spektrofotometrie (uv/vis) · • vis a uv . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000...
TRANSCRIPT
![Page 1: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/1.jpg)
Spektrofotometrie (UV/VIS)Speciální analytická chemie
Luboš Paznocht
![Page 2: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/2.jpg)
• absorpce ultrafialového (UV) a viditelného záření (VIS) zředěnými roztoky molekul
• UV (10-380 nm)
• VIS (380-780 nm)
![Page 3: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/3.jpg)
zdroj elektromag. záření monochromátor
kyveta se vzorkem
detektor
displej spektrofotometru, PC
![Page 4: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/4.jpg)
• princip: měření transmitance (neabsorbované záření)• viditelně barevné vzorky – VIS vlnové délky• některé bezbarvé – UV vlnové délky• Lambert-Beerův zákon
záření ze zdroje primární světlo
vzorekabsorpce
propuštěné zářenísekundární světlo
= +
A = ελ.c.l
ελ . . . . . molární (c=1mol/l) extinkční koeficient daného analytu při dané vlnové délce
c . . . . . koncentrace analytu ve vzorku (konst.)l . . . . . šířka absorbujícího prostředí (konst.)
A = cl
c
ελ
! absorbance je bezrozměrná veličina !
![Page 5: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/5.jpg)
ZDROJE ZÁŘENÍ
• wolframová žárovka (vlnové délky 350 -3000 nm) měřené ve VIS oblasti
• halogenová zářivka (spektrum zasahuje až do UV oblasti)
• deuteriová lampa měření v UV oblasti
![Page 6: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/6.jpg)
VÝBĚR VLNOVÉ DÉLKY
MONOCHROMÁTORY
• vstupující polychromatické záření rozdělí na množství monochromatických paprsků a vybere 1 požadovanou λ
• menší λ větší lom
filtr
monochromátor
hranol
mřížka
mřížka• hustota vrypů dle požadovaných vlnových
délek• IČ oblast . . . 30 – 300 vrypů/mm• VIS a UV . . . 600 – 2 400 vrypů/mm• rentgenová . 10 000 – 100 000 vrypů/mm
![Page 7: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/7.jpg)
Úskalí a pravidla fotometrie
• omezená použitelnost• analyty schopné absorpce elektromag. záření• zředěné roztoky analytů
• VIS oblast – skleněné, plastové kyvety• UV oblast – křemenné sklo
„normální sklo“ K2O, CaO, SiO2
absorpce λ < 350 nm
křeměnné sklo SiO2
![Page 8: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/8.jpg)
• dokonalá čistota kyvet
• polarita rozpouštědel – ! jednorázové plastové kyvety!
polární nepolární
voda methanol ethanol aceton hexan
disperze světla
![Page 9: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/9.jpg)
Volba vlnové délky
kyanidin 3-O-glukosid
systém doplňkových barev
• proměření celého spektra vlnových délek• určení vlnových délek absorpčních maxim• měření absorpce elektromagn. záření jehož vlnová
délka odpovídá absorpčnímu maximu daného analytu -> nejvyšší citlivost
barva doplňková k „té kterou vidíme“
DPPH radikálměření AOx při 515 nm
absorpční spektrum
![Page 10: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/10.jpg)
• měření fixní vlnová délka: výsledek je jediná číselná hodnota, odpovídající koncentraci daného analytu ve vzorku
„1D“ – absorbance při jedné λ v jednom okamžiku
sken = proměření celého spektra vlnových délek (př.: 300-600nm)
výsledek: absorpční spektrum
„2D“ – absorbance ve spektru vlnových délek v jednom okamžiku
DAD (PDA) detektor v kapalinové chromatografii
„3D“ – absorbance ve spektru vlnových délek v průběhu času
![Page 11: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/11.jpg)
absorbance
vlnová délka λ vlnová délka λ
čas
λmax= 445 nm
„vrstevnice na mapě“
![Page 12: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/12.jpg)
abso
rban
ce
čas
chromatogram kalibračního roztoku standardu směsi karotenoidů metoda: HPLC-DAD
![Page 13: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/13.jpg)
Příprava kalibrační křivky
koncentrace STDGLU(µg.ml-1)
A (660 nm)
0 00,1 0,071 0,19
2,5 0,385 0,75
10 1,35
slepý vzorek (blank)
známá koncentrace STD
naměřená A daného STD
naměřená A vzorku
z grafu odečtená koncentrace vzorku
y = ax + b
x
y
![Page 14: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/14.jpg)
• nejedná se o separační metodu • ideálně pokud je výsledná barva (absorbance) dána přítomností jediné látky
př.: určení přesné koncentrace roztoků analytických standardů
• v případě směsých extraktů kvantifikace např. jako ekvivalent jednoho urč. analytu
luteinu (karotenoidy)
kya 3-O-Glu (anthokyany)
gallové k. (polyfenoly)
trolox = syntetický ve vodě rozpustný analog vit. E (antioxidační aktivita)
• pro stanovení jednotlivých látek ve směsi je nutno použít některou ze separačních analytických metod (LC, GC, …)
![Page 15: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/15.jpg)
Anthokyanidiny• hojně rozšířená rostlinná barviva (borůvky, ostružiny, červené zelí, černý rybíz,
víno, brambory, pšenice, rýže, kukuřice …)
• výskyt v podobě glykosidů (tzv. anthokyanů)
• antioxidanty
• barva je dána: druhem anthokyanidinu (kyanidin, delfinidin, malvidin, …)
typem sacharidu (glukosid, rutinosid, galaktosid, ..)
pH prostředí
![Page 16: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/16.jpg)
pH < 3,5 <7> 11
pH <1,0 barva červenáflavyliová sůl
pH 4,0-4,5bezbarvékarbinolovápseudobáze
pH 4,5-7,5purpurováchinoidní báze
pH 7,5-8,0modráanion
pH > 8,0intenzity modrétvorba chalkonužlutá
![Page 17: Spektrofotometrie (UV/VIS) · • VIS a UV . . . 600 –2 400 vrypů/mm • rentgenová . 10 000 –100 000 vrypů/mm. Úskalí a pravidla fotometrie • omezená použitelnost •](https://reader034.vdocuments.pub/reader034/viewer/2022042319/5f08d6617e708231d423f67d/html5/thumbnails/17.jpg)