su pomoću restrikcijskih endonukleaza EcoRI i XbaI dok je kanamicinska kazeta KanR

ugrađena pomoću BamHI restrikcijske endonukleaze pa postoje dvije verzije ovog plazmida: (+)

„forward“ i (–) „reverse“. AmpR, gen za otpornost na ampicilin; pUC ori, početak replikacije; BamHI,

EcoRI i XbaI, restrikcijska mjesta za kloniranje.


26

A

B

Slika 8. Prikaz dvije različite orijentacije KanR kazete u vektoru pBsc0192K. (A) Shematski prikaz

orijentacije: ako je (+)“forward“ orijentacija, fragmenti dobiveni restrikcijom s HindIII su veličine ~1,15

i 4,12 kb; ako je u pitanju (-) „reverse“ orijentacija fragmenti su veličine 1,26 i 3,99 kb. Razlika manjih

fragmenata između orijentacija je ~120 pb. (B) Elektroforeza DNA fragmenata u 0,7% agaroznom gelu.

Pruge 1 i 10:biljeg veličine fragmenata DNA “GeneRulerTM

“, Pruga 2 „forward“ orijentacija, Pruga 3

„reverse“ orijentacija.


27

2.4. Transformacija cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803

postupak

Pripremila sam svježu tekuću kulturu stanica. Kroz dva tjedna kultura je narasla na

OD730nm do 1,6 (<1 × 109 stanica ml–1). U sterilnim uvjetima prenijela sam 30 ml kulture u

Falcon tubu i centrifugiranjem 10 min na 3000×g/ RT istaložila stanice. Zatim sam ih

resuspendirala u 9 ml BG–11 podloge i ponovo centrifugirala 10 min na 3 000×g/ RT. Nakon

resuspendiranja u 3 ml BG–11 svježe tekuće podloge izmjerila sam im OD730nm. Svaka

transformacija se izvodi pri OD730nm od 2,5 pa prikladno tome treba razrijediti kulture pomoću

BG–11 podloge.

Reakcijske smjese za transformaciju priredila sam u sterilnim Eppendorf tubicama od 2

ml prema protokolu:

100 µl stanica ( „ruska“ i „japanska“ linija, divlji tip)

900 µl BG–11 tekuća podloga

5 µg DNA (plazmid pBsc0192K (+) i (–) orijentacija).

Nakon što sam ih dobro protresla, 2 sata sam ih ostavila na svjetlu i temperaturi 30 °C.

U jednu tubicu sam umjesto DNA dodala reH2O i ona mi je služila kao negativna kontrola.

Nasadila sam zatim 500 µl transformirane kulture cijanobakterijskih stanica na BG–11

ploče bez dodatka antibiotika i ostavila 24 sata na svjetlu i 30 °C u komori za uzgoj.

Na tim pločama postupno sam tijekom slijedećih dana povećavala koncentraciju

antibiotika dodavanjem BG–11 tekuće podloge s kanamicinom ispod agara sve dok se nisu

počele pojavljivati pojedinačne kolonije (od 5 µg ml–1 kanamicina do 25 µg ml–1 kao konačne

koncentracije). Tada sam presadila kolonije na svježe BG–11 ploče s konačnom

koncentracijom kanamicina.

Presađivanje pojedinačnih kolonija sam radila svakih 7 dana kroz 6 tjedana da bi

osigurala potpunu segregaciju transformanata.


28

2.5. Provjera mutantnog genotipa ∆slr0192 Synechocystis sp. PCC

6803

Synechocystis sp. PCC 6803 stanice sadrže otprilike 10-tak kopija svog genoma i to je

razlog zašto je potrebno potvrditi da sve kopije sadrže inaktiviranu kopiju željenog gena, tj. da

je došlo do potpune segregacije. To možemo provjeriti pomoću lančane reakcije polimerazom

i metodom hibridizacije po Southern-u, što sam i napravila. U tim pokusima koristila sam

izoliranu DNA divljeg tipa „ruske“ i „japanske“ linije, DNA mutante ∆slr0192 „rus rev“

linije (divlji tip „ruske“ linije transformiran plazmidom pBsc0192K (–)) i DNA mutante

∆slr0192 „jap forw“ linije (divlji tip „japanske“ linije transformiran plazmidom pBsc0192K

(+)).

2.5.1. Izolacija DNA cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803

2.5.1.1. Lančana reakcija polimerazom cijanobakterijskih kolonija („colony PCR“)

materijal

· TE pufer: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 1mM EDTA

· 1%-tni Triton X–100

· Kloroform (koji sadrži 1/25 volumena izoamilalkohola)

· Tris pufer 1: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA i 50 mM NaCl

postupak

Lančana reakcija polimerazom cijanobakterijskih kolonija („colony PCR“) najbrža je

metoda za utvrđivanje potpune segregacije mutantnog genotipa.

S BG–11 ploča na kojima su rasle cijanobakterijske stanice dodala sam pomoću

mikrobiološke ušice po jednu koloniju u Eppendorf tubice gdje sam ih resuspendirala u 200 µl

TE pufera koji je sadržavao 1 %-tni Triton X-100. Zatim sam uzorke zagrijala na

95 °C u trajanju od 3 min. Triton X-100 sam uklonila iz otopine dvjema ekstrakcijama

kloroformom na sljedeći način: Dodala sam 200 µl kloroforma, lagano promiješala

preokretanjem tubice te centrifugirala 2 min na 13 600×g/ RT. Gornji sloj sam odvojila u

nove tubice te ponovo dodala kloroform. Nakon završnog centrifugiranja 5 µl gornje vodene

faze sam dodala u reakcijsku smjesu (vidi 2.5.2.).


29

Moguće je također dodavanje cijanobakterijske kolonije izravno u reakcijsku smjesu za

PCR bez provođenja prethodno opisanog tretmana. U tom slučaju postupak je bio sljedeći:

Napravila sam 50 µl PCR reakcijsku smjesu (vidi 2.5.2.) u tubici, ali nisam dodala

enzim polimerazu. Uz pomoć mikrobiološke ušice dodala sam koloniju u tubicu i promiješala

pomoću vrtložne miješalice. Zatim sam skupila uzorak kratkom vrtnjom (< 2 sek) u

centrifugi. Dodala sam polimerazu, pažljivo promiješala uzorak pipetom i pokrenula reakciju.

Nakon njenog završetka, smjesu sam centrifugirala 30 sek na 13 600×g/ RT, supernatant

prenijela u čistu tubicu i količinu umnožene DNA provjerila u gelu elektroforezom.

2.5.1.2. Izolacija genomske DNA iz cijanobakterijskih kultura na pločama

materijal

· Zasićena otopina KI (~ 2 g ml–1)

· Tris pufer 1: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM EDTA i 50 mM NaCl

· Lizozim (50 mg ml–1)

· 10%-tna otopina N-lauril sarkozina

· Fenol-Tris-HCl otopina, pH > 7,8

· Kloroform (koji sadrži 1/25 volumena izoamilalkohola)

· 96 %-tni hladni etanol (–20 °C)

· 3 M natrijev acetat (NaC2H3O2), pH 5,5


postupak

Pomoću mikrobiološke ušice skinula sam sve stanice s BG–11 ploče gdje su se nalazile

cijanobakterije starosti 3 tjedna, resuspendirala ih u 200 µl zasićene svježe pripremljene

otopine KI u Eppendorf tubici i inkubirala ih 10 min na 37 °C. Dodala sam 1 ml redestilirane

vode da razrijedim KI te centrifugirala 10 min na 13 600×g/ RT. Bacila sam supernatant i

potom resuspendirala talog pomoću pipete u Tris puferu 1. Dodala sam 100 µl otopine

lizozima, inkubirala smjesu 10 min na 37 °C te zatim dodala 100 µl 10 %-tne otopine N-lauril

sarkozina. Nakon što sam smjesu lagano promiješala preokretanjem tubice inkubirala sam je

ponovo 10 min na 37 °C. Zatim sam dodala 600 µl otopine fenol-Tris-HCl i ostavila 20 min

na rotirajućoj miješalici. Potom sam centrifugirala smjesu 10 min na 13 600×g/ RT i prenijela

gornju vodenu fazu u novu tubicu pomoću 1 ml pipete s odrezanim vrhom da izbjegnem

oštećivanje DNA. U tu novu tubicu sam dodala 600 µl kloroforma i ponovo lagano


30

promiješala na rotirajućoj miješalici 20 min. Centrifugirala sam smjesu 10 min na 13 600×g/

RT i prenijela ponovo gornju vodenu fazu u čistu tubicu. DNA je zatim trebalo istaložiti i to

sam napravila tako što sam dodala 1/10 volumena natrijevog acetata i 2,5 volumena 96 %-tnog

etanola te ostavila preko noći na –20 °C. Sljedeći dan sam smjesu centrifugirala na 13 600×g/

4 °C 20 min, bacila supernatant i isprala talog u 70 %-tnom etanolu da uklonim sol (dodala

sam 500 µl etanola). Centrifugirala sam 5 min na 13 600×g/ 4 °C te bacila supernatant. Talog

koji sadrži genomsku DNA Synechocystis sp. osušila sam na sobnoj temperaturi,

resuspendirala u 50 µl reH2O i pohranila na –20 °C.

2.5.1.3. Izolacija genomske DNA iz cijanobakterijskih tekućih kultura

materijal

· isto kao u 2.5.1.2.

· RNAza (10 mg ml–1)

· 10 %-tna otopina SDS (natrij dodecil sulfat)

· Proteinaza K (20 mg ml–1)

postupak

10 ml kulture (OD730nm 0,8) centrifugirala sam 10 min na 3000×g/ RT da se stanice

istalože. Supernatant sam bacila, a talog suspendirala u mediju koji je ostao u tubi i prebacila

u Eppendorf tubicu (najviše 1,5 ml suspenzije stanica) i ponovo centrifugirala 10 min na

3000×g/ RT. Nakon toga talog sam resuspendirala u 100 µl zasićene otopine KI i suspenziju

inkubirala na 30 °C s osvjetljenjem 20 min. Zatim sam dodala 900 µl reH2O i centrifugirala 1

min na 7 000×g/ RT. Talog sam otopila u 300 µl Tris pufera 1, dodala 30 µl lizozima i 3 µl

RNAze, inkubirala 20 min na 37 °C s laganim miješanjem. Potom sam dodala 30 µl 10 %-tne

otopine N-lauril sarkozina, 30 µl 10 %-tne otopine SDS, 3 µl proteinaze K (20 mg ml–1) i opet

inkubirala 20 min na 37 °C. Zatim sam DNA ekstrahirala s fenolom tako da sam dodala 1

volumen fenola (500 µl) i promiješala okretanjem tubice tijekom 2 min. Zatim sam

centrifugirala 5 min na 13 600×g/ RT. Otpipetirala sam gornju fazu i dodala ½ volumena

fenola (250 µl) i ½ volumena kloroforma (250 µl) te promiješala okretanjem tubice tijekom 2

min. Centrifugirala sam ponovo 5 min na 13 600×g/ RT. Otpipetirala sam gornju fazu i

dodala 1 volumen kloroforma (500 µl) te promiješala okretanjem tubice tijekom 2 min.

