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Primavera 2001 7.28 Examen 1

Nombre___________________________

Pregunta 1 ______/ 24 puntos



Pregunta 4 ______/ 20 puntos ________________________________

Total __________/ 100 puntos

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Nombre___________________________ Pregunta 1 (24 puntos). Se est estudiando la iniciacin de la replicacin del ADN cromosmico en una bacteria nueva que crece a 75C. Para ello, se han aislado mutantes de replicacin sensibles a la temperatura en doce protenas/genes diferentes derivados de esta cepa. A estas mutaciones se las denomina hot1-hot12. Se espera poder usarlas para identificar las protenas que actan en la iniciacin de la replicacin del ADN. 1A (5 puntos). Cmo se podra reducir el nmero de mutantes que habr que investigar? Describir el experimento que se llevara a cabo para centrarse en los factores de iniciacin y el tipo de mutantes que se elegiran para continuar la investigacin.

(3 Pts.) Medir la incorporacin de 3H dTTP en un anlisis para observar losmutantes de parada rpida y de parada lenta. Cultivar los mutantes ts atemperatura permisiva (75 C) y controlar la incorporacin de 3H dTTP despusde cambiar a una temperatura no permisiva. (2 Pts.) Las mutaciones de parada lenta son aquellas que siguen incorporando 3HdTTP durante un periodo corto de tiempo despus de que la temperatura nopermisiva vare. Se trata de clulas que presentan mutaciones en los genesnecesarios para que se inicie la replicacin de ADN. Los mutantes de parada rpida son necesarios para la elongacin.

Siguiendo el mtodo descrito anteriormente, se van desechando candidatos y, finalmente, se escogen 3 mutaciones (hot4, hot6 y hot9). Se decide abordar de dos formas distintas el estudio de las protenas codificadas por estas mutaciones.

(1) Se clonarn los genes mutados y se sobreexpresarn las protenas que stos codifican.

(2) Nuestro tcnico emplear complementos bioqumicos para purificar la actividad que complementa la capacidad de los extractos celulares derivados de las clulas mutantes para replicar un plsmido que contiene el origen cromosmico.

Rpidamente, se clonan los genes que complementan las cepas mutantes y se purifican las protena que codifican. En primer lugar, se decide comprobar, mediante un ensayo de retardo en gel, si una o varias de las protenas se asocian al origen. Los resultados que se obtienen son los siguientes:

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1B (5 puntos). Basndose en los resultados anteriores, qu se puede concluir acerca de la asociacin de los tres factores con el origen?

Despus de varios meses de investigacin bioqumica, nuestro tcnico nos asegura que ha purificado los factores que complementan cada uno de los tres extractos mutantes. Al analizar cada una de las fracciones con el mismo ensayo, obtiene los siguientes resultados:

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1C (5 puntos). Cmo se explicara la diferencia existente entre los resultados de nuestro tcnico y los obtenidos por nosotros con las protenas que purificamos?

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Nombre___________________________ Basndonos en nuestras ideas con respecto a los diferentes resultados obtenidos, decidimos pedir a nuestro tcnico que examine si el factor complementario de hot 4 tambin complementa los defectos observados en los extractos procedentes de cualquier otro extracto. l descubre que el factor complementario de hot 4 tambin complementa los defectos de los extractos procedentes de hot8 y hot12, dos mutaciones que habamos eliminado en nuestro anlisis inicial de mutantes (pregunta 1A). 1D (5 puntos) Cmo se explicara la capacidad del factor que complementa a hot4 para complementar la replicacin en los extractos derivados de las mutaciones determinadas para efectuar la iniciacin (hot4) o la elongacin (hot8 y hot12)?

(2 Pts.) El tcnico purific un complejo de multisubunidades. (3 Pts.) Un componente de este complejo podra ser el responsable de lainiciacin y otro componente lo sera de la elongacin. (Nota: Se aceptan otras interpretaciones, incluida la de que una sola protenahot4 presente actividades de elongacin e iniciacin, siempre que se d unaexplicacin de cmo hot4 podra sufrir mutaciones para ambas actividades.(Ej.: hot4, hot8 y hot12 eran, en realidad, un solo gen mutado en diferentesregiones responsables de la elongacin y la iniciacin).

