Spektrofotometri visible disebut juga spektrofotometri sinar tampak. Yang dimaksud

sinar tampak adalah sinar yang dapat dilihat oleh mata manusia. Cahaya yang dapat dilihat oleh

mata manusia adalah cahaya dengan panjang gelombang 400-800 nm dan memiliki energi

sebesar 299–149 kJ/mol.

          Elektron pada keadaan normal atau berada pada kulit atom dengan energi terendah disebut

keadaan dasar (ground-state). Energi yang dimiliki sinar tampak mampu membuat elektron

tereksitasi dari keadaan dasar menuju kulit atom yang memiliki energi lebih tinggi atau menuju

keadaan tereksitasi.

           Cahaya yang diserap oleh suatu zat berbeda dengan cahaya yang ditangkap oleh mata

manusia. Cahaya yang tampak atau cahaya yang dilihat dalam kehidupan sehari-hari disebut

warna komplementer. Misalnya suatu zat akan berwarna orange bila menyerap warna biru dari

spektrum sinar tampak dan suatu zat akan berwarna hitam bila menyerap semua warna yang

terdapat pada spektrum sinar tampak. Untuk lebih jelasnya perhatikan tabel berikut.

Panjang gelombang

(nm)

Warna warna yang

diserap

Warna komplementer

(warna yang terlihat)

400 – 435 Ungu Hijau kekuningan

435 – 480 Biru Kuning

480 – 490 Biru kehijauan Jingga

490 – 500 Hijau kebiruan Merah

500 – 560 Hijau Ungu kemerahan

560 – 580 Hijau kekuningan Ungu

580 – 595 Kuning Biru

595 – 610 Jingga Biru kehijauan

610 – 800 Merah Hijau kebiruan

         Pada spektrofotometer sinar tampak, sumber cahaya biasanya menggunakan lampu

tungsten yang sering disebut lampu wolfram. Wolfram merupakan salah satu unsur kimia, dalam

tabel periodik unsur wolfram termasuk golongan unsur transisi tepatnya golongan VIB atau

golongan 6 dengan simbol W dan nomor atom 74. Wolfram digunakan sebagai lampu pada

spektrofotometri tidak terlepas dari sifatnya yang memiliki titik didih yang sangat tinggi yakni

5930 °C.

Gambar spektronic-20 yang bekerja pada rentang panjang gelombang sinar tanpak

           Panjang gelombang yang digunakan untuk melakukan analisis adalah panjang gelombang

dimana suatu zat memberikan penyerapan paling tinggi yang disebut λmaks. Hal ini disebabkan

jika pengukuran dilakukan pada panjang gelombang yang sama, maka data yang diperoleh makin

akurat atau kesalahan yang muncul makin kecil.

           Berdasarkan hukum Beer absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasi, karena b

atau l harganya 1 cm dapat diabaikan dan ε merupakan suatu tetapan . Artinya konsentrasi makin

tinggi maka absorbansi yang dihasilkan makin tinggi, begitupun sebaliknya konsentrasi makin

rendah absorbansi yang dihasilkan makin rendah. Berikut rumus yang diturunkan dari hukum

Lambert-Beer:

A= a . b . c atau A = ε . b . c

dimana:

            A = absorbansi

            b atau l = tebal larutan (tebal kuvet diperhitungkan juga umumnya 1 cm)

            c = konsentrasi larutan yang diukur

            ε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam molar)

           a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur dalam ppm).

           Secara eksperimen hukum Lambert-beer akan terpenuhi apabila peralatan yang digunakan

memenuhi kriteria-kriteria berikut:

1. Sinar yang masuk atau sinar yang mengenai sel sampel berupa sinar dengan dengan

panjang gelombang tunggal (monokromatis).

2. Penyerapan sinar oleh suatu molekul yang ada di dalam larutan tidak dipengaruhi oleh

molekul yang lain yang ada bersama dalam satu larutan.

3. Penyerapan terjadi di dalam volume larutan yang luas penampang (tebal kuvet) yang

sama.

4. Penyerapan tidak menghasilkan pemancaran sinar pendafluor.

5. Indeks reflaksi larutan tidak tergantung pada konsentrasi. Dimana hukum lamber-beer

tidak berlaku untuk larutan dengan konsentrasi tinggi.

 

        Hubungan antara absorbansi terhadap konsentrasi akan linear (A≈C) apabila nilai

absorbansi larutan antara 0,2-0,8 (0,2 ≤ A ≥ 0,8) atau sering disebut sebagai daerah berlaku

hukum Lambert-Beer. Jika absorbansi yang diperoleh lebih besar maka hubungan absorbansi

tidak linear lagi. Kurva kalibarasi hubungan antara absorbansi versus konsentrasi dapat dilihat

pada Gambar.

Gambar Kurva hubungan absorbansi vs konsentrasi

Faktor-faktor yang menyebabkan absorbansi vs konsentrasi tidak linear:

1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu

larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna.

2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet

dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.

3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau

sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran

sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).

         Zat yang dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri sinar tampak adalah zat dalam

bentuk larutan dan zat tersebut harus tampak berwarna, sehingga analisis yang didasarkan pada

pembentukan larutan berwarna disebut juga metode kolorimetri. Jika tidak berwarna maka

larutan tersebut harus dijadikan berwarna dengan cara memberi reagen tertentu yang spesifik.

Dikatakan spesifik karena hanya bereaksi dengan spesi yang akan dianalisis. Reagen ini disebut

reagen pembentuk warna (chromogenik reagent). Berikut adalah sifat-sifat yang harus dimiliki

oleh reagen pembentuk warna:

1. Kestabilan dalam larutan. Pereaksi-pereaksi yang berubah sifatnya dalam waktu beberapa

jam, dapat menyebabkan timbulnya semacam cendawan bila disimpan. Oleh sebab itu

harus dibuat baru dan kurva kalibarasi yang baru harus dibuat saat setiap kali analisis.