Ponovo sam centrifugirala 5 minuta na 13 600×g/ RT. Gornju sam fazu otpipetirala i dodala

2,5 volumena ledenog 96 %-tnog etanola i 1/10 volumena otopine natrijevog acetata, dobro


31

izmiješala na vrtložnoj miješalici i stavila na –20 °C preko noći da se DNA istaloži (može i na

–80 °C 2 h). Sljedeći dan sam smjesu centrifugirala 10 min na 13 600×g/ 4 °C, bacila

supernatant, a na talog dodala 500 µl 70 %-tnog etanola. Na kraju sam centrifugirala smjesu 5

min na 13 600×g/ 4 °C, osušila talog na sobnoj temperaturi, DNA otopila u 10 µl reH2O i

pohranila na –20 °C.

2.5.2. Lančana rekcija polimerazom

Lančana reakcija polimerazom (PCR, eng. polymerase chain reaction) je metoda

umnožavanja specifičnog nukleotidnog slijeda molekule DNA u nestaničnim uvjetima. Za

izvođenje ove metode nužno je poznavati mali dio nukleotidnog slijeda kojeg je potrebno

umnožiti, a prema kojem se sintetiziraju dva jednolančana oligonukleotida sa slobodnim

3' OH završetkom (klice, početnice). U reakcijsku smjesu za PCR je, uz kalup i početnice,

potrebno dodati i sva četiri dNTP-a (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzim DNA polimerazu

koja umnožava specifični nukleotidni slijed počevši od početnica te odgovarajući pufer s

Mg2+ ionima neophodnim za aktivnost enzima.

PCR se najčešće odvija u 30-ak ciklusa, a svaki od njih sastoji se od tri koraka:

1. Razdvajanje lanaca dvolančane molekule DNA (denaturacija) odvija se pri temperaturi

od 95 °C.

2. Hibridizacija početnica s lancima kalupa DNA odvija se najčešće pri temperaturi od

50 – 60 °C (ovisno o temperaturi mekšanja početnica).

3. Sinteza novih lanaca, odnosno produljivanje početnica, odvija se pri temperaturi od

72 °C. Vrijeme potrebno za umnožavanje nukleotidnog slijeda ovisi o njegovoj veličini.

Novosintetizirani lanci DNA služe kao kalupi u slijedećim ciklusima tako da se početna

količina DNA molekule kalupa eksponencijalno povećava.

Lančanu reakciju polimerazom koristila sam za provjeru ugradnje kanamicinske kazete

unutar ORF-a slr0192 genoma Synechocystis sp. PCC 6803. Prvo sam provjerila postojanje

Lslr0192 i Rslr0192 slijeda nukleotida unutar genoma divljeg tipa i mutante ∆slr0192

postupkom opisanim pod 2.5.1.1. Sastav reakcijske smjese i temperaturni uvjeti reakcije

prikazani su u tablici 3.


32

Tablica 3. Reakcijske smjese i temperaturni raspon za lančanu reakciju polimerazom Lslr0192 i Rslr0192

slijeda nukleotida.

Lslr0192 Rslr0192

5 µl DNA (2.5.1.1.)

0,5 µl dNTP (svaki 25 mM)

0,5 µl početnica P1 EcoRI

0,5 µl početnica P2 BamHI RE

5 µl 10 × TROL Taq reakcijski pufer

1 µl TROL Taq DNA polimeraza

Σ volumen smjese 50µl (nadopuniti s reH2O)

5 µl DNA (2.5.1.1.)


0,5 µl početnica P3 BamHI FO

0,5 µl početnica P4 XbaI




1. 96 °C 5 min (denaturacija kalupa)

2. 94 °C 30 sek (denaturacija)

3. 55 °C 30 sek (hibridizacija početnica)

4. 72 °C 30 sek (sinteza novih lanaca)

5. 72 °C 10 min (završno produljivanje lanaca)

35 ×


33

Zatim sam provjerila uspješnost ugradnje KanR kazete unutar ORF-a slr0192

usporedbom veličine umnoženog fragmenta DNA iz divljeg tipa i mutante ∆slr0192. Kao

DNA kalup upotrijebljena je DNA izolirana postupkom opisanim pod 2.5.1.2. Sastav

reakcijske smjese i temperaturni uvjeti same reakcije prikazani su u tablici 4.

Tablica 4. Reakcijska smjesa i temperaturni raspon za lančanu reakciju polimerazom. Provjera ugradnje

KanR

kazete unutar ORF-a slr0192.

0,1 µg DNA Synechocystis sp.


0,5 µl početnica P1 EcoRI

0,5 µl početnica P4 XbaI




1. 96 °C 5 min (denaturacija kalupa)

2. 94 °C 30 sek (denaturacija)

3. 55 °C 30 sek (hibridizacija početnica)

4. 72 °C 2 min (sinteza novih lanaca)

5. 72 °C 10 min (završno produljivanje lanaca)

U svim reakcijama koristila sam enzim rekombinantnu TROL Taq DNA polimerazu s

pripadajućim puferom koja je proizvedena u Laboratoriju za elektronsku mikroskopiju, Zavod

za molekularnu biologiju, Institut Ruđer Bošković, Hrvatska. Oligonukleotidne početnice su

proizvod tvrtke Invitrogen, SAD, a njihov nukleotidni slijed je naveden pod 2.3.

35 ×


34

2.5.3. Elektroforetsko razdvajanje DNA molekula u agaroznom gelu

materijal

· 50 × TAE pufer: 242 g L–1 Tris

57,1 ml L–1 octena kiselina (CH3COOH)

100 ml L–1 0,5 M EDTA pH 8,0

· Etidijev bromid, EtBr (10 mg ml–1)

· Agaroza

· Brom-fenol plavo boja: 40 % saharoza

brom-fenol plavo (tetrabromfenolsulfonftalein)

30 % glicerol

50 mM EDTA, pH 8,0

· Biljeg veličine fragmenata DNA: GeneRulerTM DNA Ladder Mix (Fermentas, SAD)

1 kb DNA Ladder (Gibco, SAD)

postupak

Za razdvajanje dvolančanih fragmenata DNA (dobivenih umnožavanjem pomoću

metode PCR pod 2.5.2. ili restrikcijskom razgradnjom ukupne genomske DNA Synechocystis

sp. pod 2.5.4) koristila sam elektroforezu u agaroznom gelu. Gel sam pripremila otapanjem

određene mase agaroze u 1 × TAE puferu (0,7 %; 1,2 %) na temperaturi vrenja. U smjesu sam

zatim dodala EtBr, izlila je u pripremljeni kalup i pustila da se polimerizira na sobnoj

temperaturi 30 min. Nakon toga sam u kalup izlila 1 × TAE pufer, izvadila češalj tako da su

na njegovom mjestu ostale jažice i nanijela u njih uzorke pomiješane s brom-fenol plavom

bojom (u 2.5.4. nisam koristila boju već samo 50 %-tni glicerol dok sam boju nanijela u

susjednu jažicu da pratim kretanje molekula u gelu). Uz uzorke sam nanijela i biljeg veličine

fragmenata DNA. Elektroforezu sam provodila pri naponu od 80 V (u slučaju 2.5.4. 50 V) i

nakon završetka fragmente DNA vizualizirala na UV transiluminatoru (λ = 256 nm), tj.

fotografirala ih pomoću uređaja za snimanje agaroznih gelova Imagemaster®VDS

(Amersham Pharmacia Biotech, SAD).

*radna otopina je 1 × TAE pufer kojem se dodaje etidijev bromid u završnoj koncentraciji 1 µg ml–1

*otopina se priprema u reH2O, te se čuva na –20 °C


35

2.5.4. Metoda hibridizacije po Southern-u („Southern blotting“)

„Southern blotting“ je metoda hibridizacije nukleinskih kiselina kojom se utvrđuje

postojanje, smještaj i duljina nukleotidnog slijeda od interesa u npr. ukupnoj genomskoj

DNA. Dvolančani fragmenti DNA (dobiveni restrikcijskom razgradnjom ili metodom lančane

reakcije polimerazom) razdvajaju se elektroforezom u agaroznom gelu s obzirom na razlike u

duljini. Nakon toga na gel se položi najlonska membrana jednakih dimenzija te se lužnatim,

kapilarnim prijenosom fragmenti DNA prenose iz gela na membranu. Tijekom prijenosa

lužnati pufer, prolazeći kroz gel, denaturira dvolančane fragmente DNA te do pozitivno

nabijene najlonske membrane donosi i čvrsto veže jednolančane fragmente negativnog

naboja. Skidanjem membrane s gela fragmenti DNA zadržavaju međusobno jednak položaj

kao što su ga imali na gelu. Najlonska membrana s prenesenim fragmentima DNA izlaže se

tijekom prekonoćne inkubacije specifičnoj sondi DNA koja ciljano sjeda na isključivo sebi

komplementarne odsječke DNA. U procesu detekcije utvrđuje se položaj specifično vezane

sonde DNA, tj. fragmenta od interesa.

„Southern blotting“ koristila sam za provjeru ugradnje kanamicinske kazete unutar

ORF-a slr0192 tako da sam za sondu upotrijebila nukleotidni slijed veličine 621 pb unutar

Lslr0192 i Rslr0192 regija iz divljeg tipa Synechocystis sp. PCC 6803 porezan s

restrikcijskom endonukleazom NcoI. (Slika 9.).

Smjesu za restrikcijsku razgradnju genomske DNA priredila sam prema protokolu:

1,5 µg DNA Synechocystis sp. (2.5.1.3.)

15 U NcoI (Invitrogen, SAD)

1 × Reakcijski pufer REact® 3

Σ volumen 50 µl

Inkubacija preko noći na 37 °C.

Slika 9. Shematski prikaz konstrukcije specifične DNA sonde korištene u postupku hibridizacije po Southernu.

∆slr0192

WT


36

2.5.4.1. Elektroforetsko razdvajanje u agaroznom gelu

Fragmente dobivene restrikcijom pomoću enzima NcoI razdvojila sam elektroforezom u

agaroznom gelu. Materijal i postupak je opisan pod 2.5.3.

2.5.4.2. Inverzni prijenos fragmenata DNA iz gela na membranu

materijal

· Pufer za denaturaciju DNA: 1,5 M NaCl (85,6 g L–1)

0,4 M NaOH (16,0 g L–1)

· Pozitivno nabijene najlonske membrane

· Whatman 3MM papir

· Papirnati ubrusi

· 20 × SSC pufer: 3 M NaCl

0,3 M Na-citrat

pH 7,0

postupak

U dimenzijama gela izrezala sam jednu pozitivno nabijenu najlonsku membranu, snop

Whatman papira i jedan Whatman papir širine gela ali puno duži koji je poslužio kao most.

Pripremila sam dvije staklene ploče, malo veće od površine gela, uteg od 500 g, kadicu

te kadicu za namakanje papira (kadicu za „blotting“). Papirnate ubruse (debljine ~ 5 cm) sam

položila na površinu staklene ploče i stavila na njih nekoliko suhih Whatman papira. Jedan

Whatman papir sam namočila u pufer za denaturaciju DNA i položila na suhe papire.

Pažljivo sam stavila membranu kojoj sam prethodno odrezala gornji lijevi kut sa

škarama da znam kasnije točan položaj gela u odnosu na membranu. Zatim sam pažljivo

položila agarozni gel pazeći da nigdje nema mjehurića između slojeva i na njega još stavila tri

Whatman papira namočena prethodno u denaturacijski pufer. Jednu staklenu ploču sam

postavila na kadicu u kojoj se nalazio pufer te duži papir (namočen prethodno u pufer-most)

na vrh konstrukcije tako da su mu donji krajevi uronjeni u tekućinu u kadici ispod njega. Na

vrh sam postavila drugu staklenu ploču te uteg i ostavila da se prijenos fragmenata DNA

odvija preko noći (Slika 10.).


