1

Small Angle X-Ray Scattering

!

F(! S ) = e2"i

! r k #! S fk (

k=1

N

$! S )Fattore di struttura del sistema:

N = numero di molecole nel sistema, fk = fattore di struttura della molecola k:

!

fk (! S ) = e2"i

! r n #! S f el (

n=1

Nelk

$! S )

L'intensità diffusa è proporzionale al modulo quadro del fattore di struttura

!

I(! S )" F 2

= fel (! S )

2e#2$i

! r n %! S

n=1

Nel

& e2$i! r m %! S

m=1

Nel

& = fel (! S )

2e#2$i

! r mn %! S

n,m=1

Nel

&

!

! r nm =! r n "! r m

!

! S = 1

"ˆ s # ˆ s 0( )

s!

!2

!

! s 0

!

I" d#d$

= F 2" d% ! x 'ei

! q ! x 'V ( ! x ')

2

Scattering:

diluizione: interferenza tra le mol. trascurabile

2

!

I(! S ) " 4# fel (

! S )

2 sin(2#Srnm )2#Srnmm,n=1

nel

$

Media su tutte le possibili orientazioni della molecola: integrazione sull’angolo solido dω

!

I(! S ) " d#

0

2$

% d& sin0

$

% & fel (! S )

2e'2$i

! r mn (! S

n,m=1

Nel

)

!

I(! S )" fel (

! S )

2e#2$i

! r mn %! S

n,m=1

Nel

&

!

d" sin#d#0

$

%0

2$

% e&2$i! r '! S = & d" dcos#

1

&1

%0

2$

% e&2$irS cos# = 4$sin(2$Sr)2$Sr

!

dx1

"1

# e"iax = "1ia

eia " e" ia( ) = "2asina

3

!

fk

! S ( ) = d" sin#d# r2dr$k (r)

0

%

&0

'

&0

2'

& e2'i! r (! S = ) d" dcos# r2dr$k (r)

0

%

&0

'

&0

2'

& e2'irS cos# =

= 4' r2dr$k (r)0

%

& sin(2'Sr)2'Sr

!

fk (! S ) = e2"i

! r n #! S f el (

n=1

Nel

$! S ) rappresentazione discreta

rappresentazione continua: !k densità elettronica della mol. k

4

!

I(! S ) " 4# fel (

! S )

2 sin(2#Srnm )2#Srnmm,n=1

nel

$

rappresentazione della mol. in termini di elettroni

!

I(! S ) " 4# fk (

! S ) fh

*(! S ) sin(2#Srhk )

2#Srhkk,h =1

N

$

rappresentazione della mol. in termini di atomi

5

Small Angle X-Ray Scattering

!

Srnm " 0

!

sin xx

=1" x2

6+ o x 4( )

!

I(! S ) " 4# fel (0)

2 1$ (2#Srnm )2

6%

& '

(

) *

m,n=1

nel

+

Definiamo il quadrato del raggio di girazione:

!

RG2 "

1(n +1)2

! r i #! r j

i< j$

2=

1(n +1)2

rij2

i< j$ =

12nel

2 rij2

i, j$

per piccoli angoli di diffrazione:

!

I(! S ) " 4# fel (

! S )

2 sin(2#Srnm )2#Srnmm,n=1

nel

$

6

!

! S =

ˆ s "#

ˆ s 0"

!

! S 2

= s2 + s02 " 2ss0 cos2#( ) =

2$21" cos2#( )

!

cos2" = cos2" # sin2"

!

! S 2

=4"2sin2#( )$

! S =

2"sin#( )

!

ˆ s !2

!

ˆ s 0

!

2" # 5°

!

I(! S ) S"0# " # # 4$ fel (

! S )

2nel2 1% (2$S)2RG

2

3&

' (

)

* +

vettore di scattering: S!0

!

I(! S ) " 4# fel (

! S )

2nel2 1$ (2#S)2RG

2

3%

& '

(

) *

7

!

I(! S ) " I(# ) $ I(0)nel

2 1% 4&2RG

2 4 sin2#3'2

(

) *

+

, -

!

e"x 2

ax#0$ # $ $ 1" x

2

a

!

I(" )I(0)

# 1$ 16%2RG

2 sin2"3&2

'

( )

*

+ , - e

$x 2

a

rappresentazione come decadimento esp.

!

I(" )I(0) S#0$ # $ $ exp %16&

2RG2 sin2"3'2

(

) *

+

, -

!

ˆ s !2

!

ˆ s 0

8

Guinier Plot

!

ln I(" )I(0)

#

$ %

&

' ( ) *

4+RG sin",

#

$ %

&

' ( 2 13

Q

RG=3 RG=6

!

I(S) = I(0)exp "RGQ( )2

3

#

$ % %

&

' ( (

I

!

