steroidi- ja wnt-signaloinnin välinen vuoropuhelu ihmisen ...· steroidi- ja wnt-signaloinnin...

Download Steroidi- ja Wnt-signaloinnin välinen vuoropuhelu ihmisen ...· Steroidi- ja Wnt-signaloinnin välinen

If you can't read please download the document

Post on 16-Feb-2019

212 views

Category:

Documents

0 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

Steroidi- ja Wnt-signaloinnin vlinen vuoropuhelu ihmisen osteoblastisissa

soluissa

Laura Mkel

Pro gradu -tutkielma Soveltavan biotekniikan koulutusohjelma/

Elinbiotekniikan paine, Molekyylibiologian ja geeniteknologian linja Kuopion yliopisto, Biotieteiden laitos

Keskuu 2008

2

KUOPION YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja ympristtieteiden tiedekunta Soveltavan biotekniikan koulutusohjelma, Elinbiotekniikan paine, Molekyylibiologian ja geeniteknologian linja MKEL, LAURA: Steroidi- ja Wnt-signaloinnin vlinen vuoropuhelu ihmisen osteoblastisissa soluissa Opinnytetutkielma 75 sivua Opinnytetutkielman ohjaajat: FT Anitta Mahonen, FM Anu Olkku, professori Maria Halmekyt Keskuu 2008

Avainsanat: Glukokortikoidi, kalsitrioli, Wnt, -kateniini, osteoblasti, GR, VDR

Osteoporoosi on luusairaus, jolle on ominaista luuaineksen ja siten luun tiheyden vheneminen. Mys luun sisinen rakenne on muuttunut; se on huokoistunut ja sen kestvyys on heikentynyt. Suomen Osteoporoosiliiton arvioiden mukaan Suomessa on noin 400 000 henkil, joilla luukudoksen mr on merkittvsti alentunut. Luustomme ei ole staattinen kokonaisuus, vaan se uusiutuu jatkuvasti. Uusiutuminen johtuu elvn kudoksen toiminnasta, jossa luuta hajottavat osteoklastit syvt luuta, ja luun muodostajasolut osteoblastit rakentavat uutta luuta tilalle. Luuston kehitykseen ja metaboliaan osallistuu useita eri biomolekyylej ja signaalireittej. Viimeaikaisten tutkimusten mukaan Wnt-signalointi on aktiivinen luun metabolian stelij. Wntproteiinit aktivoivat ainakin kolme solun sisist signaalireitti, joista kanonisen signaalireitin tiedetn vaikuttavan luun muodostumisen ja resorption kontrollointiin. Mys steroidihormoneilla tiedetn olevan monimuotoisia vaikutuksia luun metaboliaan. Esimerkiksi glukokortikoidit edistvt osteoblastisen fenotyypin kehittymist ja siten mesenkymaalisten kantasolujen osteogeenist erilaistumista. Toisaalta glukokortikoidit vaikuttavat kypsien osteoblastien toimintaan ja metaboliaan vhentmll luun muodostumista. Steroidihormonien vaikutukset vlittyvt usein systeemisell tasolla, joten ne vaikuttavat useissa kudoksissa samanaikaisesti. Niiden vaikutukset vlittyvt spesifisten reseptorien vlityksell, jotka toimivat ligandistariippuvaisina transkriptiotekijin. Wnt-signaalireitin toiminnot vastaavasti vlittyvt paikallisella tasolla. Molemmat signaalireitit kuitenkin osallistuvat solujen proliferaation, erilaistumisen ja selviytymisen kontrollointiin. Tm viittaisi siihen, ett soluilla on oltava mekanismeja, joiden avulla ne voivat yhdist eri signaalireittien vlittmt samansuuntaiset kskyt. Tmn tyn tarkoituksena oli selvitt steroidi- ja Wnt-signaloinnin vlisen vuoropuhelun molekulaarista mekanismia ihmisen osteoblastisissa soluissa. Steroidien osalta tyss keskityttiin glukokortikoideihin ja aktiiviseen D-vitamiiniin. Wnt-signalointireitin aktivoitumista tutkittiin U2-Os -osteoblasteissa raportoijakokeilla ja -kateniinin immunovrjyskokeilla. Wnt-signalointireitti aktivoitui litiumkloridilla sek transfektoimalla villityypin -kateniinia tai stabiilia S33-kateniinia. Wnt-signaalireitin aktivoituminen johti -kateniinin tumalokalisaatioon. Tyss osoitettiin, ett glukokortikoidit ja kalsitrioli heikensivt sek LiCl- aktivoitua ett -kateniini aktivoitua Wnt-signaalireitti. Wnt-signaalin vaimentuminen johtui ainakin osittain siit, ett -kateniinin translokalisoituminen tumasta solukalvolle tehostui. Steroidireseptorien mutanteilla muodoilla kartoitettiin Wnt-signaalin modulointiin osallistuvia reseptorin alueita. Tmn tutkimuksen perusteella GR:n DNA:han sitoutuvan alueen (DBD) aminohapot 418-500 ja VDR:n ligandia sitovan alueen (LBD) aminohapot K264 ja E420 nyttisivt osallistuvan Wnt-signaloinnin modulointiin.

