ปญหาพเศษปรญญาตร สาขาวชาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร

เรอง การประเมนความสมพนธทางพนธกรรมของฟกทองพนธผสมเปดดวย SRAP marker Genetic evaluation of open pollinated pumpkin cultivars using SRAP marker

โดย

นางสาวปณาล ภวรกลชย

ควบคมและอนมตโดย

วนท…….เดอน……………….พ.ศ……..… (อ.ดร.อญมณ อาวชานนท) วนท…….เดอน……………….พ.ศ……..… (อ.ดร.บบผา คงสมย)

ค านยม

ขอขอบพระคณอาจารย ดร.อญมณ อาวชานนท และอาจารย ดร.บบผา คงสมย อาจารยทปรกษาปญหาพเศษ ในความกรณาใหความร ค าแนะน า และค าปรกษาทมประโยชนในการท าปญหาพเศษ ขอขอบพระคณในความเอาใจใสดแลอยางดยง อกทงยงกรณาชวยตรวจทานแกไขปญหาพเศษฉบบนใหเสรจสมบรณ

ขอขอบคณ พ ๆ ในหองปฏบตการปรบปรงพนธพชและเทคโนโลยชวภาพ และพๆ ประจ าแปลงทดลอง ภาควชาพชสวนมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทคอยใหความชวยเหลอ ใหค าปรกษา ใหค าแนะน า และการเอาใจใสทดมาโดยตลอด

ขอขอบคณ ส าขา เทค โน โล ย ช วภาพทางกา ร เ กษตร คณะ เกษตร ก า แพงแสน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน ทใหการสนบสนนทนส าหรบการท าปญหาพเศษ

ขอขอบคณบดา มารดา และญาตพนองทคอยอบรมเลยงด มอบสงด ๆ ให และคอยใหค าปรกษาในทก ๆ เรอง

และสดทายนขอขอบคณคณะเพอนทก ๆ คน ทคอยชวยคด ใหขอเสนอแนะ เตอนสต ใหก าลงใจ และคอยรวมทกขรวมสขเสมอมา ท าใหขาพเจาสามารถผานพนอปสรรคในครงนมาไดดวยด

ปณาล ภวรกลชย

มนาคม 2555

การประเมนความสมพนธทางพนธกรรมของฟกทองพนธผสมเปดดวย SRAP marker

นางสาวปณาล ภวรกลชย

บทคดยอ — ฟกทอง (pumpkin) เปนพชผกทมคณคาทางอาหารสงโดยเฉพาะอยางยงมปรมาณเบตาแคโรทนและวตามนเอสงซงเปนสารส าคญทเปนประโยชนตอผบรโภค ฟกทองในทองตลาดสวนใหญใชในการบรโภคผลสด แมวาฟกทองพนธการคาจะมหลายพนธ แตลกษณะทางสณฐานวทยาฟกทองในประเทศไทยมความใกลเคยงกน ดงนน จงเปนทมาของการประเมนความสมพนธทางพนธกรรมของฟกทองพนธผสมเปดเพอน ามาใชเปนขอมลพนฐานในการปรบปรงพนธตอไป ในการศกษาครงนเปนการตรวจสอบความแตกตางของฟกทองพนธผสมเปดจ านวน 14 พนธ พนธลกผสม 4 พนธ และพนธพนเมอง 2 พนธ ดวยเทคนค Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP) ใชไพรเมอรจ านวน 10 คไพรเมอร พบวา เกดความแตกตางของแถบดเอนเอรวมทงหมด 47 แถบ น าลายพมพดเอนเอทไดมาวเคราะหคาสมประสทธความเหมอนแบบ Dice similarity coefficient และจดกลมดวยวธ UPGMA (Unweighted pair group method with arithmetic average) โดยใชโปรแกรมส าเรจรป NTSYSpc-version 2.01e พบวามคาความเหมอนระหวาง 0.63-0.93 ทคาดชนความเหมอนเฉลย 0.812 สามารถจดกลมฟกทองออกเปน 3 กลม และ 5 พนธทไมสามารถจดกลมได โดยกลม 1 จะเปนฟกทองพนธการคาทงทเปนพนธผสมเปดและพนธลกผสม ถกจดอยในกลมเดยวกนจ านวน 11 พนธ กลม 2 ม 2 พนธเปนฟกทองทมผลใหญ ผวเปนหนงคางคก ทนโรคไดด ตนและใบมขนาดใหญ กลม 3 ม 2 พนธ คอ ฟกทองลายขาวตอกและหนงคางคก ทมทรงผลทคลายกนตางกนเพยงผวผลเทานน สวนฟกทองจ านวน 5 พนธทไมเขากลม คอ ฟกทอง Top A, หนงคางคกฟกทอง A, นพเกา, Japan-1 และ First test-764 ซงจากการจดกลมฟกทองดงกลาวพบวาฟกทองพนธผสมเปดทางการคาในปจจบนมความใกลเคยงกนทางพนธกรรมสง ค าส าคญ : ฟกทอง, SRAP marker ปญหาพเศษ : ปรญญาตร สาขาเทคโนโลยชวภาพทางการเกษตร คณะเกษตร ก าแพงแสน

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร อาจารยทปรกษา : อ.ดร.อญมณ อาวชานนท ปทพมพ : 2555 จ านวนหนา : 22

Genetic evaluation of open pollinated pumpkin cultivars using SRAP marker

Miss Panalee Pooworakulchai Abstract

Pumpkin is a high β–carotene and vitamin A vegetable. In Thailand, pumpkin is grown for both fresh vegetable and processing. Although there are several commercial pumpkin cultivars, the characteristics are very similar. Therefore, the hypothesis was that pumpkin cultivars in Thailand are similar genetic base. In this study, the objective is to evaluate the genetic diversity of 20 pumpkin cultivars including 14 open pollinated cultivars, four F1 hybrid cultivars, and two landrace cultivars using Sequence Related Amplified Polymorphism (SRAP). From 25 primers, 10 primers amplified 47 polymorphic band and Dice similarity coefficients are between 0.63 and 0.93. At threshold 0.812 similarity coefficient, 20 pumpkin cultivars were grouped into 3 groups and 5 pumpkin cultivars (Top A, pumpkin-nungkangkok A, Noppakoa, Japan 1 and First test 764) were clustered as outgroup. Group 1 contained 11 cultivars that are Pumpkin, Pumpkin A, Tongumpai 426, Jinda 2003, Karton, Olarn, Buengkan,Koatong 573, Tesukubot, Kangkok and China 1. Group 2 is a group of pumpkin with rough skin, disease tolerance and big leaves and stem. Group 3 include 2 cultivars that are Lai Koatok and Nungkangkok cultivars. Key words : Pumpkin, SRAP marker Degree : Bachelor of Science, Program in Agricultural Biotechnology, Faculty of Agriculture Kamphaeng Saen, Kasetsart University Advisor : Anyamanee Auvuchanon, Ph. D. Year : 2012 Page : 22

สารบญ

เรอง หนา สารบญ -1- สารบญตาราง -2- สารบญภาพ -3- ค าน า 1 วตถประสงค 3 ตรวจเอกสาร 4 อปกรณและวธการทดลอง 8 ผลการทดลอง 17 วจารณผลการทดลอง 19 สรปผลการทดลอง 20 เอกสารอางอง 21

