sodyum terraboratın büyük balmumu güvesi (galleria mellonella l. (lepidoptera:pyralidae)'ın...

8/7/2019 Sodyum Terraboratn Byk Balmumu Gvesi (Galleria Mellonella L. (Lepidoptera:Pyralidae)'n Yaama, Geliimi ve

1/75

SODYUM TETRABORATIN BYK BAL MUMU GVESGALLERIAMELLONELLA L. (LEPIDOPTERA: PYRALIDAE)NIN YAAMA, GELM VE

BAZI ENZMLERNN AKTVTES ZERNE ETKS

Yonca DURMU

Zonguldak Karaelmas niversitesi

Fen Bilimleri Enstits

Biyoloji Anabilim Dalnda

Bilim Uzmanl Tezi

Olarak Hazrlanmtr

ZONGULDAK

Ocak 2007


2/75

ii


3/75

iii

ZET

Bilim Uzmanl Tezi

SODYUM TETRABORATIN BYK BAL MUMU GVES GALLERIA

MELLONELLA L. (LEPIDOPTERA: PYRALIDAE)NIN YAAMA, GELM

VE BAZI ENZMLERNN AKTVTES ZERNE ETKS

Yonca DURMU

Zonguldak Karaelmas niversitesi

Fen Bilimleri Enstits

Biyoloji Anabilim Dal

Tez Danman: Do. Dr. Kemal BYKGZEL

Ocak 2007, 75 sayfa.

Byk bal mumu gvesi Galleria mellonella L. yapay besin ortamnda beslenerek sodyum

tetraboratn bcein yaama, geliimi, ergin mr uzunluu ile 7. evre larvalarnn

hemolenf ve ya dokusunda malondialdehid (MDA) ve lizozim miktar, glutatyon S-

transferaz (GST), alanin aminotransferaz (ALT), aspartat aminotransferaz (AST) ve asetil

kolinesteraz (AChE) enzimlerinin aktivitesi zerine etkisi incelendi. Sodyum tetraboratn

0,3 g 7. evreye ulaan larva orann % 17,5 2,9a istatistiksel olarak nemli derecede

drm, 7. evreye ulama sresini ise ortalama 5 gn geciktirmitir. Bu miktar ieren

besinden % 12,5 orannda pup ve ergin elde edilmi ve bu evrelere ulamak iin gerekli

sre ise ortalama 5 gn uzamtr. Kontrol besini ile yetitirilen erginlerin mr uzunluu

ortalama 9,0 0,7 gn iken sodyum tetraboratn 0,2 gn ieren besin ile yetitirilen

erginler kontrole gre 4,2 gn daha uzun (13,2 1,9 gn) yaamtr. Denenen en yksek


4/75

iv

ZET (devam ediyor)

madde miktar erginlerin mr uzunluunu nemli derecede ksaltmtr. Sodyum

tetraboratn yksek konsantrasyonlar larvalarn hemolenf ve ya doku MDA miktarn

nemli derecede artrmtr. Sodyum tetraboratn yksek konsantrasyonlar (0,2 ve 0,3 g)hemolenf GST aktivitesinde istatiksel olarak nemli bir azalmaya sebep olurken, sodyum

tetraboratn tm konsantrasyonlar ya doku GST aktivitesini artrmtr. En yksek

sodyum tetraborat konsantrasyonu (0,3 g) ya doku GST aktivitesini yaklak 12 kat

artrmtr. Besindeki sodyum tetraboratn yksek konsantrasyonlar, hemolenf ve ya

dokulizozim enzimi miktarn nemli derecede drmtr. Sodyum tetraboratn dk

konsantrasyonlar ya doku lizozim miktarn nemli derecede artrmtr. Bu yksek

konsantrasyonlar hemolenf ALT, AST ve AChE aktivitesini nemli derecede azaltrken,

ya doku ALT, AST ve AChE aktivitesini nemli derecede artrmtr. Bu alma sodyumtetraborat tarafndan oluturulan oksidatif stresin byk bal mumu gvesinde baz

metabolik ilevleri ve sinaptik iletimi olumsuz ynde etkilediini, oksidatif strese kar

bcein eitli biyokimyasal ve fizyolojik adaptasyon tepkileri verdiini gstermitir. Elde

edilen sonular sodyum tetraboratn bcein yaama, gelime ve mr uzunluu

zerindeki olumsuz etkisinde oksidatif stresin nemli bir faktr olabileceini

desteklemektedir.

Anahtar Kelimeler:Galleria mellonella, sodyum tetraborat, yaama, mr uzunluu,

glutatyon S-transferaz, transaminazlar, asetilkolinesteraz

Bilim Kodu: 401.04.02


5/75

v

ABSTRACT

M.Sc. Thesis

EFFECTS OF SODIUM TETRABORATE ON SURVIVAL, DEVELOPMENT, AND

ACTIVITIES OF SOME ENZYMES OF GREATER WAX MOTH, GALLERIA

MELLONELLAL. (LEPIDOPTERA: PYRALIDAE)

Yonca DURMU

Zonguldak Karaelmas University

Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Biology

Thesisi Advisor: Assoc. Prof. Dr. Kemal BYKGZEL

January 2007, 75 pages.

The effects of sodium tetraborate on survival, development, adult longevity, and

hemolymph and fat body malondialdehyde (MDA) and lysozyme content, glutathione S-

transferase (GST), alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST),

acetylcholinesterase (AChE) activities and in 7th instar larvae (one-day old) of greater wax

moth Galleria mellonella L. were investigated by rearing the larvae on artificial diets. The

highest concentration of sodium tetraborate (0.3 g) significantly decreased the survival rate

of 7th instars to 17.5 2.9 % and prolonged the time required to reach 7th instar by 5 days.

The diet containing this concentration produced 12.5 % of both pupae and adult yields and

also prolonged development by 5 days. When compared to adult longevity (9.0 0.7 days)

from control diets, adults reared with 0.2 g of sodium tetraborate survived by about 4.2

days longer (13.2 1.9 days). The highest concentration of sodium tetraborate resulted in

decreased adult longevity in comparison to control. High concentrations


6/75

vi

ABSTRACT (continued)

tetraborate significantly increased MDA content in hemolymph and fat body of the 7 th

instar larvae. The highest concentration of sodium tetraborate (0.3 g) increased MDA

content from 0.008 0.004 to 0.17 0.015 nmol/mg protein. Sodium tetraborate at highconcentrations (0.2 and 0.3 g) caused a significant decrease in hemolymph GST activity

while all dietary concentrations of sodium tetraborate increased fat body GST activity. The

highest concentration of sodium tetraborate (0.3 g) significantly increased fat body GST

activity by 12-fold and raised to an activity of 1050 73.8 nmol/mg protein/min. Lysozym

content in hemolymph and fat body of 7th instars was decreased by high concentrations of

sodium tetraborate. Sodium tetraborate at low concentrations resulted in significantly

increased fat body lysozyme content. These high concentrations resulted in significantly

decreased ALT, AST, AChE activities in hemolymph while they casued a significantincrease in activities of the enzymes of fat body of larvae. This study showed that sodium

tetraborate-induced oxidative stress caused the some metabolic and synaptic dysfunctions

in greater wax moth and alter its biochemical physiology as adaptive response to oxidative

stress. The results are consistent with the hypothesis that oxidative stress may be causative

factor in deterioratve effects of sodium tetraborate on survival, development and longevity

of the insect.

Key Words:Galleria mellonella, sodium tetraborate, survival, longevity, gluthatione S-

transferase, transaminases, acetylcholinesterase

Science Code: 401.04.02


7/75

vii

TEEKKR

Bu konuda bana alma frsat veren, aratrma srasnda ilgi, neri ve yardmlarn

esirgemeyen danman hocam, Sayn Do. Dr. Kemal BYKGZELe, almamn her

aamasnda deerli neri ve bilgilerinden yararlandm Biyoloji Blm Aratrma

Grevlisi Ender BYKGZELe, lizozim deneylerime bilgi ve deneyimleriyle katkda

bulunan RNDr. Pavel Hyrsl (Masaryk niversitesi Deneysel Biyoloji Enstits Hayvan

Fizyolojisi ve mmnoloji Blm)e teekkrlerimi bir bor bilirim. Sodyum tetraborat

bu alma iin hediye eden Eti Maden letmeleri Genel Mdrl'ne, almamn

deneysel ve yazma aamasnda moral destei ve yardmlarn esirgemeyen eim Mustafa

DURMUa ve aileme teekkrlerimi sunarm.


8/75

viii

NDEKLER

Sayfa

KABUL.ii

ZET....iii

ABSTRACT..v

TEEKKRvii

NDEKLER.......viii

EKLLER DZN...x

ZELGELER DZN.....xi

BLM 1 GR.12

BLM 2 MATERYAL VE METOT....25

2.1 BCEK KLTRNN DEVAMI...25

2.2 BESNLERN HAZIRLANMASI...25

2.3 SODYUM TETRABORATIN DENEYLERDE KULLANILMASI..26

2.4 LARVALARIN ELDE EDLMES.26

2.5 YAAMA, GELME VE MR UZUNLUU...26

2.6 ENZM EKSTRAKSYONU VE AKTVTE TAYN..28

2.6.1 Ya Doku ve Hemolenfzolasyonu.28

2.6.2 Malondialdehid (MDA)...28

2.6.3 Glutatyon S-Transferaz (GST).29

2.6.4 Alanin Aminotransferaz (ALT), Aspartat Aminotransferaz (AST),

Asetilkolinesteraz (AChE)....29

2.6.5 Lizozim.30

2.7 VERLERN DEERLENDRLMES...30


9/75

ix

NDEKLER (devam ediyor)

Sayfa

BLM 3 ARATIRMA BULGULARI

3.1 SODYUM TETRABORATIN G. MELLONELLANIN YAAMA,

GELMNE ETKS...31

3.2 SODYUM TETRABORATIN G. MELLONELLANIN MR

UZUNLUUNA ETKS.33

3.3 SODYUM TETRABORATIN G. MELLONELLA LARVALARININ

HEMOLENF VE YA DOKU MALONDALDEHD (MDA) MKTARINA

ETKS..........34

3.4 SODYUM TETRABORATIN G. MELLONELLA LARVALARININHEMOLENF VE YA DOKU GLUTATYON S-TRANSFERAZ (GST)

ENZM AKTVTESNE ETKS36


HEMOLENF VE YA DOKU LZOZM ENZMNN MKTARINA

ETKS..........38


HEMOLENF VE YA DOKU ALANN AMNOTRANSFERAZ (ALT)

ENZM AKTVTESNE ETKS403.7 SODYUM TETRABORATIN G. MELLONELLA LARVALARININ

HEMOLENF VE YA DOKU ASPARTAT AMNOTRANSFERAZ (AST)

ENZM AKTVTESNE ETKS42


HEMOLENF VE YA DOKU ASETLKOLNESTERAZ (AChE) ENZM

AKTVTESNE ETKS.....................................................................................44

BLM 4 TARTIMA...........47

KAYNAKLAR.60

ZGEM..75


10/75

x

EKLLER DZN

No: Sayfa

1.1 Lipid peroksidasyonu rn MDAnn oluumu.....18

1.2 Oksidatif stres ve hcre hasar.19

3.2 Sodyum tetraboratnG. mellonella erginlerinin mr uzunluuna etkisi33

3.3.1 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn hemolenf MDA miktarnaetkisi.34

3.3.2 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn ya doku MDA miktarna

etkisi.353.4.1 Sodyum tetraboratn G. mellonella larvalarnn hemolenf GST aktivitesine

etkisi.363.4.2 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn ya doku GST aktivitesine

etkisi.373.5.1 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn hemolenf lizozim miktarna

etkisi.383.5.2 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn ya doku lizozim miktarna

etkisi.393.6.1 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn hemolenf ALT aktivitesine

etkisi.403.6.2 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn ya doku ALT aktivitesine

etkisi.413.7.1 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn hemolenf AST aktivitesine

etkisi.423.7.2 Sodyum tetraboratn G. mellonella larvalarnn ya doku AST aktivitesine

etkisi..433.8.1 Sodyum tetraboratn G. mellonella larvalarnn hemolenf AChE aktivitesine

etkisi.443.8.2 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn ya doku AChE aktivitesine

etkisi.45


11/75

xi

ZELGELER DZN

No: Sayfa

3.1 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn yaama ve gelimesine etkisi...32


