soutenance de thèse de biologie
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Soutenance de thèse de Biologie. Cécile Lestrat. Université Joseph Fourier Grenoble. Directeur de Thèse: Cécile Caron Institut Albert Bonniot Ontogenèse et Oncogenèse Moléculaire. Financé par La Région Rhône-Alpes Et l’ARC. Identification et caractérisation de la protéine Atad2. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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Soutenance de thèse de Biologie
Cécile Lestrat
Directeur de Thèse: Cécile CaronInstitut Albert BonniotOntogenèse et Oncogenèse Moléculaire
Université Joseph FourierGrenoble
Financé par La Région Rhône-AlpesEt l’ARC
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Identification et caractérisation de la protéine Atad2
Un facteur impliqué dans le remodelage de la chromatine acétylée au cours de la
spermiogenèse
16 Octobre 2008
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SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche
Résultats Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse: résultats de
l’équipe
Conclusion et Perspectives
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SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche
Résultats
Conclusion et Perspectives
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ADN double brin (2 nm)
’’collier’’ de nucléosome (11 nm)
Fibre de chromatine (30 nm)
Section chromosomique sous sa forme étendue (300 nm)
Section condensée de la chromatine (700 nm)
Chromosome mitotique entier (1400 nm)
Les différents degrés de l’organisation de la chromatinienne
Felsenfeld & Groudine, 2003
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La structure chromatinienne
H2B
H2A H
2B
H2AH3
H3H4
H4
Nucléosome
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Epigénétique et code histone
H2B N- PEPVKSAPVPKKGSKKAINK…..VKYTSSK….
N- SGRGKQGGKARA…..AVLLPKKTESHHK….H2A
N- ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP…..H3
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDNIQGIT….H4
Ub
Me
P
Ac
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Structure fermée(Transcription réprimée)
HDAC(Histones
déacétylases)
HAT(Histones
acétytransférases)CH3-CO-SCoA
CoA
Structure ouverte(Transcription activée)
Exemple de l’acétylation
Machinerie de remodelage
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SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche
Résultats
Conclusion et Perspectives
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Les bromodomaines: Conservation et structures N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo
:Ac
Zeng & Zhou, 2002
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Les bromodomaines: reconnaissance des histones acétylées
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo
:Ac
Reconnaissance des lysines acétylées
Spécificité de la reconnaissance: chaque bromodomaine ne reconnait pas toutes les lysines acétylées
Affinité expliquée par l’environnement du site de liaison (au niveau des acides aminées non conservés, de la conformation de la protéine)
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SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche
Résultats
Conclusion et Perspectives
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Les protéines à bromodomaines
De la Serna, Ohkawa & Imbalzano, 2006.
Famille SWI/SNF
Facteurs de remodelage dépendantes à l’ATP
Les Histones AcetylTransferases (HAT)
HAT, reconnaissance des histones acétylées et extension du signal au nucléosome suivant
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SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-
ATPases Problématique de recherche
Résultats
Conclusion et Perspectives
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Les AAA-ATPasesVCP AAAATPases Associated with a wide variety of cellular Activities
Anneaux hexa/heptamériquesImplication dans le désassemblage de complexes multiprotéiques
Walker AWalker BSRH
Boucle Pore
Hanson and Whiteheart, 2005; Lenzen et al.,1998
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Homologue d’Atad2
Sous-unités Rpt du protéasome
Homologues de VCP
Conservation des AAA-ATPases
VCP AAA
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Les AAA-ATPasesVCP AAA
VCP
sous-unités du protéasome (dégradation des protéines)Hexamères chargés du dépliement des protéines à dégrader
Particule 20S
Particule 19S
Particule 19S
protéasomeRpt
Hexamérisation en anneaux, dépliement des protéines neo-synthétisées mal repliées..
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AAA: Le protéasome
Dégradation des protéines
Rechsteiner & Hill, 2005
19 S : reconnaissance du substrat, dépliement et insertion dans la chambre catalytique
19 S
20 S: chambre catalytique, site de coupure des séquences peptidiques
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Les AAA et l’activité génomique
Helicases mcm2-mcm7 (minichromosome maintenance 2-7)Initiation et élongation de la réplication de l ’ADN
RptCoactivatrice traductionnelles (GAL)Dégradation des facteurs de transcription et modifications post-traductionnelles des histonesEtapes de la transcription
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SommaireIntroduction
La chromatine Le Bromodomaine Les protéines à bromodomaines Autres machineries: Les AAA-ATPases Problématique de recherche
Résultats
Conclusion et Perspectives
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Remodelage chromatinien et spermatogenèse
Arrêt de la transcription
Compaction
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Méiose
H2B
H2A H
2B
H2AH3
H3H4
H4
Nucléosome
protamines
Enlèvement des histones
? ?