สารบญตาราง

ตารางท หนา

1 ตารางตวอยางฟกทอง 20 ตวอยาง 9

2 ตารางแสดงไพรเมอรทใช 13

3 ตารางแสดงความเขมขน และปรมาณสารทใชในปฏกรยาพซอาร 14

4 ตารางแสดงขนตอนของปฏกรยาพซอาร 14

สารบญภาพ

ภาพท หนา

1 Dendrogram ทแสดงการจดกลมของฟกทอง 18

ค าน า

ฟกทอง (Pumpkin) ชอวทยาศาสตรวา Cucurbita moschata Decne อยในวงศ Cucurbitaceae นยมปลกกนอยางแพรหลาย เพราะเปนพชทปลกงาย สามารถขนไดดในดนเกอบทกประเภท โดยเฉพาะประเทศไทย แตจะใหผลผลตดในบางฤดเทานน โดยเฉพาะเขตทมอากาศเยน ดนทมการระบายน า และมอาหารพชสมบรณ จะท าใหผลดยงขน

ฟกทอง เปนพชผกทมราคาถก มวตามนเอสง ชวยบ ารงผวพรรณและถนอมสายตา น ามา

ท าอาหารไดหลายชนด เชน ยอดออนน ามาลวกจมน าพรก หรอใสแกงเลยง แกงสมเปรอะ แกงสม เปนตน เนอใชท าอาหารไดทงคาวหวาน ทงผด แกง ขนม และใชเปนอาหารเสรมในเดกเลก รวมทงดดแปลงมาใชโรยหนาหรอปนในขนมตางๆ ท าใหมสสนสวยงาม และมคณคาทางอาหารมากยงขน ในผลของฟกทองประกอบดวย เบตาแคโรทนสง (สเหลอง) คารโบไฮเดรต โปรตน แคลเซยม ฟอสฟอรส เหลก วตามนเอ (มมากทสด) วตามนบ 1 วตามนบ 2 ไนอาซน และวตามนซ สวนยอดฟกทอง มคารโบไฮเดรต โปรตนเหลก มแคลเซยมและฟอสฟอรสสงกวาในผลฟกทอง และมวตามนเชนเดยวกนเนอในเมลดฟกทอง มสารควเคอรบตน (cucurbitin) ซงมฤทธถายพยาธ นอกจากนนยงม เปปโนไซด (pepponosiide) กรดเอลลาจก (ellagic) และกรดควเคอรบก (cucurbic) ในเมลดฟกทอง มน ามนรอยละ 40 มโปรตนและฟอสฟอรสสง สวนในดอกฟกทองจะมวตามนเอ แคลเซยม และฟอสฟอรส

ในประเทศไทยมการบรโภคฟกทองเปนจ านวนมาก ไมวาจะเปนเมลดฟกทองหรอผลฟกทอง

สามารถน ามาบรโภค น าไปท าอาหาร แปรรป เวชภณฑ และประดบตกแตง ซงจากการศกษาพบวาประเทศไทยมการสงออกฟกทองตงแตป 2549 มปรมาณและมลคาการสงออกเพมขนทกปจนกระทงปจจบน จงถอไดวาฟกทองเปนพชเศรษฐกจทส าคญอกอยางหนง

การใชเครองหมายดเอนเอ แบงตามการตรวจสอบได 2 วธ คอ (1) วธไฮบรไดเซชน

(hybridization) ไดแก RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (2) วธการตรวจสอบโดยการเพมปรมาณดเอนเอในหลอดทดลองดวยปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส PCR ไดแก RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Rereat), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) และ SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism) เปนตน เนองจากใหผลทแนนอนและน าไปสการศกษาทางพนธศาสตรในขนตอไป เชน การท าแผนทยน การปรบปรงพนธ

ในการศกษาความหลากหลายของพนธกรรม (genetic diversity) ของฟกทอง จงเลอกใชวธการตรวจหาเครองหมายดเอนเอดวยเทคนค SRAP เพราะเปนเทคนคทสามารถท าไดงาย สะดวก รวดเรว ใชดเอนเอตงตนนอย มความคงตวโดยใหผลสม าเสมอและใหผลคงเดมเมอท าการทดลองซ า สามารถเปรยบเทยบความแตกตางทางพนธกรรมไดอยางมประสทธภาพ จงคดวาเทคนค SRAP จะสามารถน ามาใชศกษาความหลากหลายของพนธกรรม (genetic diversity) ของฟกทองเพอทจะน าไปใชเปนขอมลส าหรบการปรบปรงพนธฟกทองเพอใหมปรมาณผลผลตมากขนและมคณคาทางอาหารสงขนตอไป

วตถประสงค เพอศกษาความหลากหลายทางพนธกรรม (genetic diversity) ของฟกทองพนธผสมเปดทเปนพนธการคาของไทยโดยใชเครองหมายโมเลกล SRAP และศกษาความสมพนธของฟกทองระหวางพนธผสมเปดและฟกทองพนธลกผสมบางพนธ

สถานทท าการวจย ท าการทดลอง ณ แปลงทดลองท 2 และหองปฏบตการปรบปรงพนธพชและเทคโนโลยชวภาพ

ภาควชาพชสวน คณะเกษตรก าแพงแสนมหาวทยาลยเกษตรศาสตร วทยาเขตก าแพงแสน จงหวดนครปฐม

ระยะเวลาทท าการวจย

เดอนมนาคม พ.ศ.2554 – เดอนกนยายน พ.ศ.2554

ตรวจเอกสาร

1. ลกษณะทวไปของฟกทอง ฟกทอง จดเปนผกในตระกลแตงทมถนก าเนดอยในประเทศทางแถบทวปอเมรกา จากประวต

ความเปนมาสบไดวาฟกทองมการปลกมาตงแต 10,000 - 30,000 ป ฟกทองจดเปนพชผกทมการใชประโยชนมายาวนานทสดชนดหนง ส าหรบการปลกฟกทองในประเทศไทยไดมการพฒนามาอยางตอเนอง นยมปลกกนอยางแพรหลาย เพราะเปนพชทปลกงาย สามารถขนไดดในดนเกอบทกประเภท โดยเฉพาะประเทศไทย แตจะใหผลผลตดในบางฤดเทานน โดยเฉพาะเขตทมอากาศเยน ดนทมการระบายน า และมอาหารพชสมบรณ จะท าใหผลดยงขน (ชมรมเผยแพรความรทางการเกษตร, 2554)

ฟกทอง เปนไมเถาเลอยไปตามดน มมอส าหรบยดเกาะ ล าตนอวบน า ใบเดยวรปหาเหลยม มขน

ทง สองดาน ดอกสเหลองรปกระดง ผลฟกทองมดวยกนหลายลกษณะ บางครงเปนผลเกอบกลมกม แตโดยทวไปเปนรปทรงกลมแปน ผวขรขระเลกนอย เมอยงดบเนอคอนขางแขง นอกจากเนอของผลฟกทองจะใชเปนอาหารแลว เมลดฟกทองกใชเปนอาหารวางไดดวย

