stress oxydatif, différentiation et mort cellulaire chez le parasite
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WILFRIED MOREIRA
STRESS OXYDATIF, DIFFERENTIATION ET MORT CELLULAIRE
CHEZ LE PARASITE LEISHMANIA
Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval
dans le cadre du programme de doctorat en Microbiologie-Immunologie pour l'obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE MEDICALE FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC
2011
Wilfried Moreira, 2011
Résumé Le parasite Leishmania est l'agent étiologique des leishmanioses, maladies négligées qui
affectent les régions les plus pauvres de la planète (Inde, Soudan, Iran, Bengladesh,
Amérique du Sud) et figurent parmi les priorités de l'Organisation Mondiale de la Santé
(OMS). Chaque année, 1.5 million à 2 millions d'individus sont infectés et on dénombre
entre 80 000 etl50 000 décès par année. En l'absence de vaccin, le traitement des
leishmanioses repose sur une chimiothérapie relativement limitée. Les traitements à base
d'antimoine demeurent en première ligne de l'arsenal thérapeutique dans les pays
endémiques. Près de 70 ans après le début de leur utilisation, leur mécanisme d'action reste
mal connu. A ceci s'ajoute une toxicité élevée et une résistance qui prend des proportions
endémiques dans certaines régions. Les traitements alternatifs, composés principalement de
l'amphotéricine B, de la miltéfosine et de la paromomycine, sont soit extrêmement onéreux
pour les régions les plus touchées ou encore sont associés à une toxicité élevée. Dans ce
contexte, la nécessité d'approfondir les recherches sur ce parasite est évidente, dans
l'objectif de mieux comprendre sa biologie et d'éventuellement définir des nouveaux
moyens de lutte.
Trois objectifs de recherche ont été définis au cours de mon doctorat et sont présentés dans
cette thèse : les deux premiers objectifs concernaient les rôles éventuels de la ptéridine
reductase PTR1 et des ptérines réduites dans la résistance aux stress oxydatifs et dans la
métacyclogénèse du parasite. Le métabolisme des ptérines est relativement peu connu et le
rôle de ces composés reste mystérieux. La métacyclogénèse, processus par lequel le
parasite acquiert sa forme infectieuse, est également peu comprise. Les ptérines réduites
étant connues chez d'autres organismes pour leur propriété anti-oxydante et ayant été
associées à la métacyclogénèse du parasite, nous avons souhaité mieux définir leur rôle
dans ces deux aspects essentiels de la biologie du parasite. Le troisième objectif était
également relié au stress oxydatif, s'intéressait aux mécanismes d'action des drogues anti-
Leishmania et à l'acquisition de la résistance à ces drogues. Effectivement, plusieurs
drogues connues pour induire l'apoptose induisent un stress oxydatif. Nous avons émis
l'hypothèse qu'un mécanisme commun de mort cellulaire pouvait être induit par ces
11
drogues et que l'existence d'un tel mécanisme pouvait favoriser l'acquisition de multi-
résistances chez les mutants résistants.
Une étude du rôle des ptérines réduites dans la résistance aux stress oxydatifs a ainsi
montré que ces composés pouvaient être ajoutés à la liste des antioxydants dont dispose le
parasite. En effet, nous avons montré que les ptérines réduites contribuaient à la survie du
Leishmania lorsque celui-ci est soumis à des stress de nature oxydatifs ou nitrosatifs, tant
exogène que cellulaire, c'est-à-dire générés par un macrophage activé. Les ptérines
contribuent donc également à l'infectivité du parasite. Nous avons ainsi pu proposer un
nouveau rôle pour ces composés.
Une étude protéomique de la métacyclogénèse d'une souche de Leishmania sauvage et
d'une souche inactivé pour le gène codant la ptéridine reductase PTR1 a permis
l'identification de plus de 200 protéines différentiellement exprimées. La mise en évidence
de l'augmentation du nombre de protéines différentiellement exprimées suggère
indirectement l'implication de PTR1 ou des ptérines réduites dans ce processus de
differentiation essentiel à la biologie du parasite. Par ailleurs, la variation de l'expression
des protéines associées à la mobilité, à la résistance au stress oxydatif ou encore aux
mécanismes d'expressions géniques suggère un rôle important de ses voies dans la
métacyclogénèse.
Enfin, une étude du mécanisme d'action des drogues anti-Leishmania a mis en évidence un
modèle dichotomique de la mort induite par ces drogues. En effet, l'antimoine, la
miltéfosine et l'amphotéricine B induisent la mort cellulaire programmée par apoptose avec
une accumulation d'oxydants alors que la paramomycine et le methotrexate (drogue
modèle) induisent la mort différemment. L'existence de mécanismes d'action communs, et
notamment l'induction d'un stress oxydant, a également pour conséquence de faciliter, chez
les mutants résistants, l'acquisition de multi-résistances dès lors que la drogue pour laquelle
ils sont sélectionnés induit le même type de mort. Ces résultats présentent des
conséquences importantes relativement aux mécanismes d'acquisition de la résistance et au
développement des thérapies mti-Leishmania.
Ill
Abstract Leishmania parasites are the etiological agent of leishmaniasis, a class of neglected diseases
that affect the poorest regions on earth (India, Sudan, Bangladesh, South America...) and
are among WHO's priorities. Each year, 1.5 to 2 million people are infected with
Leishmania and between 80 000 to 150 000 die. In the absence of an efficient available
vaccine, the treatment of leishmaniasis relies on a limited number of chemotherapeutic
agents. Antimony-based drugs are still the first line of treatment used in endemic countries.
Almost 70 years after the beginning of their use, their mode of action remains poorly
understood. Adding to that, there is a high toxicity and resistance problem, which is taking
epidemic proportions in certain regions.of the world Alternative treatments, mainly
composed of amphotericin B, miltefosine and paromomycin, remain very expensive for the
most affected regions and are also associated to high toxicity, which compromise their use.
In this context, more research on this parasite appears obvious, with the goal to better
understand its biology and eventually to find new ways to fight it.
Three objectives were addressed during my Ph.D. studies and are presented in this thesis:
the two first objectives were about defining the putative role of the pteridine reductase
PTR1 and reduced pterins in the resistance to oxidative stress and in metacyclogenesis of
the parasite. Pterin's metabolism is poorly understood and the role played by these
molecules remains elusive. Metacyclogenesis, which is the process by which the parasite
acquire its infectious form, is also poorly understood. Reduced pterins are known in other
organisms to have anti-oxidants properties and have been associated to Leishmania
metacyclogenesis. We therefore aimed at deciphering their role in these two very important
aspects of the parasite biology. The third objective was linked to the mode of action of anti-
Leishmania drugs and to drug-resistance acquisition. Several drugs known to induce
apoptosis are associated to oxidative stress. We emitted the hypothesis that these drugs
could induce a common mechanism of cell death and that this could favor the acquisition of
multi-drug resistance in resistant mutants.
