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Specie radicalichee stress ossidativo
Prof. Giorgio Sartor
Copyright © 2001-2012 by Giorgio Sartor.
All rights reserved.
Versione 4.2 – nov 2012
gs © 2001-2012 ver 4.2 F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo - 2 -
Radicali
• Specie chimiche con elettroni spaiati• occupano da soli un orbitale atomico o
molecolare
• Molto instabili e reattivi verso le altre molecole per compensare tale squilibrio
• Autopropagazione per reazioni a catena
• Pericolosità inversamente proporzionale all’emivita
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Meccanismi di formazione di radicali
• Perdita di un elettrone:X → X•+ + e-
Chl* + A → Chl•+ + A-(•)• Acquisto di un elettrone:
X + e- → X•-O2 + e
- → O2•-• Scissione omolitica di un legame covalente:
X-Y → X• + Y•Cl2 → 2Cl•
• Astrazione di un atomo di idrogeno (H•) da parte di un altra specie radicalica:
CH4 + Cl• → CH3• + HCl
Lipide-H + OH• → Lipide• + H2OR-SH + R-O2
•- → R-S•- + R-O2H
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Ossigeno
• Orbitali molecolari dell’ossigeno
• Potenziali di riduzione
σσσσx
ππππy,ππππx
ππππy*,ππππx*
σσσσx*
O2 O2.- H2O2 O2
1∆g
O2 O2.- H2O2
H2OOH.
e- e- + 2H+ e- + 2H+H2O
e- + H+
-0.16v 0.94v 0.38v
2.33v
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Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
• Specie non radicalicheH2O2 acqua ossigenata (perossido di idrogeno)
HOBr acido ipobromoso
HOCl acido ipocloroso
O3 ozono
O21∆g ossigeno singoletto
LOOH perossido lipidico
ONOOH perossinitrito
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Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
• Radicali prodotti per riduzione ad un elettrone
•O-O• + e- → •O-O:- anione superossido
O2•- + •OH → ¹O2 + OH
- ossigeno singoletto
2O2•- + 2H+ → H2O2 + ³O2 perossido
O2•- + H2O → HOO
• idroperossiradicale
H2O2 + e- → OH- + OH• radicale idrossido
H2O2 + Fe²+ (Cu+ ) → Fe³+ (Cu++ ) + OH- + OH•
(Reazione di Fenton)
H2O2 + O2•-(Cu/Fe) → O2 + OH
- + OH•
(Reazione di Haber-Weiss)
L + O2•- → LOO•- anione lipoperossido
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Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
• Prodotte dalla catena respiratoria
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Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
• Prodotte dalla catena respiratoria nel
complesso IV
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Complesso IV
Eme aEme a3
CuB
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Formazione di H2O nel complesso IV
N
N
N
N
Fe O
O
N
N
N
N
Fe OH
OH
Cu++
N
N
N
N
FeN
N
N
N
FeN
N
N
N
Fe
N
N
N
N
Fe O
O
Cu++N
N
N
N
Fe O Cu++
O+
H H
Cu+
Cu+
Cu+
2H+
e-
2H2O
e-
e-
2H+
e-
O2
+++
+++
CuB++
+++ +++ ++
+++4+
eme a
eme a eme a
eme a
eme a3
O2 + 4H+ + 4e- 2H2O
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Lipoperossidi
XY
H
HO
H
O H
C XY
XY
O
O
O2
XY
O
O H
XY
H
C XY
O O
H H
Y CH2
WCH3
O
HR
OH
+ +