ฟกทองมกากใยสง อดมดวยวตามนเอและสารตอตานการผสมกบออกซเจนกบเกลอแร และม

“กรดโปรไพโอนค” กรดนท าใหท าใหเซลลมะเรงใหออนแอลง (กฤษฎา, 2533) 2. ลกษณะทางพฤกษศาสตรของฟกทอง

ตน เปนพรรณไมลมลก ทมล าตนเปนเถาเลอยไปตามพนดนและตองการหลกยด ตามล าเถาจะม

มอเอาไวเกาะ เถามขนาดยาว ใหญ และมขนสาก ๆ ปกคลมอย มสเขยว ใบ ออกใบเดยว ตามล าเถา ใบของฟกทองเปนแผนใหญสเขยว แยกออกเปน 5 หยกและมขนสาก ๆ มอ ปกคลมอยทวทงใบ ดอก ออกดอกเดยวตามงามใบ และสวนทยอดของเถา ลกษณะของดอกเปนรปกระดงสเหลอง ในดอกตวเมยเมอบานเตมทแลว จะมองเหนผลเลก ๆ ตดอยทใตดอก ผล มขนาดใหญ ลกษณะเปนพกลมจะมทงทรงแบน และทรงสง เปลอกของผลจะแขง มทงสเขยวหรอสน าตาลแดงกแลวแตชนดของฟกทองนน ๆ เนอในผลสเหลองรบประทานได เมอทานเขาไปแลวจะเปลยนเปนวตามนเอในรางกาย (กฤษฎา, 2533)

3. การปลกฟกทองในประเทศไทย

แหลงปลก ฟกทอง (Pumpkin) ในประเทศไทย มหลายจงหวด แตทปลกมากคอ ศรสะเกษ,

สกลนคร, ขอนแกน, กาญจนบร, ชมพร และฉะเชงเทรา ซงจะทยอยกนใหผลต ออกมาสทองตลาด ท าให

มฟกทองขายตลอดทงป พนทปลกฟกทองในประเทศไทย เปนอตราสวน 2.3% ของพนทปลกผกทงหมดในประเทศ การผลตฟกทองเพมขนจาก 20,963 ตน (ป 2005-2006) เปน 37,915 ตน (ป 2006-2007) คดเปน 80% (กรมสงเสรมการเกษตร, 2551)

4. คณคาทางอาหารและสรรพคณทางยาของฟกทอง

ฟกทอง เปนพชตระกลเดยวกบมะระ ซงแตละสวนของ "ฟกทอง" มสรรพคณและคณคาทาง

อาหารในแตละสวนมากมาย นอกเหนอจากเนอฟกทอง มวตามนเอสง แลวยงมทงฟอสฟอรส แคลเซยม วตามนซ แปง โดยเฉพาะ "เบตาแคโรทน" ซงเปนสารตานอนมลอสระอยในเนอสเหลองของฟกทอง สามารถชวยลดการเกดมะเรง โรคหลอดเลอดหวใจ และโรคหวใจได แถมเบตาแคโรทน ยงชวยตานความชรา ปองกนโรคผวหนง บรรเทาอาการปวดเมอยของขอเขา และบนเอวไดเปนอยางด เปลอกฟกทอง มฤทธทางยามากมาย หากทานฟกทองทงเปลอก จะสามารถกระตนการหลงอนซลนในรางกาย ซงชวยควบคมระดบน าตาลในเลอด ปองกนการเกดเบาหวาน ความดนโลหต บ ารงตบ บ ารงไต บ ารงดวงตา และสรางเซลลใหมทดแทนเซลลทตายไป ใหท างานไดอยางมประสทธภาพ ใบออน มวตามนเอสงเทากบเนอฟกทอง แตมแคลเซยมและฟอสฟอรสสงกวาในเนอ ดอก มวตามนเอ ธาตแคลเซยมและฟอสฟอรส มวตามนซเลกนอย เมลด ประกอบดวยแปง ฟอสฟอรส โปรตนและวตามน รวมทงสารทชอวา "ควเคอรบตน" (cucurbitine) ซงมฤทธในการฆาพยาธตวตดไดด และยงชวยขบปสสาวะ ปองกนการเกดนว มะเรงกระเพาะปสสาวะ นอกจากน น ามนจากเมลดฟกทองยงชวยบ ารงประสาทไดด และยงมกรดอะมโนบางชนดทชวยปองกนไมใหตอมลกหมากของผชายขยายใหญขน และชวยปรบระดบฮอรโมนเพศชายทไดจากลกอณฑะใหอยในระดบปกต ราก น ามาตมน าใชดมแกอาการไอได และยงชวยบ ารงรางกาย ถอนพษของฝนได เยอกลางผล สามารถน ามาพอกแผล แกอาการฟกช า อาการปวด อกเสบได (ดวงจนทร, 2546)

5. ความหลากหลายทางพนธกรรม (Genetic diversity)

ความหลากหลายทางพนธกรรม (genetic diversity) หมายถง ความหลากหลายของยน (gene)

ทมอยในสงมชวตแตละชนด สงมชวตชนดเดยวกนอาจมยนแตกตางกนไปตามสายพนธ ความแตกตางทางพนธกรรมมสาเหตจากการกลายพนธ (mutation) ซงอาจเกดในระดบยนหรอโครโมโซม ในการสบพนธแบบอาศยเพศอาศยกลไก crossing over ท าใหยนเกดการสลบทหรอรวมตวกนใหมแลวถกถายไปสรนตอๆ ไปในประชากร อยางไรกตาม ประชากรของสงมชวตชนดใดชนดหนงจะรวมตวเปนกลม และผสมพนธกนภายในกลมเผาพนธของตนท าใหเกดการถายทอดยนเกดขนเฉพาะภายในประชากรสปชสเดยวกน กลมยนของประชากรของสงมชวตเดยวกนเรยกวา gene pool การถายยนแตละรนตองประสบ

กบปญหาเรองววฒนาการ (evolutionary forces) เชน การคดเลอกโดยธรรมชาต การอพยพ ความผนแปรทางพนธกรรม เปนตน ท าใหโครงสรางทางพนธกรรมของประชากรในแตละรนเปลยนแปลงไปกอใหเกดความหลากหลายทางพนธกรรมในประชากรตาง ๆ ของสปชส ประชากรของสปชสอาจจะมลกษณะจ าเพาะ (speciation) ในแตละพนทซงสาเหตจากการโดดเดยวทางภมศาสตร (geographic isolation) อนเกดจากการแยกกลมประชากร (splittng) ของสงมชวตโดยสภาพภมศาสตร ซงเปนตวสกดกน ท าใหสงมชวตมการพฒนาการทเฉพาะตวขนมาเปนสปชสใหม โดยการผสมขามพนธหรอผสมกนเองภายใตขอจ ากดทางภมศาสตร ท าใหมความหลากหลายทางพนธกรรมขน (ศานนท, 2552)

6. เครองหมายดเอนเอ (DNA marker)

เครองหมายดเอนเอ คอ เปนต าแหนงดเอนเอบนโครโมโซมในนวเคลยสหรอนอกนวเคลยส ใน

คลอโรพลาสตและไมโคอนเดรยทอาจเกดความแปรปรวนภายในโมเลกลของดเอนเอและมความหลากหลายทสามารถตรวจสอบได โดยแบงการตรวจสอบออกไดเปน 2 วธ คอ