12/75

12

BLM 1

GR

Tarmsal zarara sebep olan en nemli canl grubu bceklerdir. Lepidoptera takmna ait

trler bu grup ierisinde nemli bir yer tutmaktadr. Bcekler tarmsal rnlerin eitlilik,

kalite, verim, depolama, pazarlama kalitesini drrken ayn zamanda eitli hastalklarn

tanmasnda arac olduklarndan halk sal asndan da tehdit oluturmaktadr. rn

verimini ve kalitesini artrmak iin bcekler ile mcadelede bir dizi kimyasal, biyolojik,

fiziksel ve dier baz yntemler kullanlmaktadr (Charriere and Imdorf, 1997). Ucuzolmas, ksa srede sonu alnmas ve kolay uygulanabilirlii sebebiyle eitli

insektisitlerin kullanld kimyasal mcadele daha ok tercih edilmektedir. Son

zamanlarda zellikle organoklorlu ve organofosforlu insektisitler evreye amasz, snrsz

ve kontrolsz olarak uygulanan toksik kimyasallardr. nsektisit kullanmnn vazgeilmez

yararlarna karn denetimsiz ve ar miktarlarda uygulanmas insan dahil hedef olmayan

dier canllarda nemli zararl etkilere ve lmlere neden olmakta, ekosistemlerin

bozulmasna, besin zincirlerinde aksamalara ve kirlenmelere yol amaktadr. nsektisitler

biyolojik birikimle canllarn vcutlarnda younlaabilir. Besin zincirinde hareket ederken

her aamada daha byk bir orana ulamaktadr. Etkili kimyasal insektisitlerin yaygn

olarak kullanlmasndan ksa sre sonra insanlar ve yabanl yaamda hedef olmayan

canllara zararl etkileri ortaya konmaya balanmtr. nsektisitlerin evreye verdii

zararlarn insan sal asndan tehlikeli boyutlara varmas zerine pek ok lke ve

kurulu soruna titizlikle eilirken, lkemizde de son zamanlarda konuya nem verilmeye

balanmtr. nsektisitler toksik ve ldrc etkiye sahiptir, bu sebeple uygulamalarda

doal yaam da gz ard edilmemelidir. Zararl bcekler ile mcadele yaplrken seilen

insektisitin hedef olmayan canllara zararl etkilerinin dk olmasna dikkat edilmelidir.

Hedef olmayan canllar iin toksik olan bu kimyasal maddelere alternatif olarak evre

dostu kimyasal maddelerin kullanld mcadele yntemleri gelitirebilmek iin birok

zararl trn laboratuvar artlarnda yapay besin ortamlar ile kitle halinde retimleri

yaplmaktadr (Al-Izzi et al., 1987; Bernardi et al., 2000; Keena et al., 1995; Lopez et al.,


13/75

13

1996). Lepidoptera takmna ait zararl trlerin yapay besinler ile kltre alnmas ekoloji

ve fizyolojilerinin yannda bunlarn farkl evrelerindeki baz metabolik olaylarnn

molekler dzeyde incelenmesine de olanak salar (Mandato et al., 1997; Pohlon and

Badwin 2001; Bykgzel et al., 2002; Tunaz et al., 2003). Bylece gelitirilen yeni

insektisitlerin arazi uygulamasndan nce laboratuvar artlarnda bcek zerindeki etkileriaratrlm olur.

Galleria mellonella L. bu konudaki almalar iin olduka iyi bir fizyolojik model

oluturmakla beraber laboratuvar artalarnda kolayca kltr yaplabilmektedir. Pyralidae

familyasna ait dier trler ile birlikte G. mellonella larvalar ve puplar parazitoid

bceklerin laboratuvar artlarnda oaltlabilmesi iin yalanc konak olarak

kullanlmaktadr (Wiedenmann et al., 1992; Bernardi et al, 2000; Gupta et al., 1996a;

1996b; Bykgzel, 2001). Gnmzde baz parazitoid trlerin tarmsal alanlarda nemlizararlara sebep olan lepidoptera takmna ait trlerin biyolojik mcadelesinde halen

kullanlmas (Chen and Welter, 2002) bu gvelerin laboratuvar artlarnda yapay ortamda

yetitirilmesi almalarnn nemini arttrmaktadr. Bu yzden yksek ergin verimine ve

ksa hayat devrine sahip olmas, doal besin olarak koyu renkli kuluka bal petei ve

eitli yapay besinler zerinde iyi gelimesi sebebiyle, mum gvesi G. mellonella konak-

parazitoid etkileimi, biyolojik ve kimyasal mcadele almalar iin nemli bir deneysel

model oluturmaktadr (Jarosz, 1989). Bu bcein larvalar ar kovanndaki peteklere ve

dier rnlere zarar verdii iin arclk sektrnde nemli ekonomik kayplara yol

amaktadr (Charrire and Imdorf, 1997).

Dorudan sinir sistemine etkili olan malatyon gibi organofosforlu bileiklerin, zararl

bceklerin kimyasal mcadelesinde kullanmnn art, evre ve hedef olmayan dier

canllar asndan nemli bir tehdit unsuru oluturmaktadr (Fenske et al., 2002; Bhavan-

Saravana and Geraldine, 2001; He et al., 2002). Dier taraftan, bu insektisitlere kar

bceklerin diren gelitirdii bilinmektedir. Bu amala son almalar hedef olmayan

yararl bcekler, insan ve dier canllara kar toksititesi dk ve dorudan etkisi

bulunmayan bor bileiklerinin alternatif kimyasal mcadele yntemlerinde kullanlmas

zerine younlamtr.

Sodyum tetraborat elementel borun bir trevidir. Bor minerali oksijenle birlikte boraks

halinde bulunur. nemli bileikleri borik asit ve borakstr (sodyum tetraborat). Suda kolay


14/75

14

eriyen bor trevleri kokusuz, uucu olmayan, beyaz kristal granller veya toz halindedir ve

uzun sreden beri hamambcei bata olmak zere kapal alanlardaki bceklerin

mcadelesinde kullanlmaktadr (Ebeling, 1995). Bcein metabolizmas zerinde bir mide

zehiri gibi etkisini gsteren borik asit ve trevleri son zamanlarda inorganik insektisit

olarak farkl sulu zeltiler eklinde kullanmdaki yerini almaya balamtr. Bu madde nbarsaa (foregut) ve orta barsaa (midgut) zarar verdiinden besin alnmasn ve alnan

besinin sindirilmesini nleyerek bcein lmne sebep olmaktadr (Cochran, 1995).

Borik asit ve sodyum tetraboratn zararllarla mcadelede kullanlmasnn dier nedeni

ksrlatrc etkisinden dolay bcein oalmasn nlemesidir (Zhou and le Patourel,

1990). Borik asit ve sodyum tetraborat kalsiyum, magnezyum, bakr ve fosfor gibi besinsel

elementlerin metabolizmasn etkiler. Borik asit karbohidratlar (monosakkarit ve

polisakkaritler), nkleotidler (adenozin monofosfat, NAD) ve vitaminler (askorbik asit,pridoksin ve riboflavin) ile kompleks oluturarak bu besinsel molekllerden yeterli

derecede yararlanlmasn nler (Xue and Barnard, 2003).

Borik asit zararl bceklerle mcadelede ldrc (biyosidal) ve uzaklatrc (repellant),

tropikal meyvelerde fungisit olarak uzun yllardan beri kullanlmaktadr. Borik asit ve

farkl trevlerini ieren insektisitlerin ou Perma-Dust PT240 (Borik asit), Dragon (% 99

ortofosforik asit ve % 1 borik asit), Timbor veya Bora care (Sodyum borat, disodium

oktaborat tetrahidrat) gibi birok ticari isimlerle sata sunulmu olup emulsifiye edilebilir,

sulandrlabilir ve znebilir toz eklinde ya da mikrokapsllenmi halde kullanma hazr

olarak temin edilebilir. Zararllarn mcadelesi ile ilgilenen uzmanlar bu insektisitleri

aalar enfekte eden baz kn kanatl bcekler ile termitlerin kontrol edilmesinde yaygn

olarak kullanmaktadr. Sodyum tetraboratn zararl bcekler ile mcadelede

kullanlmasnn nemi memelilere kar olduka dk bir toksiteye sahip olmasndan ileri

gelmektedir (Weir and Fisher, 1972). Bu zellii sayesinde sodyum tetraboratn

Amerikada evre Koruma Ajans tarafndan pestisid formlasyonlarnda aktif madde

olarak kullanlmas kararlatrlmtr (Borax Europe Limited Guildford, UK). Baz zararl

bceklerin mcadelesinde hedef olmayan dier canllara kar dk toksisiteye sahip,

uucu olmayan inorganik insektisit borik asit ve trevleri sodyum tetraborat (boraks),

disodyum oktaborat tetrahidratn eker zeltileri ile oluturulduu karmlar

kullanlmtr. Sodyum tetraboratn % 0,1lik konsantrasyonu tropik meyvelere zarar veren

Anastrepha suspensa (Loew)nn lm orann artrm ve remesini yavalatmtr (Yang


15/75

15

et al., 2000). Ayn maddenin % 0,5lik zeltisi yumurta retimi ve almn azaltm tr.

Sodyum tetraborata uzun sreli maruz kalan A. suspensa erginlerinin yumurta retimi ve

bu yumurtalarn alma oran dmtr. Benzer sonular bir bcek byme dzenleyicisi

kiromazin (cyromazine) uygulanan diptera takmna ait eitli meyve zararllar Ceratitis

capitata (Wiedemann), A. obliqua (Macquart), A. serpentina (Wiedemann) ve A. ludens(Loew) ile elde edilmitir (Budia and Vinuela, 1996; Diaz et al., 1996). Laboratuvar

artlarnda yaplan almalar borik asitin % 1lik zeltisinin % 10luk skroz zeltisi ile

karmnn bir sivrisinek tr, Aedes albopictus (Skuse) populasyonunu % 98 orannda

azalttn ortaya karmtr (Xue and Barnard, 2003). Trkiyede zararllarla yaplan

mcadele almalarnda halk arasnda geleneksel olarak kullanlan borik asit ve

trevlerinin inorganik insektisit olarak ticari formlasyonlar tarm ve haere ilalar reten

firmalarda bulunmamakta olup profesyonel anlamda kullanlmamaktadr. Benzer bir

alma Alman hamam bcei Blatella germanica L. zerinde yksek konsantrasyonlarda(0,1- 0,5 M) skroz zeltisi ile hazrlanm % 1 ve 2lik borik asit zeltisi kullanlarak

yaplmtr. Yksek eker konsantrasyonunda borik asit besin almay nleyici etki yaparak

bcek zerinde etkili olmutur. Borik asitin % 1lik zeltisi 0,5 M skroz ile

kartrldnda ise B. germanica populasyonunu nemli derecede drmtr (Gore and

Schal, 2004; Gore et al., 2004). Sodyum tetraborat ve dier bor bileiklerinin bir termit

tr Coptotermes formosanus (Shiraki) (Grace, 1991), B. germanica (Bare, 1945; Cochran,

1995), bir karnca tr Solenopsis invicta (Buren) (Klotz et al., 1997), karasinek Musca

domestica L. (Hogsette and Koehler, 1992; Mullens and Rodriguez, 1992), larvalar scak

kanl hayvanlarn dokularnda parazit olarak yaayan Cochliomyia hominivorax (Coquere)

(Settepani et al., 1969) ve M. autumnalis (De Geer) (Lang and Treece, 1972) gibi

bceklerin farkl geliim evrelerinde ldrc ve erginlerde ise ksrlatrc etkiye sahip

olduu bilinmektedir. Settepani et al. (1969) C. hominivorax erkek ve dii bireylerin 5 gn

sreyle % 1 orannda sodyum tetraborat ieren besin ile beslenilmesinin erginlerin %

87sini ldrdn ve diilerin yumurta retimini tamamen nlediini gstermitir.