A study of the role of reduced pterins in the resistance to oxidative stress led to the
demonstration that these molecules could be added to the list of anti-oxidants of the
IV
parasite. Indeed, we showed that reduced pterins contributed to survival of Leishmania
when exposed to oxidative and nitrosative stress from exogenous sources as well when
derived from activated macrophages. Reduced pterins also contributed to the parasite
infectivity. We were therefore able to propose a new role for these molecules.
A comparative proteomic study of the metacyclogenesis between wild-type Leishmania and
a strain in which PTR1 was inactivated allowed the identification of more than 200
differentially expressed proteins. We showed that the number of proteins differentially
expressed was substantially greater in the PTR1 deficient strain. These results indirectly
suggest an implication of PTR1 or reduced pterins in metacyclogenesis. Furthermore, the
variation of expression of several proteins associated to mobility, resistance to oxidative
stress or gene expression mechanisms suggest an important role of these pathways in
metacyclogenesis.
Finally, studying the mode of action of anti-Leishmania drugs led to the establishment of a
dichotomic model of drug-induced cell death. Indeed, antimony, miltefosine and
amphotericin B induced apoptosis with an accumulation of oxidants while paromomycin
and methotrexate (a model drug not used against Leishmania) did not. The existence of a
common mode of action, and especially oxidants accumulation, also favored the
acquisition, in drug-resistant mutants, of multi-drug resistance more easily as long as they
shared the same mode of killing. These results have important consequences in terms of
multi-drug resistance acquisition and anti-Leishmania chemotherapy development.
Avant-propos Parce qu'il à été bien plus qu'un directeur de recherche, je souhaite témoigner ma profonde
gratitude au Dr. Marc Ouellette. J'avais besoin d'un mentor, et j 'en ai trouvé un en sa
personne. J'avais besoin de liberté et j 'ai pu, au sein de son équipe et avec ses
encouragements, développer mes travaux de doctorat dans les directions qu'il me suggérait,
tout en explorant les voies qui me semblaient stimulantes et originales. Pour son talent, sa
disponibilité, son formidable esprit critique et son soutien je le remercie chaleureusement.
Je suis, comme il le dit lui-même, l'un de ses « enfants scientifiques ».
Je remercie bien évidemment les membres de mon jury d'avoir accepté de lire et critiquer
cette thèse de doctorat. Merci aux Drs. Fasel, Papadopoulou et Sato. J'ai une pensée toute
particulière pour le Dr. Sato car je me souviendrai très longtemps, je pense, de nos longues
discussions dans son petit bureau qui ne reflète en rien la largeur de son cœur et de son
esprit. Merci « Dr. Sachiko ».
J'adresse un énorme remerciement aux membres de l'équipe du Dr. Ouellette.
L'atmosphère de cette équipe vaut bien tous les Ph.D. du monde. Une mention spéciale
pour Suzanne (notre « maman du lab » à tous), à Gaétan Roy, au Dr. Jolyne
Drummelsmith, ainsi qu'au Dr. Philippe Leprohon. Un énorme merci au Dr. Danielle
Légaré pour son dévouement au travail et son soutien.
Les cinq lettres du mot « merci » seront également bien peu pour dire tout ce que je
voudrais dire à Dominic Gagnon ainsi qu'à Amin A. Ouameur, mes deux précieux amis.
Amin, je n'oublierai jamais les premiers mois de mon Doctorat ni tout ce que nous avons
partagé par la suite. Dominic, nous savons tous les deux tout ce que tu as fait pour moi et
pour tout ça, je te serai toujours reconnaissant.
À tous ceux que j 'ai côtoyés et qui ont contribué à faire de ce doctorat une expérience
humaine si enrichissante, je souhaite témoigner ma sympathie, tout particulièrement à ceux
qui sont devenus des amis. Mes pensées vont aux Dre. Michaela Muller, Dre. Céline
Deffrasnes et Dre. Alexandra Lambert, pour nos conversations et moments partagés qui
resteront inoubliables.
VI
A ma famille, ma mère, mon père et mon frère, je veux témoigner toute ma reconnaissance
pour leur soutien inconditionnel. Ni l'océan qui nous séparait ni le temps qui s'écoulait n'a
entamé l'amour qu'ils m'ont toujours porté. Aujourd'hui, je sais bien que mon doctorat est
un peu le leur !
Enfin, je voudrai conclure ces remerciements par ces mots : la plus belle chose qui me soit
arrivées au cours de ces dernières années, c'est ma rencontre avec toi, Véro ! Ma plus belle
expérience, c'est toi ! Mon plus beau résultat, c'est ton sourire, lorsque tu me l'offres ! Et la
chose la plus importante que j 'ai apprise, c'est que rien n'est inaccessible. Le monde nous
appartient et bientôt nous le ferons rouler sous nos pieds ! Je t'aime ! !
vu
À ma mère et à mon père, que j'aime profondément,
je dédie bien plus que ces quelques pages.
Ever tried. Ever failed. No matter.
Try again. Fail again. Fail better.