6.1 วธไฮบรไดเซชน (hybridization based DNA markers) เปนการตรวจสอบความแตกตาง

ของต าแหนงจดตดของเอนไซมตดจ าเพาะ (restriction enzyme) โดยอาศยการจบอยางจ าเพาะระหวางโพรบ (probe) และดเอนเอทเราตองการศกษา ซงอาจเปนยนหรอชนสวนของดเอนเอทสนใจกบดเอนเอเปาหมายในจโนม ไดแก เครองหมายโมเลกลชนด RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

6.2 วธการตรวจสอบโดยการเพมปรมาณดเอนเอในหลอดทดลองดวยปฏกรยาลกโซโพลเมอเรส PCR โดยเพมปรมาณดเอนเอบรเวณใด ๆ ทสนใจ โดยอาจเพมปรมาณดเอนเอทต าแหนงเดยวหรอเพมปรมาณดเอนเอพรอมกนหลายต าแหนงกได เปนวธทท าไดสะดวกและรวดเรว เชน RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeat), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) และ SRAP (Sequence Related Amplified Polymorphism) (จ าลองลกษณ, 2546)

ซงเทคนค SRAP เปนเทคนคการตรวจหาเครองหมายดเอนเอ ทพฒนาและคดคนโดย Li and

Quiros (2001) ซงใชวธพซอาร ในการเพมปรมาณดเอนเอ ไพรเมอรทใชม 2 ชนด คอ (1) forward primer มขนาด 17 เบส ปลาย 5' ม core sequence 14 เบส และตอดวยเบสทใชส าหรบคดเลอก (selective base) อก 3 เบส ทางปลายดาน 3' สวนประกอบของ core sequence ม filler sequence 10 เบส ซงสงเคราะหแบบสม ตามดวยเบส CCGG (2) reverse primer มขนาด 18 เบส ปลาย 5' ม core

sequence 15 เบส ทประกอบดวย filler sequence 11 เบส ซงเปนคนละชนดกบ filler sequence ใน forward primer ตามดวยเบส AATT และเบสทใชส าหรบคดเลอกอก 3 เบส ตรวจสอบผลทไดจาก การท าพซอาร ดวยเทคนคอเลกโทรโฟรซส ใน denaturing polyacrylamide gel ซง Li and Quiros ไดใชเทคนค SRAP ในการสรางแผนทยนของ Brassica oleracea L. พบวาสามารถจดกลมยนได เปน 9 กลม เหมอนกบแผนทยนทไดจากเทคนค AFLP นอกจากนยงใชเทคนค SRAP ในการ ตดตามยน BoGLS-ALK ได และจากการหาล าดบนวคลโอไทดของเครองหมายดเอนเอทไดจาก เทคนค SRAP พบวามล าดบเหมอนกบยนททราบแลวถง 45 เปอรเซนต แสดงวามความครอบคลม สวนทเปนยนสง เทคนค SRAP ยงสามารถใชเพมปรมาณดเอนเอในพชชนดอน ไดแก มนฝรง ขาว ผกกาดหอม Chinese cabbage (Brassica rapa L.) rapeseed (Brassica napus L.) กระเทยม แอบเปล (ชชย, 2549)

Ferriol et al. (2001) ไดศกษาความแปรปรวนทางพนธกรรมของฟกทอง Cucurbita maxima จ านวน 8 accession ดวยเครองหมายโมเลกล RAPD จ านวน 11 Primer พบวาสามารถเพมปรมาณ polymorphic band ไดจ านวน 32 แถบ และมคาความเหมอนเทากบ 0.5672 สามารถจดกลมของ Cucurbita maxima ได 3 กลม Ferriol et al. (2004) ใชเครองหมายโมเลกลสองชนดดวย AFLP และ SRAP สามารถแยกกลม Cucurbita moschata จากอเมรกา อเมรกาใต และสเปน Balkaya et al. (2010) ในประเทศตรกไดมการศกษาลกษณะทางสณฐานวทยาใน Cucurbita maxima จ านวน 115 population ท าการจดกลมดวยลกษณะทางดานปรมาณ 14 ลกษณะและลกษณะทางดานคณภาพ 7 ลกษณะ พบวา winter squash ทงหมดถกจดเปน 10 กลม ผลทมลกษณะใกลเคยงกนถกจดอยในกลมเดยวกน วารน (2545) ใชเทคนค SRAP ในการสรางลายพมพดเอนเอ และศกษาความสมพนธทางพนธกรรมของพชในวงศยาง (Family : Dipterocarpaceae) ท าใหสามารถจ าแนกตวอยางทศกษาได 3 กลม คอ กลมยางกราด กลมยางพลวง และกลมยางทคาดวาเปนลกผสม นฤมล (2547) ใชเทคนค SRAP ในการสรางลายพมพดเอนเอของ ยคาลปตสคามาลดเลนซส (Eucalyptus camaladulensis) ยคาลปตสเทเรทคอรนส (E. tereticarnis) และยคาลปตสลกผสมระหวางสปชสทงสอง พบวาเทคนคนสามารถสรางลายพมพดเอนเอทจ าเพาะตอยคาลปตสไดทกตวอยาง และแถบดเอนเอทแตกตางกนน ยงสามารถใชในการตรวจสอบลกผสมระหวางสปชสได

อปกรณและวธการ

อปกรณ

1. ตวอยางฟกทอง ตวอยางฟกทองมทงหมด 20 ตวอยาง ประกอบดวยพนธผสมเปดจ านวน 14 พนธ ดงน Pumpkin, ฟกทองลายขาวตอก, ฟกทองหนงคางคก, ฟกทอง (A), หนงคางคก ฟกทอง A, พนธคางคกแท, โอฬาร, K-โกลดเดน, Tesukubot, พนธคางคก, ฟกทอง Top A, Japan 1, China 1, First test 764, กระโถน และพนธลกผสม (F1) จ านวน 5 พนธ ดงน ขาวตอก 573, บงกาฬ, จนดา 2003, ทองอ าไพ 426 และนพเกา ดงตารางท 1

2. อปกรณและสารเคม 2.1 อปกรณส าหรบการสกด วดคณภาพ และปรมาณดเอนเอ

2.1.1 โกรงบดตวอยาง 2.1.2 เครองเขยาแบบควบคมอณหภม (water bath incubator)

2.1.3 เครองปนเหวยง (microcentrifuge) 2.1.4 ชดแยกขนาดดเอนเอ (gel electrophoresis) ส าหรบ agarose gel

2.1.5 เตาไมโครเวฟ 2.1.6 ตแชอณหภม -20 องศาเซลเซยส 2.1.6 ชดฉายแสงยวและอปกรณถายภาพเจล (Gel Documentation System) 2.1.7 หลอดทดลองขนาด 1.5 มลลลตร

2.2 อปกรณส าหรบการวเคราะห SRAPไดแก ชดแยกขนาดดเอนเอแบบตง ส าหรบ acrylamide gel ไดแก เครองพซอาร ,micropipette, PCR tube

2.3 สารเคมในการท าปฏกรยา 2.3.1 สารเคมทใชสกดดเอนเอ เชน Liquid nitrogen, CTAB, Mercaptoethanol,

Chloroform, Isoamyl alchohol, NaCl, Isopropanol, TE buffer, RNaseA, phenol, CH3COOH, absolute ethanol, 70% Ethanol