Borkovec et al., (1969) % 1lik sodyum tetraborat ile beslenen yeni erginleen karasinek

M. domesticann yumurta almn ve alan larvalarn pup olma orann nemli derecede

etkilemediini gstermitir. Ancak, sodyum tetraborat konsantrasyonu % 2,5 ve 5e

karldnda yumurtalarn almas tamamen nlenmitir. Nigg and Simpson (1997)

sodyum tetraborat ile beslenen A. suspensa erginlerinde yumurta retiminin 7 gn

gecikdiini gstermitir. Bu almalarda bor trevi maddelerin bcein yaama, gelime

ve remesi zerine gsterdii etkilerin mekanizmas tam olarak belirlenememitir. Ancak,


16/75

16

en azndan borik asitin bceklerde ktikl tabakasnn su kaybn nleyici zelliini

azaltmas (Ebeling, 1975) ile n barsak (Cochran, 1995) ve orta barsak (Habes et al.,

2006) epitelinin yapsn bozmak suretiyle besin maddelerinin emilimini nleyerek lme

sebebiyet verdii ynnde bilgiler bulunmaktadr. Habes et al. (2006) B. germenica

erginlerinin orta barsak epitel dokusundaki yapsal bozulmaya borik asit tarafndanoluturulan oksidatif hasarn sebep olduunu ne srmtr. Ayn zamanda bu aratrclar

borik asit ile beslenen bcein orta barsak dokusunda oksidatif strese bal olarak

glutatyon S-transferaz (GST) aktivitesinin nemli derecede ykseldiini, asetilkolinesteraz

(AChE) aktivitesinin azaldn ve lm orannn arttn gstermitir.

Baz almalarda eitli evresel stres faktrlerine maruz kalan birka bcek trnn mr

uzunluundaki artn, lipid peroksidasyonu seviyesinin dmesi (Setsini et al., 1991) ve

antioksidan enzimlerden speroksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve glutatyona bamlantioksidan enzimlerin aktivitelerinin ykselmesi (Sohal et al., 1995; Bains et al., 1998;

Sun et al., 2002) ile ilikili olduu vurgulanmtr. Uzun sre fenitrotiyona maruz braklan

lepidoptera takmna ait Spodoptera exigua (Hbner)nn erginlerinde artan SOD aktivitesi

ile birlikte yaama orannn ve mr uzunluunun artt gzlenmitir (Adamski et al.,

2003). Bykgzel et al. (2006) organofosforlu insektisitlerin ldrc olmayan dozlarna

kar bir adaptasyon tepkisi olarak Pimpla turionellae L. erginlerinde SOD aktivitesinin ve

mr uzunluunun arttn gstermitir. Kimyasal mcadelede kullanlan yeni

insektisitlerin bcekler zerindeki etkilerinin tespit edilmesinde yaama, gelime, mr

uzunluu, yumurta verimi gibi biyolojik etkinlik parametrelerinin yannda biyokimyasal ve

fizyolojik tepki mekanizmalarnn da iyi bilinmesi gerekmektedir.

Canllarn insektisitlerin de dahil olduu eitli kimyasal maddeler ve baz evresel stres

faktrlerine maruz kalmalar, reaktif oksijen trevlerinin (ROT) oluumuna ve dolaysyla

metabolik olaylarn bozulmasna neden olur (Felton and Summers, 1995). ROTlar, sahip

olduklar paylalmam elektronlarndan dolay olduka reaktif atom veya molekllerdir.

Biyolojik sistemlerdeki reaktif oksijen trevleri (ROT), speroksit anyonu (O2.-), hidroksil

radikali (HO.), nitrik oksit (NO.), peroksit radikali (ROO.) gibi serbest radikaller ile radikal

olmayan hidrojen peroksit (H2O2) oksidatif stresin en nemli nedenlerinden birisidir. Her

ne kadar serbest radikal reaksiyonlar, omurgallarda baklk sistemi hcrelerinden

ntrofil ve makrofaj gibi hcrelerin savunma mekanizmalar iin gerekli olsa da, serbest

radikallerin fazla retimi hcre hasar ve lm ile sonulanmaktadr. Aerobik yaamn


17/75

17

normal bir aamas olan oksidatif reaksiyonlar sonucunda ortaya kan ROTlar DNA,

proteinler, karbonhidratlar ve lipidler gibi makromolekler hcresel yaplara kovalent

balanarak yapsal hasar meydana getirir. Bu reaktif trevler hcre zarnn doymam ya

asitlerine (lipid peroksidasyonu) ve protein bileimine (protein oksidasyonu) zarar

vermektedir (Halliwell, 1994; Heinle and Betz, 1994). Serbest radikaller zar ileetkiletiinde zar ile fonksiyonel olarak etkileim halinde olan enzimler, hormonlar ve

nrotransmitterler olumsuz ynde etkilenmektedir.

Lipid peroksidasyonu, zarda bulunan oklu doymam ya asitlerinin, serbest oksijen

radikalleri tarafndan lipid peroksitler, alkoller, aldehidler, hidroksi ya asitleri, etan ve

pentan gibi esitli rnlere yklmas reaksiyonudur (Felton and Summers, 1995). Lipid

hidroperoksitlerinin ykm ile oluan ve biyolojik olarak aktif olan aldehidler ya hcre

dzeyinde metabolize edilirler veya balangtaki etki alanlarndan diffuze olup hcrenindier blmlerine hasar yayarlar. veya daha fazla ift ba ihtiva eden ya asitlerinin

(Linoleik, linolenik ve araidonik asitler) peroksidasyonunda tiyobarbitrik asit ile

llebilen malondialdehid (MDA)in yannda 4-hidroksi-2 nonenol (4-HNE) meydana

gelir (Bokov et al., 2004). MDA ya asidi oksidasyonunun kantitatif bir indikatrdr ve

lipid peroksidasyonunun derecesiyle iyi uyum gsterir. MDA lipid peroksidasyonunun son

rn olan bir aldehid (ekil 1.1) olup oksidatif stresin derecesi ile orantl olarak miktar

artmaktadr (Suwalsky et al., 2001). Oluan MDA, hcre zarlarndaki iyon al-veriine

etki ederek zardaki bileiklerin apraz balanmas, iyon geirgenliinin ve enzim

aktivitesinin deimesi gibi olumsuz sonulara neden olur.

Canllarn tmnde antioksidan savunma sistemi, kimyasal maddelerin sebep olduu

endojen (metabolik) veya eksojen (besinsel) kaynakl ROTlarn ortadan kaldrlmasndan

veya etkisiz hale getirilmesinden sorumludur (Halliwel and Gutteridge, 1999). evresel

stres faktrleri canl trlerinde biyolojik deiikliklere neden olabilir. Bu canllar

detoksifikasyon kapasitesilerine bal olarak bu faktrlerin zararl etkisinden korunma

yeteneine sahiptir (Vasseur and Leguille, 2004). Patofizyolojik durumlarda retilen

ROTlar antioksidan sistem ile uzaklatrlr. Hcrelerde ROTlarn yapm olduu hasar

nleyen enzimatik ve enzimatik olmayan savunma sistemleri vardr. Enzimatik olmayan

savunma sistemlerinin balca elemanlar glutatyon, vitamin E (-tokoferol), vitamin C

(askorbik asit), melatonin, karoten ve dier maddelerdir (Hermes-Lima et al., 1998).


18/75

18

ekil 1.1 Lipid peroksidasyonu rn MDAnn oluumu.

Enzimatik savunma sistemi ise SOD, CAT, glutatyon peroksidaz (GPx) l enzim sistemi

(Ahmad, 1995) ile glutatyon redktaz (GR), GST (Yu, 2004) ve son zamanlarda nemi

anlalan askorbat peroksidaz (APOX) enzimleridir. SOD enzimi, speroksiti hidrojen

peroksite ve molekler oksijene paralar. CAT ise oluan hidrojen peroksiti su ve

molekler oksijene dntrr. Bu enzimlerin grevi hcreleri speroksit serbest

radikallerinin zararl etkilerine kar korumaktr (Parker et al., 2004). GPx omurgallarda

oksidan strese kar en etkili antioksidan olup hidrojen peroksit ve lipid peroksitlerin

indirgenmesini (redksiyon) katalizleyen, drt alt birimden oluan (tetramer) ve 4

selenyum atomu ieren sitozolik bir enzimdir (Manduzio et al., 2005). GPx aktivitesindeki

azalma, hidrojen peroksit dzeylerinin ykselmesine ve hcre hasarna yol amaktadr

(Schaeffer and Stainer, 1978; Ursini et al., 1982). GR ise oksitlenmi glutatyonda (GSSG)

oluan dislfid bann tekrar slfidril yapsna indirgenerek daha sonraki konjugasyon

reaksiyonlar iin hcreye indirgemi glutatyon (GSH) salar.


19/75

19

Serbest Radikalretimi

Serbest RadikalUzakla trlmas

Proteinler Lipidler DNA

OksidatifStres

HasarlProteinler

HasarlLi idler

HasarlDNA

Organizmada serbest radikallerin oluum hz ile bunlarn ortadan kaldrlma hz bir denge

ierisindedir ve bu durum oksidatif denge olarak adlandrlr. Oksidatif denge saland

srece organizma serbest radikallerden etkilenmemektedir. Bu radikallerin oluum hznda

artma ya da ortadan kaldrlma hznda dme bu dengenin bozulmasna neden olur.

Oksidatif stres olarak adlandrlan bu durum serbest radikal oluumu ile antioksidansavunma mekanizmas arasndaki ciddi dengesizlii gstermekte olup, sonuta doku

hasarna yol amaktadr (ekil 1.2). Oksijenli solunum yapan btn organizmalarda

kullanlan oksijenin ou sitokrom oksidaz tarafndan mitokondride tam olarak

indirgenerek su molekl oluturulduu halde hcrelerde eitli enzimatik ve enzimatik

olmayan reaksiyonlar sonucu ROTlar olumaktadr. Canllar ayn zamanda dorudan

besinler ile bu reaktif oksijen radikalleri ve dier serbest radikalleri almaktadrlar.

ekil 1.2 Oksidatif stres ve hcre hasar.


20/75

20

GST ksenobiyotiklerin biotransformasyonunda nemli rol oynayan faz II enzim sisteminin

nemli bir enzimidir (Sivori et al., 1997; Sheehan et al., 2000). Bata araidonik asit ve

linolenik asitin (C18: 9,12,15) peroksidasyonu sonucu olaan hidroperoksidler olmak zere

lipid peroksidlerine kar selenyumdan bamsz GPx aktivitesi gstererek bir savunma

mekanizmas oluturur. Hem detoksifikasyon yaparlar hem de hcre ii balayc vetayc rolleri vardr. Katalitik olarak ila, herbisit ve insektisit gibi yabanc maddeleri

glutatyon (GSH; -glutamil-sistenil-glisin)daki sisteine ait SH grubu ile balayarak

onlarn elektrofilik blgelerini ntralize ederler ve rnn daha fazla suda znr hale

gelmesini salarlar (O'Brien and Tew, 1996). Oluan bu GSH konjugatlar bylece

organizmadan atlabilir veya daha ileri metabolize olurlar. GSHdan glutamat ve glisinin

koparlmasndan sonra sisteinin serbest amino grubu asetillenerek merkaptrik asidlere

dntrlr. Ksenobiyotiklerin omurgallardaki klasik atlm rnleri olan bu merkaptrik

asitler daha sonra safra ile atlrlar. Metabolize edilmeyen lipofilik-hidrofilik pek ok

bileii balamalar ise bu enzimlerin hcre iinde snrl znrlle sahip molekller

iin depo ve tama rol stlendiini gsterir.