Malondialdeide
4-idrossinonenale
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Specie Reattive dell’Azoto (RNS)
• Prodotti prevalentemente dallo smog fotochimico
• Specie non radicaliche– HNO2 acido nitroso
– NO+ catione nitrosile
– NO- anione nitrosile
– N2O4 tetrossido di diazoto
– N2O3 triossido di diazoto
– NO2+ nitrile
– ROONO alchilperossinitrito
– NO2Cl cloruro di nitrile
• Specie radicaliche– O2 + L-arginina → NO
• + L-citrullina ossido d’azoto
– O2•¯ + NO• → ONOO¯ perossinitrito
– ONOO¯ + CO2 → ONOOCO2¯ nitroperossicarbonato
– ONOOCO2¯ → NO2• + CO3
•¯ biossido d’azoto
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Ciclo dell’urea e NO
CO2
NH3 NH
2
O
OP
O
O
O
NH3+
O
O
NH3+
NH
O
O
NH3+
O
NH2
NH3+O
O
NH3+
NH
O
O
NH3+
O
NH2
N
O
N
N
OH
OH
N
NH2
O
P
OO
O
NH
O
O
NH3+
NH2+
NH
O
O
NH3+
O
NH2+
O
O
O
O
NH3+
O
O
O
O
NH3+
O
NH
NH2+
NH2O
O
O
O
O
O
NH2
NH2
NH
N
NH2
NH3+
O
O
OH
+
2ATP 2ADP + Pi
ATP
PPi
2 Pi
AMP
H2OFumarato
Urea
Ornitina(OUT)
Ornitina(IN)
Citrullina(IN)
Citrullina(OUT)
Citrullil-AMP
Argininosuccinato
Aspartato
Arginina
Argininosuccinatoliasi
EC 4.3.2.1
ArginasiEC 3.5.3.1
Argininosuccinatosintasi
EC 6.3.4.5
Argininosuccinatosintasi
EC 6.3.4.5
Trasportatoredell'ornitina
Trasportatoredella citrullinaOrnitina
trans carbamilasiEC 2.1.3.3
Malato
Ossalacetato
αααα-chetoacido
Aminoacido
Carbamilfosfato
Carbamil-fosfatosintasi
EC 6.3.4.16
O2 +
NADPH
H2O +
NADP+
N-ϖϖϖϖ-idrossi-L-arginina
NO.O2 +
0.5 NADPH
H2O +
0.5 NADP+
NO sintasiEC 1.14.13.39
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gs © 2001-2012 ver 4.2 F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo - 15 -
Ossido d’azoto e NOS (EC 1.14.13.39 )
NH
NH
NH2
NH3+
O
O NH
N
NH2
NH3+
O
O
OH
NH
O
NH2
NH3+
O
O
O2
H2O
NADPHNADP+L-arginina N-ωωωω-idrossi-L-arginina
0.5 NADPH
0.5 NADP+
Ossidazione a due elettroni
Ossidazione a tre elettroni
O2
H2O
L-citrullina
+ NO.
Nitric Oxyde Sinthase
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Ossido d’azoto e NOS (EC 1.14.13.39 )
NH
N
NH2
NH3+
O
O
H
NH
N
NH2
NH3+
O
O
OH
NH
O
NH2
NH3+
O
O
Fe3+
Fe2+
NH
N
NH2
NH3+
O
O
OH
Fe2+
OO
Fe2+
OO
NH
N
NH2
NH3+
O
O
O H
O
O
O
O
Fe3+
H2O
NADPHNADP+
L-argininaN-ωωωω-idrossi-L-arginina
0.5 NADPH
0.5 NADP+
Ossidazione a
due elettroni
Ossidazione a tre elettroni
H2O
L-citrullina
+ NO.
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NO sintasi (EC 1.14.13.39)Dominio Ossidoreduttasico
1F20
NADP+ FAD
Dominio eme1FOP EME ARG
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Specie reattive del cloro (RCS)
• Radicali
–Cl•
• Non radicaliche
–HOCl acido ipocloroso (ROS)
–NO2Clcloruro di nitrile (RNS)
–Cloramine
–Cl2 cloro
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Mieloperossidasi (EC 1.11.1.7)
• La mieloperossidasi(MP3+) è un enzima perossidasico presente nei granuli dei neutrofili.
• Si ritiene che produca HOCl nei fagosomi.
• Può usare anche altri ioni oltre il cloruro.
MP3+ + H2O2 Comp I
Comp II
Cl-HOCl
MP2+O2
O2.-
O2.-
RH
R.
