spectrométrie de masse
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Spectrométrie de Masse Principe et applications en Biologie Clinique
Dr Abdellah TEBANI
12 janvier 2017
Laboratoire de Biochimie Métabolique
CHU de Rouen
La spectrométrie de masse (SM)
Définir les concepts de base de la SM
Expliquer le principe de fonctionnement
Connaître les modes d'acquisition MS et MS/MS
Applications en Biologie Clinique
Objectifs
2 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Spectrométrie de masse / Etat de l’art
3 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Thomas M. Annesley et al. Clin Chem 62:1 1–3 (2016)
12/01/2018 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 4
Spectrométrie de masse / Etat de l’art
Paul J. Jannetto et al. lin Chem 2016;62:92–8
La spectrométrie de masse
Aspects méthodologiques
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Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Concept 1 : Spectromètre de masse
Un spectromètre de masse est un instrument utilisé pour
peser des molécules.
Une balance à l'échelle moléculaire !
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Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Un spectromètre de masse est utilisé pour :
Identifier des molécules présentes dans des échantillons
solides, liquides ou gazeux
Déterminer la quantité de chaque molécule (Quantitatif)
Déterminer la structure de chaque molécule (Qualitatif)
Concept 2 : utilité d’un spectromètre de masse
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Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Une molécule doit être chargée pour être
analysée par un spectromètre de masse.
Un spectromètre de masse "pèse" les
molécules électroniquement par attraction et
répulsion des ions.
Concept 3 : ions et charge
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Spectrométrie de Masse
«L’ionisation permet aux molécules d’être mobiles
dans un spectromètre de masse."
12/01/2018
Trier puis compter
Mélange de molécules
Molécules de différents PM et structures
Séparation par spectres de masse
3
8
5
4
2
Valeur (m/z)
Quanti
té (
Inte
nsi
té)
Concept 4 : Analyse des masses
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Combien ?
Un spectromètre de masse
mesure la masse de molécules isolées
Le spectromètre de masse doit : 1- Volatiliser Séparer les molécules les unes des autres : on passe de
l’état de matière condensée à un état gazeux. 2- Ioniser Transformer les molécules en ions, car un spectromètre de
masse fonctionne grâce à des champs électriques 3- Mesurer les rapports m/z La masse moléculaire est calculée à partir du rapport : masse (m)/nombre de charges de la molecule (z)
Spectromètre de masse : principe
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Ionisation
Spectrométre de masse
Ionisation des molécules
Séparation des ions par m/z
Analyse quantitative/qualitative
Séparation Spécificité
Détection Mesure
Déconvolution Analyse des spectres
Interprétation Biologie
Spectromètre de masse : principe
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Méthode de mesure des rapports masse/charge (m/z) de molécules
individuelles et ionisées
Echantillon Spectromètre de masse Signal
Spectromètre de masse
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Echantillon Source d’ions
Analyseur de masse
Détecteur Signal
Spectromètre de masse : principe
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Ion Source
Type de sources d’ions
Electrospray (ESI, DESI)
Matrix-Assisted Laser
Desorption Ionization
(MALDI)
Chemical Ionization
(CI, APCI)
Electron Ionization (EI)
Rapid Evaporation
Ionization (REIMS)
Fast Atom Bombardment SS TI
GD TS
DESI DART
Spectromètre de masse : principe
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Analyseurs de masse
Quadripole (Q)
Time of Flight (ToF)
Ion Trap
Trappe d’ions linéaire
Secteur magnétique
Fourier Transform Ion
Cyclotron Resonance
(FT-ICR)
Spectromètre de masse : principe
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Detecteurs
Détection d’ions
Amplification
Conversion en signal
digital
Spectromètre de masse : principe
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« ionisations dures » génèrent des
ions moléculaires qui se fragmentent
parfois même totalement avant
d’avoir eu le temps de sortir de la
source.
Ionisation à Impact électronique (IE)
Ionisation Chimique (IC)
Les « ionisations douces » génèrent
des ions moléculaires qui sont
stables et qui ont des durées de vie
suffisantes pour traverser
l’analyseur, arriver jusqu’au
détecteur, et donc être mesurés.
Ionisation par électronébullisation
(ESI)
Désorption Ionisation Laser assistée
par Matrice (MALDI)
Sources d’ions
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Pic Moléculaire
m/z
Nombre d’ions
m/z
Pic Moléculaire
Fragments
Nombre d’ions
Spectrométrie de masse : définitions
Informations La masse moléculaire d’un composé La masse des fragments de ce composé (empreinte) Une mesure de la quantité
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Echantillon Source
d’ions Mass
Analyzer Detector Signal
Molécules en phase Gazeuse
CI / EI
Sources d’ions
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Spectrométrie de Masse
Ionisation en phase gazeuse
12/01/2018
Echantillon Source Mass Analyzer
Detector Signal
ESI APCI
Ionisation en phase liquide
Sources d’ions
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Techniques d’ionisation de surface
Sample Ion
Source Mass
Analyzer Detector Signal
http://histoloblog.blogspot.co.uk/
Surface solide
(Tissues) ?