37

Sljedeći dan pažljivo sam rastavila konstrukciju i membranu isprala 3 × 5 min u

2 × SSC puferu (prije skidanja s gela sam označila na membrani položaj jažica s gela pomoću

grafitne olovke). Membranu sam izvadila na suhi filter papir i ostavila na sobnoj temperaturi 2

sata da se osuši. Zatim sam je položila između dva suha Whatman papira između dviju

staklenih ploča i učvrstila kvačicama. Sve zajedno sam stavila u suhi sterilizator na 120 °C 20

min da se fragmenti DNA fiksiraju na najlonskoj membrani.

Slika 10. Shematski prikaz inverznog prijenosa fragmenata DNA sa agaroznog gela na najlonsku membranu.


38

2.5.4.3. Obilježavanje DNA sonde digoksigeninom

materijal

· DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche, Njemačka) – komercijalni paket

· GFXTM PCR DNA and Gel Purification Kit (Amersham Biosciences, Velika Britanija)

– komercijalni paket

· 4 M LiCl



postupak

Koristila sam neradioaktivnu metodu obilježavanja sonde koja uključuje obilježavanje

steroidom digoksigeninom (iz biljke Digitalis purpurea) vezanim na dUTP (DIG–11-dUTP),

koji se pomoću podjedinice DNA polimeraze (enzima Klenow-a) ugrađuje u

novosintetizirajući lanac.

Lančanom reakcijom polimeraze prvo sam umnožila Lslr0192 i Rslr0192 nukleotidni

slijed iz divljeg tipa Synechocystis sp. PCC 6803 (2.5.2.) te zatim pripremila restrikcijsku

smjesu prema protokolu:

0,5 µg DNA (L+R slr0192 wt Synechocystis sp.)

10 U NcoI

1× Reakcijski pufer REact® 3

Σ volumen 50 µl


Željeni fragment DNA od 621 pb sam zatim razdvojila elektroforezom na agaroznom

gelu, izolirala i pročistila pomoću komercijalnog paketa GFXTM PCR DNA and Gel

Purification Kit. Na kraju izolacijskog postupka fragment sam eluirala redestiliranom vodom i

pohranila na –20 °C.

300 ng fragmenta DNA otopljenog u 15 µl reH2O denaturirala sam 10 min u tubici na

100 °C (u čaši kipuće vode). Čep tubice sam osigurala omotavši ga parafilmom i

aluminijskom folijom da ne bi došlo do isparavanja. Nakon denaturacije ohladila sam tubicu

na ledu kroz 5 min, sadržaj skupila na dnu kratkim centrifugiranjem i vratila na led.


39

Zatim sam pripremila reakcijsku smjesu pomoću komercijalnog paketa DIG DNA

Labeling and Detection Kit:

300 ng DNA fragment 1/10 volumena mješavine heksanukleotida (služe kao početnice za enzim Klenow-a) 1/10 volumena dNTP (1mM dATP, dCTP, dGTP, 0,65 mM dTTP i 0,35 mM DIG–11-dUTP)

2U Klenow enzima

Σ volumen 20 µl


Sljedeći dan sam reakcijsku smjesu zagrijala na 65 °C 10 min (inaktivacija DNA

polimeraze) da zaustavim reakciju. Obilježenu DNA sondu istaložila sam dodatkom 2,5 µl

LiCl i 75 µl ledenog 96 %-tnog etanola. Nakon što sam dobro promiješala na vrtložnoj

miješalici, uzorak sam ostavila preko noći na –20 °C. Sljedeći dan sam smjesu centrifugirala

10 min na 13 600×g/ 4 °C, bacila supernatant, a na talog dodala 500 µl 70 %-tnog etanola. Na

kraju sam centrifugirala smjesu 5 min na 13 600×g/ 4 °C, osušila talog na sobnoj temperaturi,

obilježenu sondu DNA otopila u 50 µl reH2O i pohranila na –20 °C.

2.5.4.4. Test za provjeru obilježenosti DNA sonde digoksigeninom

Točkastim testom obilježenosti sonde procjenjuje se kvaliteta DNA sonde. Točne upute

se mogu naći u uputama proizvođača komercijalnog paketa DIG DNA Labeling and

Detection Kit. Ja sam izvela pokus uz manje izmjene tako da sam napravila test kao pozitivnu

kontrolu sonde i to na sljedeći način:

Uzela sam mali komadić pozitivno nabijene najlonske membrane i na njega kapnula po

1 µl denaturirane neobilježene sonde (10 min u kipućoj vodi) u različitim razrjeđenjima npr.

1 : 1 (20 ng), 1 : 500 (0,04 ng), 1 : 1000 (0,02 ng). Membranu sam ostavila da se osuši na

zraku te zatim između filter papira i dva stakla fiksirala fragmente 20 min na 120 °C.

Komadić membrane sam tretirala paralelno s pravom membranom u postupku hibridizacije i

detekcije.


40

2.5.4.5. Hibridizacija

materijal

· Hibridizacijski pufer: 0,25 M fosfatni pufer pH 7,2 (Za 100 ml pufera :

72 ml 0,5 M Na2HPO4

28 ml 0,5 M NaH2PO4)

1 mM EDTA, pH 8,0

20 % SDS (natrij dodecil sulfat)

0,5 % blokirajući reagens (Roche, Njemačka)

· Digoksigeninom obilježena sonda DNA (2.5.4.3.)

· Pufer za ispiranje: 20 mM Na2HPO4

1 mM EDTA

1 % SDS

postupak

a) Prehibridizacija

U hibridizacijski cilindar sam stavila membranu u ~ 10 ml prethodno zagrijanog

hibridizacijskog pufera. Stranu membrane na kojoj su se nalazili DNA fragmenti sam

okrenula prema unutra. Postupak prehibridizacije sam provela 2 sata na 64 °C što odgovara

stupnju homologije između sonde i ciljnih fragmenata.

b) Hibridizacija

U čaši kipuće vode denaturirala sam DNA sondu 10 min na 100 °C u tubici osiguranoj

parafilmom i aluminijskom folijom. Iz hibridizacijskog cilindra sam izlila prehibridizacijski

pufer i dodala 10 ml svježeg pufera, prethodno zagrijanog na temperaturu hibridizacije.

Dodala sam sondu DNA u koncentraciji 25 ng sonde/ ml hibridizacijskog pufera i

hibridizirala na temperaturi od 64 °C preko noći.

c) Ispiranje nespecifično vezane DNA sonde

Slijedeći dan izlila sam iz cilindra hibridizacijski pufer koji je sadržavao sondu (može se

ponovo iskoristiti pa sam ga spremila na –20 °C ; treba ga denaturirati prije upotrebe 10 min

na 100 °C i zatim ohladiti na temperaturu hibridizacije).

U cilindar sam ulila ~ 50 ml prethodno zagrijanog pufera za ispiranje. Ispiranje sam

provela na 60 °C tri puta po 20 min.


41

2.5.4.6. Detekcija

materijal

· Pufer 1: 0,1 M maleinska kiselina

3 M NaCl

0,3 % Tween 20

pH 8,0

· Pufer 2: 1 % blokirajući reagens otopljen u puferu 1

· Pufer 3: 0,1 M Tris–HCl, pH 9,5

0,1 M NaCl

· Anti-DIG-AP konjugat (iz DIG DNA Labeling and Detection Kit)

· CDP-star (disodium 2-chloro-5-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-

(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decan}-4-yl)–1-phenyl phosphate), (Roche, Njemačka)

· Röntgen medicinski filmovi (Fotokemika, Hrvatska)

· Razvijač (Fotokemika, Hrvatska)

· Fiksir (Fotokemika, Hrvatska)

postupak

U kadici na tresilici inkubirala sam membranu prvo 5 min u puferu 1, zatim 30 min u

puferu 2. Razrijedila sam anti-DIG-AP konjugat u puferu 2 u omjeru

1 : 20 000 (2,5 µl u 50 ml pufera) i inkubirala 30 min. Nakon toga sam isprala membranu 5

puta po 10 min u puferu 1. Slijedila je inkubacija membrane 2 puta po 5 min u puferu 3.

Membranu sam zatim u kadici s puferom 3 odnijela u tamnu komoru. Pripremila sam

otopinu CDP-Star-a (u mraku u 1 ml pufera 3 dodala sam 10 µl CDP-Star-a) koju sam zatim

pažljivo nakapala na membranu prethodno izvađenu iz pufera 3 i osušenu s donje strane.

Membranu sam stavila u prozirnu plastičnu vrećicu koju sam pažljivo zatalila da ne

bude u njoj zraka i prstima jednoliko i pažljivo raspršila otopinu CDP Stara. Inkubirala sam je

u mraku 10 min, zatim sam odrezala ugao vrećice, pažljivo istisnula višak tekućine i ponovo

zatalila. U mraku sam membranu stavila u kazetu za razvijanje, preko nje Röndgenov film

koji sam prethodno izrezala na potrebnu veličinu i zatvorila kazetu. Vrijeme ekspozicije je

bilo manje od 5 min. U međuvremenu sam pripremila tri kadice koje su sadržavale razvijač,

vodu i fiksir.

Po završetku ekspozicije film sam stavila u razvijač (kada se slika počela pojavljivati

izvadila ga van), zatim u vodu gdje sam ga kratko isprala pa u fiksativ gdje je postao proziran.

Film sam isprala još jednom u vodi te ga osušila na sobnoj temperaturi.


42

2.5.4.7. Uklanjanje DNA sonde s membrane

materijal

· Pufer za skidanje DNA sonde: 0,2 M NaOH

0,1 % SDS

· 20 × SSC pufer

postupak

Ukoliko se ista membrana želi koristiti za novu hibridizaciju, može se s nje skinuti

sonda i to sam napravila tako da sam membranu isprala 2 puta po 15 min na 42 °C u

prethodno zagrijanom puferu za skidanje sonde (u hibridizacijskoj pećnici). Zatim sam je

isprala 3 puta po 5 min u 2 × SSC puferu, zatalila u vrećicu s 2 × SSC puferom i pohranila na

4 °C (valjanost i do godinu dana).


43

2.6. Osnovna fenotipska karakterizacija divljeg tipa i mutante

∆slr0192 Synechocystis sp. PCC 6803

2.6.1. Fotoautotrofne krivulje rasta

Za svaku liniju („ruski“ divlji i mutantni tip, „japanski“ divlji i mutantni tip) uzgojila

sam početnu kulturu stanica na OD730 nm oko 0,8. Kulture mutantnih tipova sadržavale su

konačnu koncentraciju antibiotika (25 µg ml–1 kanamicina).

Izlila sam 40 ml početne kulture u sterilnu Falkon tubu od 50 ml i centrifugirala stanice

5 min na 2760×g/ RT. Osiguravši da su sterilni uvjeti održani, bacila sam supernatant i

resuspendirala talog pomoću vrtložne miješalice u 5 ml BG–11 tekuće hranidbene podloge.

Napunila sam tubu s 40 ml BG–11 podloge i istaložila stanice 5 min na 2760×g/ RT. Ponovila

sam ispiranje još 2 puta da maknem sve tragove glukoze, tj. raznih produkata metabolizma.