1E (4 puntos). Partiendo del hecho de que nuestro tcnico ha purificado el factor complementario de hot4 a la homogeneidad, describir brevemente cmo se podra probar nuestra hiptesis experimentalmente. (2 Pts.) Partiendo de un complejo de multisubunidades, se pueden separar en un gel desnaturalizante las protenas purificadas bioqumicamente o por clonacin. (2 Pts.) Un complejo de multisubunidades producira una banda >1 en este gel, mientras que una nica protena dara lugar a una sola banda.

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Nombre___________________________ Pregunta 2 (34 puntos en total). Estamos estudiando qu limita la velocidad de movimiento de la horquilla de replicacin de E.coli. Decidimos probar la hiptesis de que la velocidad con la que el complejo carga la pinza deslizante (protena ) es lo que limita la velocidad. Para probar esta hiptesis, pretendemos impedir que el complejo se disperse alejndose de la horquilla de replicacin. Decidimos probar nuestra hiptesis mediante la fusin del gen que codifica la mayor subunidad del complejo (dnaX) con el gen que codifica la subunidad cataltica de ADN polimerasa III (dnaE), de modo que la ADN polimerasa y el complejo estn unidos de forma covalente. Ante la preocupacin de que la fusin de las protenas dnaX y dnaE pueda inhibir la actividad enzimtica de la polimerasa, queremos analizar ambas actividades y compararlas con la Holoenzima de la ADN Pol III normal, sin protenas fusionadas. 2 (4 puntos). Describir el ensayo que se podra utilizar para determinar si la actividad de la ADN polimerasa de la Holoenzima de la ADN Pol III modificada est alterada. Suponer que se tiene acceso a cualquier dNTP o ADN radiomarcado que sea necesario.

Dado que en la pregunta se pide un ensayo de la actividad de la polimerasa, seran vlidos tanto un ensayo de incorporacin de dNTP como uno de extensin del cebador. No se pide un ensayo de procesividad, por lo que un reto del molde sera innecesario, pero vlido. Una respuesta completa incluira: Una unin cebador / molde Cebador radiomarcado o dNTPs tambin radiomarcados. Mg++ Unin de filtracin o electrofresis en gel para detectar los productos

radiomarcados. NOTA: las polimerasas NO requieren ATP. No se han restado puntos por esto, ya que la presencia de ATP no produce ningn dao, pero es innecesaria.

Tambin nos preocupa que la fusin pueda alterar la capacidad del complejo para funcionar dentro de la Holoenzima de ADN Pol III. Para estudiar esta posibilidad, pretendemos realizar una ensayo de carga de la pinza deslizante basado en el ensayo de asociacin de moldes descrito en clase. 2B (3 puntos). Qu molcula habra que radiomarcar para realizar este ensayo?

La pinza deslizante beta (queremos examinar si el cargador de la pinza gamma est cargando la pinza beta, no si el propio cargador de la pinza gama se est asociando. Se otorgarn algunos puntos por mencionar que se quiere marcar la protena en cuestin, ya que es pequea y se dividir en diferentes fracciones dependiendo de si se asocia o no con el ADN grande.

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Nombre___________________________ 2C (3 puntos). Dado que el cargador de la pinza requiere una unin molde-cebador para cargar la pinza deslizante en el ADN, dibujar la estructura del molde de ADN que se empleara en el ensayo. 2D (6 puntos) Dibuje el resultado de la prueba que esperara si el cargador de pinza estuviese activo o inactivo. Asegrese de que marca los ejes del cuadro.