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Sources d’ions
Sample Ion
Source Mass
Analyzer Detector Signal
DESI Surface solide
(Tissues)
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Sources d’ions
Techniques d’ionisation de surface
Ifa DR et al. Clin chem 62:111-123
Sample Ion
Source Mass
Analyzer Detector Signal
MALDI Surface solide
(Tissues)
http://kenickbiochem09.wikispaces.com/How+does+MALDI-TOF+work%3F
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Spectrométrie de Masse 23
Sources d’ions
Techniques d’ionisation de surface
Sample Ion
Source Mass
Analyzer Detector Signal
SIMS Surface solide
(Tissues)
Jiangjiang Liu et al. Anal Bioanal Chem. 2013 Jul; 405(17): 5645–56533
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Sources d’ions
Techniques d’ionisation de surface
Sample Ion
Source Mass
Analyzer Detector Signal
REIMS In vivo Tissues
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Sources d’ions
Techniques d’ionisation de surface
Balog J et al. Angew Chem Int Ed Engl 2015 Sep 14;54(38):11059-62
Ionisation par Electrospray (ESI)
Royal Society of Chemistry
Sources d’ions
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Q : Déflexion par un champ quadripolaire
IT : Confinement dans un piège à ion (Ion Trap)
TOF : Mesure d’un temps de vol (Time Of Flight)
FT-ICR : Résonnance Cyclotronique d’Ions à
Transformée de Fourrier
Différents types d’analyseurs.
Principes physiques différents, mais tous mesurent des valeurs m/z.
Un vide suffisant indispensable pour que les ions puissent atteindre le
détecteur.
L’analyseur de masse (rapports m/z)
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Caractéristiques génériques des analyseurs
L’analyseur des rapports m/z
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Quadripôle Piège à ions Q-TOF OrbiTrap FTMS
Justesse (ppm) 100 100 <10 <5 <5
Résolution 3000 - 5000 4000 - 2000 10 000 - 60 000 100 000 –
240 000
750 000 -
2 500 000
Gamme (m/z) < 4000 6000 20 000 10 000 10 000
Vitesse de
balayage
~ second ~ second milliseconds ~ second ~ second
Tandem MS MS2 (QQQ) MSn MS MS2 MSn
L’analyseur quadripolaire
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http://www.chemicool.com/definition/quadrupole_mass_spectrometry.html
L’analyseur quadripolaire
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Mode SIM (Single Ion Monitoring)
342 Da
342.1 Da
342.12 Da
342 Da
342.1 Da
342.13 Da
Sucrose Coniferine
Spécificité et résolution de l’analyseur
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3-Phenoxypropionic acid Formule : C9H10O3
Tropic acid Formule : C9H10O3
Isopenol Formule : C9H10O3
166.0630
166.0630
166.0630
Spécificité : Quand la résolution ne suffit plus !
32 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
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3-Phenoxypropionic acid Formule : C9H10O3
Tropic acid Formule : C9H10O3
Isopenol Formule : C9H10O3
150.0310
93.0331
103.0550
Spécificité : Quand la résolution ne suffit plus !
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MS 1 Fragmentation MS 2
Trier les
molécules
Casser les
molécules
Trier et compter
les pièces
2
1
1
2
1
1
Concept 6 : spectrométrie en tandem
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Fragmentation Moléculaire
Parent selection m/z = 166
Collision-induced dissociation (CID)
Fragment selection m/z = 103
Quadrupole (Q1)
Quadrupole (Q2)
Spécificité : Quand la résolution ne suffit plus !
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Analyseurs de masse à basse résolution mais multiples
Modified from : http://www.mrmatlas.org/mrmassays.php
Sélection ion Parent m/z = 166
Collision-induced dissociation (CID)
Sélection ion Fragment m/z = 103
Quadripôle (Q1)
Quadripôle (Q2)
Spécificité : Quand la résolution ne suffit plus !
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Les modes d’acquisition MS/MS
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Les modes d’acquisition MS/MS
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Couplage avec les méthodes séparatives
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Spectrométrie de Masse
Ajouter une 2ème dimension à l'analyse MS
Maximiser la spécificité : la séparation d'espèces moléculaires de masse
similaire ou identique dans les Matrices complexes
Critères supplémentaire pour l'identification moléculaire (tR)
Améliorer la sensibilité (Meilleur rapport Signal/Bruit)
Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00
%
0
100
ACD_120307_NestleP1_NEG_QC01_minusb03 TOF MS ES- TIC
9.03e4
3.76212.0065
2.98261.0087
1.75191.02210.73
149.0142 1.90129.0311
3.85212.0049
4.56187.0133
5.29204.0728
5.64186.1170
8.61371.2094
6.44415.1971
6.82569.3440
8.81344.1531
Time (minutes)
m/z Total signal
intensity
Profile LC-MS d’un échantillon urinaire
40 12/01/2018 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse
Couplage avec les méthodes séparatives
Mobilité ionique et SM
41 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Chouinard CD, Wei MS, Beekman CR, Kemperman RH, Yost RA. Ion Mobility in Clinical Analysis: Current Progress and
Future Perspectives. Clin Chem. 2016 Jan;62(1):124-33
Une dimension séparative supplémentaire !!