Poslije zadnjeg ispiranja resuspendirala sam talog u 5 ml BG–11 podloge pomoću vrtložne

miješalice i osiguravši da je sve sterilno, odredila OD730nm (u razrjeđenju

1 : 100; 10 µl stanica u 1 ml BG–11 podloge) pomoću spektrofotometra.

Pripremila sam tikvice za uzgoj tekuće kulture stanica tako da sam izlila 150 ml BG–11

podloge i dodala antibiotik (25 µg ml–1 kanamicina) u one namijenjene za uzgoj mutantnog

tipa. Zatim sam dodala toliku količinu stanica da je početna OD730nm bila oko 0,05. Izmjerila

sam i zabilježila točnu OD730nm u početnoj vremenskoj točci. Pričvrstila sam pumpu na tikvice

i osigurala da je prozračivanje zrakom i osvjetljenje jednako za sve kulture. Uzimala sam po

tri uzorka kulture stanica od 1 ml svaka 24 sata tijekom 7 dana i mjerila OD730nm. Cijeli

postupak ponovila sam tri puta.


44

2.6.2. Ekstrakcija proteina i određivanje rodanazne aktivnosti

2.6.2.1. Ekstrakcija staničnih proteina

materijal

· Pufer za ispiranje: 5 mM Tris-HCl, pH 8,6

2 mM MgCl2

· Bradfordov reagens (matična otopina): 25 % metanol

42,5 % H3PO4

0,5 mg ml–1 Coomassie brilliant blue G

postupak

Iz tikvice sam izlila 40 ml tekuće kulture OD730nm 0,6 – 0,8 i centrifugirala 5 min na

5000×g/ RT da istaložim stanice. Nakon što sam ih isprala 2 puta u puferu za ispiranje

resuspendirala sam ih u 2 ml istog. Po 1 ml svake suspenzije cijanobakterijskih stanica sam

ispipetirala u Eppendorf tubice i stavila na led.

Stanice sam razbila pomoću ultrazvuka (Ultrasonic processor Cole-Palmer, SAD). Na

svakom uzorku primijenila sam 5 pulseva jačine 8 W trajanja 30 sek, s periodom hlađenja od

120 sekundi između svakog pulsa. Postupak sam izvodila na ledu.

Dobivenu homogenu smjesu centrifugirala sam 35 min na 13 600×g/ 4 °C da se istalože

cijele stanice i ostaci membrana. Supernatant sam koristila kao sirovi ekstrakt u kojem sam

odredila koncentraciju proteina metodom Bradforda (1976). Ova metoda temelji se na

mjerenju apsorbancije smjese proteinskog ekstrakta i reagensa pri valnoj duljini 595 nm. U

otopinu Bradforda (200 µl reagensa i 799 µl H2O) dodala sam 1 µl uzorka sirovog ekstrakta.

Koncentraciju proteina u svakom uzorku odredila sam očitavanjem baždarne krivulje dobivene

mjerenjem apsorbancije otopina serumskog goveđeg albumina poznatih koncentracija

(1 – 20 µg ml–1).

2.6.2.2. Određivanje rodanazne aktivnosti

materijal

· 1 M Tris–HCl, pH 8,6

· 0,25 M Na2S2O3

· 0,25 M KCN

· 36 %-tni formaldehid

· Reagens željeznog nitrata [100 g Fe(NO3)3 × 9 H2O i 200 ml 65%-tne HNO3 na 1000 ml)

Sve reagense je potrebno pripremati svježe i u reH2O.


45

m

mlJedinicamgJedinica proteina

// =

uznmSCN

srnm

V

FRVAmlJedinica

×Σ×

××=

460

..460

5/

postupak

Rodanaznu aktivnost mjerila sam u sirovom ekstraktu staničnih proteina modificiranom

kolorimetrijskom metodom po Westley-u (1981). Priredila sam reakcijsku smjesu prema

protokolu: 0,1 M Tris–HCl, pH 8,6

50 mM KCN

50 mM Na2S2O3

50 µl sirovog ekstrakta proteina

Σ volumen 500 µl.

Smjesu sam preinkubirala na 30 °C 5 min i reakciju pokrenula dodatkom Na2S2O3

Sama reakcija se odvijala na 25 °C kroz 5 min. Zaustavila sam je dodavanjem 250 µl 38 %-

tnog formaldehida. Smjesu sam centrifugirala 5 min na 13 600×g/ RT da uklonim suvišni

materijal koji bi mogao smetati spektrofotometrijskim očitanjima. Razvijanje boje postigla

sam dodavanjem 750 µl reagensa željeznog nitrata koji s tiocijanatom (SCN–) formira

crvenosmeđi kompleksni ion. Očitala sam A460nm pomoću spektrofotometra.

Kao slijepu probu upotrijebila sam reakcijsku smjesu koja je sadržavala denaturirani

umjesto svježeg proteinskog ekstrakta (zagrijavanjem 40 min u kipućoj kupelji na 100 °C

postiže se potpuna deaktivacija rodanaze) prema Singleton i Smith-u (1988).

Specifičnu rodanaznu aktivnost izrazila sam kao formiranje µmol SCN– min–1 mg

proteina–1 prema slijedećim formulama:

Jedinica/ml = jedinica po ml uzorka (1 jedinica će prevesti 1,0 µmola cijanida u tiocijanat po

minuti na pH 8,6 i 25 °C)

A460nm = apsorbancija mjerena na valnoj duljini od 460 nm

Vr.s. = ukupni volumen reakcijske smjese (1,5 ml)

FR = faktor razrjeđenja uzorka (30)

5 = faktor konverzije da bi se rezultat izrazio u minuti

ΣSCN 460nm = milimolarni ekstinkcijski koeficijent za tiocijanat (3,17)

Vuz = volumen uzorka (0,05 ml)

Jedinica/mg proteina = specifična rodanazna aktivnost

m = koncentracija ukupnih proteina u uzorku (2.6.2.1.) (mg ml–1)

[µmol SCN–1 min–1 ml–1]

[µmol SCN–1 min–1 mg proteina–1]


46

2.6.3. Snimanje apsorpcijskog spektra i autofluorescencije klorofila

Od svake kulture sam uzela 3 uzorka stanica iste OD730nm (~ 0,4) i snimila njihov

apsorpcijski spektar od 380 do 700 nm pomoću spektrofotometra UNICAM UV/Vis

Spectrometer UV4.

Autofluorescenciju klorofila, u Synechocystis stanicama divljeg i mutantnog tipa,

promatrala sam između 600 i 700 nm uz pomoć Leica TCS SP2 AOBS konfokalnog

mikroskopa.

2.6.4. Elektronska mikroskopija

materijal

· 2 %-tni agar

· Natrij kakodilatni pufer pH 7,2

· 1 %-tni glutaraldehid u kakodilatnom puferu

· 1 %-tni osmijev tetroksid (OsO4) u kakodilatnom puferu

· Etanol različitih koncentracija (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 96 %, 100 %)

· Propilen oksid (1,2 epoksi –propan, metiloksiran)

· Spurrovo sredstvo: 40 g ERL vinil-cikloheksen dioksid (C8H12O2)

32 g DER diglicil eter

104 g NSA nonenilsukcininski anhidrid (C13H20O3)

1,6 g S.1 dimetil amino etanol (C4H11NO)

· 4 %-tna vodena otopina uranil acetata

· Reynolds olovni citrat

postupak

a) Fiksacija

Sa BG–11 ploče uzela sam uzorak mutantnog i divljeg tipa stanica Synechocystis sp.

PCC 6803 tako da sam izrezala komadiće BG–11 krute podloge na čijoj površini su se

nalazile. Komadiće agara stavila sam u 2 ml 1 % glutaraldehida u kakodilatnom puferu (pH

7,2) na led (+2 °C) 30 min. Zatim sam te komadiće izvadila i uklopila u 2 %-tni agar te

izrezala pomoću žileta da dobijem blokove sa stanicama unutar agara. Blokove sam isprala u

2 ml kakodilatnog pufera 2 puta u trajanju od 10 min.


47

b) Postfiksacija

Uzorke sam prenijela u 1 %-tni osmijev tetroksid u kakodilatnom puferu i ostavila ih u

tome stajati 2 sata, nakon čega je slijedilo ispiranje 10 min u destiliranoj vodi.

c) Dehidracija

Blokovi su propušteni kroz seriju sve većih koncentracija etanola i to redom

50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 96 %. U svakoj od navedenih koncentracija uzorci su stajali po

10 min. Konačna dehidracija je postignuta tako da sam prenijela blokove u apsolutni etanol

(100 %) gdje sam ih ostavila stajati preko noći.

d) Uklapanje

Sljedeći dan sam uzorke premjestila u 1 : 1 mješavinu apsolutnog etanola i propilen

oksida gdje sam ih ostavila stajati 30 min i nakon toga u čisti propilen oksid ponovo 30 min.

Ovako fiksirani i dehidrirani materijal sam prenijela u mješavinu propilen oksida i Spurrovog

sredstva (1 : 1) u trajanju od 1 sata na 40 °C (propilen oksid ima temperaturu vrelišta na 34 –

35 °C pa on polako isparava ostavljajući samo sredstvo za uklapanje). Sljedeće sam stavila u

samo sredstvo za uklapanje gdje su uzorci stajali 5 sati na 40 °C s miješanjem sredstva svakih

sat vremena. Na kraju sam uklopila blokove u jažice prethodno napunjene Spurrovim

sredstvom i slijedila je polimerizacija u termostatu na 65 °C u trajanju od 2 dana.

e) Rezanje i bojanje prereza

Prereze različitih debljina (oko 90 nm) nastale pomoću Leica ultamikrotoma

kontrastirala sam u kapi 4 % vodene otopine uranil acetata 10 min. Nakon toga sam ih isprala

u destiliranoj vodi 1 min te nakon sušenja na filter papiru dehidrirala u kapi Reynolds olovnog

citrata 10 min. Slijedilo je ispiranje 1 min s destiliranom vodom zagrijanom na 60 °C.

Preparate sam gledala pomoću transmisijskih elektronskih mikroskopa Zeiss EM10A i

FEI Morgagni 268D.

3. REZULTATI

3. Rezultati

49

Slika 11. Djelomično sravnjenje aminokiselinskog slijeda slr0192 sa sljedovima reprezentativnih

sulfurtransferaza. Istaknut je jednoglasni slijed s označenim aktivnim mjestom i konzerviranim

cisteinskim ostatkom. Tamnosivom bojom označene su iste, a svijetlosivom bojom slične aminokiseline.

slr0192 –Syn: hipotetski protein Synechocystis sp., glpe-E.c: rodanazama sličan protein Escherichia coli,

p21-A.f: rodanazama sličan protein Acidithiobacilus ferrooxidans, rhod-B.t: mitohondrijska rodanaza iz

jetre Bos taurus, sud-W.s: sulfidna dehidrogenaza Wolinella succinogenes. DDBJ/EMBL/GenBank

pristupni brojevi: slr0192-Syn: BAA10411; glpe-E.c: M96795; p21-A.f: AJ312238; rhod-B.t: M58561;

sud-W.s: X81642.