(TABLAS)

Un ADN de cadena simple, grande y circular, con un cebador hibridado para que la pinza lo reconozca. Se ha otorgado parte de la puntuacin por dibujar simplemente una unin cebadormolde, pero la mxima puntuacin de esta prueba se obtiene al afirmar que el ADN circular grande no marcado se aleja de la columna de filtracin en gel en distinto sitio que la protena pequea marcada por s sola. Muchos alumnos intentaron tambin dibujar la horquilla tal y como es en vivo. Sin embargo, esto no es un molde que se pueda hacer ni utilizar en un ensayo.

2D (6 puntos). Dibujar el resultado que se espera obtener del ensayo segn el cargador de la pinza est activo o inactivo. Es importante asegurarse de marcar los ejes de la grfica.

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Nos alegra descubrir que tanto la ADN polimerasa como las actividades de carga de la pinza de la Holoenzima de ADN Pol III modificada son las mismas que en la Holoenzima no modificada, cuando se investigan por separado. Para determinar si la unin covalente de estas enzimas permite que las actividades funcionen bien juntas, se pretende estudiar la velocidad de movimiento de la horquilla de replicacin (donde ambas actividades deben actuar de forma simultnea, al contrario que en las preguntas 2A-D, en las que se haban examinado las actividades por separado).

En primer lugar, se realiza una prueba in vitro, empleando un plsmido con OriC como molde para la reaccin de replicacin del ADN. 2E (6 puntos) Nuestro supervisor ve que estamos utilizando el plsmido Oric y, sin pararse a pensar, nos indica que deberamos usar el molde de ADN de cadena simple ms sencillo y un cebador hibridado. Por qu es necesario realizar este ensayo con un molde de ADN que contiene OriC, en lugar de emplear un molde ADN de una sola hebra con un cebador simple? Ilustrar al supervisor.

Para disponer de una horquilla de replicacin con hebras conductoras y retardadas, se necesita un molde de origen de cadena doble, no una simple unin cebadormolde. La Holoenzima completa consiste en polimerasas, conductoras y retardadas, conectadas por tau y ms procesivas debido a la accin de la pinza y de sus protenas de carga, las cuales pueden funcionar slo conjuntamente en una horquilla de ADN de cadena doble. Se ha otorgado parte de la puntuacin por hablar de la carga en el origen de dnaA / B/ y C, pero el punto clave est en que para analizar las actividades de la holoenzima es necesario preparar una horquilla.

Se lleva a cabo un ensayo de replicacin/periodo de tiempo utilizando dTTP radiomarcado, otros dNTP, Mg+2, un plsmido de 5000 pares de bases que contiene una sola secuencia de OriC, dnaA, dnaB, dnaC, primasa, topoisomerasa y la Holoenzima ADN Pol III, ya sea modificada o no modificada. Se separan los productos en un gel desnaturalizante y se obtienen los siguientes autoradiogramas:

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Nombre___________________________ 2F (5 puntos). En el ensayo, no se observa ningn producto de ms de ~2.500 bases. Explicar el motivo. Qu protenas adicionales habra que aadir al ensayo para ver esas molculas?

El punto clave del gel estaba en que los fragmentos de Okazaki (alrededor de 500-1000 bases) no se estaban uniendo ni entre s ni a las cadenas conductoras (2500 bases). Esto se deba a la total ausencia de ADN ligasa, Polimerasa I exonucleasa y ARNse H. Sin embargo, muchos de los alumnos se dieron cuenta de que olvidamos incluir las protenas SSB. Y, aunque no es una protena y, por tanto, vale menos puntos, olvidamos tambin el ATP. La mxima puntuacin se obtena mencionando 2 de las protenas que faltaban en la reaccin, junto con una explicacin razonable.

Nos sentimos decepcionados porque no hay una gran diferencia entre las dos polimerasas. Sin embargo, observamos que ambas reacciones pasan de incompletas a completas en el segundo 15, lo que nos lleva a sospechar que ambas enzimas son tan rpidas que completan la totalidad del molde en menos de 15 segundos. 2G (3 puntos). Debido a la dificultad del experimento, no se puede tomar un punto en el tiempo inferior a 15 segundos. Cmo se podra cambiar el molde para aumentar las posibilidades de ver alguna diferencia entre las dos polimerasas? Explicar brevemente el razonamiento seguido.