2.3.2 สารเคมทใชในการท าปฏกรยา PCR ไดแก DNA, MgCl2, dNTP, Taq DNA polymerase, primer, 10x PCR buffer

2.3.3 สารเคมทใชในการท าปฏกรยา electrophoresis ไดแก 40%Polyacrylamide, 10% APS, TEMED, 5X TBE buffer, Loading buffer (ประกอบดวย 37% formamide, EDTA pH 8.0, 0.1% bromophenol bule, 0.1% xylene cyanol), Silver nitrate (ประกอบดวย silver nitrate,

formamide, water), 10% Acetic acid, Developer (ประกอบดวย sodium carbonate, water, sodium triosulfate,formamide), Bind silane, Clear view

ตารางท 1 รายชอตวอยางฟกทองทใชในการศกษา 20 ตวอยาง

ล าดบท พนธ เครองหมายการคา 1 พนธ Pumpkin เจยไต 2 ฟกทองลายขาวตอก เจยไต 3 ฟกทองหนงคางคก สามเอ 4 ฟกทอง (A) ปลาวาฬ 5 หนงคางคก ฟกทอง A ปลาวาฬ 6 พนธคางคกแท สงโต 7 โอฬาร สามเอ 8 K-โกลดเดน ปลาอวน 9 Tesukubot Bhutan Alpine seed 10 พนธคางคก หวขวาน 11 ฟกทอง Top A ก าไลทองมงกรค

12 Japan 1 Tiwa 13 China 1 Kritsana 14 First test 764 เพอนเกษตร 15 กระโถน Pramote 16 ขาวตอก 573 (F1) ศรแดง 17 บงกาฬ (F1) เจยไต 18 จนดา 2003 (F1) งอบทอง 19 ทองอ าไพ 426 (F1) เจยไต 20 นพเกา นกค

วธการ 1. การเตรยมตวอยาง เพาะเมลดฟกทอง 20 พนธ ปลกลงในถาดหลม รดน าเชา-เยน หลงปลกได 2 สปดาห เกบ

ตวอยางใบฟกทองพนธละ 1-2 ใบ น าไปใสถงพลาสตก แชในน าแขงทนท เพอน ามาสกดดเอนเอ

2. การสกดดเอนเอ น าตวอยางใบฟกทองทเกบมา มาลางท าความสะอาด ตดเปนชนเลกๆ ใสลงในโกรง เตม

ไนโตรเจนเหลว และบดตวอยางใบฟกทองในไนโตรเจนเหลวใหละเอยดจนเปนผงแปง น าตวอยางทบดแลวใสลงในหลอดเซนตรฟวจขนาด 1.5 มลลลตร ทม (2X CTAB buffer 600 ไมโครลตร และ 2-mercaptoethanol 200 ไมโครลตร) ปรมาตร 600 ไมโครลตร ผสมใหเขากนโดยเขยาแรงๆ น าไปบมทอณหภม 60 องศาเซลเซยส นาน 60 นาท เขยาโดยกลบหลอดไปมา 2-3 ครงทกๆ 10 นาท บมทอณหภมหอง นาน 5 นาท เตม chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) 600 ไมโครลตร ผสมใหเขากน โดยกลบหลอดไปมาเบาๆ 2-3 ครง ปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท ดดของเหลวใสสวนบนปรมาตร 450 ไมโครลตรใสในหลอดเซนตรฟวจใหมทเตม NaCl 5 ไมโครลตร และเตม isopropanol ปรมาณ 450 ไมโครลตร หรอ 2 ใน 3 เทาของปรมาณของเหลวทมอยผสมใหเขากนเบาๆ น าไปบมทอณหภม -20 องศาเซลเซยส ขามคน ปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท เทสารละลายใสสวนบนทง ตากตะกอนใหแหงทอณหภมหอง ละลายตะกอนใน (TE buffer 300 ไมโครลตร + RNaseA 2 ไมโครลตร) ปรมาตร 300 ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยสขามคน เตม phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) ปรมาตร 300 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท ดดสวนใสดานบน ปรมาตร 450 ไมโครลตร ใสในหลอดเซนตรฟวจหลอดใหม เตม chloroform: isoamyl alcohol (24 : 1) 450 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท ดดสารละลายใส ปรมาตร 300 ไมโครลตร ใสในหลอดเซนตรฟวจหลอดใหมทม 3M CH3COONa 3 ไมโครลตรอย เตม absolute ethanol ปรมาณ 600 ไมโครลตร หรอ 2 เทาของปรมาณของเหลวทมอย และบมทอณหภม -20 องศาเซลเซยส ขามคน ปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน 15 นาท เทน าสวนใสทง ลางตะกอนดวยเอธานอล 70 เปอรเซนต ปรมาตร 300 ไมโครลตร น าไปปนเหวยงท 13,000 รอบตอนาท นาน 5 นาท เทสวนใสทง ตากใหแหงทอณภมหอง ละลายตะกอนดวย TE buffer ปรมาตร 35 ไมโครลตร เกบดเอนเอทอณหภม -20 องศาเซลเซยสจนกวาจะใชตอไป

3. การตรวจสอบคณภาพดเอนเอ 3.1 การวดปรมาณและคณภาพของสารละลายดเอนเอ วดจากคาการดดกลนแสง

3.1.1 น าสารละลายดเอนเอทละลายอยใน TE buffer 2 ไมโครลตร เจอจางในน า dH2O 98 ไมโครลตร โดยใช dH2O เปนมาตรฐาน (blank)

3.1.2 วดคาการดดกลนแสงของสารละลายดเอนเอทเจอจางแลวทความยาวคลน 260 นาโนเมตร และ 280 นาโนเมตร น าผลทไดมาค านวณความเขมขนของสารละลายดเอนเอจากสตรดงน

3.1.3 ตรวจสอบคณภาพโดยดอตราสวนของคา A260/A280 คาทไดมคาระหวาง 1.8-2.0 แสดงวาดเอนเอทสกดไดนนเปนดเอนเอเกลยวคบรสทธ ถาไดคานอยกวา 1.8 แสดงวามโปรตนปะปนอยในสารละลาย ถาคาทค านวณไดมากกวา 2.0 แสดงวาในสารละลายดเอนเอมอารเอนเอปน