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Axes de recherche de l’équipe
Organisation finale du génome spermatique
Mécanismes moléculaires du remodelage
Recherche fondamentale
Exploitation des connaissances en physiopathologie humaine (procréation)Exploitation des connaissances en oncologie
- Département de Génétique et procréation/CECOS -
Transfert au niveau médical
Mécanismes moléculaires du remodelage
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Identification?
Criblage bio-informatique d’ une banque d’ADNc :
Spermiogenèse•Banque testiculaire
•Candidat liant la chromatine
•Candidat ayant une possible activité enzymatique
BRDTCDYL Atad2
Caron, Pivot-Pajot, van Grunsven, Col, Lestrat, Rousseaux, Khochbin; EMBO Rep 2003
Pivot-Pajot, Caron, Govin, Vion, Rousseaux, Khochbin; MCB 2003
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SommaireIntroduction
Résultats Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:
résultats de l’équipe
Conclusion et Perspectives
![Page 26: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/26.jpg)
SommaireIntroduction
Résultats Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:
résultats de l’équipe
Conclusion et Perspectives
![Page 27: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/27.jpg)
Atad2 AAATPase Bromodomaine
Reconnaissance des histones acétylées ?
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo:Ac
Remodelage?
1 114 255 631 743 1040
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Atad2 & conservation
mAtad2-l
A.thaliana2
C. elegans
humainAtad2
ratAtad2
S. Cerevisiae
A.thaliana1
mAtad2-s
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SommaireIntroduction
Résultats Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:
résultats de l’équipe
Conclusion et Perspectives
![Page 30: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/30.jpg)
Hypothèse de travailSpermiogenèse
protamines
Dégradation des histones?
Enlèvement des histones?
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SommaireRésultats
Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse
Profil d’expressionBromodomaineDomaine AAA-ATPase
Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe
![Page 32: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/32.jpg)
Existence d’Atad2,profil d’expression
court
longRT-PCR
Gla
nde
saliv
aire
Atad2
GAPDH
Sans
ARN
7 11 15 17 Cerv
eau
Oei
lCo
eur
Rein
Foie
Poum
on
Rate
Testi
cule
Ute
rus
Embryon
Les deux formes d’Atad2 existent chez la sourisLa forme courte est strictement testiculaire
![Page 33: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/33.jpg)
Existence d’Atad2,profil d’expression
court
long
Western-blotM
uscl
e
180
130
100
73
Poum
on
Coeu
r
Testi
cule
Cerv
eau
Rein
Rate
Foie
PM (K
da)
Spermiogenèse
180
130
PM (K
da)
Les deux formes d’Atad2 sont présentes au cours des phases tardives de la spermiogenèse
![Page 34: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/34.jpg)
SommaireRésultats
Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse
Profil d’expressionBromodomaineDomaine AAA-ATPase
Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe
![Page 35: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/35.jpg)
Les bromodomainesCBP bromodomain
Motifs de reconnaissance des histones acétylées
AAATPase BromodomaineAtad2
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo:Ac
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Localisation subcellulaire
Atat2 dans la fraction chromatinienneAffinité différente des deux formes pour la chromatine
Cyto
plas
me
Nuc
léop
lasm
e
Chro
mati
ne
long
court
Histones de coeur
180
130
PM (K
da)
200
Sol Son C Sol Son C Sol Son C Sol Son C
350 500 750
long
court
Histones de coeur
[KCl] (mM)
Extraction saline
180
130
PM (K
da)
![Page 37: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/37.jpg)
Liaison à la chromatine
H2A
H2B
H3
H4
?
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAC
ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAC
PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQC
PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQC
SGLGKQGGKARAC
SGLGKQGGKARAC
Quelle affinité avec les histones?