3.1. Analiza aminokiselinskog slijeda slr0192

3.1.1. Homologija slr0192 i reprezentativnih rodanaza

Otvoreni okvir čitanja (ORF) označen slr0192, identificiran u genomu cijanobakterije

Synechocystis sp. PCC 6803, kodira protein od 114 aminokiselinskih ostataka s izračunatom

molekularnom masom od 12 767 Da. Izvedeni aminokiselinski slijed posjeduje određenu

sličnost s grupom proteina karakteriziranih kao sumporne transferaze, rodanaze (EC 2.8.1.1.),

iz drugih organizama. Sličnost između tih proteina ograničena je na katalitičke domene koje

posjeduju konzervirani cisteinski ostatak u aktivnom mjestu. Najveću sličnost slr0192 ima s

proteinima koji sadrže jednu rodanaznu domenu, a to su GlpE iz E. coli (19,44 %) i Sud iz

W. succinogenes (21,05 %). Postotak sličnosti s ostalim referentnim sljedovima za ovu grupu

enzima je nešto manji, za goveđu rodanazu 12,28 % i za protein p21 A. ferrooxidans 11,40 %

(Slika 11.).

3. Rezultati

50

3.1.2. Analiza proteina s rodanaznom domenom iz Synechocystis sp. PCC

6803

U genomu cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803 nalazi se 5 ORF-ova čiji proteini

posjeduju aktivnu rodanaznu domenu s potencijalno katalitičkim cisteinom. To je

ustanovljeno pretragom baze podataka CyanoBase pomoću BLASTP programa sa slr0192 i

reprezentativnim rodanazama kao upitom. Katalitičko mjesto se sastoji od 6 aminokiselina na

čijem je početku aktivni cisteinski ostatak i čiji je jednoglasni slijed Cys-X-X-Gly-X-Arg.

Analiza sekundarne strukture tih pet sljedova otkrila je različita svojstva pripadajućih

proteina. Predviđene subcelularne lokalizacije upućuju da se radi o citoplazmatskim,

periplazmatskim i membranskim proteinima s različitim brojem transmembranskih domena.

Molekularne mase su im u rasponu od 12,7 do 42,7 kDa, a izoelektrične točke (pI) od 4,9 do

9,0. Samo je sll1536 dodijeljena moguća funkcija u CyanoBase usporedbom potencijalnog

aminokiselinskog slijeda s drugim genomima, ostali proteini označeni su kao hipotetski jer

sliče proteinima nepoznate funkcije u drugim organizmima. Točan popis ORF-ova s

pripadajućim obilježjima može se vidjeti u Tablici 5.

Slika 12. Višestruko sravnjenje aminokiselinskih sljedova koji pokazuju sličnost s rodanazama iz

genoma Synechocystis sp PCC 6803. Istaknut je jednoglasni slijed s označenim aktivnim mjestom

(Cys-X-X-Gly-X-Arg) i konzerviranim cisteinskim ostatkom. Tamnosivom bojom označene su iste, a

svijetlosivom bojom slične aminokiseline.

3. Rezultati

51

Tablica 5. Neke karakteristike ORF-ova prisutnih u genomu cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803

koji posjeduju rodanaznu domenu.

oznaka ORF-a

broj aminokiselina

molekularna masa (Da)

teoretski pI

moguća funkcija

predviđena subcelularna lokalizacija

transmembranske

domene

sll1536 392 42 759 4,93 MoeB biosinteza molibdopterina

membrana 2

sll0765 278 31 166 6,01 hipotetski protein, citoplazma 0

slr1184 164 17 903 7,76 hipotetski protein, periplazma 1

slr1261 179 19 068 9,00 hipotetski protein, membrana 2

slr0192 114 12 767 4,90 hipotetski protein citoplazma 0

3. Rezultati

52

3.2. Transformacija cijanobakterija

U postupku transformacije cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803 korištene su

kulture stanica „japanske“ i „ruske“ linije. One su transformirane s obje verzije plazmidnog

vektora (pBsc0192K (+) i pBsc0192K (–)). Selektivni biljeg bila je otpornost na antibiotik

kanamicin koji je dodavan u podlogu za selekciju mutanata. Kanamicin uzrokuje pogrešno

čitanje mRNA vezujući se na 70S ribosome prokariotskih stanica, a otpornost se postiže

postojanjem gena koji kodira za enzim aminoglikozid fosfotransferazu, inaktivator

antibiotika. Nakon transformacije divljih tipova prošlo je više od tri tjedna dok su se počele

pojavljivati pojedinačne kolonije. Slijedilo je presađivanje kolonija na podloge s postupno

višom koncentracijom antibiotika te kroz 6 tjedana na podloge s konačnom koncentracijom

kanamicina (Slika 13.).

Slika 13. Pojedinačne kolonije transformiranih cijanobakterija na podlozi s konačnom koncentracijom

kanamicina (25µg ml–1

).

3. Rezultati

53

U slijedećim eksperimentalnim postupcima korištene su obje linije divljeg tipa i dvije

linije mutanata ∆slr0192. Mutante su bile kulture stanica „ruske“ linije transformirane s

pBsc0192K (–), u daljnjem tekstu označene „rus rev“ i kulture stanica „japanske“ linije

transformirane s pBsc0192K (+), u daljnjem tekstu označene s „jap forw“ (Slika 14.).

Slika 14. Rast mutanata ∆slr0192 na podlozi s kanamicinom (lijeva strana ploče) gdje divlji tip ne raste

(desna strana ploče).

3. Rezultati

54

3.3. Provjera mutantnog genotipa ∆slr0192 Synechocystis sp. PCC

6803

3.3.1. Lančana reakcija polimerazom

Uspješnost transformacije cijanobakterijskih stanica i potpuna segregacija inaktiviranog

gena (postojanje u svim kopijama cijanobakterijskog genoma) provjerava se na više načina.

Prvi način je provjera PCR-om. Radi provjere valjanosti početnica prvo su umnoženi

Lslr0192 i Rslr0192 sljedovi nukleotida (Slika 15.). Rezultati su pokazali da se ti sljedovi

mogu umnožiti pomoću odgovarajućih početnica i da su iste veličine u uzorcima mutanata i

divljih tipova.

Nakon toga je uspješnost ugradnje KanR kazete provjerena PCR reakcijom s krajnjim

početnicama Lslr0192 i Rslr0192 nukleotidnih sljedova te je u mutanata utvrđeno da se

između njih nalazi ugrađen fragment od oko 1,2 kb što odgovara veličini KanR kazete.

Nepostojanje signala na veličini od oko 1000 pb u mutanata ukazuje na potpunu segregaciju

inaktiviranog gena, tj potvrđuje njegovu prisutnost u svim kopijama cijanobakterijskog

genoma (Slika 16.).

Slika 15. Elektroforeza PCR produkata u 1,2 %-tnom agaroznom gelu. Pruge 1 i 10: biljezi veličine

fragmenata DNA, „1 kb DNA Ladder” i „Gene Ruler™ ”. Pruga 2: wt „ruske“ linije. Pruga 3: wt

„japanske“ linije. Pruga 4: ∆slr0192 „rus rev“. Pruga 5: ∆slr0192 „jap forw“. Lslr0192 regija veličine oko

560 pb. 6,7,8,9: Rslr0192 regija veličine oko 430 pb, isti redoslijed uzoraka kao u 2,3,4,5.

3. Rezultati

55

3.3.2. Metoda hibridizacije po Southernu

Specifična DNA sonda veličine 621 pb pripremljena je restrikcijskom razgradnjom

L+Rslr0192 slijeda nukleotida iz divljeg tipa Synechocystis sp. PCC 6803 pomoću enzima

NcoI. Veličina fragmenta provjerena je elektroforezom u agaroznom gelu (Slika 17.).

Slika 16. Elektroforeza PCR produkata u 0,7 %-tnom agaroznom gelu. Razlika u veličini između

umnoženih fragmenata iz divljih tipova i mutanata potvrđuje ugradnju KanR kazete veličine 1,2 kb u

mutanata. Pruge 1 i 7: biljezi veličine fragmenata DNA, „1 kb DNA Ladder”. Pruga 2: wt „ruske“ linije.

Pruga 3: wt „japanske“ linije. Pruga 4: ∆slr0192 „rus rev“. Pruga 5: ∆slr0192 „jap forw“. Pruga 6:

negativna kontrola.

Slika 17. Elektroforeza DNA fragmenta u 0,7 %-tnom agaroznom gelu. Pruga 1: biljeg veličine fragmenata

DNA „Gene Ruler™ ”. Pruga 2: fragment DNA veličine 621 pb koji će poslužiti kao sonda u postupku

hibridizacije.

3. Rezultati

56

Fragmenti ukupne genomske DNA sve 4 linije, divljih tipova i mutanata, nakon

restrikcijske razgradnje s NcoI razdvojeni su elektroforezom u agaroznom gelu (Slika 18.).

Analiza rezultata hibridizacije NcoI razgrađene genomske DNA Synechocystis sp. PCC

6803 metodom po Southernu pokazala je razliku u veličini fragmenata između divljeg tipa i

mutanata, na koje se vezala specifična DNA sonda obilježena digoksigeninom. U genomskoj

DNA divljeg tipa „ruske“ i „japanske“ linije položaj obilježene DNA sonde odgovara manjem

fragmentu nego položaj u genomskoj DNA insercijskih mutanata. Na taj način potvrđena je

integracija kazete s antibiotikom u obje linije mutanata i uspješnost potpune segregacije

inaktiviranog gena zbog izostanka signala u mutanata koji odgovara veličini fragmenta iz

divljeg tipa (Slika 19.).

Slika 18. Elektroforeza genomske DNA nakon restricijske razgradnje s NcoI u 0,7 %-tnom agaroznom

gelu. Pruge 1 i 6: biljezi veličine fragmenata DNA „1 kb DNA Ladder”. Pruga 2: wt „ruske“ linije. Pruga

3: ∆slr0192 „rus rev“. Pruga 4: wt „japanske“ linije. Pruga 5: ∆slr0192 „jap forw“.

3. Rezultati

57

Slika 19. Potpuna segregacija inaktiviranog ORF-a slr0192 u ∆slr0192 „rus rev“ i „jap forw“ mutantnim

stanicama potvrđena metodom hibridizacije po Southernu. (A) Rezultat testa za provjeru obilježenosti DNA sonde digoksigeninom A 20 ng sonde B 0,04 ng C

0,02 ng.

(B) Hibridizacija genomske DNA Synechocystis sp. Pruga A wt „ruske“linije. Pruga B: ∆slr0192 „rus

rev“. Pruga C: wt „japanske“ linije. Pruga D: ∆slr0192 „jap forw“. Istaknute vrijednosti su u pb.

A

B

3. Rezultati

58

3.4. Fotoautotrofne krivulje rasta

Na slici 20. prikazane su krivulje rasta divljih tipova i ∆slr0192 insercijskih mutanata.

Dana je usporedba pojedine linije divljeg tipa i njegove mutante zasebno. U slučaju „ruske“

linije mutanta je pokazivala neznatno brži rast od divljeg tipa, dok je u slučaju „japanske“

linije situacija bila obratna.