3.2 การวเคราะหและแยกขนาดดเอนเอโดยวธอะกาโรสเจลอเลคโทรโฟรซสชงผงอะกาโรส 1 กรม ใสลงในบฟเฟอร 1XTBE (Tris-base 4.84 กรม, glacial acetic acid 1.15 มลลลตร, 0.5 M EDTA pH 8.0 2 มลลลตร) 100 มลลลตร ละลายผงอะกาโรสดวยความรอน รอใหอณหภมเปน 60 องศาเซลเซยส เทลงในพมพใหเจลหนาประมาณ 3-5 มลลเมตร ปลอยใหอะกาโรสเยนลงจนแขงตวทอณหภมหอง โดยใชเวลาประมาณ 30 นาท ผสมสารละลายดเอนเอกบ 6x loading buffer (ประกอบดวย bromphenol blue 0.25 เปอรเซนต , xylene cyanol 0.25 เปอรเซนต , glycerol 30 เปอรเซนต) ปรมาตร 1 ไมโครลตร ใชสารละลายดเอนเอ 3 ไมโครลตร และน า 2 ไมโครลตร แลวโหลดลงในชองเจลทเตรยมไว ปดฝาเครองและเปดกระแสไฟฟาใหวงผานขวลบไปขวบวก โดยใชกระแสไฟฟา 100 โวลต ประมาณ 30 นาท เมอสโหลดเคลอนทไปไดในระยะทางทเหมาะสมจงปดกระแสไฟฟาน าแผนเจลไปยอมในสารละลาย เอธเดยมโบรไมด (ethidiumbromide 0.5 ไมโครกรมตอมลลลตร) นาน 10-15 นาท ลางแผนเจลดวยน าสะอาด 5 นาท น าแผนเจลทไดไปสองดภายใตแสงอลตราไวโอเลตบนทกภาพ เปรยบเทยบความเรองแสงของแถบดเอนเอกบดเอนเอมาตรฐาน

ความเขมขนของดเอนเอ (µg/ml) = A260 x 50 x 50 dilution factor

4. การสรางลายพมพดเอนเอโดยวธ SRAP ในการศกษาลายพมพดเอนเอดวยเทคนค SRAP โดยการเพมปรมาณดเอนเอฟกทองตวอยาง

ดวยวธพซอาร (PCR) โดยใชไพรเมอรทประยกตมาจาก Li and Quiros (2001) ซงมคไพรเมอรทใชในการเพมปรมาณ 25 คไพรเมอร ดงตารางท 2 แสดงความเขมขน และปรมาณสารทใชในปฏกรยาพซอาร ดงตารางท 3 และแสดงขนตอนของปฏกรยาพซอาร ดงตารางท 4 ซงล าดบเบสของไพรเมอรมดงน

ME 1 : 5’-TGAGTCCAAACCGGATA-3’ ME 2 : 5’-TGAGTCCAAACCGGAGC-3’ ME 3 : 5’- TGAGTCCAAACCGGAAT-3’ ME 4 : 5’- TGAGTCCAAACCGGACC-3’ ME 5 : 5’- TGAGTCCAAACCGGAAG-3’ EM 1 : 5’-GACTGCGTACGAATTAAT-3’ EM 2 : 5’-GACTGCGTACGAATTTGC-3’ EM 3 : 5’-GACTGCGTACGAATTGAC-3’ EM 4 : 5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’ EM 5 : 5’-GACTGCGTACGAATTAAC-3’

ตารางท 2 แสดงไพรเมอรทใช Code Forward Tm Ta=Tm-5 Reverse Tm Ta=Tm-50

S1 Me1 50 45 Em1 54 49 S2 Me1 50 45 Em2 54 49 S3 Me2 50 45 Em1 54 49 S4 Me2 50 45 Em2 54 49 S5 Me1 50 45 Em3 54 49 S6 Me1 50 45 Em4 52 47 S7 Me1 50 45 Em5 52 47 S8 Me2 50 45 Em3 54 49 S9 Me2 50 45 Em4 52 47 S10 Me2 50 45 Em5 52 47 S11 Me3 50 45 Em1 54 49 S12 Me4 54 49 Em1 54 49 S13 Me5 52 47 Em1 54 49 S14 Me3 50 45 Em2 54 49 S15 Me4 54 49 Em2 54 49 S16 Me5 52 47 Em2 54 49 S17 Me3 50 45 Em3 54 49 S18 Me3 50 45 Em4 52 47 S19 Me3 50 45 Em5 52 47 S20 Me4 54 49 Em3 54 49 S21 Me4 54 49 Em4 52 47 S22 Me4 54 49 Em5 52 47 S23 Me5 52 47 Em3 54 49 S24 Me5 52 47 Em4 52 47 S25 Me5 52 47 Em5 52 47

ตารางท 3 ความเขมขน และปรมาณสารทใชในปฏกรยาพซอาร สารทใช ปรมาณ (µl)

DNA template (50ng/µl) 5 forward primer (5 pmole) 1 reverse primer (5 pmole) 1

10x PCR buffer 2 dNTP (2 mM) 2

MgCl2 (25 mM) 2 Taq polymerase 0.2

น า(dH2O) 6.8 รวม 20

ตารางท 4 ขนตอนของปฏกรยาพซอาร

ขนตอน อณหภม (oซ) เวลา (นาท)

1. Pre - denaturation 94 3

2. denaturation 94 1

3. annealing 47 1

4. extension 72 1

5. final extension 72 5

ท าปฏกรยาพซอาร ขนตอน 2-4 จ านวน 37 รอบ

5. ตรวจสอบดเอนเอดวย denaturing polyacrylamide gel electrophoresis 5.1 การเตรยมกระจกส าหรบเทเจล

น าแผนกระจกส าหรบเตรยมเจลมาลางใหสะอาด แลวเชดดวยเอธานอล 95 เปอรเซนตใหสะอาดทง 2 แผน กระจกแผนทมลกษณะเปนหกระตายเชดดวย clear view ใหทวเพอไมใหเจลเกาะตดกระจก ปลอยใหแหง เชดกระจกแผนสเหลยมผนผาดวย bind silane (bind silane 1 ไมโครลตร, glacial acetic acid 2.5 ไมโครลตร และเอธานอล 95 เปอรเซนต 500 ไมโครลตร) เพอใหเจลตดกบกระจก น ากระจกทง 2 แผนมาประกอบเขาชดโดยวาง spacer ไวทงสองขาง เพอใหเกดชองวางระหวางกระจกทงสองโดยหนดานททา bind silane และ repel silane เขาหากน ใชกระดาษกาวตดดานขางใหแนน ใชคลปหนบยดอกท

5.2 เตรยมเจลโพลอะครลาไมด วธการเตรยมเจลโพลอะครลาไมด 6 เปอรเซนต มดงน ชงยเรย 13.5 กรม ใสน ากลน 8.5

มลลลตร และ 5xTBE buffer 6 มลลลตร ผสมสารละลายในบกเกอรคอย ๆ เขยาใหยเรยละลายหมดทอณหภม 60 องศาเซลเซยส หรอน าไปอน 12 วนาท แลวเตมอะครลาไมด 30 เปอรเซนต 4.5 มลลลตร 10% APS (ammonium persulfate) ปรมาตร 400 ไมโครลตร และ N,N,N´,N´- tetramethylenediamine (TEMED) ปรมาตร 20 ไมโครลตร ผสมใหเขากนอยางรวดเรว เทเจลลงในชองระหวางกระจกจนเตมระวงอยาใหเกดฟองอากาศแลวใสหวเขาดานบนปลอยใหเจล แขงตวประมาณ 20 นาท