(Samuel Beckett)
Table des matières Résumé i Abstract iii Avant-propos v Table des matières viii Liste des Figures 10 Liste des abréviations 11 Chapitre I. Leishmania et la leishmaniose 13
1.1 Le parasite Leishmania : Généralités 13 1.2 Cycle de vie du parasite 14
1.2.1 Stade extracellulaire promastigote 15 1.2.2 Métacyclogénèse 15 1.2.3 Stade intracellulaire amastigote 17
1.3 La leishmaniose 17 1.3.1 Epidemiologic et distribution géographique 17 1.3.2 Manifestations cliniques 19 1.3.3 Diagnostic 22 1.3.4 Vaccins 24 1.3.5 Traitements 24
Chapitre II. Mode d'action des drogues et mécanismes de résistance 27 2.1 Mécanismes d'action des drogues anti-Leishmania 27
2.1.1 L'antimoine et ses dérivés 27 2.1.2 La pentamidine 28 2.1.3 L'amphotéricine B 28 2.1.4 La miltéfosine 29 2.1.5 La paromomycine 29 2.1.6 Autres molécules : sitamaquine, terbinafine et methotrexate 29 2.1.7 L'induction de l'apoptose par les drogues anti-Leishmania 30
2.2 Nouveau paradigme pour le mode d'action des antibiotiques et des drogues anticancéreuses 33 2.3 Mécanismes de résistance 34
2.3.1 Mécanismes de résistance spécifiques 34 2.3.2 Mécanismes de résistance généraux et nouveau paradigme 41
Chapitre III. Leishmania et les stress oxydatifs 44 3.1 Cycle de vie et stress oxydatifs 44 3.2 Mécanismes de résistance aux stress oxydatifs 45
3.2.1 Les thiols et le métabolisme du trypanothion 46 3.2.2 Les ptérines 49 3.2.3 Autres mécanismes de défense contre le stress oxydatif 50
Chapitre IV. Problématiques, hypothèses et objectifs 52 Problématiques 52 Hypothèses 52 Objectifs 53
Chapitre V. Le rôle des ptérines réduites dans la résistance au stress oxydatif et nitrosatif chez le parasite Leishmania 55
IX
5.1 Résumé 55 5.2 Article 56
Chapitre VI 87 6.1 Résumé 87 6.2 Article 88
Chapitre VII. La tolérance à la mort cellulaire induite par les drogues favorise l'acquisition de résistances multiples chez Leishmania 150
7.1 Résumé 150 7.2 Article 152
Chapitre VIII. Discussion générale 152 8.1 Leishmania et les stress oxydatifs : un nouveau rôle dans la résistance au stress oxydatif pour PTR1 et les ptérines réduites 182 8.2 Analyse protéomique du rôle des ptérines dans la métacyclogénèse du parasite 185 8.3 Dichotomie du mécanisme d'action des drogues anti-Leishmania : implication pour l'acquisition de la résistance 188
Conclusions 192 Bibliographie 193
Liste des Figures
Figure 1. Cycle de vie du Leishmania 11
Figure 2. Distribution géographique des leishmanioses 15
Figure 3. Classification des espèces de Leishmania 16
Figure 4. Manifestations cliniques des différentes formes de leishmanioses 17
Figure 5. Mécanismes de résistances aux drogues 31
Figure 6. Mécanisme de mort cellulaire commun induit par les antibiotiques
bactéricides 39
Figure 7. ROI and RNI produites par les systèmes enzymatique Phox et iNOS dans les
cellules phagocytaire des mammifères 40
Figure 8. Structure chimique du trypanothion ou bis(glutathionyl)spermidine 42
Figure 9. Voie de synthèse et de réduction du trypanothion (TSH) 44
Figure 10. Métabolismes des folates et des ptérines chez Leishmania 45
11
Liste des abréviations ABC ATP-binding cassette
ADN Acide déoxyribonucléique
AIF de l'anglais « Apoptosis inducing factor »
AQP1 Aquaporine 1
ARN Acide ribonucléique
ARNm Acide ribonucléique messager
BT1 Transporteur de bioptérine 1
CR3 Récepteur du complément 3
DAT de l'anglais «Direct agglutination test »
DHFR Dihydrofolate reductase
fPPG Protéophosphoglycan filamenteux
GP63 Glycoprotéine de surface 63
GSH Glutathion
GST de l'anglais « Glutathione S-transferase »
iNOS de l'anglais « Inducible nitric oxide synthase »
LdMT Transporteur de la miltefosine de Leishmania donovani
LPG Lipophosphoglycan
MDMs Macrophage dérivés de monocytes
MDRl de l'anglais « Multidrug resistance protein 1 »
MRP1 de l'anglais « Multidrug resistance-associated protein »
MRPA de l'anglais « Multidrug resistance-associated protein A »
MTX Methotrexate
NADH Nicotinamide adenine dinucleotide
ODC Ornithine decarboxylase
OMS Organisation mondiale de la santé
PCD de l'anglais « Programmed cell death »
PCR de l'anglais Polymerase chain reaction
PKDL Leishmaniose dermique post-kala-azar
PMN Polymorphonucléaire
12
PRP1 Protéine de résistance à la pentamidine 1
PSG de l'anglais « Promastigote Secretory Gel »
PTR1 Ptéridine reductase 1
RNI de l'anglais « Reactive nitrogen intermediates »
ROI de l'anglais « Reactive oxygen intermediates »
ROS de l'anglais « Reactive oxygen species »
SblII Antimonite ou antimoine trivalent
SbV Antimonate
TDR1 Reductase dépendante des thiols 1
TR de l'anglais « Tryapnothion reductase »
TSH Trypanothion
TST de l'anglais « Trypanothione S-transferase »
VIH Virus de l'immunodéficience humaine
y-GCS y -glutamylcystéine synthetase
A\|/m symbole du potentiel membranaire mitochondrial
13
Chapitre L Leishmania et la leishmaniose
1.1 Le parasite Leishmania : Généralités Leishmania est un parasite protozoaire unicellulaire appartenant à l'ordre des
Kinetoplastidae et à la famille des Trypanosomatidae. Il a été décrit pour la première fois
en 1903 de manière indépendante par William Leishman et Charles Donovan (qui
donneront respectivement leurs nom à l'espèce et à un genre responsable d'une pathologie
humaine, Leishmania donovani, voir section 1.2.2). L'ordre des Kinetoplastidae regroupe
un ensemble d'eucaryotes unicellulaires flagellés qui se distingue par la présence d'une
organelle nommé le kinétoplaste. Le kinétoplaste est une mitochondrie géante fournissant
l'énergie cellulaire nécessaire au fonctionnement de la cellule et au flagelle (du grec kineto
signifiant mouvement). La famille des Trypanosomatidae (du grec trypano signifiant vrille)
regroupent plusieurs parasites dits hémoflagellés. Le genre le plus important, en termes de
nombre d'espèces, est le genre Trypanosoma (regroupant notamment les espèces
responsables de la maladie du sommeil ou trypanosomiase africaine (Trypanosoma brucei)
et de la maladie de Chagas ou trypanosomiase américaine (Trypanosoma cruzi). Le second
genre le plus important est le genre Leishmania responsable de plusieurs pathologies qui
présentent des manifestations cliniques différentes chez l'humain : les leishmanioses (voir
section 1.3.2). Leishmania possède un cycle de vie complexe impliquant un vecteur du
genre Phlebotomus (en Afrique, Asie et Europe, soit le « Vieux Monde ») ou Lutzomyia (en
Amérique centrale et en Amérique du sud, soit le « Nouveau Monde »), communément
dénommé mouche des sables, et un hôte mammifère. Leishmania est un parasite
intracellulaire de son hôte mammifère. Il infecte et se multiplie au sein des cellules
phagocytaires mononucléés, principalement les macrophages (section 1.2). Les
leishmanioses constituent un problème de santé publique majeur dans les pays tropicaux et
subtropicaux, avec une réémergence dans certains pays développés, justifiant les recherches
conduites pour lutter contre les différentes formes de cette maladie. Par ailleurs, ce parasite
est devenu depuis quelques années un modèle d'étude important, de part sa divergence
évolutive précoce au sein du domaine des Eucaryotes et sa biologie unique.
