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spettroscopia di
assorbimento e fluorescenza
laura d’alfonso @ Unimib
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assorbimento e colori
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assorbimento molecolareuna molecola può assorbire una radiazione (λ) solo se nella molecolaesiste una transizione di corrispondente energia
λ=ν=
hchE
c = 3x108 m/sech = 6.63x10-34 Jsec
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la radiazione elettromagnetica
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pigmenti naturali
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la legge di Beer - Lambert
• variazioni dei coefficienti di assorbimento ad alte concentrazioni (>10mM)a causa delle interazioni elettrostatiche tra molecole vicine;
• scattering di luce (torbidità, particelle in sospensione, ~ 1/λ4);• contributi di fluorescenza o fosforescenza;• variazioni di indice di rifrazione ad alta concentrazione;• spostamento degli equilibri chimici in funzione della concentrazione;• contributi non monocromaticità (più affidabile il massimo della banda);• luce di fondo.
I0 I
cammino ottico l
sostanzaconcentrazione c
0II T arasmittanzt =
cl IIlog logT- A 0
ε=
−==
deviazioni:
250 300 350 400 450 5000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4as
sorb
anza
lunghezza d'onda
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strumentazione
Assorbanza (A) A = log10 (I0/I)
A=3 I0 = 1000 IA=2 I0 = 100 IA=1 I0 = 10 I
% Transmission (%T) %T = I/IoA = log10 (1/T)
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I0 Iz II-dI
dzz l
significato fisicoN = c NAV /1000 = molecole/cm3
r = raggio molecole
P = probabilità assorbimento luce incidente
σ = Pπr2 = sezione d’urto
A
dz N IdI z σ−= dz N IdI
σ−=
∫∫ σ−=l
0
I
Idz N
IdI
0l N IlnIln 0 σ−=−
l c /1000)(N l N IIln AV0
σ=σ=
−
=
−
00 II2.303log-
IIln
l c 03/1000)/2.3(N IIlog- AV0
σ=
l c A IIlog- 0
ε==
03/1000)/2.3(N AVσ=ε
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I0 Iz II-dI
dxz l
significato fisicoN = c NAV /1000 = molecole/cm3
σ = sezione d’urtoA
dx N IdI σ−=
l N IlnIln 0 σ−=−
l c /1000)(N l N IIln AV0
σ=σ=
−
=
−
00 II2.303log-
IIln
l c 03/1000)/2.3(N IIlog- AV0
σ=
l c A
IIlog- 0
ε==
03/1000)/2.3(N AVσ=ε
3x10910-29scattering Raman
3x1010-19infrarosso
3x10410-16molecole
3x10810-12assorbimento atomi
ε(M-1cm-1)
σ(cm2)
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1 GM = 10-50 cm4sec
assorbimento multi-fotoni
10-84 cm6sec2
www.drbio.cornell.edu/MPE
σ2 ÷ σ1 ∆x ∆t
∆x ≈ σ1 ≈ 10-17–10-16 cm2
∆t ≈ 10-16 sec
σn ÷ σ1n ∆tn-1
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alcune sezioni d’urto a 2 fotoni
sonde convenzionali
indicatori del calcio
proteine fluorescenti
sezione d’urto a due fotoni
il picco di assorbimento si trova spesso ad una λ doppia rispetto al
picco a singolo fotone..
es.: cumarina
.. e spesso no!
es.: rodamina
assorbimentosingolo fotone(asse x per 2)
probabilitàassorbimento
2 fotoni
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responsabili assorbimento nelle proteine..