Slika 20. Krivulje rasta Synechocystis sp. PCC 6803 divljih tipova i insercijskih mutanata ∆slr0192 u

standardnim uvjetima uzgoja (20-30 µmolfotonam–2

s–1

, 30 °C, BG-11 podloga)

(A) usporedba wt „ruske“ linije i ∆slr0192 „rus rev“

(B) usporedba wt „japanske“ linije i ∆slr0192 „jap forw“

Prazni simboli predstavljaju divlje tipove, a puni simboli mutante. Prikazani podaci su srednja vrijednost

± standardna devijacija za 3 neovisna mjerenja.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168

Vrijeme (sati)

OD

na

73

0n

m

"rus rev"

wt "rus"A

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 24 48 72 96 120 144 168

Vrijeme (sati)

OD

na

73

0 n

m

wt "jap"

"jap forw"B

3. Rezultati

59

3.5. Rodanazna aktivnost

Aktivnost enzima rodanaze određena je u staničnim proteinskim ekstraktima kultura

divljeg tipa „japanske“ i „ruske“ linije te u kulturama mutanata ∆slr0192 „jap forw“ i

„rus rev“ linije. Upotrijebljena metoda zasniva se na spektrofotometrijskoj kvantifikaciji

rodanida (tiocijanatnog iona, SCN–). Zabilježene vrijednosti specifične rodanazne aktivnosti u

rasponu su od 0,34 ± 0,22 – 0,72 ± 0,53 µmol SCN– min–1 mg–1 proteina. Najveća vrijednost

zabilježena je u kulturi divljeg tipa“ruske linije“ (0,72 jedinica mg–1 proteina), dok je u kulturi

divljeg tipa „japanske“ linije ona znatno manja (0,34 jedinica mg–1 proteina). Rodanazna

aktivnost u kulturama mutanata ima približno istu vrijednost (0,41 ± 0,27 i 0,38 ± 0,15

jedinica mg–1 proteina).

Specifična rodanazna aktivnost (µmol SCN– min–1 mg–1 protein)

WT „jap“ 0,343 ± 0,219

∆slr0192 „jap forw“ 0,408 ± 0,272

WT „rus“ 0,717 ± 0,530

∆slr0192 „rus rev“ 0,384 ± 0,155

Tablica 6. Rodanazna aktivnost mjerena u sirovim ekstraktima stanica Synechocystis sp. PCC 6803.

Vrijednosti predstavljaju srednje vrijednosti ± standardna devijacija za 4 neovisna mjerenja.

3. Rezultati

60

3.6. Apsorpcijski spektar stanica i autofluorescencija klorofila

Pomoću spektrofotometra analizirani spektar stanica valnih duljina od 400 do 700 nm

prikazuje maksimume apsorpcije koji odgovaraju valnim duljinama na kojima apsorbiraju

pojedini pigmenti. Klorofil a apsobira na valnim duljinama od 440 i 680 nm, fikoeritrin na

570 nm, fikocijanin na 630 nm, alofikocijanin na 650 nm, karoteni na 480 nm. Apsorpcijski

spektri mutanata u usporedbi s divljim tipovima ne razlikuju se značajno u apsorpcijskim

maksimumima pojedinih pigmenata što upućuje na jednaki sastav i količinu pigmenata u

mutantnim stanicama i divljem tipu.

Slika 21. Apsorpcijski spektar stanica Synechocystis sp. PCC 6803 od 400 do 700 nm. (A) „japanska“linija

divlji tip i ∆slr0192 “jap forw“ mutanta (B) „ruska“ linija i ∆slr0192 „rus rev“ mutanta.

A

B

3. Rezultati

61

Promatrana je i autofluorescencija klorofila u stanicama divljeg tipa i mutanata pomoću

konfokalnog mikroskopa. Intenzitet fluorescencije je jednak što upućuje da nema oštećenja

fotosintetskog aparata kao posljedica inaktivacije gena slr0192. Za pobuđivanje

autofluorescencije klorofila korištena je svjetlost valne duljine 594 nm, a promatrana je

između 600 i 700 nm. Snimljene su fazno kontrastne fotografije uzoraka i u vidljivom dijelu

spektra.

Slika 22. Stanice Synechocystis sp. PCC 6803 snimljene konfokalnim mikroskopom (A) stanice divljeg

tipa “japanske” linije (B) stanice mutantnog tipa ∆slr0192 „jap forw“. Na lijevoj strani su fotografije

autofluorescencije klorofila, a na desnoj fazno kontrastne u vidljivom dijelu spektra.

B

A

3. Rezultati

62

3.7. Elektronska mikroskopija

Stanice Synechocystis sp PCC 6803 uzgajane na pločama, u prisutnosti i odsutnosti

sumpora u hranidbenoj podlozi, analizirane su elektronskim mikroskopom. Promatrane su

stanice „ruske“ i „japanske“ linije koje pokazuju slične morfološke promjene s obzirom na

eksperimentalne uvjete. Slika 23. prikazuje divlji tip stanica uzgajan na potpunoj hranidbenoj

podlozi (A), (C) i u uvjetima gdje je sumpor uklonjen iz podloge (B), (D). Stanice koje su

rasle u normalnim uvjetima pokazuju uobičajenu morfologiju. Tilakoidne membrane nalaze se

na periferiji stanice u koncentričnom rasporedu s dobro vidljivim fikobilisomima. Dobro je

vidljiv i polisaharidni omotač, te 4 sloja stanične stijenke. Periplazmatski prostor je cjelovit,

neprekinut i homogen, plazmatska membrana je vezana uz staničnu stijenku. Stanice koje su

rasle u uvjetima nedostatka sumpora pokazuju morfološke promjene koje se očituju

prvenstveno u izgledu tilakoidnih membrana. Dolazi do njihove deformacije i postepene

degradacije te nisu više u pravilnom koncentričnom rasporedu.

Slika 23. Elektronska mikroskopija stanica divljeg tipa uzgajanih na potpunoj hranidbenoj podlozi

(A) (C) i podlozi iz koje je uklonjen sumpor (B) (D). Povećanja su 16 000 : 1 (A) (B) i (C) i 12 500 : 1 (D).

Linija predstavlja 300 nm.

B A

C D

3. Rezultati

63

Stanice s inaktiviranim genom slr0192 pokazuju slične morfološke promjene s obzirom

na stres izazvan nedostatkom makronutrijenta. U stanica uzgajanih na kompletnoj hranidbenoj

podlozi raspored tilakoidnih membrana je koncentričan i pravilan dok se u stanica uzgajanih

na podlozi s nedostatkom sumpora on gubi (Slika 24.).

Sve analizirane stanice su se nalazile u kasnoj eksponencijalnoj fazi.

Slika 24. Elektronska mikroskopija ∆slr0192 stanica uzgajanih na potpunoj hranidbenoj podlozi (A i C) i

podlozi iz koje je uklonjen sumpor (B i D). Povećanja su 12 500 : 1 (A i D), 16 000 : 1 (B i C). Linija

predstavlja 300 nm.

A B

C D

3. Rezultati

64

Slika 25. Kulture cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803 nakon 7 dana u hranidbenoj podlozi bez

dodatka sumpora. Kulture divljeg tipa „ruske“ i „japanske“ linije u podlozi bez sumpora (wt“rus“-S i

wt“jap“-S) su primjetno svjetlije i žućkastije boje od ostalih kultura.

3.8. Makroskopska opažanja preživljavanja stanica u kulturama

bez dodatka sumpora u hranidbenoj podlozi

Promatrajući tekuće kulture mutanata i divljih tipova cijanobakterije Synechocystis sp.

PCC 6803 u BG–11 normalnoj hranidbenoj podlozi i onoj iz koje je uklonjen sumpor uočila

sam vidljivu razliku u obojenosti. Nakon vremenskog perioda od 7 dana u podlozi bez

sumpora kultura divljeg tipa obje linije je znatno svjetlije, žućkaste boje (kloroza). Nakon 14

dana iste kulture potpuno izgube boju što je znak ugibanja stanica. Kulture mutanata s

inaktiviranim genom slr0192 su čitavo vrijeme zelene boje u podlozi bez dodatka sumpora.

Nakon više od 21 dan i one postanu bezbojne, dolazi i do njihovog ugibanja. Kulture divljeg

tipa mutanata i u normalnoj hranidbenoj podlozi kao kontroli identične su boje tijekom

čitavog vremena. Opažanje je ponovljeno 3 puta u nezavisno inokuliranim kulturama

3. Rezultati

65

Slika 26. Kulture cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803 nakon 14 dana u hranidbenoj podlozi bez

dodatka sumpora. Kulture divljeg tipa (A) „ruske“ (wt“rus“-S) i (B) „japanske“ (wt“jap“-S) linije u

podlozi bez sumpora su bezbojne što je znak ugibanja stanica.

A

B

4. RASPRAVA

4. Rasprava

67

4.1. Funkcija slr0192 kao sumporne transferaze - rodanaze

Unutar genoma Synechocystis sp. PCC 6803 identificirano je 5 ORF-ova za koje je

utvrđeno da sadrže rodanaznu domenu. Svaki od tih potencijalnih proteina posjeduje različite

karakteristike te su najvjerojatnije uključeni u sasvim drugačije procese i obavljaju različite

funkcije unutar organizma. U ovom radu pristupilo se pobližem istraživanju jednog od njih,

malog topivog proteina. Analiza aminokiselinskog slijeda gena slr0192 pokazala je određenu

sličnost s reprezentativnim predstavnicima iz porodice rodanaza. Najveću sličnost slijed je

posjedovao s proteinima GlpE i Sud koji pripadaju jednoj od tri grupe oblika u kojima se

rodanazne domene pojavljuju i to onoj kod koje se čitav protein sastoji od katalitičke domene

s konzerviranim cisteinskim ostatkom. BLASTP pretraživanjem genoma ostalih

cijanobakterija pronađeni su homolozi, alr4043 u Anabaena sp. PCC 7120 i tll0044 u

Thermosynechococcus elongatus, oba proteina su opisana kao hipotetski i ne postoje

eksperimentalni podaci o njima. Proteini homologni slr0192 postoje i u nefotosintetskim

bakterijama. Najveća sličnost od 81 % pronađena je s genom iz nefotosintetske morske

slobodnoživuće bakterije Rhodopirellula baltica, označenim kao moeB, molibdopterin

sintetaza-sulfurilaza, koji ima 114 aminokiselinskih ostataka kao i slr0192.

Za rodanaze kao grupu proteina pretpostavlja se da su se dosta rano pojavile u

evolucijskoj prošlosti, u prilog tome govori pretpostavka da se jedan od prvih mutacijskih

događaja, duplikacija gena zbog koje se kasnije u njihovoj strukturi javljaju katalitički aktivne

C-terminalne i neaktivne N-terminalne domene, dogodio vjerojatno prije podjele živih

organizama na Archaea, Bacteria i Eucarya (Bordo i Bork 2002). Za pretpostaviti je da je

usporedno s evolucijskim razvojem fotosinteze i ostalih biokemijskih procesa tekao i razvoj

porodice rodanaza kod kojih se javila raznolikost u izboru supstrata i vršenju katalitičkih

procesa. Kad se pristupa istraživanju određene rodanaze iz bilo koje vrste stanica i organizma

jedan od prvih koraka je određivanje aktivnosti enzima. Kod animalnih stanica je to relativno

jednostavno, primjenjuje se kolorimetrijska metoda po Sorbu (1955) te je npr. Westley (1981)

u ekstraktu proteina iz jetre zabilježio enzimatsku aktivnost za goveđu mitohondrijsku

rodanazu u vrijednosti 4,3 µmol SCN– min–1 mg proteina–1.

Kod biljaka teško je bilo dugo vremena uopće dokazati postojanje sumpornih

transferaza, no kompjuterskom analizom pretpostavljeno je postojanje 18 proteina s jednom

ili dvostrukom rodanaznom domenom (Pappenbrock i Bauer 2002). Hatzfeld i Saito (2000) su

zabilježili rodanaznu aktivnost u izolatima topivih staničnih proteina u nadzemnom dijelu

biljaka od 0,0231 i 0,1294 µmol SCN– min–1 mg proteina–1 u korijenu.