3

ESIPUHE

Tein pro gradu -tyni vuosien 2006 ja 2007 aikana lketieteellisen biokemian

yksikss, Anitta Mahosen johtamassa ryhmss.

Haluaisin kiitt ohjaajiani Anitta Mahosta, Anu Olkkua ja Biotieteiden laitoksen

puolelta Maria Halmekyt. Lisksi haluaisin kiitt ystvini ja vanhempiani tuesta

hetkill, jolloin usko ja ymmrrys meinasivat loppua.

Kuopiossa 12.7.2008

Laura Mkel

4

LYHENNELUETTELO APC engl. adenomateous polyposis coli

AR androgeenireseptori

CKI kaseiinikinaasi I

DBD DNA:ta sitova domeeni

Dkks engl. Dickkopfs

Dsh engl. Disheveled

GBP GSK3: ta sitova proteiini

GIO glukokortikoidien indusoima osteoporoosi

GR glukokortikoidireseptori

GRE glukokortikoidiresponsiivinen elementti

GSK3 glykogeenisyntaasikinaasi 3

HDAC1 engl. histone deacetylase 1

LBD ligandia sitova domeeni

LDLR engl. low-density lipoprotein related receptor

Lef engl. lymphoid enhancer-binding factor

NTD N-terminaalinen alue

PDE fosfodiesteraasi

PLC fosfolipaasi C

RXR retinoidi-X-reseptori

Sfrps engl. secreted frizzled related proteins

TCF T-solutekij

VDR D-vitamiinireseptori

VDRE D-vitamiiniresponsiivinen elementti

Wif-1 Wnt:t inhiboiva tekij -1 (engl. Wnt inhibitory factor-1)

5

TIIVISTELM

ESIPUHE

LYHENNELUETTELO

SISLLYSLUETTELO

1 JOHDANTO...................................................................................................................7

2 KIRJALLISUUSKATSAUS...........................................................................................8 2.1 Luukudos ............................................................................................................................ 8

2.1.1 Luusolut .............................................................................................................. 10 2.1.2 Luun uudismuodostus ja luuston sairaudet..................................................... 12

2.2 Steroidihormonit .............................................................................................................. 14 2.3 Steroidihormonireseptorien rakenne ............................................................................. 16

2.3.1 N-terminaalinen domeeni .................................................................................. 17 2.3.2 DNA:ta sitova domeeni ...................................................................................... 17 2.3.3 Ligandia sitova domeeni .................................................................................... 18

2.4 Steroidihormonien reseptorivlitteinen vaikutusmekanismi....................................... 19 2.5 Wnt-proteiinit ja signaalinvlittyminen......................................................................... 21

2.5.1 Wnt-proteiinien rakenne ................................................................................... 21 2.6 Wnt-reseptorit .................................................................................................................. 22 2.7 Wnt-signaalireitit ............................................................................................................. 23

2.7.1 Ei-kanoniset signaalireitit.................................................................................. 23 2.7.2 Kanoninen signaalireitti .................................................................................... 24

2.8 Wnt-signaloinnin kohdegeenit ........................................................................................ 27 2.9 Wnt-antagonistit .............................................................................................................. 27

3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET................................................................................28

4 MATERIAALIT JA MENETELMT.........................................................................29 4.1 Solukokeet......................................................................................................................... 29

4.1.1 U2-Os -solujen kasvatus ja jakaminen ............................................................. 29 4.1.2 Tutkittavat yhdisteet.......................................................................................... 29

4.2 Transfektiokokeet ............................................................................................................ 30 4.2.1 Transfektiossa kytetyt raportoija-konstruktit ja ekspressiovektorit .......... 30 4.2.2 Transfektio TransIT LT1 -lipofektio- ja FuGENE HD- transfektioreagenssilla ................................................................................................ 31 4.2.3 Lusiferaasi-mritys .......................................................................................... 32 4.2.4 -galaktosidaasi-mritys.................................................................................. 32 4.2.5 Proteiinipitoisuuden mritys........................................................................... 33

4.3 Immunofluoresenssivrjys ............................................................................................ 33 4.4 Kvantitatiivinen PCR ...................................................................................................... 34

4.4.1 Kokonais-RNA:n eristys.................................................................................... 34 4.4.2 cDNA-synteesi .................................................................................................... 35 4.4.3 KvantitatiivinenPCR -ajo................................................................................ 36

5 TULOKSET..................................................................................................................37 5.1 Raportoijakokeiden analysointi........

Recommended

View more >