Br-HOBr
I-HOI
SCN-HOSCN
NO2-HONO2
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Mieloperossidasi (EC 1.11.1.7)
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Stabilità dei radicali
RADICALE TEMPO DI
VITA
Radicale idrossido ·OH 10-9 s
Radicale alcossido ·OR 10-6 s
Ossigeno
singoletto
1O2 10-5 s
Anione
perossinitrito ONOO- 0.05-1.0 s
Ossido di azoto ·NO 1-10 s
Radicale perossido ROO· 7 s
Anione
superossido O2·
- 103-104 s
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Sorgenti di Radicali
• Endogene:
– Catena respiratoria,
– Fotosintesi,
– Sintesi di
prostaglandine,
– Metabolismo dei
nucleotidi
– Perossisomi,
– Autossidazione,
– Fagocitosi,
– Ossiemoglobina,
– Enzimi ossidativi…
• Esogene:
– Xenobiotici,
– Radiazioni – Ionizzanti (raggi X)
– Non ionizzanti (UV)
– Calore,
– Infezione,
– Iperossia,
– Inquinamento
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Sorgenti di Radicali
• Endogene:
– Catena respiratoria,
– Fotosintesi,
– Sintesi di
prostaglandine,
– Metabolismo dei
nucleotidi
– Perossisomi,
– Autossidazione,
– Fagocitosi,
– Ossiemoglobina,
– Enzimi ossidativi…
• Esogene:
� Xenobiotici,
– Radiazioni – Ionizzanti (raggi X)
– Non ionizzanti (UV)
– Calore,
– Infezione,
– Iperossia,
� Inquinamento
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Invecchiamento
Diminuzione delle difese antiossidanti
UV
Aumento dello stress ossidativo
AUMENTATA PRODUZIONE DI
ROS
Accumulazione dimutazioni del DNA
Stimolazione delle vie di trasduzione del
segnale
Modificazione di proteine
Alterazione della struttura genica
Alterazione dell’attivitàgenica
Alterazione della struttura e della
funzione delle proteine
Perdita della regolazione dell’omeostasi intracellulare ed extracellulare
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gs © 2001-2012 ver 4.2 F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo - 25 -gs © 2001-2008 ver 4.1 Specie radicaliche e stress ossidativo - 25 -
Stress ossidativo
Danni al DNA
Attivazione di Poli ADP riboso sintasi
Riduzione diNAD(H)
Inibizione dellasintesi di ATP Danni diretti
alle proteine
Aumento di Ca++
intracellulare
Danni al citoscheletro
Perossidazionelipidica
Aumento di Fe++, Cu++, eme-proteine liberi
Attivazione diNOS
Formazione di perossinitrito
Alterazione delle membrane
Perossidazionedelle membrane
Aumentato danno a DNA,
proteine e lipidi
Rilascio di ioni, eme-proteine perossidi ecc.
Diminuzione eossidazione di GSH
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Danni al DNA
• Danni endogeni – ROS prodotti dal metabolismo, potano alla
deaminazione ossidativa
• Danni esogeni da:– Radiazioni: UV (200-400 nm), Raggi X, Raggi
γ– Idrolisi e degradazione termica
– Tossine vegetali
– Composti mutageni di origine antroica(intercalanti)
– Virus
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Tipi di danno
• Ossidazione delle basi: formazione di 8-osso-7,8-diidroguanine (8-oxoG)
• Alchilazione delle basi (in genere metilazione) con formazione di 7-metilguanina, 1-metiladenina, 6-O-Metilguanina
• Idrolisi delle basi (deaminazione,depurinazione e depirimidinazione)
• Formazioni di addotti con IPA e derivati
• Formazione di cross-link tra citosine e timine adiacenti formano dimeri di pirimidina da UV
• Depurinazione da temperatura
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• Perdita di basi: il legame glicosidico è labile sotto condizione fisiologiche (formazione di un sito AP).
• Deamminazione ossidativa: i gruppi amminici primari sono a volte instabili e possono venire convertiti in chetoni.
• Metilazione con formazioni di O-metilderivati
O P O
R
O P OH
O
NO
N
OO
NH2
P OH
O
O
OO
OH
H
NO
N
N
O
N
NH2O
O P O
O
R
Sito AP
R
O P OH
O
NO
N
OO
O
H
O P O
R
NH3
R
O P OH
O
NO
N
OO
NH2
O P O
R
O2
Citidina Uracile
N
NH
N
NNH2
OCH3
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Danni Fisici: Radiazioni Ionizzanti
• Danni diretti: Single Strand Break, Double Strand Break, Mismatched bases.
• Danni indiretti: produzione di ROS.