14
1.2 Cycle de vie du parasite Le parasite Leishmania présente un cycle de vie dimorphique. On le retrouve au stade
promastigote chez l'insecte vecteur, au sein duquel il passe de la forme procyclique non
infectieuse à la forme infectieuse métacyclique lors du processus de métacyclogénèse, et
au stade amastigote chez l'hôte mammifère, à l'intérieur duquel il réside et se multiplie
dans les cellules phagocytaires, principalement les macrophages. Au cours de son cycle de
vie, le parasite sera exposé à des environnements et à des stress très différents (notamment
en termes de température, de pH et de stress oxydatifs). Les processus de differentiation qui
accompagnent son cycle de vie jouent un rôle prépondérant dans la biologie du parasite et
constitue un domaine de recherche important, notamment en ce qui concerne l'acquisition
de sa forme infectieuse au cours de la métacyclogénèse, ou encore lors du passage du stade
promastigote au stade amastigote (Figure 1).
Amastigote intracellulaire
Transformation _ ■ ■ «w Prolifération
Phagocytose
Attachement
Plqûm \ > r ~ P**0™
ftomastlgotes métacycllques * S W S _ • « m i s â t e s
Prolifération e t \ . / Transformation Métacyclogénèse
Promastigote s procycliques
Figure 1 : Cycle de vie du Leishmania (modifié de Handman, 2001)
15
1.2.1 Stade extracellulaire promastigote Le stade promastigote du Leishmania, caractérisé par des parasites présentant une forme
allongée (11-20 um), flagellée et mobile, se retrouve au niveau de l'insecte vecteur, la
mouche des sables (du genre Phlebotomus ou Lutzomyia). Cette forme est issue de la
differentiation du parasite au stade amastigote suite à l'ingestion de parasites au cours du
repas sanguin de l'insecte sur un hôte mammifère infecté. La differentiation du stade
amastigote au stade promastigote semble être contrôlée par la variation de température et
du pH entre l'insecte vecteur et l'hôte mammifère (37°C et pH 4.5-5 au sein du
phagolysosome de l'hôte mammifère et 25°C et pH légèrement alcalin chez l'insecte
vecteur) [1]. Le stade promastigote est également marqué par un autre processus de
differentiation, au cours duquel le parasite acquiert sa forme infectieuse, lors du passage de
la forme procyclique à la forme métacyclique. Ce processus est dénommé
métacyclogénèse.
1.2.2 Métacyclogénèse Le stade promastigote est le stade au cours duquel le parasite acquiert sa forme infectieuse.
Dans un premier temps, les promatigotes sont peu mobiles et se multiplient rapidement. Ils
sont attachés aux parois de la partie postérieure du tractus digestif de l'insecte vecteur. Cet
attachement est contrôlé par des molécules de surface du parasite, principalement le LPG
(lipophosphoglycan). Le LPG est un glycolipide qui assure la liaison avec une galectine
présente à la surface des cellules épithéliales du tractus digestif de l'insecte [2]. Le LPG est
une molécule très abondante à la surface des promastigotes. Elle est constituée de
répétitions du phospho-disaccharide galactose-mannose qui, selon les espèces de
Leishmania, peuvent être modifiées par des chaînes latérales de longueur variable [3].
L'affinité des galectines des espèces d'insectes vecteurs de Leishmania serait responsable
de la restriction d'espèce entre vecteur et parasites. Il a été estimé qu'il s'écoulait entre 7 et
9 jours entre le repas sanguin et la differentiation complète des promastigotes, de leur
forme procyclique vers leur forme métacyclique. À partir du septième jour, les parasites
entrent dans la phase de métacyclogénèse. L'acquisition de cette forme infectieuse
correspond à une adaptation pré-infection en vue de favoriser la survie du parasite au sein
de l'hôte mammifère. Certaines modifications morphologiques et biochimiques sont
16
associées à ce processus : l'élongation des molécules de LPG présentes à la surface du
parasite lui permet ainsi de résister à la lyse induite par le complément [4] et favorise
l'infection des cellules phagocytaires, et l'augmentation de l'expression de la
metalloprotease GP63 contribue à l'augmentation de la virulence du parasite en assurant la
conversion du fragment du complément C3b en C3bi, favorisant ainsi sa phagocytose [5]
sans flambée oxydative via le récepteur CR3 [6]. D'autres molécules de surface sont
impliquées dans la phagocytose du parasite [7]. Au sein du tractus digestif, les formes
métacycliques migrent vers l'œsophage et le pharynx de l'insecte. Il se forme une
accumulation de parasites qui sécrètent un protéophosphoglycan filamenteux (fPPG)
formant un gel de sécrétion des promastigotes (PSG). Ce gel ainsi que la présence d'un
grand nombre de parasites causent une obstruction qui va forcer l'ouverture de la valve
stomodéale [8-10] lors de la piqûre de l'insecte. En conséquence, l'insecte est obligé de
régurgiter les parasites infectieux avant de prendre un repas sanguin, augmentant ainsi les
chances de transmission. Le PSG est également régurgité et il a été montré qu'il contribuait
significativement à l'établissement de la pathologie. Lorsque les promastigotes
métacycliques sont injectés dans l'hôte mammifère, les cellules polymorphonuclées
(PMN), principalement les neutrophiles, sont les premières cellules recrutées au site
d'inoculation (10-24 heures post-infection) [11]. Les promastigotes sont phagocytés par ces
cellules et retardent leur apoptose, favorisant ainsi l'arrivée subséquente des macrophages
au site d'infection (1 à 2 jours post-infection). Les macrophages phagocytent ensuite les
PMN infectés [12]. L'hypothèse du « cheval de Troie », selon laquelle le parasite aurait la
capacité d'infecter le macrophage « silencieusement », sans activer ses fonctions immunes,
découle de cette observation [13]. Cette hypothèse, qui repose sur le fait que les parasites
resteraient « quiescents » à l'intérieur des neutrophiles, c'est-à-dire sans se différencier en
amastigotes [14], ni se multiplier [13], reste controversée puisqu'il est très probable que les
neutrophiles soient parfaitement en mesure de détruire les parasites phagocytés. Il a
également été rapporté que, bien que la forme métacyclique soit supposément la seule
forme infectieuse, la présence des promastigotes procycliques apoptotiques contribue à
l'établissement de l'infection [15]. Finalement, lorsque les formes métacycliques se
retrouvent dans la vacuole phagocytaire du macrophage, laquelle fusionne avec les
17
lysosomes pour former le phagolysosome, les parasites se différencient en leur forme
amastigotes.