Bu enzim alt birimden oluan zara bal mikrozomal enzim ve iki alt birimden oluan

dimerik sitoplazmik enzim olarak iki gruba ayrlr. Bceklerde sitoplazmik GSTlerin

byk blm zeta, teta ve omega snfna dahildir (Ranson et al., 2000). GSTnin

bceklerin insektisitlere kar diren gelitirmelerinde nemli bir rol vardr (Syvanen et

al., 1996; Wei et al., 2001; Hamimy et al., 2004). GSTler bceklerde insektisitlerdenkorunmada rol alan detoksifikasyon enzimlerinin byk bir ailesidir (Yu, 2004). Yksek

GST aktivitesi, insektisitlerin iddetli toksitesinin izlendii ou bcekte saptanmtr

(Punzo, 1993; Vontas et al., 2001). GST ve GSH, reaktif trlerin konjugasyonu ve lipid

peroksidasyon rnlerinin detoksifikasyonu ile oksidatif zararn nlenmesinde nemli bir

rol oynarlar (Singh et al., 2001). M. domesticada organofosforlu insektisitlere direnli

mutantlarn yksek GST aktivitesine sahip olduu bulunmutur (Zhou and Syvanen, 1997).

GST, bceklerde insektisitlerin (Yu, 1996) ve konak bitkilerden salnan allelokimyasallarn

(Yu, 1993; Wadleigh, 1988) metabolik detoksifikasyonunda, ROTlarn toksik etkilerinden

bcekleri korumada (Clark et al., 1985; Ahmad and Pardini, 1990; Parkes et al., 1993;

Zaman et al., 1994; Vontas et al., 2001), ayn zamanda prostaglandin ve baz hormonlarn

biyosentezinde (Kanaoka et al., 2000) ve hcre ii iyon kanallarnn dzenlenmesinde

(Dulhunty et al., 2001) nemli role sahiptir. GSH, sahip olduu slfhidril grubu ile

oksidatif hasar ve toksik maddelere kar hcreleri koruyan bol miktarda tiyol ihtiva eden,


21/75

21

dk molekler arlkl bir maddedir. Bceklerde GPxin selenyumdan bamsz tipi

bulunmaktadr. Daha nceki almalarda lepidopter bceklerin ounun hidrojen peroksiti

uzaklatrmak iin nemli saylabilecek derece GPx aktivitesine sahip olmadn

belirtilmitir (Ahmad and Pardini, 1990). Son almalar Trichoplusia ni (Hbner),

Spodoptera eridania (Stoll), Papilio polyxenes (Fabricius) gibi lepidopter trlerde GPxaktivitesinin dk de olsa bulunduunu gstermitir (Ahmad et al., 2005). Bu bceklerde

dk olan GPx aktivitesinin GSTnin peroksidaz aktivitesi tarafndan desteklenmekte

olduu (Ahmad et al., 1989; Peri-Mataruga et al., 1997; Krishnan and Sehnal, 2006) ve

katalaz aktivitesinin de yksek olduu bulunmutur. Katalaz enzimi sitoplazmada ve

peroksizomlarda bulunmakta olup H2O2yi oksijen ve suya paralamaktadr (Wang et al.,

2002). Bceklerin sahip olduklar GST lipid peroksitleri metabolize edebilir fakat H2O2 ye

kar reaktif deildir (Ahmad et al., 1991; Ahmad, 1992; Kono and Shishido, 1992).

Bceklerde katalaz dk konsantrasyonlarda iken H2O2 yi redkte etmekte baarszdr(Ahmad et al., 1991; Felton and Duffey, 1991; Ahmad, 1992). Bu nedenle bcekler

peroksitleri gvenli bir dzeyde tutmak iin farkl mekanizmalara sahiptir. Askorbat

peroksidaz (APOX) bceklerde bulunan dier bir doal antioksidan enzimdir. Helicoverpa

zea (Boddie) larvalarnda bu enzim askorbatn oksidasyonu ile ezamanl olarak H2O2yi

enzimatik olmayan yollardan redkte etmektedir (Mathews et al., 1997). Bceklerde

reaktif oksijen trevlerine kar enzimatik antioksidan savunma sistemleri tiyoredoksin

redktaz (TrxR) ve glutatyon redktaz (GR) enzimlerini de iermektedir. Tiyoredoksin ve

glutatyon peroksidaz (TPx ve GPx) substrat olarak glutatyonu kullanr. Fonksiyonel bir

GRden yoksun olan meyve sinei Drosophila melanogaster(Meigen)glutatyonu

indirgeme olaynda tiyoredoksin sistemini kullanlr (Missirlis et al., 2003).

Bcekler antioksidan savunma sistemi dnda antibakteriyel proteinlerin rol oynad bir

humoral savunma sistemine sahiptir. Lizozimin bcek baklk sistemindeki rol tam

olarak bilinmemesine ramen fagosite edilmeden nce bakteri, virus ve parazitlerin hcre

duvarn paralamas yannda spesifik olmayan bir humoral savunma molekl olarak

sentezi uyarlr (Jarosz and Spiewak, 1979). Lepidoptera takmna ait trlerden Bombyx

mori L., G. mellonella ve Spodoptera littoralis (Boisduval) ile yaplan almalar bu

trden izole edilen lizozimlerin c-tipi (tavuk yumurta lizozimi) lizozimlere ait olduunu

gstermitir (Jolles et al., 1979). Baz znr maddelerin enjekte edildii G. mellonella

larvalar ve puplarnda lizozim aktivitesi yksek bulunmutur. Puplara gre bu maddelere

kar larvalarda daha fazla lizozim salglanmtr. M. domesticada lizozimin fizyolojik


22/75

22

pHda Micrococcus luteus (Schroeter)a karaktivite gstermedii kitine kar aktivite

gsterdii grlmtr. Bu enzim savunma amal sentezlenen protein olmaktan ok

bcein orta barsanda bir sindirim enzimi gibi i grmtr (Ito et al., 1995). Bu

zellik baz memeli hayvanlarn midesindeki sindirim ilevinden sorumlu lizozim ile

benzerlik gstermitir (Fujita, 2004).Omurgallarda daidrar ve serebrospinal sv hariolmak zere, tkrk, st, ter, gzya gibi salglarda bulunan glikoprotein yapsnda olan

lizozim, mikroorganizmalarda bulunan peptidoglikan tabakasn ayrtrarak bunlar tahrip

eder. Lizozim bilinen en genel antibakteriyel proteindir. Bakteri hcre duvarnn

peptidoglikan tabakasnda bulunan N-asetilglukozamin (NAG) ve N-asetilmuramik asit

(NAM) arasndaki -1,4-glikozidik ban hidrolize eden bir enzimdir. Fizyokimyasal ve

molekler yaps gz nne alndnda lizozim alt gruba ayrlmaktadr. Omurgaszlarda

genel olarak i-tipi lizozimler bulunur. Lepidoptera, Ortoptera ve Diptera takmlarna ait

eitli trlerde yaygn olmak zere bceklerde c-tipi lizozimler (tavuk yumurta lizozimi)bulunmaktadr (Hultmark, 1996). Bceklerin sindirim kanalnda besinle alnan bakterileri

sindirmede ve vcut boluklarna giren patojenlere kar savunma amal olarak lizozimin

iki ynl rol vardr. (Ursic bedoya et al., 2005) M. domestica, D. melanogastergibi

trlerin sindirim sistemlerinde bulunan veya dardan alnan bakterilerin sindirimi lizozim

tarafndan gerekletirilmektedir (Daffre et al., 1994; Lemos and Terra, 1991; Regel et al.,

1998). Bceklerde lizozimin antimikrobiyal savunma ile ilikisi uzun yllardr

bilinmektedir (Malke, 1965; Mohrig and Messner, 1968). Lizozim epidermal kitin

tabakasnda d ortamdan bulaabilecek mikrobiyal enfeksiyonlara kar bcei

korumaktadr (Lee and Brey, 1995). B. mori, H. virescens (Fabricius) ve M. sexta L. gibi

ok sayda Lepidoptera takmna ait trlerde lizozim retiminin temel kayna ya

dokusudur. Bal ars Apis mellifera L.nn zehir salgsndaki litik aktivitenin lizozim ile

ilikili olduu tespit edilmitir (Mohrig and Messner, 1968).

Oksidatif hasara kar organizmalar antioksidan enzimler ile kendilerini savunurlar. Eer

antioksidan savunma sistemi yetersiz kalrsa oksidatif hasarn artmas sonucunda hcresel

yalanma, kanser oluumu ve hcre lm gzkr. Transaminaz enzimlerinin aktiviteleri

memelilerde organ fonksiyonlarn test etmek ve varsa fonksiyonel hasarlar saptamak iin

zellikle yaygn olarak kullanlmaktadr (Rosenthal, 1997). Ancak bu testler son yllarda

zellikle evre biyolojisi ve evresel kirleticilerin canllara etkileri ile ilgilenen

aratrmaclar tarafndan da kullanlmaya balanmtr. Genelde kimyasal maddeler ve

biyolojik ajanlar doku hasarlarna yol aarak hcresel enzimlerin salnmna ve bunun


23/75

23

sonucunda da serum enzim konsantrasyonlarnda arta neden olurlar. Her iki enzim de

hasarl hcrelerden hcre zarndaki geirgenliin artna veya hcre nekrozuna bal

olarak salnm gsterir. lerleyen doku ve hcre hasarnn en nemli biyobelirteleri

aminotransferaz enzimlerinden alanin aminotransferaz (ALT) ve aspartat aminotransferaz

(AST) aktifliindeki deimedir (Sidlova et al., 2003). ALT ve AST enzimleri karbohidratve aminoasit metabolizmasyla ilgili olup bir moleklden bir dierine amino gruplarn

aktararak hcre iindeki kimyasal reaksiyonlar katalizlemektedirler (Zubay, 1993). Baz

omurgal canllarda da ALT, AST enzimleri eitli kimyasal etkenlere kar oluan doku

hasarnn nemli biyobelirteleri olarak kullanlmaktadr (Blain, 1990, Oru and ner,

2000; Gze et al., 2001). Bceklerde enzimler ile ilgili yaplan almalar ounlukla

insektisitlere kar biyokimyasal tepki olarak antioksidan enzimlerin aktivitelerinin

deiimi zerinedir (Miota et al., 1998). evre kirliliine kar bceklerde oluan tepkide

transaminaz enzimlerinin aktivitesi hakknda ok az bilgi bulunmaktadr. Pretroidler veDDT gibi insektisitlere maruz kalan Culex fatigans (Wiedemann) tr sivrisinekte ALT ve

AST aktivitelerinde nemli deiim ortaya karlmtr (Verma and Rahman, 1984).

Tetrasiklin ile beslenen Philosamia ricini (Boisduval) larvalarnda AST miktar iki kat

artmtr (Eid et al., 1989). ALT, AST enzim aktiviteleri bceklerde organ fonksiyonlarn

test etmek ve varsa fonksiyonel hasarlar saptamak iin yaygn olarak kullanlmaya

balanmtur. Ya doku, bceklerde azot metabolizmasnn merkezi organdr ve

omurgallardaki karacierin ilevine benzer bir ileve sahiptir. Ya dokudaki yapsal ve

ilevsel deiimler organizmadaki metabolik olaylar etkilemektedir. Hcre zarnn

geirgenliinin deimesi veya hcrelerin paralanmas sonucu ya dokudaki enzimlerin

hemolenfe salnmas nedeni ile ALT, AST gibi hcresel enzimlerin hemolenfteki

aktiviteleri artmaktadr.