I(" )I(0) S#0$ # $ $ exp %16&

2RG2 sin2"3'2

(

) *

+

, -

9

!

F(S) = 4"#0R3 sin 2"RS( ) $ 2"SR( )cos 2"RS( )

(2"SR)3%

& '

(

) *

Facciamo un passo indietro: consideriamo il fattore di struttura di una molecola in soluzione

!

F(! S ) = d! r "(! r )# e2$i

! r %! S = d& sin'd' drr2"(r)

0

(

#0

$

#0

2$

# e2$irS cos' =

!

= 2" drr2#(r)0

$

% e2"irS & e&2"irS

2"irS= 4" drr2#(r)

0

$

% sin2"rS2"rS

= 4"#0 drr20

R

% sin2"rS2"rS

!

sinara" rdr =

1a2

(#dcosar)r =" 1a2

(cosar)dr # rcosar 0R"( ) =

!

=1a2

sinaRa

" RcosaR#

$ %

&

' (

Se la molecola è sferica e la sua dens. el. e’ cost. " seleziona il raggio di integrazione = R = raggio della sfera Integriamo per parti:

Se la particella è sferica

10

Per ottenere il Guinier plot abbiamo fatto 2 approssimazioni successive arrivando al decadimento esponenziale.

!

I(! S ) " sin(2#Srnm )

2#Srnmm,n=1

nel

$ %sin x

x

!

limx"0

sin xx

= limx"0

##xsin x

##x

x= lim

x"0cos x =1

!

S =2"sin#( )

!

F(S) = 4"#0R3 sin 2"RS( ) $ 2"SR( )cos 2"RS( )

(2"SR)3%

& '

(

) *

In realtà partendo da

11

!

sin xx

=1+ f '(0)x + f ' '(0) x2

2+ f ' ' '(0) x

3

6+ f IV (0) x

4

24+ o x 6( )

!

=1+ f ' '(0) x2

2+ f IV (0) x

4

24=1" x

2

6+x 4

120

!

e"ya #1" y

a+y 2

2a2$1" x

2

6+x 4

72

!

y =x 2

2a = 3

"

# $

% $

!

sin xx

" e#x 2

6 + o(x 6)

Stima dell’errore nell’approssimazione di Guinier

funzione pari

12

Intensità diffusa

!

F(! S ) = d! r "(! r )# e2$i

! r %! S

!

= d! r d! r '"(! r )"(! r ')# e2$i! S (! r %! r ' )

!

I(! S )" F(

! S )

2= F(! S )F(

! S )* = d! r #(! r )$ e2%i

! r &! S d! r '#(! r ')$ e'2%i

! r '&! S =

!

! r " ! r '# ! u d! r = d! u

!

I(! S )" d! u d! r '#(! r '+ ! u )#(! r ')$ e2%i

! S ! u = d! u &(! u )$ e2%i

! S ! u = F .T.(&)

!

"(! u ) = d! r '#(! r '+ ! u )#(! r ')$ == 0% 0& ' (

# = funzione di autocorrelazione della densità elettronica (Patterson)

Se u non unisce 2 atomi della proteina

Se u unisce 2 atomi della proteina

trasf. di Fourier

13

!

I(! S )" d! u d! r '#(! r '+ ! u )#(! r ')$ e2%i

! S ! u = d! u &(! u )$ e2%i

! S ! u = F .T.(&)

!

I(S) " 4# duu2$ (u)% sin 2#uS( )2#uS

= 4# dup(u)% sin 2#uS( )2#uS

= F .T.($ )

!

p(u) = u2"(u) = u2 d! r '#(! r '+! u )#(! r ')$

Mediando su tutte le possibili orientazioni =

Funzione di distribuzione delle distanze

!

"(! u ) = "(u,# ,$)% & % "(u)

u=rij

j i p(u)

Dmax

! dipende solo dal modulo di u

14

15

Contrasto

La radiazione incidente interagisce con tutte le molecole in soluzione: solvente e soluto

!

" #$" = "proteina % "solvente & 0.43 % 0.34( ) elÅ3

!"0.43! =

0 0.335! =

el. A-3

!

particle

solvent

16

Intensità all’origine (S=0)

!

i(0)" d! r #$(! r )%2

= v#$( )2 =MwNA

V #$&

' (

)

* +

2

!

c =NMwNAV

concentrazione in mg/ml

!

I(0)"cMw

Se la concentrazione è nota l’intensità all’origine ci da il peso molecolare e dunque lo stato di aggregazione (struttura quaternaria) della proteina

Intensità per grandi angoli: legge di Porod:

!

I(S) S"#$ " $ $ S%4

volume specifico

peso della proteina

numero di moli 0.71-0.73 ml/gr

!