1.23 Stade intracellulaire amastigote Le stade amastigote correspond à la forme du parasite la mieux adaptée à sa survie dans
l'environnement du phagolysosome. Cette differentiation est induite par le changement
d'environnement (de 25°C et pH légèrement alcalin chez l'insecte vecteur à 37°C et pH
4.5-5 au sein du phagolysosome) (revu dans [1]). Les amastigotes (4 à 5 urn) sont non
mobiles, ronds et de formes réduites par rapport aux promastigotes. Ils se multiplient de
manière active au sein de la vacuole du phagolysosome et font finalement éclater les
macrophages, puis infectent d'autres cellules. Le mécanisme de libération des amastigotes
n'est pas totalement caractérisé. L'éclatement à été présumé comme mécanisme principal
en raison du grand nombre d'amastigotes présents dans le phagolysosome, mais des études
ont suggéré que le parasite pouvait manipuler le mécanisme d'exocytose du macrophage
afin de favoriser sa libération sans augmenter la réaction inflammatoire qu'induit un
éclatement [16].
1.3 La leishmaniose
1.3.1 Epidemiologic et distribution géographique Les leishmanioses représentent un enjeu majeur de santé publique à l'échelle de la planète
et figure sur la liste prioritaire des maladies négligées établie par l'OMS. Elles affectent
principalement et plus fortement les régions tropicales et subtropicales. Il y a 350 millions
de personnes qui vivent dans des régions à risque et la prévalence globale est estimée à 12
millions de personnes (Figure 2). Chaque année, 1.5 million à 2 millions d'individus
développent des symptômes cliniques. Ceux-ci se répartissent entre les formes cutanées (1
à 1.5 millions, voir section 1.2.2.2 et 1.2.2.3) et la forme viscérale (0.5 million, voir section
1.2.2.1) selon l'espèce de Leishmania. Les leishmanioses sont associées à 2.4 millions
d'années de vies ajustées sur l'incapacité et on estime qu'elles sont responsables de 80 000
à 150 000 décès par année [17].
18
Figure 2 : Distribution géographique des leishmanioses (à partir de Handman. 2001). Les régions affectées
par la leishmaniose viscérale son indiquées en vert et par la leishmaniose cutanée ou mucocutanée en rouge.
Les régions où les deux formes de leishmaniose coexistent sont indiquées en violet.
Le parasite est endémique dans 88 pays dont certains comptent parmi les plus pauvres de la
planète. En effet, 90% des cas de leishmanioses cutanées sont retrouvés en Afghanistan, au
Pakistan, en Syrie, en Arabie Saoudite, en Algérie, en Iran, au Brésil et au Pérou. De même,
90% des cas de leishmanioses viscérales sont retrouvés en Inde, au Bengladesh, au Népal,
au Soudan et au Brésil. Au regard de cette distribution géographique, il est aisé de constater
que la leishmaniose est associée à la pauvreté et constitue en cela une maladie négligée. Par
ailleurs, on constate la réémergence de foyers épidémiques en Israël et au Maroc, ainsi
qu'aux États-Unis (en tant que zoonose) [18-20]. D'autre part, les cas d'infections de
soldats occidentaux et de voyageurs en zones d'endémies, ainsi que la recrudescence des
cas de co-infections (notamment chez des personnes atteintes par le VIH) au niveau du
pourtour méditerranéen et du Brésil (mais également en Afrique et en Asie) font que cette
maladie n'est plus seulement restreinte aux régions pauvres de la planète [21-26]. Il est
important de noter que la plupart des leishmanioses sont des zoonoses et que les
19
mammifères domestiques ou sauvages en sont les réservoirs. Ces animaux sont
relativement bien adaptés à l'infection par Leishmania et développent des infections
mineures pouvant persister plusieurs années (à l'exception des chiens, qui constituent un
réservoir important pour L. infantum, l'agent de la leishmaniose viscérale, et développent
les symptômes cliniques sévères de la maladie). Dans la plupart des cas, l'homme n'est
qu'un hôte intermédiaire et accidentel de ce parasite (à l'exception de L. donovani, en Inde
et en Iran).
1.3.2 Manifestations cliniques Les leishmanioses prennent diverses formes cliniques, selon l'espèce qui infecte l'humain.
Les espèces infectant les mammifères, et par conséquent les humains, peuvent être classées
en deux sous-genres, Leishmania et Viannia, selon que le parasite se développe
respectivement dans la partie centrale ou postérieure du tractus digestif de l'insecte vecteur
(Figure 3).
Ordre
l'.iinilU'
Genres
Sous-genres
Complexes
Kspèces
Kinetoplastidae
Trypanosomatidae
( "rithidia Herpetontonas Leishmania Phytomonas Leptomonai Suuroleishmania Trypanosoma Endotrypuniim
J r
Leishmania I
1 I iannia
I 1 1 I » < ' 1 /.. ilimoruni L. tropica t.. major !.. acthiopica L. mtxicana L. hraziliensis L. guyaittntis
L. archihalili L. killicki L. major t.. acthiopica t.. amazoncnsis t.. acthiopica t.. guyaittnni I... chagasi L. tropica t.. gamhami t.. peruviana L. panamensis /„ ilonovam L. mexicana L. infantum L. pifanoi
L. rcnezuelcnsia
l~ tarentoalu
Figure 3 : Classification des espèces de Leishmania.
Les infections par Leishmania se manifestent de différentes manières, qui vont de la simple
lésion cutanée évoluant spontanément vers la cicatrisation et la guérison, jusqu'à la forme
20
viscérale toujours létale lorsque non traitée, en passant par une forme mucocutanée
généralement non létale mais fortement débilitante et incapacitante (Figure 4).
Figure 4 : Manifestations cliniques des différentes formes de leishmanioses
A, forme viscérale (Kala Azar ou fièvre noire) ; B, forme cutanée (bouton d'orient);
C. forme muco-cutanée (tiré de www.who.int)
1.3.2.1 La leishmaniose viscérale La leishmaniose viscérale ou Kala-Azar (signifiant « fièvre noir » en Hindi et ainsi nommée
à cause de la coloration noire de la peau qui apparaît sur les extrémités et l'abdomen) est
causée par les espèces au tropisme viscéral : L. donovani et L. infantum dans le
« Vieux Monde » et L. chagasi dans le Nouveau Monde, particulièrement au Brésil. L.
infantum et L. chagasi sont deux espèces génétiquement identiques. La pathologie est
causée par la multiplication du parasite dans les cellules phagocytaires mononucléés des
organes viscéraux comme le foie, la rate, la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques.
De manière habituelle, les patients atteints de leishmaniose viscérale présentent un
ensemble de symptômes incluant la fièvre, la toux, des douleurs abdominales, de la
diarrhée, des épistaxis (saignements du nez), de la cachexie (perte progressive de poids,
anémie, fatigue, perte musculaire, perte d'appétit) et enfin un gonflement progressif de la
rate (splénomégalie) et du foie (hépatomégalie). Les enfants, les personnes
immunodéprimées et souffrantes de malnutrition sont particulièrement sensibles au
21
développement de la maladie. La leishmaniose viscérale est une maladie chronique dont
l'évolution peut prendre plusieurs années. Elle aboutit généralement à la mort en 2 à 3 ans
si elle n'est pas traitée. Sous sa forme aiguë, la mort peut survenir en 6 à 12 mois.