Asetilkolinesteraz (AChE) enzimindeki kalitatif ve kantitatif deiimler bceklerin

insektisitlere kar hassasiyetini etkiler. Organofosforlu insektisitlere maruz kalan D.

melanogasterinmerkezi sinir sisteminde fazla miktarda AChE sentezlendii ve yabanl

trlere gre daha direnli olduu tespit edilmitir. Bunun aksine daha dk seviyede

AChE ieren bceklerin ise insektisite kar daha duyarl olduu bulunmutur (Villatte et

al., 2000). Merkezi sinir sisteminin dnda dier dokularda AChE enziminin ar

retilmesi de bcekleri insektisitlere kar korur. Bceklerde sitoplazmik AChE retilerek

hemolenfe gnderilir ve insektisite kar diren salanr. Dier taraftan AChE enzimindeki

yapsal deiimde insektisit direnliliini salar (Fournier et al., 1993). Bceklerle


24/75

24

mcadelede geleneksel baz insektisitler yaygn kullanma sahiptir. Bunlarn en nemlileri

organoklorlu ve organofosforlu insektisitler ile pretroidler ve karbamat grubu

insektisitlerdir. nsektisitlerin kendilerine zg etki mekanizmalar bulunmasna ramen

bata organofosforlu insektisitler olmak zere birok insektisit sinir sistemini olumsuz

ynde etkilemektedir. Gelimi canllarda sinir sistemi en duyarl sistemlerin banda gelir.Organofosforlu insektisitlerin en nemli zellii, hedef enzim olan AChE enzimini inhibe

etmeleridir. Organofosforlu insektisitler AChE enziminin doal substrat olan asetilkolini

taklit ederek enzimin aktif merkezine fosfat araclyla balanr. AChE bceklerdeki

merkezi sinir sisteminin kolinerjik sinapslarnda nrotransmitter madde olan asetilkolinin

hidrolizini katalizleyen ve sinir impluslarnn sonlanmasnda anahtar rol oynayan bir

enzimdir (Wang et al., 2004). Asetilkolin, AChE enzimi tarafndan kolin ve asetik asite

dntrlr. Asetilkolin hidroliz olmasna ramen, insektisitler enzim-substrat

kompleksine bal halde kalr. AChE enziminin aktivitesinin drlmesi sinapslardaasetilkolinin birikmesine sebep olarak merkezi sinir sisteminin srekli uyarlmas sonucu

lm meydana gelir (Chen et al., 2001). Habes et al. (2006) borik asitin hamam bceinde

AChE enzimini inhibe ettiini gstermesine ramen, bor trevi inorganik insektisitlerin

AChE enzimine etkileri detayl bilinmemektedir. AChE enziminin bu insektisitlerin

toksitesine kar diren salamada etkili olup olmad ise aklanmay bekleyen bir

konudur.

imdiye kadar sodyum tetraboratn ve trevlerinin G. mellonella ve dier lepidopter

bcekler zerindeki kalitatif ve kantitatif etkileri belirtilmemitir. Bu almada yapay

besine ilave edilen farkl konsantrasyonlardaki sodyum tetraboratn G. mellonellann

yumurtadan yeni km larvalarnn ergin evreye kadar yaamas, gelimesi, erginlerin

mr uzunluuna etkisi incelenmitir. Ayrca bu maddenin bcein 7. evre larvalarnn

hemolenf ve ya dokusunda lipid peroksidasyonu seviyesini gsteren malondialdehid

(MDA) miktar, antibakteriyel bir protein olan lizozim miktar, detoksifikasyon enzimi

GST, aminoasit ve karbohidrat metabolizmasnda rol oynayan AST, ALT ve sinaptik

iletimin normal ileyiinden sorumlu AChE enzimlerinin aktivitelerinde sebep olduu

deiimler incelenmitir. Bylece sodyum tetraboratn bcein biyolojik etkinlik

parametreleri zerindeki etki mekanizmasnn oksidatif stres ve doku hasar ile birlikte

sinaptik depresyonla ilikisinin biyokimyasal ve fizyolojik temelleri ortaya konmaya

allmtr.


25/75

25

BLM 2

MATERYAL VE METOT

2.1 BCEK KLTRNN DEVAMI

Byk bal mumu gvesi Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) kltrnn

devam yumurtadan yeni km larvalarn yapay besinde aseptik olmayan artlarda

yetitirilmesi ile saland (Bronskill, 1961). Kltr 30 2 C ve % 65 5 nisbi nemde ve

gn boyu devaml karanlkta yrtld.

G. mellonella larvalarn laboratuvar artlarnda yetitirmek iin Bronskill (1961)

tarafndan gelitirilen yapay besin kullanld. Hazrlanan besin bir litrelik cam kavanozlarn

(80 x 180 mm) yaklak 1/3ne kadar dolduruldu. Bu kavanozlarn iine 10-15 adet dii

braklarak tel kafesli kapak ile kapatld. Bu ekilde erginlerin besin zerine yumurta

brakmalar saland. Bu yumurtalardan kan larvalardan yaklak 25-30 gn sonra

geliimlerini tamamlayan 7. evre larvalar pup olmalar iin dier bir kavanoza aktarld.

Bu kavanozun iine, larvalarn pup olmalar iin kuru ortam salamak zere, katlanm

pelur kt paralar brakld (Campos et al., 1990). Puplardan yaklak 7-8 gn sonra

ergin bireyler meydana geldi. Bu erginlerin byk bir ounluu bcek kltrnn

devam, baz erginler ise sodyum tetraborat ile ilgili beslenme almalar iin gerekli

yumurtalarn elde edilmesinde kullanld.

2.2 BESNLERN HAZIRLANMASI

Bcek kltrnn devam iin kullanlan besin sodyum tetraboratn bcek zerindeki

etkisini incelemek amacyla yrtlen beslenme deneylerinde kontrol besini olarak

kullanld. Besin, 420 g kepek, 150 ml szme bal, 150 ml gliserin (Merck, Darmstadt,

Germany), 20 g tlm koyu renkli kuluka petei ve 30 ml saf sudan olumaktadr.

Besinin bileenlerinden gerekli miktar geni bir kap ierisinde kartrld ve nce mekanik

bir kartrc ile homojen bir karm oluturuldu. Daha sonra el yardm ile zenle ve uzun


26/75

26

sre kartrlarak gliserinin dier bileenlerce emilmesi saland. Bu karm sv

bileenlerin kat bileenler tarafndan tam olarak emilebilmesi iin 24 saat bekletildi.

2.3 SODYUM TETRABORATIN DENEYLERDE KULLANILMASI

Bu almada denenen sodyum tetraborat dekahidrat (boraks, Na2B4O7.10H2O) Eti Maden

letmeleri Genel Mdrlnden temin edildi. Sodyum tetraboratn beslenme

deneylerinde denenen konsantrasyonlar g/100 g besin olarak ifade edildi. Sodyum

tetraborat suda byk oranda znd iin bu miktarlar besinin hazrlanmas srasnda

dorudan besine ilave edildi. almann balangcnda kontrol besini (sodyum tetraborat

iermeyen) hari sodyum tetraboratn 0,005, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5 g/100 g olmak zere 5 farkl

konsantrasyonu denendi. Yaplan n denemeler sonucunda en yksek konsantrasyon olan

0,5 gda larvalarn hibiri yedinci evre ulaamadndan bu almada en yksekkonsantrasyon 0,3 g olarak belirlendi.

2.4 LARVALARIN ELDE EDLMES

Beslenme deneylerinde kullanlacak larvalar, kapakl, bir plastik kabn (ORLAB, 30 ml,

L190030, 35 x 55 mm) i yzeyine G. mellonella diileri tarafndan braklan yumurtalarn

almas ile elde edildi. Bunun iin 2-3 dii birey, delikli kapaklar olan bu plastik kaplara

konuldu ve yumurta brakmak iin stok kltrn devam ettirildii ortam koullarnda

bekletildi. Braklan yumurtalar yine ayn ortam artlarnda bekletilerek almalar

saland. Yumurtadan yeni kan larvalarn kamasn nlemek iin caydrc olarak kabn

kapana yakn i yzeyine yaklak 1 cm kadar genilikte gliserin srld. Yumurtalarn

almas ile serbest kalan larvalar, yumuak ulu ve ucu gliserine batrlarak

nemlendirilmi fra ile besinlere aktarld. Bu ekilde larvalar tarafndan dorudan besin

ile alnan sodyum tetraboratn ergin evreye kadar yaama, geliime ve erginlerin mr

uzunluuna etkisi incelendi.

2.5 YAAMA, GELME VE MR UZUNLUU

Sodyum tetraboratn G. mellonellann yaama ve geliimi zerine etkilerini incelemek iin

yaplan deneyler srasnda besinin hazrlanmas, yumurtalarn elde edilmesi, bu

yumurtalardan kan larvalarn besine alanmas en et al., (2005)nn yntemine gre


27/75

27

yapld. Besinin hazrlanmas, yumurtalarn elde edilmesi, bu yumurtalardan kan

larvalarn besine alanmas ilemleri tamamen aseptik olmayan artlarda yapld. Kontrol

besini ve sodyum tetraboratn herbir konsantrasyonunu ieren besinlere balangta 20er

adet yumurtadan yeni kan larva aland. Larvalar besine brakldktan sonra geliimlerini

tamamlayan 7. evre olgun larvalar alnarak pup olmak zere 15 mllik plastik rnekkaplarna (ORLAB, L190015, 35 x 33 mm) her kapta bir larva olacak ekilde brakld.

Larval olgunlua (yedinci evre) kadar geen sre (larval gelime) ve yaama oran (larval

yaama) belirlendi. Bu kaplarn ierisine larvalarn pup olmas iin ortam salamak zere

katlanm, ince pelur kt brakld. Larvalarn pup olma sreleri (pupal gelime) ve pup

olma oran (pupal yaama) ile bu puplardan erginleen bireylerin ergin olma sreleri (ergin

evreye gelime) ve ergin olma oran (ergin evrede yaama) belirlendi.

Sodyum tetraboratn G. mellonella zerindeki etkisinin aratrld deneylerin hepsindelarvalarn aland besin kaplar ve olgun larvalarn pup olmalar iin hazrlanan kaplar

ksa bir gnlk inceleme periyodu hari srekli olarak karanlkta tutuldu. Besinin

hazrlanmas ve larvalarn alanmas hari beslenme deneylerinin tm G. mellonella stok

kltrnn yetitirildii artlarda yrtld ve drder defa tekrarland. Bir ok lepidopter

trnn birinci evre larvalarnda olduu gibi G. mellonella larvalarnn da besin ortamna

konulduktan sonra lm orannn yksek olduu, len larvalarn ilerinin boalarak

kuruduu ve gzden kaybolduu iin besine alanan her bir larvann olgun evreye

ulancaya kadar gnlk olarak takip edilmesi mmkn olamamtr (Zalucki et al., 2002).

Bu yzden farkl evrelerdeki yaama oran tespit edilirken deney sresince yaayan larva

says olarak, besine balangta alanan larvalarn says dikkate alnd.

Sodyum tetraboratn ergin bireylerin yaama sresine etkisini belirlemek iin yapay besin

ile beslenen larvalardan erginleen bireyler kullanld. Bu amala yumurtadan yeni km

G. mellonella larvalar sodyum tetraboratn farkl miktarlarn ieren yapay besin ile ergin

evreye kadar beslendi. Kontrol grubu olarak sodyum tetraborat iermeyen besinler

kullanld. Her bir deney iin 10 adet ergin kullanld ve deneyler drt defa tekraraland.

Erginleen bireyler 30 mllik, geni azl, effaf, delikli kapakl plastik kaplara (ORLAB,

L190030, 35 x 55 mm) birer adet brakld. Deney sresince bu erginlere herhangi bir besin

verilmedi. Bu erginler 25 2 C de brakld. Erginler, her gn belirli saatte kontrol

edilerek yaama sreleri belirlendi.


28/75

28

2.6 ENZM EKSTRAKSYONU VE AKTVTE TAYN

2.6.1 Ya Doku ve Hemolenfzolasyonu

G. mellonella larvalar buz zerinde 5 dakika bekletildikten sonra larvalarn yzeyi %95lik etil alkol ile steril edildi. Stereo mikroskop altnda 7. evre larvalarndan ya doku

(fat body) bir pens yardmyla izole edildi iinde homojenizasyon tamponu (% 1,15lik

w/v KCL, 25 mM K2HPO4, 5 mM EDTA, 2 mM PMSF, 2 mM DDT, pH: 7,0 ) bulunan bir

ependorf tpne konuldu. Fenol oksidaz aktifliini nlemek iin tplere birka feniltire

kristali konuldu. Olgun larvalarn n bacaklarnn dip ksmndan steril bir enjektr inesi

ile delinmesi ile aktlan hemolenf ise birka feniltire kristali ieren bir ependorf tpe

alnd.