5.3 การท าอเลคโทรโฟรซส น าสารละลายดเอนเอในขอ 4 มา 6 ไมโครลตร น ามาเตม AFLP loading buffer ซงประกอบดวย

formamind 98 เปอรเซนต EDTA 10 mM bromphenol blue 0.05 เปอรเซนต และ xylene cyanol 0.05 เปอรเซนต จ านวน 3 ไมโครลตร น าไปบม ทอณหภม 90 oซ เปนเวลา 5 นาท แลวแชในน าแขงทนทพรอมส าหรบท าอเลคโทรโฟรซส เมอเจลเขงตวแลวใชน าประปาลางดานนอก ดงหวออก ประกอบกระจกเขากบเครองอเลคโทรโฟรซส แลวเตม 1X TBE buffer ลงในชองดานบนและดานลาง ตอสายไฟเขากบเครองอเลคโทรโฟรซส เปดกระแสไฟฟา 295 โวลต ท า prerun เปนเวลา 30 นาท หลงจากนนปดเครอง ใชเขมฉดยาดดบฟเฟอรมาลางยเรยทอยในชองหวแตละชองออกใหหมด โหลดตวอยางดเอนเอทเตรยมไวลงในแตละชองในครบ จากนนเปดเครองอเลคโทรโฟรซสโดยใชแรงเคลอนไฟฟา 295 โวลต เปนเวลา 2.5 ชวโมง หรอจนกวาส xylene cyanol (สบน) จะเคลอนทลงมา 2 ใน 3 สวนของเจล เมอครบเวลาปดเครอง ดดบฟเฟอรจากชองดานบนออก น ากระจกออกจากเครอง แกะกระจกทง 2 แผนออกจากกน เจลจะตดอยกบกระจกแผนหลงทเปนสเหลยมผนผา น าเจลไปยอมดวยสารละลายซลเวอรไนเตรทตอไป

5.4 การตรวจสอบลายพมพดเอนเอดวยสารละลายซลเวอรไนเตรท น าแผนกระจกทมเจลตดอยมาลางในน า(dH2O) ปรมาตร 200 มลลลตรเปนเวลา 5 นาท พรอม

กบเขยาเบาๆ น าไปแชในสารละลาย CTAB ความเขมขน 0.1 เปอรเซนต (CTAB 0.25 กรม,dH2O 250 มลลลตร) เปนเวลา 30 นาท พรอมเขยาเบาๆ อยางตอเนอง แลวแชแผนเจลในสารละลายแอมโมเนยความเขมขน 0.3 เปอรเซนต (0.3% ammonium 750 ไมโครลตร, dH2O 250 มลลลตร) เปนเวลา 15 นาท โดยเขยาเบาๆ ตลอดเวลา หลงจากนนแชแผนเจลในสารละลายซลเวอรไนเตรท (ชงซลเวอรไนเตรท 0.4 กรม เตมน า (dH2O) 250 มลลลตร +โซเดยม ไฮดรอกไซดความเขมขน 1 โมลาร 1 มลลลตร คนใหละลายจะไดสารละลายขนสน าตาล เตมสารละลายแอมโมเนยเขมขน 25 เปอรเซนต 1500 ไมโครลตร) เปนเวลา 20 นาท โดยเขยาอยางสม าเสมอ แลวน าแผนเจลออกมาลางน า (dH2O) 200 มลลลตร 2 ครง ครงละประมาณ 10 วนาท แลวน าแผนเจลมาแชในสารละลาย developer ทเตรยมแชเยนไวทอณหภม

10 องศาเซลเซยส (สารละลาย developer ประกอบดวย sodium carbonate 2 เปอรเซนต 5 กรม, dH2O 250 มลลลตร ปนใหละลายแลวน าไปแชเยน และ เตม formaldehyde 0.02 เปอรเซนต 50 ไมโครลตร หลงจากน าออกมาจากแชเยนแลว) เขยาสม าเสมอจนกวาจะเหนแถบแบนดเอนเอชดเจน จากนนน าแผนเจลมาลางในน า (dH2O) เพอหยดปฏกรยา ผงใหแหงทอณหภมหอง

5.5 การวเคราะหผล

น าแผนเจลทแหงแลวมา Score band โดยสงเกตจากแถบแบนทเกดขนบนแผนเจล ใหเลอกเฉพาะแถบดเอนเอทเหนชดเจนและเปนแบนทมตวอยางขนมากทสด โดยการใหคะแนนแถบแบนจะใหโดย ตวอยางใดเกดแบนจะให 1 คะแนน ตวอยางใดไมเกดแบนให 0 คะแนน Score band ใหครบทก Primer และน าไปค านวณหา คา Similarity ( Dice similarity ) แลวจดกลมดวยวธ UPGMA ( Unweighted pair group method with arithmetic average ) ดวย โปรแกรม NTSYS

ผลการทดลอง

1. การวเคราะหลายพมพดเอนเอดวยเทคนค SRAP เมอน าดเอนเอมาเพมปรมาณดวยเทคนค PCR ใชไพรเมอรซงประยกตจากไพรเมอรของ Li and

Quiros (2001) โดยใชไพรเมอรทงหมด 25 คไพรเมอร (ตารางท 2) จากนนน าตวอยางดเอนเอของฟกทองแตละสายพนธมาเพมปรมาณเพอทดสอบไพรเมอรทง 25 คไพรเมอร น าผลทไดจากการท า PCR มาแยกขนาดดวยการท า denaturing polyacrylamide gel electrophoresis พบวา คไพรเมอรทมการเพมปรมาณชนสวนดเอนเอไดดและเกด polymorphism มทงหมด 10 คไพรเมอร ไดแก S2, S5, S8, S15, S16, S19, S21, S22, S23 และ S24 สามารถเพมปรมาณดเอนเอไดจ านวน 88 แถบ ซงมแถบทเปน polymorphism จ านวน 47 แถบ คดเปน 53.41 %

2. การวเคราะหผลดวยโปรแกรมคอมพวเตอรจากลายพมพดเอนเอเทคนค SRAP

โปรแกรมคอมพวเตอรทใชในการทดลองคอ โปรแกรม NTSYS และจดกลมดวยวธ UPGMA (Unweighted pair group method with arithmetic average) และแสดงผลในรปแบบของ Dendrogram (ภาพท 1)

จากการศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมดวยเครองหมายดเอนเอ SRAP พบวา มคา Dice similarity Coefficient ในชวง 0.63 – 0.93 เลอกการจดกลมท Similarity Coefficient เฉลย เทากบ 0.81 สามารถจดกลมฟกทองจ านวน 20 สายพนธได 3 กลม ดงน

กลม 1 ไดแก Pumpkin, ฟกทอง A, ทองอ าไพ 426, จนดา 2003, กระโถน, โอฬาร, บงกาฬ,ขาวตอก 573, Tesukubot, พนธคางคก และChina 1

กลม 2 ไดแก พนธคางคกแท และ K-โกลดเดน กลม 3 ไดแก ฟกทองลายขาวตอก และฟกทองหนงคางคก นอกจากนยงมฟกทองอก 5 สายพนธทไมเขากลมใด ๆ เลย ไดแก ฟกทอง Top A, หนงคางคก

ฟกทอง A, นพเกา, Japan 1และ First test 764

ภาพท 1 Dendrogram แสดงการจดกลมของฟกทองพนธผสมเปดและพนธลกผสมทางการคา จ านวน

20 พนธ

วจารณผลการทดลอง

จากการจดกลมฟกทอง 20 สายพนธ พบวา ม 5 สายพนธทไมสามารถจดกลมได หรอเปน Out group และทเหลอ 15 สายพนธ พบวามการจดดงน