1.3.2.2 La Leishmaniose cutanée
La leishmaniose cutanée est causée par les espèces au tropisme cutané (avec quelques
exceptions). On retrouve principalement les espèces L. major, L. tropica et L. aethiopica (et
exceptionnellement L. donovani dans le « Vieux Monde » et les espèces
L. mexicana, L. panamensis, L. amazonensis, L. peruviana, L. braziliensis et L. guyanensis
dans le «Nouveau monde» [27]. Les formes cliniques de la leishmaniose cutanée sont
connues depuis l'antiquité et on a d'ailleurs retrouvé des statuettes de l'époque Maya
portant les représentations des séquelles causées par cette forme de leishmaniose.
Classiquement, la leishmaniose cutanée se manifeste par des lésions de la peau localisées et
généralement limitées au site d'inoculation (suite à la piqûre de la mouche des sables) [28].
L'apparition des lésions, ulcéreuses ou non, est précédée d'une période d'incubation allant
de 2 semaines à 3 mois. Ces lésions sont indolores et évoluent spontanément vers la
résorption en quelques mois mais elles laissent généralement une cicatrice importante et
irréversible. La leishmaniose cutanée porte également le nom de « bouton d'orient »
1.3.2.3 La Leishmaniose muco-cutanée, cutanée diffuse et cutanée post-kala-azar La leishmaniose muco-cutanée est principalement causée par L. braziliensis, L. guyanensis
et L. panamensis. Elle se retrouve en Amérique centrale et en Amérique du Sud où elle est
également nommée « espundia ». Cette forme de leishmaniose fait généralement suite à une
première leishmaniose de type cutanée et se caractérise par une destruction progressive des
muqueuses et des cartilages au niveau du nez, de la bouche, des lèvres, des gencives, du
palais ou des oreilles. Elle conduit à une défiguration irréversible et entraine des
conséquences sociales dévastatrices au sein des populations affectées (suicide ou
marginalisation des personnes atteintes). La mort peut également survenir suite à des
infections bactériennes secondaires ou pour cause de malnutrition. Ce type de leishmaniose
survient dans 1-5% des cas de leishmaniose cutanée primaire, et peut se développer jusqu'à
5 ans après la primo-infection [29, 30]. La leishmaniose cutanée diffuse correspond à une
22
forme sévère de la leishmaniose cutanée. Elle se caractérise par la présence de multiples
nodules non-ulcéreux et riches en parasites qui finissent par converger et fusionner pour
recouvrir le corps au complet, y compris le visage. Cette évolution de la leishmaniose
cutanée semblerait correspondre à un défaut de la réponse immunitaire cellulaire. Elle est
également résistante aux traitements classiques anti-Leishmania et ne guérit jamais
spontanément. Une étude récente a montré que la métastacisation des lésions cutanées au
cours d'une leishmaniose cutanée pouvait être corrélé avec la présence d'un virus intégré
dans le génome de Leishmania et qui induisait une réponse immunitaire accrue suite à sa
détection par le système immunitaire de l'hôte. Enfin, la leishmaniose cutanée post-kala-
azar est une forme particulière de la leishmaniose viscérale. Elle est particulièrement
fréquente en Inde et au Soudan. La durée de latence suite à la première infection de type
viscérale varie entre 6 mois et 2-3 ans et peut parfois même se développer avant que les
symptômes de leishmaniose viscérale aient complètement disparus. Les lésions cutanées
qui surviennent alors de manière localisée autour de la bouche et s'étendent ensuite
généralement sur l'ensemble du corps évoluent spontanément vers la guérison dans les 6
mois qui suivent leur apparition mais peuvent également persister plusieurs années. Cette
forme de leishmaniose est particulièrement infectieuse puisque les nodules contiennent un
nombre important de parasites et jouent donc un rôle non négligeable dans la propagation
de la maladie en agissant comme réservoir de parasites.
1.3.3 Diagnostic Le diagnostic de l'infection à Leishmania représente un point critique de la lutte contre
cette maladie. L'OMS a établie qu'un cas clinique de leishmaniose viscérale se définit par
une fièvre persistante (plus de deux semaines) associée à une splénomégalie chez une
personne résidant en zone endémique (ou qui y a demeurée). La combinaison de ces deux
symptômes se retrouve dans la majorité des cas de leishmaniose viscérale bien que la
splénomégalie ne soit pas toujours présente. Ceci a conduit certains programmes de
contrôle de la leishmaniose viscérale à ajouter d'autres symptômes à cette définition
comme la cachexie et principalement le dépérissement et l'anémie qui y sont associés, ainsi
qu'une lymphadénopathie. Malheureusement, cette définition clinique manque de
spécificité puisque ces signes cliniques sont associés à d'autres pathologies également
23
présentes en zones d'endémies de la leishmaniose viscérale, comme la tuberculose, la
malaria, la fièvre entérique, la brucellose, la lèpre, les schistosomiases ou encore certains
cancers. Si on prend en compte le coût élevé et la forte toxicité des traitements actuellement
disponibles pour la leishmaniose viscérale, il est inconcevable de décider d'un traitement
anti-Leishmania en se basant seulement sur la suspicion clinique d'une telle infection. [31,
32] C'est en cela que réside tout l'enjeu d'un diagnostic confirmatoire probant pour cette
pathologie. Ils existent d'ores et déjà plusieurs techniques permettant d'établir ce
diagnostic, mais celles-ci ne sont pas toujours adaptées aux moyens des praticiens
hospitaliers dans les zones d'endémies, généralement pauvres et sous-équipées en ce qui
concerne le matériel requis. De manière générale, ces techniques reposent sur l'observation
du parasite, la détection de son ADN ou d'anticorps spécifiques de Leishmania dans les
échantillons cliniques. Ainsi, les biopsies réalisées à partir d'aspirations de moelle osseuse,
du foie ou ganglions lymphatiques sont utilisées dans les cas suspectés de leishmanioses
viscérales. Les biopsies directes de la peau au niveau de lésions cutanées seront employées
dans le cas des leishmanioses cutanées. Dans les deux cas, le matériel biologique collecté
pourra être examiné directement sous microscope après étalement sur lame, être cultivé
pour identification subséquente, ou soumis à des techniques de PCR. L'observation directe
des parasites nécessite leur coloration au Giemsa et permet la visualisation directe des
parasites sous leur forme amastigote intracellulaire. Elle demeure la technique de choix en
zone d'endémie en raison de son faible coût mais requière une bonne expérience en plus de
sa sensibilité relativement variable et de son incapacité à distinguer les espèces de
Leishmania. La culture des parasites, relativement longue, permettra cependant la
caractérisation de l'espèce par la technique d'electrophorese iso-enzymatique ou par PCR.