Larvalardan alnan ya doku ve hemolenf rnekleri analiz yaplncaya kadar derin

dondurucuda (-86 0C) sakland. Daha sonra rnekler +4 0Cde ultrasonik homojenizatrde

(Bandelin Sonoplus HD2070, Berlin, Germany) (10 sn, 30 W) homojenize edildi. Enzim

inaktivasyonunun nlenmesi iin homojenizasyon dahil tm ilevler buz ile salanan souk

ortamda yapld. Homojenize edilen rnekler, +4 Cde 16000 x g devirde soutmal

santrifjde 20 dakika santrifj edildi. knt atlarak st svlar enzim aktivitesinin

lmnde kullanld.

2.6.2 Malondialdehid (MDA)

Jain and Levine (1995)nn kulland metod temel alnarak 532 nmde tiyobarbitrik asit

(TBA) ile reaksiyona giren lipid peroksidasyonun son rn malondialdehid (MDA)

miktar lld. Hemolenf ve ya doku % 1,15lik KCl ile ultrasonik homojenizatr (10

sn, 30 W) (Bandelin Sonoplus HD2070, Berlin, Germany) ile paraland. Homojenize

edilen rneklere pH 7,4 olan fosfat tamponu (18 mM NaCl, 18 mM Na 2HPO4), 0.04 M

butillenmi hidroksi toluen (BHT), % 30luk triklorasetik asit (TCA) eklenerek, 2 saat

buzun ierisinde bekletildikten sonra 4 C de, 2000 x g devirde 15 dakika santrifj edildi.

Tplerden alnan st svya 0.1 M EDTA ve % 1lik TBA ilave edilerek kaynar su

banyosunda 45 dakika bekletildi, daha sonra spektrofotometrede (Shimadzu 1700 UV/Vis,

Kyoto, Japan) 532 nmde absorbans okundu. MDA miktar 1,56 x 105 M-1cm-1 kat says

kullanlarak nmol/mg protein olarak verildi.


29/75

29

2.6.3 Glutatyon S-transferaz (GST)

Habig et al. (1974) tarafndan gelitirilen metod uyguland. GSTnin btn izozimleri iin

1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) yaygn bir substrattr. CDNB 340 nmde ykselen

absorbans gsteren glutatyon oksidasyonunu katalizleyen GST enzimi iin substrat olarakkullanld. Bu enzimin aktivitesinin llmesi iin 3 mllik cam kvetlere 2,5 ml 50 mM

fosfat tamponu, 200 l 20 mM redkte glutatyon ve 150 l spernatant ilave edildi.

Enzimatik reaksiyon bu karma 150 l 25 mM CDNB eklenerek balatld ve 2 dakika

boyunca ykselen absorbanslar okundu. Ykselen absorbans CDNBnin redkte glutatyon

ile reaksiyona girerek tioether yapsnn oluumunu gstermektedir. Enzim aktivitesi 340

nmde (340: 0,0096 M.cm1) spernatantta bulunan 1 mg toplam protein bana 1

dakikada oluturulan tioether miktar olarak lld ve enzimin spesifik aktivitesi nmol/mg

protein/dk olarak verildi.

2.6.4 Alanin Aminotransferaz (ALT), Aspartat Aminotransferaz (AST) ve

Asetilkolinesteraz (AChE)

Spektrofotometrede ALT (E.C.2.6.1.2, L-alanin 2-oksoglutarat aminotransferaz) iin 340

nm, AST (E.C.2.6.1.1, L-aspartat 2-oksoglutarat aminotransferaz) iin 405 nm, AChE

(E.C.3.1.1.7, Asetilkolin asetilhidrolaz) iin 405 nm dalga boylarnda absorbanslar

llerek enzim aktiviteleri hesapland. ALT ve AST enzim aktivitelerinin tayininde

Biomreux tehis kitleri [ALT, Kit No: 63313; AST, Kit No: 63213, Biomreux diagnostik

A.., Marcy-lEtoile, France], substrat olarak AST iin L- aspartat ve 2-oksoglutarat, ALT

iin de L-alanine ve 2-oksoglutarat kullanld. AChE enzimi aktivitesi iin Sigma Chemical

Co. (St Louis, MO, USA, Kit No: 420) kitleri kullanld. Bu enzimin aktivitelerinin

belirlenmesinde otoanalizr (Htach, P 800, Tokyo, Japonya) kullanlmtr.

Enzim tayinleri iin elde edilen spernatantlardan enzimlerin spesifik aktifliini

hesaplamak iin znr toplam protein tayini yapld. Bu amala rneklerin absorbans

spektrofotometrede 600 nmde Folin-Lowry (Lowry et al., 1951) metoduna gre llerek

total protein miktar tespit edildi. Bu hesaplamay yapmak iin ncelikle farkl

konsantrasyonlarda Bovin serum albumini zeltileri hazrland ve bir standart grafik

oluturuldu. Total protein miktarlar bu standart grafie gre hesapland.


30/75

30

2.6.5 Lizozim

Lizozim miktar in vitro koullarda agarozda radyal dalm esasna gre tespit edilmitir

(Hyrl and Marex, 1999). Bu yntemde Micrococcus luteus (CCM 169) bakterisi

kullanld. Micrococcus luteus bu enzime hassasiyeti en fazla olan mikroorganizmadr.(Powning and Davidson, 1973). 18 x 8,5 cm ebatlarndaki petri kaplar ierisine bakteri ile

nceden kartrlm ve kaynatlm 20 ml agaroz zeltisi 2 mm kalnlnda dkld.

Agaroz souyarak donduktan sonra zerinde belirli aplarda ukurluklar ald. Her bir

delie 5 l hemolenf ve ya doku rnekleri konuldu. Kontrol ukurluklarna saf lizozim

(E.C.3.2.1.17, Sigma)den farkl konsantrasyonlarda hazrlanan standart zeltiler konuldu.

Petriler 24 saat oda scaklnda bekletildi. Deney sonucunda hemolenf ve ya doku

rneklerindeki lizozim miktarna bal olarak farkl byklklerde zonlar olutu. rneklere

ait zon aplar llerek standartlara ait zon aplaryla karlatrlarak rneklerde mevcutlizozim ierii mg/ml olarak ifade edildi. Lizozim tayininde ya dokunun

homojenizasyonundan elde edilen supernatant kullanld ve enzim miktar mg lizozim/ ml

ya doku spernatant olarak verildi.

2.7 VERLERN DEERLENDRLMES

Denenen sodyum tetraboratn farkl konsantrasyonlarn ieren besinlerin bcek zerindeki

etkileri yaama (7. evreye ulaan larva oran, pup ve ergin olma oran), geliim (7. evreye,

pup ve ergin evreye ulamak iin geen, gn olarak, ortalama sre), mr uzunluu (ergin

bireylerin gn olarak yaama sresi) ile birlikte 7. evre larvalarnn ya doku ve

hemolenfindeki MDA miktarlar, GST, ALT, AST ve AChE aktiviteleri ve lizozim

miktarndaki deiiklikler dikkate alnarak deerlendirildi. Bcein geliimi, mr

uzunluu ile 7. evre larvalarnn MDA miktar, GST, ALT, AST ve AChE enzimlerinin

aktiviteleri ve lizozim miktar ile ilgili verilerin deerlendirilmesinde Tek Ynl Varyans

Analizi (ANOVA), ortalamalar arasndaki farkn nemini saptamak iin LSD Testi

(SPSS, 1997), yaama ile ilgili verilerin deerlendirilmesinde ise 2 (Chi square) Testi

(Snedecor and Cochran, 1989) kullanld. Hemolenf ve ya doku MDA miktar ile enzim

aktiviteleri arsndaki ilikinin belirlenmesinde Regresyon Analizi (SPSS, 1997)

kullanld. Sonular 0.05 olaslk seviyesinde deerlendirildi.


31/75

31

BLM 3

ARATIRMA BULGULARI

3.1 SODYUM TETRABORATIN G. MELLONELLANIN YAAMA, GELMNE

ETKS

Sodyum tetraboratn farkl konsantrasyonlarn ieren besinler ve bunlarn etkileri izelge

3.1de verilmitir.

Sodyum tetraboratn, besinin 100 gnda, 0,2 g ve bunun zerindeki miktar bceinyaama orann nemli derecede drm, gelimesini geciktirmitir. Sodyum tetraboratn

0,2 g yalnzca yaama orann nemli derecede drrken gelime sresi zerine nemli

bir etkisi olmamtr. Bu maddenin denenen en yksek konsantrasyonu (0,3 g) ise bcein

hem yaama orann hem de gelime sresini olumsuz ynde etkilemitir. Sodyum

tetraborat iermeyen kontrol besininde birinci evre larvalarnn % 62,5 15,5i 7. evreye,

% 40,0 15,8i pup evresine ve % 32,5 11,9u ise ergin evreye ulamtr. Bu maddenin

dk miktarlar (0,005 ve 0,1 g) 7. evreye ulaan larva orann ve pup olma orann

drmesine ramen istatistiksel olarak nemli bir etki ortaya kmamtr. Benzer ekilde,

bu konsantrasyonlar bcein tm evrelerine ulamak iin gerekli sreyi uzatmalarna

ramen yaplan istatistiksel analizler gelimedeki bu gecikmenin anlaml olmadn

gstermitir. Sodyum tetraboratn 0,1 g ise ergin olma orannda istatistiksel olarak nemli

olmayan bir arta sebep olmutur. Bu maddenin 0,2 gn ieren besin 7. evreye ulaan

larva orann yaklak drtte bir orannda nemli derecede drm olup kontrol

besinindeki % 62,5 15,5 olan yaama orann % 17,5 6,4e azaltmtr. Bu miktar ergin

olma orann te bir orannda drm olup bu besinden % 11,2 3,5 orannda ergin

elde edilmitir. Sodyum tetraboratn 0,3 g 7. evreye ulaan larva orann % 17,5 2,9a

istatistiksel olarak nemli derecede drm, 7. evreye ulama sresini ise ortalama 5 gn

geciktirmitir. Bu miktar ieren besinlerden % 12,5 orannda pup ve ergin elde edilmi ve

bu evrelere ulamak iin gerekli sre ise ortalama 5 gn uzamtr.


32/75

32

izelge 3.1 Sodyum tetraboratn G. mellonella larvalarnn yaamave gelimesine etkisi

* Drt tekrarn ortalamas, her bir tekrar iin 20 larva kullanld. Ayn stunda ayn harfi ieren deerler birbirinden farkl deildir, P > 0,05 Kontrol besini (Sodyum tetraborat iermeyen)

S. tetraborat

miktar

(g/100 g besin)

7.evreye ulaan

larva oran (%)

(Ort* S.H)

7.evreye ulama

sresi (gn)

(Ort* S.H)

Pup olma

oran (%)

(Ort* S.H)

Pup olma

sresi (gn)

(Ort* S.H)

Erg

or

(Ort

0,00 62,5 15,5a 22,0 2,90a 40,0 15,8a 27,3

0,005 47,5 17,0a 23,9 1,10a 35,0 14,7a

0,1 46,2 17,5a,b 22,8 1,00a 37,5 13,2a

0,2 17,5 6,4b 23,7 3,6a 11,2 7,50b

0,3 17,5 2,9b 27,0 2,3b 12,5 2,50b


33/75

33

3.2 SODYUM TETRABORATIN G. MELLONELLANIN MR UZUNLUUNA

ETKS

Sodyum tetraboratn farkl konsantrasyonlarn ieren besinler ve bunlarn etkileri ekil

3.2de verilmitir.