Tests de pull down sur la protéine endogène utilisant des peptides mimant les queues N-Terminales des histones
![Page 38: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/38.jpg)
- + - + - + - + - +No
tat
input Acetylation
Peptides pull down d'extraits nucléoplasmiques testiculaires
peptidesH2A H2B H3 H4
Résultats
court
contrôlesK5 K8 K12 K16+ -inputH4
court
Acetylation spécifique
Le bromodomaine d’Atad2 lie l’histone H4 acétylée, majoritairement sur la lysine K5
Liaison à la chromatine
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV
![Page 39: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/39.jpg)
-
IP HA Atad2
162535
Histones de coeur
PM+ - HA mAtad2
TSA+ + +
HA mAtad2
10
HA mAtad2- - +-
IP HA Atad2
162535
Histones de coeur
PM+ + HA mAtad2
TSA- - +
HA Atad2
10
Implication du bromodomaineTests d’immunoprécipitation de différentes constructions d’Atad2 court
Affinité d’Atad2 avec la chromatine quand celle-ci est acétyléeLe bromodomaine est responsable de cette interaction
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SommaireRésultats
Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse
Profil d’expressionBromodomaineDomaine AAA-ATPase
Atad2 hors spermiogenèse: résultats de l’équipe
![Page 41: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/41.jpg)
Hypothèses
Atad2 Hexamère
• Complexe de remodelage• Extraction des nucléosomes acétylés
Atad2 sous unité du protéasome
• S’insère dans l’anneau Rpt• Recrute le protéasome sur la chromatine acétylée• Dégradation des nucléosomes acétylés
Domaine AAA
![Page 42: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/42.jpg)
AAATPase Bromodomaine
ATPases Associated with a wide variety of cellular Activities
Anneaux hexamériquesChaperonnes: désassemblage de complexes multiprotéiques
sous-unités du protéasome (dégradation des protéines)Hexamères chargés du dépliement des protéines à dégrader
RptComplexe 20S
Complexe 19S
Complexe 19S
protéasomeRpt
Interaction avec les Rpt
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Interaction avec les Rpt
3ème stratégie-Approche in vivo indirecte: colocalisation des protéines lors de séparation par ultra-centrifugation dans gradient de glycérol
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des Rpt TIV
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Rpt ou Rpt endogènes
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Pull down des Rpt traduites in vitro sur des bille GST / GST-Atad2, domaine ATPase
Input Rpt1 2 3 4 5 6- + - + - + - + - + - +
1 2 3 4 5 6
Pull down
Tests in Vitro
Interactions in vitro
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Interaction avec les Rpt
3ème stratégie-Approche in vivo indirecte: colocalisation des protéines lors de séparation par ultra-centrifugation dans gradient de glycérol
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des Rpt TIV
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Rpt ou Rpt endogènes
![Page 46: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/46.jpg)
Rpt1
Input Rpt1
Rpt1IP
Rpt3
Input Rpt3
Rpt3IP
Atad2 c
Rpt1
-Input 5% +
Rpt6
Rpt
Co-immunoprécipitation
Rpt
Avec des Rpt surexprimées de façon transitoire Avec des Rpt endogènes
Interaction entre les Rpt et Atad2 via son domaine AAA
![Page 47: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/47.jpg)
Interaction avec les Rpt
3ème stratégie-Approche in vivo indirecte: colocalisation des protéines lors de séparation par ultra-centrifugation dans gradient de glycérol
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des Rpt TIV
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Rpt ou Rpt endogènes
![Page 48: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/48.jpg)
Méthodes de séparation
testicule
1 - Noyaux
2 - Extrait soluble
3 - Centrifugation sur gradient de densité Glycerol
20%
40%
SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV
4 - AcH4 peptide pulldown
Ultracentrifugation
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Atad2Fraction
Atad2Pull down
Rpt1
Rpt1
?
UltracentrifugationRésultats
Colocalisation de la population d’Atad2 en complexe et des Rpt
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Hypothèses
Atad2 Hexamère
• Complexe de remodelage• Extraction des nucléosomes acétylés
Atad2 sous-unité du protéasome
• S’insère dans l’anneau Rpt• Recrute le protéasome sur la chromatine acétylée• Dégradation des nucléosomes acétylés
Domaine AAA
![Page 51: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/51.jpg)
Multimérisation
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des constructions Atad2
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Atad2
3ème Stratégie- Degrés de multimérisation
![Page 52: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/52.jpg)
Multimérisation
Test in vitro: Pull down d’Atad2 traduit in vitro sur des bille GST / GST-Atad2 AAA
Input Atad2Pull down
WT AAA - + - +WT AAA
Dimérisation possible grâce au domaine AAA
![Page 53: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/53.jpg)
Multimérisation
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des constructions ATad2
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Atad2
3ème Stratégie- Degrés de multimérisation
![Page 54: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/54.jpg)
Implication du domaine AAA
Double transfection: domaine ATPase responsable de la multimérisation?