Il existe également deux méthodes sérologiques standardisées et commercialement
disponibles pour l'usage « sur le terrain ». Il s'agit du test dit « d'agglutination directe »
(DAT, Direct Agglutination Test) [33-35] et du test dénommé « test rK39 » [36-40]. Le test
d'agglutination direct consiste en la mise en présence d'une fraction lyophilisée de
leishmanies avec le sérum du patient. Si le sérum du patient contient des anticorps anti-
Leishmania, une agglutination est visible en moins de 20 h. Le test rK39 est basé sur la
détection d'anticorps dirigés contre un epitope de 39 acides aminés conservés chez les
espèces viscéro-tropiques. Ce test est réalisé sur une bande immuno-chromatographique à
24
partir d'une goutte de sang du patient, ce qui en fait un test bien adapté au diagnostic « sur
le terrain ». Il est par ailleurs peu coûteux (1 US$ / test), rapide (environ 20 minutes) et
présente une très forte sensibilité. Sa limite réside dans sa sélectivité pour les espèces
responsables de la leishmaniose viscérale.
1.3.4 Vaccins Il n'existe pas de vaccin disponible contre la leishmaniose. Cependant, l'immunité
protectrice que certaines personnes développent après avoir été exposées au Leishmania
indique qu'il est possible d'induire une telle protection par la vaccination. L'efficacité d'un
vaccin anti-Leishmania repose sur la capacité d'induire une réponse immunitaire à
médiation cellulaire de type Thl et d'induire une mémoire immunologique de longue
durée. Une réponse immunitaire de type Th2 est invariablement associée à une sensibilité
au parasite et à une exacerbation des symptômes. L'induction des cytokines associées à une
réponse de type Thl (IL-22,1-12, IFNy et TNF0) ou à une réponse de type Th2 (IL-4, IL-
10, IL-13) représente donc un point essentiel au niveau du développement d'un vaccin anti-
Leishmania. La plupart des vaccins reposent aujourd'hui sur des formulations de type
vaccin-recombinant et n'induisent qu'une immunité partielle insatisfaisante. Une approche
originale consiste en l'utilisation de Leishmania tarentolae, parasite du lézard non
pathogène pour l'humain, qui a démontré des capacités d'induction d'une réponse de type
cellulaire chez la souris, et pourrait servir de vecteur d'antigènes d'espèces pathogènes.
[41-44]
1.3.5 Traitements La lutte contre la leishmaniose repose, en l'absence de vaccin efficace, sur l'administration
de composés chimiques. La chimiothérapie anti-Leishmania est peu diversifiée et la
première ligne de traitement, constituée des dérivés de l'antimoine, est utilisée depuis plus
de 70 ans. Par ailleurs, la résistance à ces dérivés d'antimoine, majoritairement utilisés dans
les régions endémiques pauvres, pose un problème de plus en plus important auquel
s'associe le coût élevé ou la toxicité des thérapies alternatives, comme la pentamidine,
l'amphotéricine B, la miltéfosine ou encore la paromomycine. Ces molécules aux
propriétés anti-Leishmania seront présentées brièvement dans cette partie. Les mécanismes
25
d'action et de résistance qui y sont associés seront développés ultérieurement (parties 2.1 et
2.3 respectivement).
1.3.5.1 L'antimoine et ses dérivés L'antimoine pentavalent (sous la forme de stibogluconate de sodium ou d'antimoniate de
meglumine) constitue le principal traitement utilisé contre les différentes formes de
leishmanioses. L'antimoine est un métalloïde aux propriétés physico-chimiques similaires à
celle de l'arsenic, dont les dérivés sont utilisés dans le traitement des trypanosomiases
africaines. Les dérivés d'antimoine présentent un certains nombre d'inconvénients : la
nécessité d'une administration parentérale quotidienne pour une durée prolongée, une
toxicité non négligeable (pancréatites, myalgies, nausée, toxicité rénale, vomissements,
troubles cardiaques). Ces molécules constituent néanmoins toujours les traitements de
première lignes dans la plupart des régions endémiques pauvres de la leishmaniose, et ce en
dépit de leur forte toxicité et des hauts niveaux de résistance [45].
1.3.5.2 La pentamidine La pentamidine est un diamidine aromatique utilisé comme traitement de second choix
depuis plus de 40 ans dans les cas leishmanioses cutanées ou dans les cas de leishmanioses
viscérales lorsque les patients sont réfractaires à l'antimoine [46]. Son utilisation est en
déclin en raison d'une résistance croissante [45, 46] et de la toxicité importante qui y est
associée, relative notamment aux problèmes d'hypotension, d'hypoglycémie et de toxicité
rénale.
1.3.5.3 L'amphotéricine B L'amphotéricine B est un antibiotique polyene originellement développé pour le traitement
des infections fongiques. Il présente une très bonne efficacité dans le traitement des
leishmanioses, ce qui en fait une drogue de choix. Elle présente néanmoins une forte
toxicité, notamment au niveau rénal, et des cas de chocs anaphylactiques sévères ont été
rapporté lors de la première injection. Par ailleurs la nécessité de l'administrer par voie
intraveineuse représente un inconvénient majeur, en plus de son coût relativement élevé. La
26
formulation liposomale présente une toxicité moindre mais reste réservée aux pays riches
[47].
1.3.5.4 La miltéfosine
La miltéfosine ou hexadecylphosphocholine, est un phospholipide analogue de la
phosphocholine développé initialement pour le traitement des cancers. Son autorisation
clinique en Inde [17, 48], en Allemagne et en Colombie en 2003 fait suite à la découverte
de ses propriétés leishmanicides contre les espèces L. infantum et L. donovani [49-51].
Malgré des effets secondaires gastro-intestinaux, la miltéfosine est relativement sécuritaire
et permet un traitement complet des leishmanioses [52, 53]. Cependant, de possibles effets
tératogènes ont été démontrés dans des études utilisant des modèles animaux [54] ce qui
rend son utilisation délicate chez les femmes. Le principal avantage de la miltéfosine réside
dans son administration par voie orale.
1.3.5.5 La paromomycine La paromomycine est un antibiotique de la famille des aminoglycosides utilisé dans le
traitement des infections bactériennes. L'identification de son activité anti-Leishmania
remonte aux années 60, mais l'autorisation de son utilisation clinique date seulement de
2006 (en Inde) suite au développement d'études cliniques coordonnées par l'OMS/TDR
(www.who.int/tdr). L'efficacité de la paromomycine est similaire à celle de
l'amphotéricine B [55, 56]. Cependant, son utilisation présente certains inconvénients
majeurs : elle doit être administrée par voie intramusculaire et cause des douleurs et
irritations au site d'injection ainsi que des dommages au niveau de l'oreille interne [31].