La respuesta ms sencilla es alargar el molde para que la polimerasa de tipo salvaje tarde ms de 15 segundos en realizar la replicacin. Aunque nadie haya seguido este razonamiento, descubrimos que la polimerasa de E. Coli se mueve a una velocidad de unos 1000 pb/s. Por lo tanto, el molde debera ser ms largo de 15.000 bases.

Utilizando el nuevo molde, los estudios in vitro indican que la hiptesis es correcta y la horquilla de replicacin se mueve dos veces ms rpido utilizando la Holoenzima de ADN Pol III modificada en el tubo de ensayo. Como prueba final de la hiptesis, se sustituyen las copias normales de los genes dnaE y dnaX en E. Coli por la versin fusionada de dichos genes y se determina el efecto que tiene sobre la tasa de crecimiento celular.

2H (4 puntos). Nos sorprende descubrir que las clulas crecen mucho ms despacio que las clulas de tipo salvaje. Sin embargo, si el gen codificador de la protena est sobre-expresado, las clulas crecen ms rpidamente que las de tipo salvaje. Cmo se explican estos resultados) (Consejo: el complejo es necesario tanto para unir la pinza deslizante al ADN como para retirarla).

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Una respuesta completa incluira la explicacin de porqu las protenas fusionadasoriginan un crecimiento ms lento de las clulas Y porqu sobreexpresar beta dalugar a un crecimiento ms rpido. Una respuesta es que la fusin de gamma a lahorquilla impide que sta vuelva y elimine las pinzas beta de detrs de la horquilla(al final de los fragmentos de Okazaki, por ejemplo). De este modo, las clulasdejan de tener pinzas beta y crecen ms despacio. Si se sobreexpresa beta, seresuelve el problema, permitiendo que la polimerasa se mueva ms rpido que eltipo salvaje, al igual que lo hace in vitro.

Pregunta 3 (22 puntos). Mediante un enfoque de clonacin del replicador, se ha aislado un fragmento de ADN que contiene un replicador derivado de la levadura, B. Rewski. La fragmento identificado tiene 5 kb de longitud y presenta el siguiente mapa de restriccin:

Los estudios iniciales indican que solo existe un origen en esta regin. Se pretende identificar el sitio del origen de replicacin en el fragmento. Basndose en la secuencia de ADN, se cree que el origen de replicacin est situado en el fragmento C del mapa. 3A (3 puntos). Con qu enzima de restriccin cortara el ADN genmico antes de llevar a cabo un anlisis con gel 2D de los intermediarios de la replicacin para identificar el origen? Explicar esta eleccin.

EcoRI: para que las sondas se puedan unir. O HindIII: para que el supuesto origen en C est fuera del centro en el fragmento (pero esta respuesta trae complicaciones al utilizar las sondas 1 2 en la parte B). Nota: las respuestas basadas en el tamao de los fragmentos de restriccin no tienen sentido en este ensayo. Se est detectando slo un fragmento con una sonda radiomarcada y cada fragmento tendr una gama de tamaos en funcin de si est completamente replicado, parcialmente replicado o no est replicado.

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Nombre___________________________ 3B (3 puntos). Cul de las sondas radiomarcadas (que se muestran mediante barras oscuras sobre el mapa de restriccin) se podra seleccionar? Explicar brevemente dicha eleccin.

Si se digiere con RI, la sonda 2 se unir a la regin que incluye C, donde se sospecha que hay un origen. Si se digiere con HindIII, no funcionar ninguna sonda, ya que ambas reconocern mltiples fragmentos, originando patrones mltiples en el mismo gel.

Se realizan experimentos de mapeo de intermediarios en un gel 2D utilizando, en cada caso, diferentes digestiones con enzimas de restriccin y diferentes sondas. Se obtienen los siguientes resultados:

3C (5 puntos). Basndose en estos datos, qu conclusiones se pueden extraer con respecto a la localizacin del origen en el fragmento?