Sodyum tetraboratn en dk miktar (0,005 g) G. mellonella erginlerinin mr uzunluu

zerinde istatiksel olarak nemli bir etki yapmamtr (P > 0,05). Bu maddenin 0,1 g ile

yetitirilen erginlerde mr uzunluu artt halde istatistiksel olarak nemli bir fark ortaya

kmamtr. Kontrol besini ile yetitirilen erginlerin mr uzunluu ortalama 9,0 0,7 gn

iken sodyum tetraboratn 0,2 gn ieren besin ile yetitirilen erginler kontrole gre 4,2

gn daha uzun (13,2 1,9 gn) yaam olup, istatistiksel olarak nemli bir fark ortaya

kmtr (P < 0,05). Sodyum tetraboratn denenen en yksek konsantrasyonu (0,3 g),erginlerin mr uzunluunu kontrole gre nemli derecede ksaltmtr. Sodyum

tetraboratn dk konsantrasyonlar ile karlatrldnda denen en yksek madde miktar

erginlerin mr uzunluunu nemli derecede ksaltmtr. Bu erginler kontrole gre

ortalama 2,1 gn daha az hayatta kalmlardr. Denenen en yksek sodyum tetraborat

miktar ergin mr uzunluunu 0,2 ga gre ortalama 6,3 gn azaltmtr.

ekil 3.2 Sodyum tetraboratn G. mellonella erginlerinin mr uzunluuna etkisi. Aynharfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkl deildir (P >0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defa tekrar edilmitir.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 0,005 0,1 0,2 0,3

Sodyum tetraborat konsantrasyonlar

Erginmruzunluu(gn

)

a

a

b

ac


34/75

34

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

0,008

0,009

0,01

0 0,005 0,1 0,2 0,3


Malondialdehidmiktar

(nmol/mgprotein)

a a

a

b

b

3.3 SODYUM TETRABORATIN G. MELLONELLA LARVALARININ HEMOLENF

VE YA DOKU MALONDALDEHD (MDA) MKTARINA ETKS

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn hemolenf MDA

miktarna etkisi ekil 3.3.1de verilmitir.

Kontrol besini ile karlatrldnda sodyum tetraboratn dk konsantrasyonlarn ieren

besinler larvalarn hemolenf MDA miktarn nemli derecede etkilememitir. Bu maddenin

0,1 g kontrol larvalarndaki MDA miktarn 0,001 0,0008 nmol/mg proteinden 0,003

0,001 nmol/mg proteine artrd halde bu art istatiksel olarak nemli deildir (P > 0,05).

Bu maddenin 0,2 g MDA miktarn kontrole gre istatistiksel olarak (P < 0,05) 8 kat

artrm olup 0,008 nmol/mg proteine kadar ykseltmitir. Sodyum tetraboratn besine

ilave edilen en yksek miktar olan 0,3 g MDA miktarn 0,006 nmol/mg proteineistatistiksel olarak nemli derecede artrmtr. Bu art sodyum tetraboratn 0,2 g ile

karlatrldnda daha dk olup istatistiksel olarak nemli bir fark ortaya kmamtr.

ekil 3.3.1 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn hemolenf MDA miktarnaetkisi. Ayn harfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkldeildir (P > 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defatekrar edilmitir.


35/75

35

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn ya doku MDA

miktarna etkisi ekil 3.3.2de verilmitir.

Son evre larvalarnn ya doku MDA miktar besindeki artan sodyum tetraboratn

konsantrasyonu ile orantl olarak artt, yksek konsantrasyonlarda ise kesin bir artasebep olduu grlmtr. Sodyum tetraboratn dk konsantrasyonlarn ieren besinler

(0,005 ve 0,1 g) larvalarn ya doku MDA miktarn artrm ancak kontrol besini ile

karlatrldnda anlaml bir art ortaya kmamtr (P > 0,05). Bu maddenin 0,2 ve 0,3

g kontrol larvalarndaki MDA miktarn 0,008 0.004 nmol/mg proteinden srasyla

0,11 0,016 ve 0,17 0,015 nmol/mg proteine istatistiksel olarak nemli derecede

artrmtr (P < 0,05). Sodyum tetraboratn en yksek miktar olan 0,3 g ya doku MDA

miktarnda kontrole gre yaklak 20 kat arta neden olmutur. Sodyum tetraboratn 0,2

gnda ise ya doku MDA miktar yaklak 14 kat artmtr.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10,12

0,14

0,16

0,18

0,2

0 0,005 0,1 0,2 0,3


Malondialdehid

miktar

(nmol/mgpr

otein)

a a a

b

c

ekil 3.3.2 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn ya doku MDA miktarnaetkisi. Ayn harfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkldeildir (P > 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defatekrar edilmitir.


36/75

36

0

200

400

600

800

1000

1200

0 0,005 0,1 0,2 0,3


GSTaktivitesi

(nmol/mgprotein/dk) a

aa

bb


VE YA DOKU GLUTATYON S-TRANSFERAZ (GST) ENZM

AKTVTESNE ETKS

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn hemolenf GSTaktivitesineetkisi ekil 3.4.1de verilmitir.

Kontrol besini ile karlatrldnda, sodyum tetraboratn dk konsantrasyonlar (0,005

ve 0,1 g) hemolenf GST aktivitesinde azalmaya neden olduu halde istatistiksel olarak

nemli bir fark ortaya kmamtr (P > 0,05). Ancak yksek sodyum tetraborat

konsantrasyonlar (0,2 ve 0,3 g) GST aktivitesinde istatiksel olarak nemli bir azalmaya

sebep olmutur (P < 0,05). Besine ilave edilen 0,2 g sodyum tetraborat, GST aktivitesini

te bir orannda azaltarak kontrol besinindeki 808,24 232,45 olan GST aktivitesini268,53 85,79 nmol/mg protein/dkya drmtr. Besindeki en yksek sodyum

tetraborat miktar (0,3 g) ise GST aktivitesinde yaklak drtte bir orannda istatiksel olarak

nemli bir azalmaya sebep olarak 203,36 79,48 nmol/mg protein/dkya drmtr.

ekil 3.4.1 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn hemolenf GST aktivitesineetkisi. Ayn harfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkldeildir (P > 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defatekrar edilmitir.


37/75

37

0

200

400

600

800

1000

1200

0 0,005 0,1 0,2 0,3

Sodyum tetraborat konsantasyonlar

GSTaktivitesi

(nmol/mgprot

ein/dk)

a

b b

c

d

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn ya doku GST

aktivitesineetkisi ekil 3.4.2de verilmitir.

Kontrol besini ile karlatrldnda, sodyum tetraboratn denenen tm konsantrasyonlar

ya doku GST aktivitesini istatistiksel olarak nemli derecede artrmtr. Bu maddenindk konsantrasyonlar (0,005 ve 0,1 g) GST aktivisinde 2 kat arta sebep olmutur.

Kontrol larvalarnda 83,12 17,6 nmol/mg protein/dk olan GST aktivitesi sodyum

tetraboratn 0,1 gn ieren besindeki larvalarda 177,32 23,8 nmol/mg protein/dkya

ulamtr. Sodyum tetraboratn 0,2 ve 0,3 g ya dokudaki GST aktivitesini kontrol

besinine ve sodyum tetraboratn dk konsantrasyonlarna gre olduka ykseltmitir. Bu

maddenin 0,2 g kontrol larvalarnda 83,12 17,6 nmol/mg protein/dk olan GST

aktivitesini yaklak 9 kat artrarak 750 57,9 nmol/mg protein/dkya ykseltmitir.

Besindeki en yksek sodyum tetraborat konsantrasyonu (0,3 g) GST aktivitesini yaklak12 kat artrarak 1050 73,8 nmol/mg protein/dkya ulatrmtr.

ekil 3.4.2 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn ya doku GST aktivitesineetkisi. Ayn harfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkldeildir (P > 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defatekrar edilmitir.


38/75

38


VE YA DOKU LZOZM ENZMNN MKTARINA ETKS

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn hemolenf lizozim

enziminin miktarna etkisi ekil 3.5.1de verilmitir.

Kontrol besini ile karlatrldnda, sodyum tetraboratn denenen en dk

konsantrasyonu (0,005 g) hemolenf lizozim miktarnda istatistiksel bakmdan nemli

olmayan bir arta neden olmutur (P > 0,05). Besindeki sodyum tetraboratn yksek

konsantrasyonlar, bu enzimin miktarn nemli derecede drmtr (P < 0,05). Bu

maddenin 0,1 g lizozim miktarn yaklak % 50 orannda azaltarak 1,55 0,08

mg/mlden 0,74 0,07 mg/mlye drmtr. Sodyum tetraboratn yksek miktarlar (0,2

ve 0,3 g) lizozim miktarn kontrol besinine gre nemli derecede azaltm olup srasyla

1,07 0,09 ve 1,04 0,06 mg/mlye kadar drmtr.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 0,005 0,1 0,2 0,3


Lizozimmikta

r(mg/ml

aa

b

c c

ekil 3.5.1 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn hemolenf lizozim miktarnaetkisi. Ayn harfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkldeildir (P > 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defatekrar edilmitir.


39/75

39

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn ya doku lizozim

enziminin miktarna etkisi ekil 3.5.2de verilmitir.

Kontrol besini ile karlatrldnda, sodyum tetraboratn denenen en dk

konsantrasyonu (0,005 g) ya doku lizozim miktarnda istatistiksel bakmdan nemli birarta (yaklak 2 kat) neden olmutur (P < 0,05). Benzer ekilde, besindeki sodyum

tetraboratn 0,1 g bu enzimin miktarn yaklak kat artrmtr. Buna karlk sodyum

tetraboratn 0,2 g sodyum tetraboratn 0,1 g ile karlatrldnda lizozim miktarn

nemli derecede drmtr. Kontrol besini ile karlatrldnda sodyum tetraboratn

dk konsantrasyonlar (0,005, 0,1 ve 0,2 g) lizozim miktarnda arta sebep olurken

sodyum tetraboratn denenen en yksek konsantrasyonu lizozim miktarn nemli derecede

drmtr. Sodyum tetraboratn en yksek miktar kontrol larvalarnn ya dokudaki

lizozim miktarn (0,12 0,013 mg/ml) yirmide bir orannda azaltarak 0,006 0,003mg/mlye kadar drmtr.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0 0.005 0.1 0.2 0.3


Lizozimmiktar(mg/ml)

a

b

c

b

d

ekil 3.5.2 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn ya doku lizozim miktarnaetkisi. Ayn harfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkldeildir (P > 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defa

tekrar edilmitir.


40/75

40

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

0,045

0,05

0 0,005 0,1 0,2 0,3


ALTaktivitesi(U/mg

protein)

a

bb

c c


HEMOLENF VE YA DOKU ALANN AMNOTRANSFERAZ (ALT) ENZM

AKTVTESNE ETKS

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn hemolenf ALTaktivitesineetkisi ekil 3.6.1de verilmitir.

Kontrol besini ile karlatrldnda, sodyum tetraboratn denenen tm konsantrasyonlar

hemolenf ALT aktivitesinde istatistiksel olarak nemli azalmaya neden olmutur (P 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defatekrar edilmitir.


41/75


42/75

42


VE YA DOKU ASPARTAT AMNOTRANSFERAZ (AST) ENZM

AKTVTESNE ETKS

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn hemolenf ASTaktivitesineetkisi ekil 3.7.1de verilmitir.

Sodyum tetraboratn denenen dk konsantrasyonlarnda meydana gelen hemolenf AST

aktivitesindeki deiim uygulanan doz ile ilikili olarak ortaya kmamtr. Kontrol besini

ile karlatrldnda bu maddenin 0,005 g AST aktivitesini % 50 orannda nemli

derecede (P < 0,05) drrken 0,1 g sodyum tetraborat miktar enzim aktivitesini tekrar

kontrol dzeyine getirmitir. Kontrol besini ile beslenen larvalarn 0,12 0,02 U/mg

protein olan AST aktivitesi 0,2 ve 0,3 g sodyum tetraborat konsantrasyonlar tarafndante bir orannda azaltlmtr.

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0 0,005 0,1 0,2 0,3


ASTaktivitesi(U/m

gprotein) a

b

a

bb,c

ekil 3.7.1 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn hemolenf AST aktivitesineetkisi. Ayn harfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkldeildir (P > 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defatekrar edilmitir.