2. Pembentukan warna yang dianalisis harus cepat.

3. Reaksi dengan komponen yang dianalisa harus berlangsung secara stoikiometrik.

4. Pereaksi tidak boleh menyerap cahaya dalam spektrum dimana dilakukan pengukuran.

5. Pereaksi harus selektif dan spesifik (khas) untuk komponen yang dianalisa, sehingga

warna yang terjadi benar-benar merupakan ukuran bagi komponen tersebut saja.

6. Tidak boleh ada gangguan-gangguan dari komponen-komponen lain dalam larutan yang

dapat mengubah zat pereaksi atau komponen komponen yang dianalisa menjadi suatu

bentuk atau kompleks yang tidak berwarna, sehingga pembentukan warna yang

dikehandaki tidak sempurna.

7. Pereaksi yang dipakai harus dapat menimbulkan hasil reaksi berwarna yang dikehendaki

dengan komponen yang dianalisa, dalam pelarut yang dipakai.

          Setelah ditambahkan reagen atau zat pembentuk warna maka larutan tersebut harus

memiliki lima sifat di bawah ini:

1. Kestabilan warna yang cukup lama guna memungkinkan pengukuran absorbansi dengan

teliti. Ketidakstabilan, yang mengakibatkan menyusutnya warna larutan (fading),

disebabkan oleh oksidasi oleh udara, penguraian secara fotokimia, pengaruh keasaman,

suhu dan jenis pelarut. Namun kadang-kadang dengan mengubah kondisi larutan dapat

diperoleh kestabilan yang lebih baik.

2. Warna larutan yang akan diukur harus mempunyai intensitas yang cukup tinggi (warna

harus cukup tua) yang berarti bahwa absortivitas molarnya (ε) besar. Hal ini dapat

dikontrol dengan mengubah pelarutnya. Dalam hal ini dengan memilih pereaksi yang

memiliki kepekaan yang cukup tinggi.

3. Warna larutan yang diukur sebaiknya bebas daripada pengaruh variasi-variasi kecil kecil

dalam nilai pH, suhu maupun kondisis-kondisi yang lain.

4. Hasil reaksi yang berwarna ini harus larut dalam pelarut yang dipakai.

5. Sistem yang berwarna ini harus memenuhi Hukum Lambert-Beer.

Menentukan konsentrasi sampel dengan cara kurva kalibrasi

 

           Konsentrasi sampel dalam suatu larutan dapat ditentukan dengan rumus yang diturunkan

dari hukum lambert beer (A= a . b . c atau A = ε . b . c). Namun ada cara lain yang dapat

digunakan untuk menentukan konsentrasi suatu spesi yang ada dalam suatu larutan yakni dengan

cara kurva kalibarasi. Cara ini sebenarnya masih tetap bertumpu pada hukum Lambert-Beer

absorbansi berbanding lurus dengan konsentrasi.

            Langkah-langkah yang perlu dilakukan dalam penentuan konsentrasi zat dengan kurva

kalibarasi:

1. Maching kuvet: mencari dua buah kuvet yang memiliki absorbansi atau transmitansi

sama atau hampir sama. Dua buah kuvet inilah yang akan digunakan untuk analisis, satu

untuk blanko, satu untuk sampel. Dalam melakukan analisis Maching kuvet harus

dilakukan agar kesalahannya makin kecil.

2. Membuat larutan standar pada berbagai konsentrasi. Larutan standar yaitu larutan yang

konsentrasinya telah diketahui secara pasti. Konsentrasi larutan standar dibuat dari yang

lebih kecil sampai lebih besar dari konsentrasi analit yang diperkirakan.

3. Ambilah salah satu larutan standar, kemudian ukur pada berbagai panjang gelombang.

Hal ini dilakukan untuk mengetahui pada panjang gelombang berapa, absorbansi yang

dihasilkan paling besar. Panjang gelombang yang menghasilkan absorbansi paling besar

atau paling tinggi disebut panjang gelombang maksimum (lmaks).

4. Ukurlah absorbansi semua larutan standar yang telah dibuat pada panjang gelombang

maksimum.

5. Catat absorbansi yang dihasilkan dari semua larutan standar, kemudian alurkan pada

grafik absorbansi vs konsentrasi sehingga diperoleh suatu kurva yang disebut kurva

kalibarasi. Dari hukum Lambart-Beer jika absorbansi yang dihasilkan berkisar antara

0,2-0,8 maka grafik akan berbentuk garis lurus, namun hal ini tidak dapat dipastikan.

Misalkan absorbansi yang dihasilkan dari larutan standar yang telah dibuat adalah

Absorbans

i

0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

konsentras

i

2 ppm 4 ppm 6 ppm 8 ppm 10 ppm 12 ppm 14 ppm 16 ppm

Grafiknya adalah

6. Ukurlah absorbansi larutan yang belum diketahui konsentrasinya. Setelah diperoleh

absorbansinya, masukan nilai tersebut pada grafik yang diperoleh pada langkah 5. Misalkan

absorbansi yang diperoleh 0,6. Maka jika ditarik garis lurus konsentrasi sampel akan sama

dengan konsentrasi larutan standar 10 ppm. Maka grafiknya sebagai berikut:

Selain dengan cara diatas konsentrasi sampel dapat dihitung dengan persamaan regresi linear:

persamaan di atas dapat dihitung dengan bantuan kalkulator. Setelah diperoleh persamaan di

atas, absorbansi sampel yang diperoleh dimasukan sebagai nila y sehingga diperoleh nila x. Nilai

x yang diperoleh merupakan konsentrasi sampel yang dianalisis.