4. Rasprava

68

Zabilježene mjerene razine enzimatskih aktivnosti u ekstraktima proteina različitih

prokariotskih organizama razlikuju se ovisno o načinu života pojedinih prokariota. Ramirez i

sur. (2002) mjerenjem su za rodanaznu aktivnost u A. ferrooxidans, kemolitoautotrofnoj

bakteriji dobili vrijednosti oko 0,250 µmol SCN– min–1 mg proteina–1 dok su Gardner i

Rawlings (2000) za istu vrstu dobili vrijednosti u rasponu 6,4-8,2 µmol SCN– min–1 mg

proteina–1. Enzimatske vrijednosti detektirane za patogenu, gram-negativnu bakteriju

Pseudomonas aeruginosa iznose 0,12 µmol SCN– min–1 mg proteina–1. Za slobodnoživuću

bakteriju Saccharopolyspora erythraea Donadio i sur. (1990) zabilježili su vrijednosti

1 – 2 µmol SCN– min–1 mg proteina–1. Razina neenzimske katalize u rodanaznoj reakciji

posredovana tiolima i nekim metalnim kompleksima predstavlja potencijalni problem kada se

upotrebljavaju uzorci iz izvora koji sadrže vrlo male količine enzima, kao što su sirovi

proteinski ekstrakti biljnih stanica i prokariotskih organizama (Westley 1981) pa je u ovom

istraživanju primijenjena modifikacija klasične kolorimetrijske metode po Singleton i Smithu

(1988). U literaturi nisu nađeni podaci o vrijednostima mjerene rodanazne aktivnosti kod

fotosintetskih prokariota te se vrijednosti dobivene ovim istraživanjem ne mogu usporediti s

drugima. Najveća vrijednost bila je zabilježena u kulturi divljeg tipa“ruske linije“ (0,72 µmol

SCN– min–1 mg proteina–1) dok je u kulturi divljeg tipa „japanske“ linije ona iznosila znatno

manje (0,34 µmol SCN– min–1 mg proteina–1). Rodanazna aktivnost u kulturama mutanata ima

približno istu vrijednost (0,41 i 0,38 SCN-min-1mg proteina-1). Pošto se može izmjeriti

rodanazna aktivnost neovisno o inaktiviranom genu moguće je da ona potiče i od druge 4

rodanaze koje je nadopunjuju.

Schmidt (1988) je zabilježio da u stanicama Synechococcus sp. koje rastu u podlozi bez

sumpora dolazi do malog povišenja u aktivnosti enzima rodanaze i tiosulfat reduktaze.

Rodanazna aktivnost u ovom radu je dokazana i izmjerena za stanice Synechocystis sp. u

normalnim uvjetima. Jedan od budućih pokusa trebao bi istražiti pretpostavku da je ta

katalitička aktivnost funkcija u procesu aklimatizacije proučavane vrste cijanobakterija na

uvjete nedostatka sumpora.

4. Rasprava

69

4.2. Moguća uloga slr0192 u metabolizmu sumpora

Unatoč tome što istraživanja proteina s rodanaznom domenom in vivo u prokariotskim

organizmima pokazuju da prokariotski rodanazni mutanti nemaju prepoznatljiv fenotip, u

većini je pretpostavljena njihova uloga u metabolizmu sumpora.

Za neke periplazmatske rodanaze poput p21 iz A. ferrooksidans (Ramirez i sur. 2002) i

rhdA iz Synechococcus sp. (Laudenbach i sur. 1991) utvrđeno je da su dio operona koji je

uključen u metabolizam sumpora. Kod gena slr0192 nije takav slučaj (Slika 4.) ali svejedno

ne možemo isključiti njegovu potencijalnu ulogu u tom metabolizmu. Da bi pokušali

odgovoriti na to pitanje, stanice Synechocystis sp. PCC 6803 su podvrgnute stresnim uvjetima

gdje im je uskraćen izvor sumpora u hranidbenoj podlozi.

Biološka uloga sumpora vodi do prvih događaja u početku života, koji su mogli nastati

kao katalitičke reakcije na FeS površini pod anaerobnim, hidrotermalnim uvjetima (Nisbet i

Sleep 2001). U sadašnjoj atmosferi atom sumpora postoji najviše u +6 valentnom stanju u

obliku sulfata (oksidirani oblik). Živi sustavi ovisni su o reduciranom sumporu u

aminokiselinama cisteinu i metioninu za formiranje proteina i sintezu koenzima (glutationa,

koenzima A, željezo sumpornih proteina, molibdenskog kofaktora – MoCo, biotina i tiamina).

S obzirom da je usporedno s razvojem biokemijskih procesa tekao i razvoj porodice rodanaza,

može se pretpostaviti da su različiti predstavnici uključeni na određene načine u tom drevnom

metabolizmu. Osim pretpostavljene uloge u mobilizaciji sumpora za biosintezu i popravak

željezo sumpornih centara u proteinima (Pagani 1984), rodanaze mogu imati ulogu i u

formiranju drugih koenzima poput sinteze molibdopterina. Molibdopterin kao tiamin te

tiouridin sintetaze imaju zajedničko to što sadrže rodanaznu domenu. Baš u tom dijelu leži

moguća uloga slr0192. Podatak koji ide tome u prilog je već spomenuta pronađena

homologija između proteina iz bakterije Rhodopirellula baltica, označenim kao moeB,

molibdopterin sintetaza-sulfurilaza. Podatak koji govori protiv toga je da na temelju

homologije već dodijeljena ta funkcija u biosintezi molibdopterina sll1536 – MoeB unutar

genoma Synechocystis sp.. MoeB je aktivirajući enzim molibdopterin sintaze na čijim

podjedinicama stvara SH grupe koje se prebacuju dalje na preteču kofaktora MoCo. Atom

molibdena dodaje se kasnije da bi se stvorila aktivna forma kofaktora. Uloga slr0192 možda

leži negdje u tom metaboličkom putu biosinteze folata gdje je u mogućnosti prenijeti atom

sumpora. Također ne može se isključiti niti moguća uloga u metabolizmu cisteina gdje se

može pretpostaviti da sumporna transferaza može prenijeti reducirani sumpor od

odgovarajuće reduktaze do cistein sintaze (Schmidt i Jäger 1992).

4. Rasprava

70

U literaturi je zabilježeno da cijanobakterije prolaze kompleksni set generalnih

morfoloških i fizioloških promjena kad im se uskrati izvor esencijalnih makroelemenata kao

što su dušik, željezo, fosfor i sumpor. To uključuje prestanak stanične diobe, smanjenje u

broju tilakoidnih membrana, stanice postaju svjetlije i žućkastije (kloroza) jer dolazi do

gubitka pigmenata (klorofila, fikobiliproteina, svih karotenoida osim zeaksantina),

degradacije i isključivanja funkcija fotosustava II. Smatra se da ti aklimatizacijski procesi

sprečavaju oštećenja uzrokovana svjetlom u stresnim uvjetima gdje stanica ima ograničeni

kapacitet za metabolizam tvari koje sadržavaju sumpor (proteina). Osim tih generalnih

odgovora postoje i specifični odgovori na manjak pojedinog nutrijenta. Vizualno dramatičan

specifičan odgovor zabilježen je kod cijanobakterije Synechococcus sp. PCC 7492 koji se

očituje u gubitku većine njihove pigmentacije radi degradacije fikobilisoma tijekom rasta na

ograničenom izvoru sumpora i dušika. Također zabilježena je i akumulacija spremišnih tvari,

polifosfata i karakterističnih lipidnih tijela koja se sastoje od poli-β-hidroksi butirne kiseline

te zadebljanje stanične stijenke. Specifičan odgovor na nedostatak sumpora uključuje i

povećanu stopu transporta sulfata u stanicu te povećanje sposobnosti iskorištavanja sumpora i

iz drugih izvora, ne samo sulfata i tiosulfata već i cisteina. Kod Synechococcus sp. PCC 7492

primijećeno je da serija fizioloških promjena uzrokovana nestašicom sumpora završava kad

stanica uđe u dormantno stanje u kojem može ostati vijabilna određeni vremenski period.

(Laudenbach i sur. 1991). U ovom istraživanju stanice divljeg tipa i stanice s nefunkcionalnim

genom slr0192 podvrgnute su uvjetima nedostatka sumpora u krutoj hranidbenoj podlozi

tijekom perioda od tri tjedna i zatim pregledane pod elektronskim mikroskopom. Zapažena je

promjena u izgledu i strukturi tilakoidnih membrana no u stanicama nije utvrđeno postojanje

očekivanih spremišnih tvari koje su trebale biti vidljive u obliku inkluzija unutar stanica koje

zauzimaju do 10% staničnog volumena (Wanner 1986). Pojava nije zapažena niti kod

mutantnih niti kod linija divljeg tipa. Postoji mogućnost da ova vrsta ne akumulira te tvari jer

je u prethodnim istraživanjima bila u pitanju vrsta Synechococcus 6301. Također, nije

primijećena nikakva značajna razlika u izgledu ultrastrukture između stanica divljeg tipa i

mutanata ∆slr0192 što je pokazatelj da se njegova uloga ne može pronaći u procesima

formiranja membrana ili ostalih staničnih struktura.

Makroskopska opažanja preživljavanja stanica u uvjetima nedostatka sumpora u tekućoj

hranidbenoj podlozi nude potencijalne prijedloge za smjer daljnjih istraživanja, koja bi trebala

uključivati fenotipsku karakterizaciju mutanata pod različitim okolišnim uvjetima kao što je

manjak drugih nutrijenata poput dušika i željeza te uvjeti jakog svjetla koje također dovodi do

4. Rasprava

71

inhibicije fotosintetskog aparata i promjena unutar cijanobakterijskog organizma. Naime,

postoji mogućnost da je slr0192 protein povezan s odgovorom stanice na stres.

Istraživanja specifičnih odgovora u prilagodbi na nedostatak sumpora proučavani u

drugim organizmima nisu zabilježena u literaturi za vrstu Synechocystis sp. PCC 6803.

Richaud i sur. (2001) zabilježili su da postoje razlike u regulatornim i signalnim putovima

koji vode do fenotipa stanica uzrokovanim nedostatkom sumpora između vrste

Synechococcus sp. PCC 7942 i Synechocystis sp. PCC 6803. U Synechococcus sp.PCC 7942

identificirani su različiti regulatorni proteini u procesu aklimatizacije (Grossman i sur. 1993).

Utvrđeno je da se među onima čija je ekspresija regulirana statusom količine nutrijenata u

podlozi protein tlxA. Njegov slijed aminokiselina pokazuje sličnost s tioredoksinima i protein

disulfid izomerazama. Uloga u procesu aklimatizacije mu je nejasna, ali se smatra da je

uključen u redoks regulaciju strukture i funkcije cijanobakterijskog fotosintetskog aparata

(Collier i Grossman 1995). Ray i sur. (2000) zabilježili su da GlpE, proteinu s rodanaznom

domenom iz E. coli kao akceptor atoma sumpora može poslužiti tioredoksin ili srodni ditiolni

proteini, te njih predložili kao fiziološki supstrat za rodanaze. Na temelju sličnosti slr0192 s

grupom rodanaza kojoj pripada GlpE postoji mogućnost za njegovu interakciju s

tioredoksinom i na taj način sudjelovanje u regulatornim i signalnim putovima tijekom

odgovora stanica Synechocystis sp. PCC 6803 na stres.