Wavelength (nm)
E x
10-
4
1. alfa elica (pH 11, 25°C)
2. random (pH 6, 25°C)
3. beta sheet (pH 11, 52°C)
Wavelength (Å)
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.. e negli acidi nucleici
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D. Hamdane et al, J. BIOL. CHEM Vol. 278, No. 51, pp. 51713–51721, 2003
TNB anione ε412 =13.6 mM-1 cm-1
analisi della reattivita’ dei gruppi SH via DTNB5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)
neuroglobina umanacitoglobina umanacitoglobina zebrafish
mioglobina
TNBS-STNB+SCys STNB+TNBS-SCys
TNB carbossilato ε420 = 190 mM-1 cm-1
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la luce puo’ indurre transizionitra gli stati elettronici di una molecola
molecola nellostato fondamentale
molecola nellostato eccitato
fotone
fotone
fluorescenza di biomolecole
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diagramma di Jablonskiassorbimento 10-15 sfluorescenza 10-12-10-7 sfosforescenza 10-2-101 s
NRR
R
qciicR
R
kkk
)Q(kkkkk
+=
+++=φ
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Stokes shiftl’emissione avviene sempre dal più basso
stato vibrazionale di S1 (conversione interna)
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regola dello specchio
lo spettro di emissioneè un’immagine specularedello spettro di assorbimento
i livelli S0 e S1 presentanostrutture vibrazionali simili
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regola di Kasha
lo spettro di fluorescenza è indipendente dallalunghezza d’onda di eccitazione
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1kk
kRNRR
R <ττ
=+
=φ
kR
…
emabs PP)(F ⋅÷λ
d)(f ⋅λ⋅φ
II0 −
Cl)(303.20
sabeII λε−=
[ ]Cl)(303.21II sab0 λε−=
se εCl < 0.05
0sab0 ClI)(303.2II λε=−
KIC)(f)()(F 0abs ⋅⋅⋅λ⋅φ⋅λε=λ
linearenellaconcentrazione
non è una misura assoluta
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strumentazione
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parametri sperimentali
lampada appropriata per l’intervallo di lunghezze d’ondadi interesse
correzione per lo spettrodella lampada
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parametri sperimentali
ampiezza fenditure monocromatore
risoluzione spettrale
scelta accurata dei filtri di eccitazione ed emissione
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• spettri (effetti circondario)
• tempi di vita della fluorescenza
• polarizzazione (orientazione e dinamica)
• trasferimento eccitazione (distanze -> dinamiche)
• localizzazione della fluorescenza
proprietà misurabili con la fluorescenza
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fluorofori: intrinseci o sintetici?
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fluorofori intrinsecifenilalanina
tirosinatriptofano
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studio del folding1. apoazurin2. ribonuclease T13. staphylococcal nuclease4. glucagon
Eftink MR, Methods Biochem Anal, 1990.
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lactate dehydrogenase
mutazioni tyr-trp
Smith CJ et al., Biochemistry, 1991.
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human antithrombin
PGW Gettings, Univ Illinois
trpacidic residueshydrophobic res
Mehager JL et al., J Biol Chem, 1998.
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fluorofori estrinseci
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eccitazione 1 vs 2 fotoni
Xu C et al., PNAS USA, 1996.
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eccitazione simultaneaXu C et al., PNAS USA, 1996.
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fluorofori sinteticila famiglia “Alexa”..
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..fluorofori per tutti i gusti!
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la famiglia “Cy..”
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titolazione raziometrica del calcio
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fluorofori sensibili al pHsonda eccitazione emissione
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Alexa 488 - actin (Ar ion 488 line)Texas Red-X - lectin ( green helium-neon 543 line)Hoechst 33342 - nucleus. (violet diode 405 line)
riconoscere i componenti cellulari..
Rat Diaphragm Smooth Muscle Tissue
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Rat Brain Hippocampus Sagittal Thin (8-Micrometer) Section
Alexa 568 - vimentin intermediate filamentAlexa 488 - glial fibrillary acidic proteinDRAQ5 - nucleus
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Adherent Rat Thoracic Aorta Smooth Muscle Cell
Alexa 568 - tubulinSYTOX Green - nucleusAlexa 350 - actin
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Adherent Rat Kangaroo Kidney Epithelial Cell
Cy2 - cytokeratinMitoTracker Red CMXRos - mitochondrial network DAPI - nucleus
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Adherent Normal Tahr Ovary (HJ1.Ov) Epithelial Cell
Alexa Fluor 488 - actinMitoTracker Red CMXRos - mitochondriaHoechst 33342 - nucleus
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proteine fluorescenti
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Opossum Kidney Cortex Epithelial Cells (OK Line)
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Human Cervical Adenocarcinoma Cells (HeLa Line)