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Danni Fisici: Radiazioni UV
• Stress ossidativo: foto-carcinogenesi e foto-invecchiamento (UV-B)
• Foto-dimerizzazione: formazione di CPD e 6-4PP (UV-C).
O P O
R
O P O
R
O
O NNH
O
O
CH3
P OH
OO
O
OO
N
NO
O
CH3
O P O
R
O P O
R
O
O
P OH
OO
O
OO
N
NO
O
CH3H
N
N
O
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Danni chimici: ROS
• Causano ossidazione delle basi e amplificanodeamminazioni e depurinazioni.
o Un esempio di composto ossidato è OH8dG: causa trasversioni delle basi GC → TA
RO
O
RO
N
N
N
NH
O
NH2
RO
O
RO
N
N
N
NH
O
NH2
O HROS
deossiGuanosina 8-ossi-deossiGuanosina (OH8dG)
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Danni chimici: inquinanti Organici
• Genotossici: danno diretto al DNA tramite formazione di addotti (alchilanti in posizioni nucleofile).
N N
NN
NH2
R
N
NH
O
O
CH3
R
N
N
O
NH2
R
N N
NNH
O
NH2R
Guanina
Adenina Timina
Citosina
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
NN N
NN
O
H
H
DNA
(+)-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-ossidobenzo[a]pirene
(-)-trans-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diolo
(+)-anti-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diol-9,10-ossido
addotto con il DNA
monoossigenasi epossido-idrolasi
monoossigenasi
• Epigenetici: danno indiretto al DNA attraverso stress ossidativo o l’attivazione di composti pericolosi. Es. IPA.
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Riparazione del danno single-strand
• Enzimi di riparazione del danno Single-strand (Uracil-DNAglicosilasi EC 3.2.2.)
• Uso dell’altro strand come templato
• Base excision repair (BER) rimuove il danno da alchilazione, ossidazione, idrolisi, deaminazione. La base danneggiata èrimossa da una DNA glicosidasi. La base mancante èrisintetizzata da una DNA polimerasi e reinserita da una DNA ligasi
• Nucleotide excision repair (NER), riconosce distorsioni dell’elica come laformazioni di dimeri di pirimidina
• Mismatch Repair (MMR) corregge errori di replicazione e ricombinazione dovuti a errori nell’accoppiamento delle basi non danneggiate.
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Uracil-DNA glicosilasi (EC 3.2.2.X)
• Ripara il danno ossidativo C → U
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Riparazione del danno double-strand
• Non-homologous end joining (NHEJ), microhomology-mediated end joining(MMEJ) e ricombinazione omologa
• L’enzima DNA ligasi ripristina il legame tra nucleotidi con la formazione di un legame estereo tra il fosfato e il nucleotide
• In NHEJ, DNA Ligasi IV, è una DNA ligasispecifica che forma un complesso con una proteina (XRCC4) che è coinvolta nelle interazione con i promotori.
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Antiossidanti
• Gli antiossidanti non sono, in genere, dei radicali liberi. Quindi quando un antiossidante agisce si forma un radicale derivato dall’antiossidante.
• Se un radicale libero perde o guadagna un elettrone non è più un radicale libero:
NO• → e- + NO+NO• + e- → NO-
• La reazione tra specie radicaliche porta alla perdita netta di radicali
O2•- + NO• → ONOO-
• nello specifico lo ione perossinitrito può generare radicale idrossile.
ONOOH → OH• + NO2•
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gs © 2001-2012 ver 4.2 F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo - 37 -
Acido ascorbico (Vit. C)
O
H
OH O
OH
H
OH
H O
H
H
+
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A mechanistic study of the reduction of quinones by ascorbic acid
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gs © 2001-2012 ver 4.2 F04 - Specie radicaliche e stress ossidativo - 39 -
Referenze sul WEB• Vie metaboliche
– KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/• Degradazione degli xenobiotici: http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html
• Struttura delle proteine:
– Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/
– Hexpasy• Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/
• Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/
• Enzyme (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/
– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/
• Enzimi:
– Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/
– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/
– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/
• Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/
• Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/
• Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html
• Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registryhttp://www.atsdr.cdc.gov
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Crediti e autorizzazioni all’utilizzo
• Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:
http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/
• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna – Alma Mater
Giorgio Sartor - [email protected]