43/75

43

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn ya doku AST


Sodyum tetraboratn denenen en dk konsantrasyonu (0,005) kontrole gre ya doku

AST aktivitesinde arta sebep olduu halde aralarnda istatistiksel olarak nemli bir farkortaya kmamtr (P > 0,05). Sodyum tetraboratn 0,1 g enzim aktivitesini kontrole gre

yaklak 4 kat artrarak 0,052 0,009 U/mg protein deerine ulatrmtr. Bu maddenin

besine ilave edilen yksek konsantrasyonlar da (0,2 ve 0,3 g) kontrole gre AST

aktivitesini nemli derecede artrmtr. Ancak, bu yksek konsantrasyonlar sodyum

tetraboratn 0,1 g ile karlatrldnda AST aktivitesini nemli derecede drmtr.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0 0,005 0,1 0,2 0,3


ASTaktivitesi(U/mgprotein)

a

a,c

b

c

c

ekil 3.7.2 Sodyum tetraboratnG. mellonella larvalarnn ya doku AST aktivitesineetkisi. Ayn harfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkldeildir (P > 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defa

tekrar edilmitir.


44/75

44


VE YA DOKU ASETLKOLNESTERAZ (AChE) ENZM AKTVTESNE

ETKS

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn hemolenf AChEaktivitesineetkisi ekil 3.8.1de verilmitir.

Sodyum tetraboratn besindeki artan konsantrasyonlar ile hemolenf AChE aktivitesinin

ilikili olarak azald gzlenmitir. Kontrol besini ile karlatrldnda (0,194 0,02

U/mg protein) sodyum tetraboratn en dk miktarn ieren besin AChE aktivitesini % 50

orannda nemli derecede drmtr (P < 0,05). Bu enzimin aktiflii sodyum

tetraboratn 0,1 gnda yaklak sekizde bir orannda azalarak 0,025 0,006 U/mg protein

deerine kadar dmtr. Sodyum tetraboratn yksek miktarlarndan 0,2 g, bu enziminaktivitesini onaltda bir orannda, 0,3 g ise otuzikide bir orannda azaltmtr. Yksek

sodyum tetraborat konsantrasyonlarnn (0,1, 0,2 ve 0,3 g) AChE aktivitesi zerine olan

etkileri bakmndan aralarnda nemli bir fark ortaya kmamtr (P > 0,05).

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 0,005 0,1 0,2 0,3


AChEaktivitesi(U/mgprotein)

a

b

cc

c

ekil 3.8.1 Sodyum tetraboratn G. mellonella larvalarnn hemolenf AChE aktivitesineetkisi. Ayn harfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkldeildir (P > 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defa

tekrar edilmitir.


45/75

45

Sodyum tetraboratn G. mellonella 7. evre (bir gnlk) larvalarnn ya doku AChE


Sodyum tetraboratn besine ilave edilen en dk konsantrasyonu (0,005) ya doku AChE

aktivitesini artrd halde istatistiksel olarak anlaml bir art ortaya kmamtr (P >0,05). Sodyum tetraboratn besindeki yksek konsantrasyonlar ise AChE aktivitesini

nemli derecede artrmtr (P < 0,05). Sodyum tetraboratn 0,1 g AChE aktivitesinde 5

kat artmaya sebep olarak 0,0006 0,003 U/mg protein deerinden 0,003 0,0004 U/mg

protein deerine ulatrmtr. Benzer ekilde sodyum tetraboratn dier yksek miktarlar

da kontrol besinine (0,0006 0,003 U/mg protein) gre AChE aktivitesini nemli derecede

artrarak 0,0027 U/mg protein deerine ulatrmtr.

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0,0025

0,003

0,0035

0,004

0 0,005 0,1 0,2 0,3


AChEaktiv

itesi(U/mgprotein)

a

a

b bb

ekil 3.8.2 Sodyum tetraboratn G. mellonella larvalarnn ya doku AChE aktivitesineetkisi. Ayn harfi ieren ubuklarn gsterdii ortalamalar birbirinden farkldeildir (P > 0,05). Deneyler her tekrarda yirmi larva kullanlarak drt defa

tekrar edilmitir.


46/75

46

Yedinci evre larvalarnn ya doku MDA miktar ile GST aktivitesi arasnda istatistiksel

olarak nemli ve gl bir pozitif iliki bulunmutur (R2 = 0,99 P < 0,05). Larvalarn ya

dokusunda artan sodyum tetraborat konsantrasyonuna kar MDA miktar artarken GST

aktivitesi de beraberinde artmtr. Larvalarn hemolenf MDA miktar ile GST aktivitesi

arasnda yksek oranda ters bir ilki olmasna ramen bu iliki istatistiksel olarak anlamldeildir. Dier bir anlaml ve negatif iliki ise larvalarn hemolenf MDA miktar ile ALT

aktivitesi arasnda ortaya kmtr (R2 = 0,89 P < 0,05). Larvalarn hemolenf MDA miktar

artarken ters orantl olarak ALT aktivitesi de d gstermitir.


47/75

47

BLM 4

TARTIMA

Lepidoptera takmna ait bir tr olan byk bal mumu gvesi G. mellonella larvalarn

laboratuvarda ergin evreye kadar yetitirmek iin kullanlan yapay besine farkl

miktarlarda katlan bir bor trevi sodyum tetraboratn bcein farkl evrelerindeki yaama,

geliimine, ergin mr uzunluuna ve yedinci evre larvalarnn hemolenf ve ya

dokusunda lipid peroksidayonunun nemli bir rn malondialdehid olan (MDA),

antibakteriyel enzim lizozim miktar, glutatyon S-transferaz (GST), alanin aminotransferaz

(ALT), aspartat aminotransferaz (AST) ve asetilkolinesteraz (AChE) enzimlerininaktivitesine etkisi incelendi. Bu almann sonular sodyum tetraboratn G. mellonella

larvalarnn yaam parametreleri ile ilgili biyolojik etkinliini olumsuz ynde etkilediini

gstermektedir. Sodyum tetraboratn, oksidatif stresin gstergesi olan MDA miktarnn

artna kar, nemli bir detoksifikasyon enzimi olan GST ve doku hasarnn nemli

biyobelirteleri ALT ve AST ile sinirsel iletimden sorumlu AChE enzimlerinin

aktivitesinde deiimlere sebep olduu akca grlmtr. Bu sonular Galleria

mellonella L. larvalarnn yaamas, gelimesi ve mr uzunluu zerindeki olumsuz

etkilerin sodyum tetraborat ile uyarlan oksidatif stresten kaynaklandn gstermektedir.

Sodyum tetraboratn yksek konsantrasyonlar hem larval evrede hem de larva sonras

evrelerde bcein yaama ve gelimesi zerinde olumsuz etki yapmtr. Bu maddenin

denenen en yksek konsantrasyonu (0,3 g) bcein hem yaama orann hem de gelime

sresini olumsuz ynde etkilemitir. Bu maddenin 0,2 gn ieren besin 7. evreye ulama

sresini yaklak drtte bir orannda nemli derecede drm olup kontrol besinindeki

% 62,5 15,5 olan yaama orann % 17,5 6,4e drmtr. Bu miktar ergin olma

orann te bir orannda drm ve bu besinden % 11,2 3,5 orannda ergin elde

edilmitir. Sodyum tetraboratn 0,3 g 7. evreye ulaan larva orann % 17,5 2,9a

istatistiksel olarak nemli derecede drm, 7. evreye ulama sresini ise ortalama 5

gn geciktirmitir. Bu miktar ieren besinlerden % 12,5 orannda pup ve ergin elde

edilmi ve bu evrelere ulamak iin gerekli sre ise ortalama 5 gn uzamtr.Ayn trn

farkl geliim evrelerinde bile deiik fizyolojik koullara gereksinim duyulduu


48/75

48

bilinmektedir (Grenier et al., 1986). Bu yzden denenen sodyum tetraboratn etkisinin bu

bcein farkl geliim evresine gre deimesi de beklenen bir sonutur.

Zararl bceklerin mcadelesi amacyla eitli besinlere ilave edilen borik asit ve sodyum

tetraborat gibi bor trevi eitli kimyasallarn yksek konsantrasyonlarda gelimeyigeciktirdii, mr uzunluunu artrd, yumurta retimini ve almn azaltt, larval ve

pupal evrede lm orann artrd gzlenmitir (Zurek et al., 2003; Xue and Barnard,

2003; Gore and Schal, 2004). Sodyum tetraboratn bcek zerindeki olumsuz etkilerinin

mekanizmas tam olarak bilinmemekle beraber borik asit gibi baz bor trevi kimyasallarn

molekler oksijene elektron transfer ederek speroksit radikallerinin oluumuna neden

olduu belirtilmitir (Jolly, 1991). Dier taraftan borik asitin Alman hamam bcei

Blatella germenica L. erginlerinin orta barsak epitel dokusunda oksidatif hasara sebep

olduu ve GST aktivitesini artrd ortaya karlmtr (Habes et al., 2006). Bu almadaborik asitin bcein besin almasn uyarmas sonucu fazla miktarda kimyasal tketmesine

bal olarak beslenme fizyolojisi ile ilgili yapsal ve ilevsel deiikliklere sebep olmu

olabilecei dnlmektedir. Tropik meyve sinei A. suspensa erginlerinin % 4lk

sodyum tetraborat ieren besin ile beslenilmesi erginlerin lm orann artrd gibi

yumurta verimini ve almn nemli derecede drmtr (Yang et al., 2000). Bu

sonular ile uyumlu olarak sodyum tetraborat G. mellonella larvalarnn pup ve ergin olma

orann nemli derecede drm gelimeyi ise geciktirmitir. Besinle alnan sodyum

tetraboratn G. mellonella larvalar zerindeki toksitesinin yksek olmas larvalarn besin

alma orannn ve bylece sindirimin artmas sonucu olabilir. Benzer bir mekanizma, eitli

besin ortamlar ile uygulanan borik asit ve trevlerinin farkl bcekler zerindeki olumsuz

etkisi ile ilgili olarak da ileri srlmtr (Appel et al., 2004; Cochran, 1995). Daha nce

bu konuda yaplan beslenme almalar yapay besinlere ilave edilen ve besinsel deeri

bulunmayan bir kimyasaln bcek zerindeki etkisinin besin maddeleri ile etkileimine

bal olarak ortaya kabileceini belirtmitir. Bu almalarda, fiziksel ve kimyasal

dzeyde ortaya kan bu etkileimlerin larvalarn besin tketim orann deitirebilecei

ileri srlmtr (Bykgzel, 2001).

Baz almalarda eitli evresel stres faktrlerine maruz kalan birka bcek trnn mr

uzunluundaki artn lipid peroksidasyonu dzeyinin dmesi (Sestini et al., 1991) ve

antioksidan enzimlerden speroksit dismutaz (SOD) ve katalaz (CAT) aktivitelerinin


49/75

49

ykselmesi (Bains et al., 1998; Sun et al., 2002) ile ilikili olduu ileri srlmtr.

Sodyum tetraboratn en yksek konsantrasyonunda G. mellonella larvalarnn hemolenf

MDA miktarnda art gzlenirken, ergin mr uzunluu ise nemli derecede azalmtr.

Antioksidan enzimler yksek oksidatif stres durumunda oluan reaktif molekllere kar

hassas olduklarndan (Pigeolet et al., 1990), sodyum tetraboratn yksek konsantrasyonutarafndan retilen serbest radikaller GST enziminde yapsal deiime sebep olarak enzimi

inaktifletirmi olabilir. Elde edilen sonular sodyum tetraboratn 0,2 gnda ya doku GST

aktivitesi ile ergin mr uzunluu arasnda pozitif bir iliki olduunu gstermitir. Bu

konsantrasyonda GST aktivitesi ve ergin mr uzunluunda art gzlenmitir.D.

melanogasterde glutatyona baml enzimlerin aktivitelerindeki artn mr uzunluunda

arta neden olduu ve oksidatif strese direncin artt gzlenmitir (Sohal et al., 1995, Sun

et al., 2002). Bu almada sodyum tetraborat ile yetitirilen erginlerin antioksidan

enzimlerindeki deiimler incelenmemitir. Ancak, Bykgzel et al., (2006)organofosforlu insektisitlerin ldrc olmayan dozlarna ka bir tepki olarak P.

turionellae erginlerinde SOD aktivitesinin ve mr uzunluunun arttn gstermitir.

Elde edilen sonular uzun yaama sresinin sodyum tetraboratn ldrc olmayan

dozlarnda ortaya kan oksidatif s

sodyum terraboratın büyük balmumu güvesi (galleria mellonella l. (lepidoptera:pyralidae)'ın...

Documents