I(0) = ni(0) = NNAMwNA

"

# $

%

& '

2

V ()( )2 =NMwNA

Mw V ()( )2 = cVMw V ()( )2

singola proteina

17

Tecnica sperimentale

Di solito si fanno 3-4 esperimenti: in ognuno di essi la proteina da analizzare viene diluita nel medesimo buffer in concentrazioni differenti.

Le curve sperimentali vengono scalate tra loro secondo la:

!

I(0)Mwc

= cost.

Le 3 curve scalate vengono mediate per produrre un’unica curva sperimentale

L'apparato sperimentale misura i conteggi (n. di fotoni che arrivano) in funzione dell'angolo di diffusione.

18

Analisi dati

Poi le 3-4 curve sperimentali vengono scalate tra loro secondo la:

!

I(0)Mwc

= cost.

viene prima sottratto il contributo del solvente

19

Informazioni che possono essere ricavate sulla proteina in soluzione

1. raggio di girazione, dal Guinier plot 2. massa della proteina dalla misura di I0, ovvero stato di aggregazione proteica

Se si considera il contributo dello scattering a medio angolo si possono costruire modelli strutturali della proteina a bassa risoluzione

20

Funzione di distribuzione delle distanze

In theory, the calculation of p(r) from I(s) is simple. Problem : I(s) - is only known over [smin, smax] : truncation

- is affected by experimental errors

$  Calculation of the Fourier transform of incomplete and noisy data, which is an ill-posed problem. Solution : Indirect Fourier Transform. First proposed by O. Glatter in 1977.

Esperimento

!

I(! S ) " 4# drp(r)$

sin 2#rS( )2#rS

Interpretazione

!

I(! S )

!

p(r)

21

Si ipotizza che le particelle abbiano dimensione finita Rmax

!

I(! S ) " 4# dr

0

Rmax

$ p(r)sin 2#rS( )2#rS

p(r) is parameterized on [0, RMax] by a linear combination of orthogonal functions

!

p(r) = cnn=1

M

" #n (r)

!

I(0) = 4" dr0

Rmax

# p(r)

!

RG2 =

dr0

Rmax

" r2p(r)

2 dr0

Rmax

" p(r)

The radius of gyration and the intensity at the origin can be derived from p(r) using the following expressions :

This alternative estimate of Rg makes use of the whole scattering curve, and is much less sensitive to interactions or to the presence of a small fraction of oligomers.

22

Se il fit dei dati sperimentali è cattivo, il modello è scorretto Se il fit dei dati sperimentali è buono, il modello è corretto ????

23

!

"(! r ) = "L r( )L# YL $( )

!

F(! s ) = Fl ,m s( )Yl,m "( )l ,m#

!

I(! s ) = d"# A(! s ) 2 = Fl,m s( )l ,m$

2= FL s( )

L$

2

Intensita’ diffusa (esperimento)

Densità elettronica (dato che si vuole ricavare)

!

I(! s ) = F(! s ) 2 = Fl ,m s( )" l , " m #

l,m# Yl ,m $( )F " l , " m

* s( )Y " l , " m * $( )

!

I(! s ) = d! r d! " r # $(! r )$(! " r )e2%i! s ! r &! " r ( ) ' Fl ,m s( )( r2dr$l,m (r)

0

)

# jl sr( )

Funzioni di Bessel

3D

1D

3D

esperimento

!

L = l,m

24

!

"(! r ) =

1 se 0 # r # f $( )

0 se r > f $( )

%

& ' '

( ' '

Struttura della proteina: funzione di forma angolare f (descrive la sup. della proteina nello spazio 3D)

!

f (") = f l,mYl ,m "( )l ,m#

!

I(s) = FL s( )L"

2= s2nan

n=0

#

" = s2n$ fl ,m( )n=0

#

"

esperimento forma della proteina

1D

superficie nello spazio 3D ricostruzione

!

Al,m s( )" fl ,m

La relazione sperimentale in 1D permette di ricostruire la superficie della proteina in 3D

25

Decomposizione in armoniche sferiche

8 armoniche 16 armoniche 24 armoniche

3D 1D

26

Esempio: la struttura di NS3

3 curve sperimentali: 2 per il solvente, 1 per la proteina. Si mediano le 2 curve del solvente e si sottraggono alla curva della proteina

Analisi del raggio di girazione con il Guinier Plot RG=3.30 nm

27

Analisi di p(r)

Rmax=11 nm

28

B

90°

Fit dei dati con il programma GASBOR

Mastrangelo E., Milani M. et al., 2007, J. Mol. Biol. 372, 444-55.

29

!"#$#

Bir3 + Smac7

Cossu F., Milani M. et al., 2009, J. Mol. Biol. 392, 630-44.

30

NS5

To be published