El origen est ubicado asimtricamente en un extremo del fragmento A o del fragmento B, ya que la sonda 1 origina una transicin de burbuja Y. El origen NO se encuentra en el fragmento C. El patrn generado por la sonda 2 podra ser TANTO una burbuja COMO un arco Y. Como se coment en clase, no hay forma de establecer la diferencia a simple vista, de ah que buscramos una transicin de burbuja Y en lo visto con la sonda 1. Se otorgaron ms puntos a los alumnos que se dieron cuenta de esto, pero la pregunta afirmaba que slo haba un origen.

3D (6 puntos). Describir un experimento adicional en gel 2D que se podra realizar para esclarecer an ms o confirmar la conclusin extrada. Explicar el razonamiento seguido para ello.

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Existen muchas posibilidades. Un ejemplo: cortar con EcoRI y HindIII, sondear con una sonda especfica para la regin de B y buscar una transicin de burbuja Y, ya que sabemos por la parte C que si el origen est en B, se encuentra en un extremo de B, no en el centro. Obsrvese que el empleo de las sondas dadas no funcionara, como se ha explicado anteriormente. Se otorgaron ms puntos a los que al menos se dieron cuenta del problema. Quiz la pregunta no fuese del todo clara a la hora indicar que se poda disear una nueva sonda.

3E (5 puntos). Basndose en los experimentos descritos anteriormente, se descubre que el origen est ubicado en un nico fragmento de 500 pares de bases. No obstante, nos interesa determinar si el replicador est situado completamente dentro del mismo fragmento. Describir brevemente cmo se podra mapear la localizacin del replicador en el fragmento.

Se quiere saber si el origen est situado completamente dentro del fragmento de500 pb. La nico modo de averiguar esto es con el ensayo de replicacin delplsmido: clonar el fragmento en un vector que contenga un marcador selectivo,un centrmero y ningn origen; transfrmarlo en levadura (no en bacteria, este esun origen de levadura) y seleccionar el marcador. Si las clulas logran crecer, elfragmento contendra el replicador. El mapeo de la mutacin se puede utilizarentonces para realizar un mapeo ms profundo, pero la nica forma de comprobarsi la regin es capaz de desempear la funcin de origen es clonndola en unplsmido lejos de las secuencias flanqueadoras.

Pregunta 4 (20 puntos en total). Para identificar las protenas que participan en la reparacin de ADN en una cepa bacteriana recientemente identificada, se deciden aislar las versiones mutantes de esta cepa que tengan un fenotipo mutador. En el contexto de este anlisis, se define la cepa mutante como una cepa mutadora si tiene una frecuencia de mutaciones al menos 10 veces mayor que la de la cepa inicial, como se determin a partir de un ensayo de reversin in vivo, similar al utilizado en el test de Ames. La cepa de prueba inicial empleada para el ensayo de reversin contiene una mutacin de sentido errneo en un gen necesario para la biosntesis de la arginina; como resultado, esta cepa es una auxtrofa de arginina. 4A (6 puntos). Nombrar, utilizando la nomenclatura de E. Coli, los cuatro genes (o la protena codificada por dichos genes) que probablemente presentarn las frecuencias de mutacin ms elevadas (ej.: un aumento de ms de 100 veces) en este ensayo. Justificar brevemente la respuesta.

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(4 Pts.) mutS, mutL, mutH y la actividad exonucleasa revisora (froofreading) dePolIII. (2 Pts.) Es necesario dar una explicacin de por qu las mutaciones anterioresoriginan las MAYORES frecuencias de mutacin. mutS, mutL y mutH participan enla reparacin de los malos apareamientos. Una mutacin en uno de stos causara unincremento de 1000 veces en la frecuencia de mutacin. Una mutacin en laactividad exonucleasa revisora (froofreading) de PolIII tambin causara unaumento de 1000 veces en la frecuencia mutacin. No se han aceptado los genes necesarios para la reparacin de la escisin de bases (BER) ni para la reparacin de la escisin de nucletidos (NER), porque la frecuencia de mutacin en estos mutantes es considerablemente ms baja que en los mutantes anteriores, en ausencia de un mutgeno. (Nota: Tambin se ha aceptado dam-, aunque una mutacin en este gen causara un aumento de 500 veces en la frecuencia de mutacin, lo cual no es tan alto como en las mutaciones mencionadas anteriormente).

