sobre este proyecto
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La creación de capacidades para el desarrollo de nuevos compuestos terapéuticos para la enfermedad de Chagas en El Salvador . JICA - JSPS - MINED 06/08/2011 - 05/08/2013. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
La creación de capacidades para el desarrollo de nuevos compuestos terapéuticos para la
enfermedad de Chagas en El Salvador.
JICA - JSPS - MINED
06/08/2011 - 05/08/2013
Este proyecto con CICES(MINED) y JICA tiene como objetivo general aumentar la capacidad de
investigación básica para encontrar un nuevo compuesto.
El período es del día 06 de agosto de 2011 al 05 de agosto de 2013.
Para el tratamiento de la enfermedad de Chagas hay que desarrollar un nuevo fármaco para lo
que se necesita encontrar un compuesto.
Sobre este proyecto
Sobre este proyecto
Generalmente, hay dos maneras:
1. Encontrar un compuesto para el tratamiento deTrypanosoma cruzi (T. cruzi).
→ Este método, después de encontrar un compuesto, hay necesidad de asegurarse de que haya un efecto sobre
T. cruzi.
2. Encontrar una enzima decidida de antemano.→ Este método, si la enzima está únicamente en T. cruzi , las reacciones adversas pueden ser reducidas en las personas.
Objetivos específicos:
1. Preparar un ambiente de cultivo para T. cruzi, y aprender el subclutivo.
Aprender el método experimental para determinar el efecto del reactivo sobre el T. cruzi.
2. Aprender el manejo de la enzima y la purificación a gran escala de la TcDHOD, la cual es una proteína diana,
decidido de antemano.Aprender el método experimental para confirmar el efecto del reactivo sobre la TcDHOD(experimentos de inhibición).
3. Preparar el ambiente del laboratorio de cada trabajo.Y lo que maneja cada una de las investigadoras.
Sobre TcDHOD
La proteína diana TcDHOD (dihidroorotato deshidrogenasa) es una enzima esencial para
el crecimiento de T. cruzi.
Cuando se inhibe la actividad, T. cruzi se muere.
Por eso, TcDHOD es necesaria para que T. cruzi pueda vivir.
DHO
FMN
N
C
CN
Estructura dimérica de TcDHOD Enzima citplasmática
DHO
FMN
Inaoka et al., Biochemistry, 47, 10881-10891, 2008
Sobre TcDHOD
La proteína diana TcDHOD (dihidroorotato deshidrogenasa) es una enzima esencial para
el crecimiento de T. cruzi.
Cuando se inhibe la actividad, T. cruzi se muere.
Por eso, TcDHOD es necesaria para que T. cruzi pueda vivir.
Ambiente del Laboratorio
La preparación del ambiente del laboratorio del CICES se hace en
cooperación con Ministerio de Educación(MINED).
Para la instalación del laboratorio, MINED ha asegurado para CICES un espacio en
CENSALUD de UES.
La preparación del ambiente de laboratorio y el trabajo de los experimentos se realizan en paralelo.
Ambiente del laboratorio
Laboratorio de CICES
Los experimentos
1. Cultivar T. cruzi en forma de epimastigote y realizar el experimento de inhibición.
2. Experimentos con la proteína(enzima) TcDHOD.
Manejo de la expresión y purificación de la TcDHOD.
3. Manejo de genes.Esto es extracción de gen y manejo del PCR.
1. Experimento de T. cruzi
Método de cultivo de T. cruzi epimastigote.
T. cruzi CL Brener es un tipo de cepa de T. cruzi.He traído el epimastigote de Japón.
（図： NCBI gene ）
1. Experimento de T. cruzi
Hacer el medio: LIT medio pH 7.2
La esterilización se debe hacer usando un filtro.
Composición:Infusión de Caldo de Hígado, Triptosa, NaCl, Na2HPO4, KCl, Glucosa, Suero
Bovino Fetal y Haemin.
1. Experimento de T. cruzi
El cultivo se hace a 25 grados centígrados.Esto se debe a que es la temperatura aproximada del cuerpo de la chinche.
1. Experimento de T. cruzi
T. cruzi epimastigote
Método de subcultivo:→ contar las células
Cámara de recuento
1. Experimento de T. cruzi
Experimentos de inhibición
El experimento de inhibición, se ha hecho con unos compuestos que he traído de
Japón.