5. ZAKLJUČAK

5. Zaključak

73

Cilj ovog rada je primjena metode inaktivacije gena na istraživanje funkcije hipotetskog

proteina slr0192 cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803.

• Analizom izvedenog slijeda aminokiselina gena slr0192 utvrđena je njegova sličnost s

reprezentativnim rodanazama iz ostalih organizama te je utvrđeno postojanje još četiri

proteina koji posjeduju rodanaznu domenu unutar genoma Synechocystis sp. PCC 6803.

• Dva laboratorijska soja cijanobakterije Synechocystis sp. PCC 6803, „ruska“ i

„japanska“ linija, transformirana su s plazmidnim vektorom pBsc0192K. Lančanom

reakcijom polimerazom i metodom hibridizacije po Southernu dokazana je uspješna

transformacija te potpuna segregacija inaktiviranog gena bez prisutnosti originalne

kopije u mutantnim stanicama. Uspješna potpuna segregacija inaktiviranog gena

ukazuje da on nije esencijalan za vijabilnost stanica u standardnim uvjetima.

• Fenotipska karakterizacija mutantnih stanica nije pokazala nikakvu razliku u

funkcionalnosti fotosintetskog aparata niti u količini pigmenata koju stanice sadrže u

standardnim uvjetima. Krivulje rasta, apsorpcijski spektar, te autofluorescencija

klorofila kao dio karakterizacije fenotipa mutanata, nisu pokazali značajnu razliku u

usporedbi s divljim tipom.

• Zabilježena je specifična rodanazna aktivnost u proteinskim ekstraktima cijanobakterija.

• Stanice mutanata i divljeg tipa podvrgnute su uvjetima nedostatka sumpora u krutoj

hranidbenoj podlozi i zatim pregledane pod elektronskim mikroskopom. Zapažena je

razlika u izgledu i strukturi tilakoidnih membrana između stanica koje su rasle na

potpunoj podlozi i podlozi iz koje je uklonjen sumpor, no nije primijećena nikakva

povećana razina spremišnih tvari u stanicama s manjkom nutrijenta. Između stanica

divljeg tipa i mutanata nije bilo razlike na razini ultrastrukture.

• Uzgajane u tekućim kulturama stanice mutanata ipak pokazuju različit odgovor na stres

koji izaziva manjak sumpora što se očituje u njihovoj zelenoj boji koju duže zadržavaju

i vremenu preživljavanja u tim uvjetima.

6. LITERATURA

6. Literatura

75

Adams H., Teertstra W., Koster M., Tommassen J. (2002): PspE (phage-shock protein E) of Escherichia coli is a rhodanese. FEBS Letters 518: 173-176. Allen J.F. (2003): The function of genomes in bioenergetic organelles. Philos. Trans. R Soc.

Lond. B 358: 19-38. Bauer M., Papenbrock J. (2002): Identification and characterization of single-domain thiosulfate sulfurtransferases from Arabidopsis thaliana. FEBS Letters 532: 427-431. Bordo D., Bork P. (2002): The rhodanese/Cdc25 phosphatase superfamily. Sequence-structure-function relations. EMBO Rep. 3: 741-746. Bradford M.M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254. Cipollone R., Bigotti M.G., Frangipani E., Ascenzi P., Visca P. (2004): Characterization of a rhodanese from the cyanogenic bacterium Pseudomonas aeruginosa. Biochem. Biophys. Res.

Comm. 325: 85-90. Collier J.L., Grossman A.R. (1995): Disruption of a gene encoding a novel thioredoxin-like protein alters the cyanobacterial photosynthetic apparatus. J. Bacteriol. 177: 3269-3276. Donadio S., Shafiee A., Hutchinson C.R. (1990): Disruption of a rhodaneselike gene results in cysteine auxotrophy in Saccharopolyspora erythraea. J. Bacteriol. 172: 350-360. Douglas A.E., Raven J.A. (2003): Genomes at the interface between bacteria and organelles. Phil.Trans.R. Soc. Lond.B 358: 5-18. Eaton-Rye J.J. (2004): The construction of gene knockouts in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Methods Mol. Biol. 274: 309-24. Gardner M.N., Rawlings D.E. (2000): Production of rhodanese by bacteria present in bio-oxidation plants to recover gold from arsenopyrite concentrates. J. Appl. Microbiol. 89: 185-190. Grossman A.R., Schaefer M.R., Chiang G.G., Collier J.L. (1993): The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiol. Rev. 57: 725-749. Hatzfeld Y., Saito K. (2000): Evidence for the existence of rhodanese (thiosulfate:cyanide sulfurtransferase) in plants: preliminary characterization of two rhodanese cDNAs from Arabidopsis thaliana. FEBS Letters 470: 147-150. Heins L., Soll J. (1998): Chloroplast biogenesis: Mixing the prokaryotic and the eukaryotic? Curr.Biol. 8: 215-217. Hoek C. van den, Mann, D.G., Jahns H.M. (1995): Algae: an introduction to phycology. Cambridge University Press, UK.

6. Literatura

76

Hoffmann K., Bucher P., Kajava A.V. (1998): A model of Cdc25 phosphatase catalytic domain and Cdk-interaction surface based on the presence of a rhodanese homology domain.

J. Mol. Biol. 282: 195-208. Ikeuchi M., Tabata S. (2001): Synechocystis sp. PCC 6803 – a useful tool in the study of the genetics of cyanobacteria. Photosynht. Res. 70: 73-83. Kaneko T., Sato S., Kotani H., Tanaka A., Asamizu E., Nakamura Y., Miyajima N., Hirosawa M., Sugiura M., Sasamoto S. i sur. (1996): Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Res. 3: 109-136. Klimmek O., Kreis V., Klein C., Simon J., Wittershagen A., Kroger A. (1998): The function of the periplasmic Sud protein in polysulfide respiration of Wolinella succinogenes. Eur. J.

Biochem. 253: 263-269. Laudenbach D.E., Ehrhardt D., Green L., Grossman A. (1991): Isolation and characterization of a sulfur-regulated gene encoding a periplasmically localized protein with sequence similarity to rhodanese. J. Bacteriol. 173: 2751-2760. Martin W., Herrman R.G. (1998): Gene transfer from organelles to the nucleus: how much, what happens and why? Plant Physiol. 118: 9-17. Mereschkowsky C. (1905): Über Natur und Ursprung der Cromatophoren im Pflanzenreiche. Biol. Centralb. 25: 593-604. Nisbet E.G., Sleep N.H. (2001): The habitat and nature of early life. Nature 409: 1083-1091. Ogasawara Y., Lacourciere G.M., Stadtman T.C. (2001): Formation of a selenium-substituted rhodanese by reaction with selenite and glutathione: possible role of a protein perselenide in a selenium delivery system. Proc. Natl Acad. Sci. USA 98: 9494-9498. Olson J.M., Blankenship R.E. (2004): Thinking about the evolution of photosynthesis. Photosynth. Res. 80: 373-386. Pagani S., Bonomi F., Cerletti P. (1984): Enzymic synthesis of the iron-sulfur cluster of spinach ferredoxin. Eur. J. Biochem. 142: 361-366. Palenchar P.M., Buck C.J., Cheng H., Larson T.J., Muller E.G. (2000): Evidence that ThiI, an enzyme shared between thiamin and 4-thiouridine biosynthesis, may be a sulfurtransferase that proceeds through a persulfide intermediate. J. Biol. Chem. 275: 8283-8286. Pantoja-Uceda D., López-Méndez B., Koshiba S., Inoue M., Kigawa T., Terada T., Shirouzu M., Tanaka A., Seki M., Shinozaki K., Yokoyama S., Güntert P. (2005): Solution structure of rhodanese homology domain At4g01050(175-295) from Arabidopsis thaliana. Prot. Sci. 14: 224-230.

6. Literatura

77

Papenbrock J., Schmidt A. (2000): Characterization of a sulfurtransferase from Arabidopsis

thaliana. Eur. J. Biochem. 267: 145-154. Race H.L., Herrmann R.G., Martin W. (1999): Why have organelles retained genomes? Trends Genet. 15: 364-370. Ramirez P., Toledo H., Guiliani N., Jerez C.A. (2002): An exported rhodanese-like protein is induced during growth of Acidithiobacillus ferrooxidans in metal sulfides and different sulfur compounds. App. Environ. Microbiol. 68: 1837-1845.

Raven J.A., Allen J.F. (2003): Genomics and chloroplast evolution: what did cyanobacteria do for plants? Genome Biol. 4: (3) 209. Ray W.K., Zeng G., Potters M.B., Mansuri A.M., Larson T.J. (2000): Characterization of a 12-kilodalton rhodanese encoded by glpE of Escherichia coli and its interaction with thioredoxin. J. Bacteriol. 182: 2277-2284. Richaud C., Zabulon G., Joder A., Thomas J.C. (2001): Nitrogen or sulfur starvation differentially affects phycobilisome degradation and expression of the nlbA gene in Synechocystis strain PCC 6803. J. Bacteriol. 183: 2989-2994. Rippka R., Deruelles J., Waterbury J.B., Herdman M., Stanier R.Y. (1979): Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen.

Microbiol. 111: 1-61. Rochaix J.D. (2004): Genetics of the biogenesis and dynamics of the photosynthetic machinery in eukaryotes. Plant Cell 16: 1650-1660. Schmidt A. (1988): Sulfur metabolism in cyanobacteria. Meth. Enzymol. 167: 572-583. Schmidt A., Jäger K. (1992): Open questions about sulfur metabolism in plants. Ann. Rev.

Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 43: 325-349. Singleton D.R., Smith, D.W. (1988): Improved assay for rhodanese in Thiobacillus spp. App.

Environ. Microbiol. 54: 2866-2867. Sörbo B.H. (1955): Rhodanese. Meth. Enzymol. 2: 334-337. Spallarossa A., Donahue J.L., Larson T.J., Bolognesi M., Bordo D. (2001): Escherichia coli GlpE is a prototype sulfurtransferase for the single-domain rhodanese homology superfamily. Structure 9: 1117-1125. Stanier R.Y., Kunisawa R., Mandel M., Cohen-Bazire G. (1971) Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriol. rev. 35: 171-205. Taiz L., Zeiger E. (1991): Plant Physiology. Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Redwood City, California.

6. Literatura

78

Viličić D. (2002): Fitoplankton jadranskog mora: biologija i taksonomija. Školska knjiga, Zagreb. Wanner G., Henkelmann G., Schmidt A., Köst H.P. (1986): Nitrogen and sulfur starvation of the cyanobacterium Synechococcus 6301. Z. Naturforsch. 41c: 741-750. Westley J. (1981): Thiosulfate: cyanide sulfurtransferase (rhodanese). Meth. Enzymol. 77: 285-291. Whitmarsh J., Govindjee (1995): The photosynthetic process. U: Singhal G.S., Renger G., Sopory S.K., Irrgang K.D. i Govindjee (ur.) Concepts in Photobiology: Photosynthesis and Photomorphogenesis. New Delhi, Narosa Publishers i Dordrecht, Kluwer Academic, str. 11-51. Woese C.R., Kandler O., Wheeler M.L. (1990): Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria and Eucarya. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4576-4579. Zhang H., Cramer W.A. (2004): Purification and crystallization of the cytochrome b6f complex in oxygenic photosynthesis. Meth. Mol. Biol. 274: 67-78.

slr0192 synechocystis sp. pcc 6803

Documents