Flag Ata2:
Ha-Atad2 wt: - + - +1-822 1-822292-822 292-822
- + - +
WB anti-flag
WB anti-Ha
Input IP anti-Ha
Dimérisation possible grâce au domaine AAAHypothèse de la multimérisation plus probable que l’interaction avec les Rpt
![Page 55: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/55.jpg)
Multimérisation
1ère stratégie- Interaction in vitro: GST-Pull down avec une construction GST-AAA d’Atad2 et des constructions ATad2
2ème stratégie-Implication du domaine AAA: Co-immunoprécipitation de constructions HA-Atad2 et Flag-Atad2
3ème Stratégie- Degrés de multimérisation
![Page 56: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/56.jpg)
Proteine recombinante sur gel électrophorèse natif
669440
232
140
KDa
Fla
g-V
CP
Ata
d2
?
Multimérisation
Proteine recombinante en HPLC
Multimérisation possible en hexamère
![Page 57: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/57.jpg)
Effet du domaine AAA sur les propriétés du bromodomaine
AAATPase Bromodomaine
?
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo:Ac
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo:Ac
![Page 58: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/58.jpg)
Effet du domaine AAA sur les propriétés du bromodomaine
1ère stratégie- liaison à la chromatine avec un domaine AAA muté?
2ème stratégie-Approche indirecte: Quelle population d’Atad2 a une affinité avec la chromatine acétylée?
![Page 59: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/59.jpg)
Régulation de l’affinité à la chromatine
Pull down H4 acétylée avec des constructions d’Atad2 dont certains domaines sont mutés
- -FL mtBd mtAAA FL mtBd mtATP
HA - Atad2
input pull-down H4 tetra-Ac
L’altération du domaine AAA affaiblit la capacité d’Atad2 à lier H4 acétylée
![Page 60: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/60.jpg)
Effet du domaine AAA sur les propriétés du bromodomaine
1ère stratégie- liaison à la chromatine avec un domaine AAA muté?
2ème stratégie-Approche indirecte: Quelle population d’Atad2 a une affinité avec la chromatine acétylée?
![Page 61: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/61.jpg)
Fractions
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
AcH4 pull down
? ??
20 % 40 %
UltracentrifugationRésultats
La population en complexe/hexamérique peut interagir avec la chromatine acétylée
![Page 62: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/62.jpg)
Rôle au cours de la spermiogenèse
Spermiogenèse
protamines
Enlèvement des histones
protamines
19S Dégradation des histones
Enlèvement des histones ?
AcK5
Multimérisation-affinité
![Page 63: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/63.jpg)
SommaireRésultats
Méthodes d’identification Présentation d’Atad2 Atad2 et la spermiogenèse Atad2 hors spermiogenèse:
résultats de l’équipe
![Page 64: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/64.jpg)
SommaireRésultats
Atad2 hors spermiogenèse:
Cellules somatiques
Expression d’Atad2
Influence sur l’activité transcriptionnelleInfluence sur la dynamique de H2A
Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales et
cancersInfluence sur l’apoptose
![Page 65: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/65.jpg)
Atad2 & conservation
mAtad2-l
A.thaliana2
C. elegans
humainAtad2
ratAtad2
S. Cerevisiae
A.thaliana1
mAtad2-s
![Page 66: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/66.jpg)
Profil d’expression
court
longRT-PCR
Gla
nde
saliv
aire
Atad2
GAPDH
Sans
ARN
7 11 15 17 Cerv
eau
Oei
lCo
eur
Rein
Foie
Poum
on
Rate
Testi
cule
Ute
rus
Embryon
La forme longue est retrouvée dans plusieurs tissus
![Page 67: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/67.jpg)
Présence de la forme longue dans des lignées de cellules en culture
Testiculemurin COS Daudi Jurkat Molt HL60 A549 H12
180
130
PM (K
da)
long
Profil d’expression
![Page 68: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/68.jpg)
SommaireRésultats
Atad2 hors spermiogenèse:
Cellules somatiques
Expression d’Atad2
Influence sur l’activité transcriptionnelle
Influence sur la dynamique de H2A
Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales et
cancersInfluence sur l’apoptose
![Page 69: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/69.jpg)
AAATPase Bromodomaine
Motifs de reconnaissance des histones acétylées
N- SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKV...
H4
Bromo:Ac
Dépliement/Extraction des histones?
Influence d’Atad2 sur l’activité transcriptionnelle?
![Page 70: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/70.jpg)
Influence d’Atad2 sur l’activité transcriptionnelle?