1. Experimento de T. cruzi
MII-5-170 MII-6-040
Método ： Determinar crecimiento en 24 horas
después de la adición.
1. Experimento de T. cruzi
Concentración finalDMSO (dimethyl sulfoxide) 0.1%Benznidazole 10μMMII-5-170 10μMMII-6-140 10μM
Total 100 μlT. cruzi epimastigote 200×104 celulas/ml
Resultado ： Determinar crecimiento en 24 horas
después de la adición.
1. Experimento de T. cruzi
La tasa de supervivencia
DMSO (dimethyl sulfoxide) -Benznidazole 90.1 %MII-5-170 87.8 %MII-6-140 52.8 %(Trabajo de Karla y Maricela)
2. Experimento con la proteína
2. Experimento de la proteína Método de expresión TcDHOD:
Escherichia coli TcDHOD es utilizada para la expresión del TcDHOD, la traje de Japón. sin His tag y con His tag
Para expresar la proteína siempre se utiliza E. coli.
2. Experimento de la proteína
El flujo del experimento es como este gráfico.
BL21(DE3)/pTcDHOD Cultivo en 200 mL de LB medioLa inducción por IPTG 1 mM
sonicación21882 x g, 10 min, R.T
Sobrenadante (citoplasma)
DEAE Sepharose Fast Flow
Phenyl Sepharose High Performance
25 ℃(1)
(2)
(3)
(4)
(4) Muestra el resultado de la columna de Phenyl. 12% SDS-PAGE, Tinción de Azul de Coomassie. Peso molecular del TcDHOD es de 34 kDa.
40
30
kDa
50
(4)
(Trabajo de Karla y Maricela)
2. Experimento de la proteína
El Resultado de la actividad de TcDHOD a través de la columna Phenyl HP.
Abs.
La actividad de TcDHOD 32.1 mg /min / ml
(Trabajo de Karla y Maricela)
2. Experimento de la proteína BL21(DE3)/pTcDHOD con His tag .Cultivo en 200 mL de LB medio
La inducción por IPTG 1 mM
sonicación21882 x g, 10 min, R.T
Sobrenadante (citoplasma)
DEAE Sepharose Fast Flow
His Trap Fast Flow
25 ℃(1)
(2)
(3)
(4)
(4) Muestra el resultado de la columna de His Trap FF. 12% SDS-PAGE, Tinción de Azul de Coomassie.
40
30
kDa
50
(4)
(Trabajo de Karla y Maricela)
2. Experimento de la proteína
Experimentos de inhibición
El experimento de inhibición, se ha hecho con unos compuestos que he traído de
Japón.MII-5-170 MII-6-040
3. Manejo de los genes
Manejo del PCR.Primer para TcDHOD lo he
traído de Japón.
3. Manejo de los genes
La electroforesis con agarosa
Confirmar en el UV
3. Manejo de los genes
Plan de acción
El laboratorio de CICES tiene capacidad para cultivar T. cruzi y microbio, para trabajar
proteína y gen.
En otras palabras, podemos hacer el experimento básico y el diagnóstico genético.
En el futuro, hay experimentos que se considerarán para desarrollar más
investigaciónes.
Plan de acción
1. Confirmar el efecto de inhibición utilizando extracto y compuestos o sintetizados que se
obtenengan El Salvador que se necesiten para el desarrollo del nuevo fármaco.
Si hay una muestra que tiene posibilidad de efecto, se puede purificar.
Y, si una muestra purificada es efectiva, se identifica el compuesto.
¿Compuesto?
Plan de acción
Si se encuentra el compuesto terapéutico, hay muchas posibilidades de desarrollo de nuevo
compuesto.
¿Compuesto?↓
Medicina
Plan de acción2. Uso del PCR
Hacemos extracción del gen, y utilizamos el PCR para aplicar a los estudios, los análisis clínicos y
epidemiológicos.
En este momento, MINSAL y CICES trabajan un proyecto de Chagas en conjunto.
Esta tecnología debería ser de beneficio para los
pacientes.
Conclusión
El laboratorio de CICES tiene capacidad para hacer desde el experimento básico al epidemiológico.
Desde ahora, me gustaría trabajar en colaboración con el MINSAL y otras instituciones de
investigación junto con el laboratorio de CICES para beneficio de todos.
Y con el tiempo, deseo que la investigación básica sea conjunta.
Puede ser a nivel de toda la región centroamericana, siendo El Salvador el eje
principal.
¡Muchas Gracias!