กลมท 1 ม 11 สายพนธ ไดแก Pumpkin, ฟกทอง A, ทองอ าไพ 426, จนดา 2003, กระโถน, โอฬาร, บงกาฬ,ขาวตอก 573, Tesukubot, พนธคางคก และChina 1 ซงฟกทองในกลมประกอบดวยฟกทองทเปนพนธผสมเปดการคา พนธผสมเปดพนเมอง และพนธลกผสม โดยเฉพาะพนธ Tesukubot เปนพนธทไดเมลดพนธมาจากประเทศภฐาน เปนพนธทประเทศภฐานนยมปลกกนอยางแพรหลาย แตจากการศกษาขอมล พบวา ประเทศภฐานไมไดพฒนาพนธ Tesukubot เอง มการน าเขามาจากตางประเทศ สวนพนธ China 1 เปนเมลดพนธทน าเขามาจากประเทศจน เมอน าทงสองสายพนธมาปลกทดสอบในประเทศไทย พบวา สามารถปรบตวไดดในประเทศไทย จงคาดวานาจะมฐานพนธกรรมทใกลเคยงกน อาจจะมฐานพนธกรรมอยในแถบเอเชยดวยกน จงถกจดอยในกลมเดยวกน

กลม 2 ม 2 สายพนธ ไดแก พนธคางคกแท และ K-โกลดเดน ฟกทองทงสองสายพนธนม

ลกษณะทางดานสณฐานวทยาทเหมอนกนมาก คอ ตนใหญ ใบใหญ ผลมทรงแปน ลกใหญน าหนก 3-5 กโลกรม ผวเปนลายหนงคางคก และทนโรคไดด จงจดอยในกลมเดยวกน

กลม 3 ม 2 สายพนธ ไดแก ฟกทองลายขาวตอก และฟกทองหนงคางคก ฟกทองทงสองสาย

พนธนมลกษณะทางดานสณฐานวทยาทคลายกน คอ ทรงผล ลกใหญ สเนอเหลอง แตมความแตกตางกนทผว ฟกทองลายขาวตอกจะมผวเปนลายขาวตอก แตฟกทองหนงคางคกจะมผวขรขระเหมอนหนงคางคก คาดวาไพรเมอรทใชไมสามารถจ าแนกฟกทองกลมลายขาวตอก และหนงคางคกออกจากกนได

นอกจากนยงมฟกทองอก 5 สายพนธทไมเขากลมใด ๆ เลย ไดแก ฟกทอง Top A, หนงคางคก

ฟกทอง A, นพเกา, Japan-1 และ First test-764 ส าหรบ Japan- 1 และ First test-764 เปนฟกทองทตางไปจาก Cucurbita moschata สวน ฟกทอง Top A, หนงคางคกฟกทอง A และนพเกา เปนเมลดพนธทไมทราบฐานพนธกรรมวามาจากทใด

สรปผลการทดลอง

จากผลการทดลองการวเคราะหลายพมพดเอนเอดวยเทคนค SRAP พบวา สายพนธของ ฟกทองแตละสายพนธมฐานพนธกรรมทใกลเคยงกน จงท าใหฐานพนธกรรมของฟกทองคอนขางแคบ เมอใชไพรเมอรทงหมด 25 คไพรเมอรในการตรวจสอบ แตพบวามไพรเมอรเพยง 10 คไพรเมอรเทานนทเพมปรมาณดเอนเอได จากการวเคราะหลายพมพดเอนเอดวยเทคนค SRAP โดยอาศยไพรเมอร 10 ค ทเพมปรมาณดเอนเอไดด คอ Me1-Em2, Me1-Em3, Me2-Em3, Me4-Em2, Me5-Em2, Me3-Em5, Me4-Em4, Me4-Em5, Me5-Em3, Me5-Em4 ใหแถบดเอนเอทงสน 88 แถบ มแถบดเอนเอทแตกตางกน 47 แถบ คดเปน 53.41% polymorphism

Similarity Coefficient ในชวง 0.63 – 0.93 เลอกการจดกลมท Similarity Coefficient เทากบ 0.81 มฟกทองจ านวน 11 สายพนธถกจดอยในกลมเดยวกนคอกลมท 1 ฟกทองพนธผสมเปดผลใหญสองพนธถกจดอยในกลมเดยวกนคอกลมท 2 และ 3 นอกจากนยงมฟกทอง 5 สายพนธทไมถกจดกลม

เอกสารอางอง กรมสงเสรมการเกษตร. 2551. ขอมลทเพาะปลก ศนยสารสนเทศ กรมสงเสรมการเกษตร. [Online]. Available : http://production.doae.go.th, 8 ธนวาคม 2554 กฤษฎา สมพนธารกษ. 2533. การปรบปรงพนธฟก. พมพครงท 1. กรงเทพฯ : ภาควชาพชไรนา, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 41 น. วารน วรรณประโพธ. 2545. การใชลายพมพดเอนเอตรวจสอบยางกราด ยางพลวง และยางทคาด วาเปนลกผสม. วทยานพนธปรญญาโท, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 140 น. จ าลองลกษณ เรองวชราภรณ. 2546. การศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของมะกอกโอลฟ โดยเครองหมายโมเลกล. วทยานพนธปรญญาโท, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 103 น. ดวงจนทร เกรยงสวรรณ. 2546. พชผกผลไมไทยมคณคาเปนทงอาหารและยาตอน “ฟกทอง”. [Online]. Available : http://natres.psu.ac.th/radio/radio_article/radio45-46/45- 460050.htm นฤมล ธนานนต. 2547. การตรวจสอบยคาลปตสดวยเครองหมายดเอนเอและการถายยน HAL2

เขาสยคาลปตสลกผสม Eucalyptus camaldulensis x E. tereticornis. วทยานพนธปรญญาเอก, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 115 น.

ชชย เนตรธวกล. 2549. การตรวจหายนทตอบสนองตอชวงแสงในขาว (Oryza sativa L.) พนธ ขาวดอกมะล 105 โดยใชเทคนค cDNA-SRAP. วทยานพนธปรญญาโท, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 70 น. ศานนท สขสถาน. 2552.การศกษาความหลากหลายทางพนธกรรมของสบด าโดยใชเทคนค โมเลกล RAPD. ปญหาพเศษปรญญาตร, มหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 23 น. ชมรมเผยแพรความรทางการเกษตร. 2554. การผลตฟกทองแบบปลอดภย. [Online]. Available : http://anydeck2.weloveshopping.com/template/a34/showproduct.php?pid=1243 3587&shopid=114578

Li, G. and C.F. Quiros. 2001. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica. Theor. Appl. Genet. 103: 455 – 461. Ferriol, M., Pic B and Nuez F. 2004. Genetic diversity of some accessions of Cucurbita

maxima from Spain using RAPD and SRAP markers. Genet Res Crop Evol (in press). 107:271–282.

Ferriol, M., Pic B and Nuez F. 2001. Genetic Variability in Pumpkin (Cucurbita maxima) Using RAPD Markers. Cucurbit Genetics Cooperative Report. 24:94-96. Balkaya, Ahmet, Mehtap Özbakir and Ertan Sait Kurtar. The phenotypic diversity and fruit

characterization of winter squash (Cucurbita maxima) populations from the Black Sea Region of Turkey. African Journal of Biotechnology Vol. 9 (2). 152- 162.