Atad2 a une activité de répression de la transcription
par RT-qPCR
Expériences de mesure de l’activité transcriptionnelle par puce
Le Knock Down d’Atad2 active globalement l’activité transcriptionnelle
244 gènes affectés2/3 montre une transcription plus élevée
![Page 71: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/71.jpg)
SommaireRésultats
Atad2 hors spermiogenèse:
Cellules somatiques
Expression d’Atad2
Influence sur l’activité transcriptionnelleInfluence sur la dynamique de H2A
Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales et
cancersInfluence sur l’apoptose
![Page 72: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/72.jpg)
Influence sur la dynamique de H2A sur la chromatine
Le Knock Down d’Atad2 déstabilise globalement la structure chromatinienne
Atad2 figerait/organiserait certains domaines de la chromatine en structures stables
Expériences de FRAP: visualisation de H2A
![Page 73: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/73.jpg)
Atad2 dans les cellules somatiques
Relâchement de la structure chromatinienne, transcription, dynamique
Domaines maintenus en structure figées
![Page 74: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/74.jpg)
SommaireRésultats
Atad2 hors spermiogenèse:
Cellules somatiques
Expression d’Atad2
Influence sur l’activité transcriptionnelleInfluence sur la dynamique de H2A
Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales
et cancersInfluence sur l’apoptose
![Page 75: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/75.jpg)
RT-qPCR (Edwige Col)
S. RousseauM. CallananS. Gazzeri
Projet EpiMed
Atad2 dans les tumeurs du poumon
Criblage de tumeurs du poumon
Atad2 est exprimé de façon anormale dans les cancers du poumon
![Page 76: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/76.jpg)
SommaireRésultats
Atad2 hors spermiogenèse:
Cellules somatiques
Expression d’Atad2
Influence sur la rapidité du turn-over de H2A
Influence sur l’activité transcriptionnelle
Cellules cancéreusesPrésence dans des cellules tumorales et
cancersInfluence sur l’apoptose
![Page 77: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/77.jpg)
Influence d’Atad2 sur l’apoptose
Expériences de FACS: mesures d’un marqueur apoptotique (caspase3)
mesures du marqueur d’apoptose caspase 3 en présence d’actynomycine D sur des cellules traitées ou non avec des ARN si d’Atad2
Atad2 agit comme un anti-apoptotique
Atad2 éliminé précocement lors de l’apoptose des cellules
Le Knock Down d’Atad2 augmente l’apoptose
![Page 78: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/78.jpg)
Atad2 dans les cellules somatiques
Dynamique de la chromatine, apoptose
Domaines maintenus en structure figées,Empêche la désorganisation de domainesEffet anti-apoptotique
![Page 79: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/79.jpg)
SommaireIntroduction
Résultats
Conclusion et Perspectives
![Page 80: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/80.jpg)
Rôles d’Atad2: Conclusion
Atad2-court
Atad2-long
Spermiogenèse
Cellules somatiques / Cancéreuses
Atad2 corrélé à une forte dynamique de la chromatineImplication dans l’enlèvement des histones?
Atad2 corrélé à une baisse de la dynamique chromatinienneEffet: baisse de la transcription
baisse de l’apoptose
![Page 81: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/81.jpg)
Les deux formes d’Atad2
Atad2-court
Atad2-longRôle de régulation de l’activité?Site d’interaction de partenaires particuliersSite de reconnaissance d’un substrat?
![Page 82: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/82.jpg)
Pourquoi continuer à étudier Atad2
Les facteurs épigénétiques tels qu’Atad2 semblent avoir un impact fort sur la spermatogenèse
L’étude d’Atad2 en tant que pseudo-C/TA pourrait déboucher sur de nouveaux marqueurs de diagnostic de cancers
Une meilleure compréhension d’Atad2 et des facteurs épigénétiques pourraient être un jour exploitée dans le développement de nouvelles molécules thérapeutiques
![Page 83: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/83.jpg)
Remerciements
Les membres du jury
Cécile CaronSaadi Khochbin
L’équipe
La Région Rhône-Alpes et l’ARC
Mon entourage
![Page 84: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/84.jpg)
![Page 85: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/85.jpg)
Exemple de développement thérapeutiques
Les inhibiteurs d’HDAC
15 molécules en développement
Les inhibiteurs d’Aurora K
1 molécule en développement(réduction de
phosphorylation D’H3)
Les Histones H1 recombinants
3 molécules en développement
Cancers, psoriasis….
![Page 86: Soutenance de thèse de Biologie](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022061614/56813949550346895da0e6af/html5/thumbnails/86.jpg)
Multimérisation ATP-dépendante
Co-immunoprécipitation de constructions d’Atad2. Certaines ont un domaine AAA altéré
La formation du multimère est dépendante de l’ATP.