Como resultado de este cuadro gentico, se aslan las clulas que constitutivamente expresan las protenas necesarias para la translesin en la sntesis de ADN (TLS). Estas clulas expresan las protenas en ausencia de induccin por medio de un agente daino para el ADN. Sin embargo, las protenas necesarias para la TLS son perfectamente normales en esta cepa. 4B (4 puntos). Por qu tienen estas clulas un fenotipo mutador? Explicar la respuesta.

(2 Pts.) La TLS es propensa a error y causar la incorporacin de nucletidos incorrectos durante la replicacin. (2 Pts.) Normalmente, los genes de la TLS estn reprimidos. Sin embargo, en estas clulas, la TLS est constitutivamente activa. Debido a esto, las protenas necesarias para la TLS pueden actuar libremente y causar, por tanto, un aumento de las mutaciones.

En el proceso de caracterizacin de la cepa que expresa constitutivamente las protenas necesarias para la TLS (utilizadas en el apartado b), se observa que un clon derivado de esta cepa posee una frecuencia de mutacin an MAYOR que la de la cepa madre. Esta elevada frecuencia de mutacin se observa en muchos tipos distintos de ensayos in vivo, independientemente de la naturaleza del alelo de prueba utilizado en el experimento. Un anlisis ms profundo de esta cepa hipermutable revela que porta una mutacin en el gen umuC.

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Nombre___________________________ 4C (5 puntos). Qu caracterstica de la protena UmuC (polimerasa V) podra estar alterada en la versin mutante para explicar el fenotipo? Explicar brevemente la respuesta. 2

( Pts.) UmuC es una polimerasa de ADN de baja fidelidad y tambin posee una bajaprocesividad. Sin embargo, una mutacin que aumente la procesividad de UmuCpermitir una polimerizacin mucho ms larga de lo normal. (3 Pts.) Cuanto ms polimerice UmuC el ADN, ms nucletidos incorrectos seincorporarn, aumentando as la frecuencia de mutacin. Nota: se han aceptado otras explicaciones, como por ejemplo, una mutacin en lasubunidad de proofreading de UmuC o una mutacin que haga que UmuC seaan ms propensa a error. Sin embargo, UmuC no posee actividad proofreading.Adems, una mutacin que la hiciese ms propensa a error sera improbable, ya queincorpora nucletidos casi al azar, sin tener en cuenta el apareamiento de basesapropiado.

4D (5 puntos). Disear un experimento para probar la hiptesis formulada acerca de la naturaleza del defecto en la protena UmuC. Explicar, especficamente, los resultados que se esperan obtener en el experimento con la protena mutante en caso de que la hiptesis sea correcta. Comparar estos datos con los obtenidos en los experimentos de control en los que se ha utilizado la protena de tipo salvaje UmuC.

(1 Pt.) Un ensayo de desafo de procesividad/molde puede probar nuestra hiptesis segn la cual UmuC sufri una mutacin que aument su procesividad. (1 Pt.) Un sustrato apropiado incluira un molde de cadena simple largo con un cebador complementario corto radiomarcado en su extremo 5. Incubar UmuC y el sustrato marcado en una proporcin equimolar. (1 Pt.) Despus de la incubacin, aadir dNTPs y sustrato fro 1000x (molde de ADN de cadena simple y cebador no marcado). Dejar actuar la reaccin y separar los productos en un gel desnaturalizante. (2 Pts.) Una mutacin de aumento de procesividad en UmuC generar un producto de ADN largo, indicando su capacidad para polimerizar una larga extensin de ADN en un solo proceso de unin. El UmuC de tipo salvaje dar lugar a un producto de ADN corto, indicando una baja procesividad en esta enzima.

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