Mobilité ionique et SM
42 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Chouinard CD, Wei MS, Beekman CR, Kemperman RH, Yost RA. Ion Mobility in Clinical Analysis: Current Progress and
Future Perspectives. Clin Chem. 2016 Jan;62(1):124-33
Séparation des isomères !!
Analyse multidimensionnelle
43 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
C1
C4
C3
C2
Concentration Area
A1
A2
A3
A4
C1 C2 C3 C4
A1
A2
A3
A4
Concentration
Air
e d
e p
ic
Courbe de calibration
Calibration sans standard interne
Quantification / Etalonnage Externe
12/01/2018 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 44
C1
C4
C3
C2
Concentration Aire
A1
A2
A3
A4
C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS
A1/AIS
A2 /AIS
A3 /AIS
A4 /AIS
Concentration de l’analyte /
Concentration du standard interne
Air
e d
e l’a
naly
te /
Air
e d
u s
tandard
inte
rn
Courbe de calibration Analyte Standard
Interne
CIS
CIS
CIS
CIS
AIS
AIS
AIS
AIS
Calibration avec standard interne
12/01/2018 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 45
Quantification / Etalonnage interne
Le résultat n’est pas affecté par les fluctuations des volumes injectés.
10 µL injectés
9 µL injectés
CX / CIS
AX / AIS
X IS
X IS
Même
ratio
Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3 Spectrométrie de Masse
46 14/01/2016
Quantification / Etalonnage interne
Avantages du standard interne
47
Rendement100%
CX / CIS
X IS
X IS
Le résultat n’est pas affecté par le rendement d’extraction et de traitement d’echantillon (Dérivatization).
Avantages du standard interne
Rendement90%
AX / AIS
Même
ratio
Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3 Spectrométrie de Masse
14/01/2016
Quantification / Etalonnage interne
La spectrométrie de masse
Applications cliniques
48 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Applications : Hormonologie
49 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Applications : Protéines
50 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Sylvain et al. Clinica Chimica Acta Volume 467, April 2017, Pages 51-58
Applications : MHM / Acides aminés
51 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Séparation chromatographique
(LC)
Détection MS/MS Quantification
Applications : MHM / Acides organiques
52 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Séparation chromatographique
(GC)
Détection MS
Identification
(Bases de Données)
Quantification
Applications : MHM / Acides organiques
53 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Applications : MHM / Acylcarnitines
54 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Introduction directe
ou
Séparation chromatographique
(LC)
Détection MS
ou
MS/MS
Profile
Quantification
Ion précurseur
TransitionsMRM
55 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Sci Transl Med 17 July 2013: Vol. 5, Issue 194, p. 194ra93
Applications : Diagnostic en temps réel
56 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
The iKnife – Real time mass spectrometry based diagnosis
Sci Transl Med 17 July 2013: Vol. 5, Issue 194, p. 194ra93
Applications : Diagnostic en temps réel
57 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
The iKnife – Real time metabolomics
Sci Transl Med 17 July 2013: Vol. 5, Issue 194, p. 194ra93
Applications
Applications
58 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Example Oncologie
Imagerie Anatomie Pathologique : iKnif
Applications : Biologie Délocalisée (POCT)
59 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Ferreira CR, Yannell KE, Jarmusch AK, Pirro V, Ouyang Z, Cooks RG (2016) Ambient Ionization Mass Spectrometry for Point-of-Care Diagnostics and
Other Clinical Measurements. Clinical chemistry 62:99-110
Applications
60 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
Mobility Ionique : BreathOmics
Bos LD, Sterk PJ, Fowler SJ. Breathomics in the setting of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. J Allergy Clin Immunol. 2016 Oct;138(4):970-976
Conclusion
61 Dr. Abdellah TEBANI. DES Biochimie G3
Spectrométrie de Masse 12/01/2018
La spectrométrie de masse est une technique qui permet de mesurer
les molécules dans la phase gazeuse
Un spectromètre de masse possède trois parties principale :
la source d'ions (ionisation)
analyseur de masse
détecteur
Analyseurs de masse varient en spécificité, la sensibilité, coût et
facilité de utilisation
Choisis en fonction de des applications souhaitées
Formation technique spécifique ++++++
Merci