L'avantage principal lié à son utilisation réside dans son moindre coût.
1.3.5.6 Autres molécules : sitamaquine, terbinafïne et azotés D'autres molécules présentent un potentiel anti-Leishmania relativement intéressant et sont
présentement à différent stade de développement. Parmi les plus avancés on retrouve la
sitamaquine et les azolés. La sitamaquine est un 8-aminoquinoline. Elle a été développée
initialement pendant la seconde guerre mondiale comme remplacement potentiel de la
primaquine (comme anti paludique). C'est un analogue structural de la primaquine. Elle est
27
administrée oralement et à passé avec succès les phases I/II des études cliniques contre la
leishmaniose viscérale au Brésil et au Kenya [57]. Cependant des études de toxicités
complémentaires sont en cours afin de vérifier la néphrotoxicité constatée lors des études
cliniques. La terbinafïne est une autre molécule prometteuse pour le traitement de la
leishmaniose. Elle a récemment été décrite comme un antifongique du groupe des
allylamine. La drogue est relativement sécuritaire et présente peu d'effets secondaires. Les
premiers essais cliniques de phase I/II sont actuellement en cours [58]. Deux autres
molécules, le fluconazole et le kétoconazole, appartiennent à la famille des azolés et
possèdent des propriétés anti-Leishmania. Ce sont des anti-fongiques qui possèdent un
mécanisme d'action similaire à celui de l'amphotéricine B. Cependant, leur efficacité
contre Leishmania demeure relativement limitée et les résultats des quelques études
cliniques conduites sont controversées [59].
Chapitre II. Mode d'action des drogues et mécanismes de résistance
2.1 Mécanismes d'action des drogues anti-Leishmania
2.1.1 L'antimoine et ses dérivés. Il est intéressant de noter que malgré l'utilisation de l'antimoine depuis plus d'un demi-
siècle, le mode d'action et les cibles cellulaires de cette drogue n'ont toujours pas été
identifiées. Son action anti-Leishmania semble être multifactorielle. L'antimoine
pentavalent (SbV) est une pro-drogue qui nécessite d'être réduit sous sa forme trivalente
(SblII), pour être active. Cette réduction est assurée par les thiols intracellulaires et par les
reductases dépendates des thiols (ACR2, TDR1), [60, 61]. Comme mentionné
précédemment, le mécanisme d'action de l'antimoine reste élusif, principalement dû au fait
que l'antimoine est un métal lourd très réactif et qu'il ne possède probablement pas de
cibles cellulaires spécifiques comme la plupart des autres drogues. Plusieurs cibles
cellulaires putatives ont néanmoins été proposées. Elles incluent l'ADN topoisomérase [62-
64] et la trypanothione reductase [65, 66], deux enzymes essentielles dans la biologie du
parasite, la première participant au bon fonctionnement du cycle de replication de l'ADN et
28
la seconde assurant la réduction du trypanothion, le principal thiol des Trypanosomatidae.
D'un autre coté, on pense que le mode d'action de l'antimoine est basé sur sa capacité à
inhiber l'activité métabolique du parasite, notamment la glycolyse et la respiration
mitochondriale [67]. Une depletion des thiols intracellulaires, en rapport avec l'inhibition
de la trypanothione reductase, a été observée. L'antimoine induit également un stress
oxydatif au sein du parasite [68, 69], lequel conduit à la fragmentation de l'ADN
génomique. La mort induite par l'antimoine présente les caractéristiques de la mort
cellulaire programmée par apoptose [70-72]. L'induction de la mort cellulaire par apoptose
par les drogues anti-Leishmania sera l'objet de la partie 2.1.7 de ce chapitre.
2.1.2 La pentamidine Les bases mécanistiques de l'activité anti-Leishmania de la pentamidine sont mal définies.
Sa cible cellulaire demeure inconnue, comme pour l'antimoine. Cependant, certaines études
menées chez le parasite Crithidia oncopelti suggèrent que la drogue inhibe la synthèse de
l'ADN, de l'ARN, des phospholipides et des protéines [73]. D'autres études suggèrent que
la drogue s'accumule au niveau de la mitochondrie de la cellule [74] et, en effet, il a été
montré que la pentamidine potentialise l'effet des inhibiteurs de la chaîne de respiration
mitochondriale [75]. Les travaux du laboratoire ont également pu mettre en évidence
l'accumulation d'oxydants intracellulaire chez Leishmania suite à un traitement avec la
pentamidine. La mort induite semble également être de nature apoptotique et ceci corrèle
avec les perturbations mitochondriales potentiellement induites par la drogue. Il n'en reste
pas moins que cette drogue est considérée comme ayant un mode d'action inconnu.
2.13 L'amphotéricine B Les propriétés antifongiques et antiparasitaires de l'amphotéricine B sont basées sur sa
capacité à interagir avec les ergostérols membranaires qui constituent les sterols les plus
abondants dans la membrane du Leishmania [76, 77]. Sa spécificité est également basée sur
cette affinité pour l'ergostérol plutôt que pour le cholestérol, constituant des membranes
cellulaires des mammifères. L'interaction de l'amphotéricine B avec l'ergostérol du
Leishmania induirait la formation de pores qui déstabiliserait la fluidité de la membrane du
29
parasite [77]. D'autre part, la mort cellulaire induite par l'amphotéricine B présente
également les caractéristiques de la mort par apoptose [70].
2.1.4 La miltéfosine L'activité leishmanicide de la miltéfosine a été associée à la perturbation du métabolisme
des phospholipides alkyles [78, 79]. Son analogie structurale avec la phosphocholine est à
la base de son interférence avec ce métabolisme essentiel au parasite. Par ailleurs, il a été
montré que la miltéfosine induisait également la mort cellulaire par apoptose [70, 80, 81].
2.1.5 La paromomycine La paromomycine appartient à la même famille d'antibiotiques que la néomycine. Chez les
bactéries, il a été clairement établi que la paromomycine se liait aux ribosomes et bloquait
la synthèse protéique. Il à également été démontré chez Leishmania que cette drogue
interagissait avec les ribosomes du parasites, bloquant également la synthèse protéique et
induisant sa mort de cette manière [82-85]. Le mécanisme sous-jacent consiste en la
fixation par la drogue du complexe ribosomal 30S-50S avec le codon initiateur de l'ARN
messager, ce qui conduit à l'accumulation de complexes d'initiation anormaux. Cela
induirait également des erreurs de lectures de l'ARN messager et subséquemment
l'incorporation incorrecte d'acide aminés dans la chaine polypeptidique en elongation [56].
Il a également été suggéré que certaines enzymes mitochondriales pourraient être la cible
de cette drogue, et qu'elle causerait également une altération de la fluidité membranaire
ainsi que du métabolisme lipidique [82-84]. Jusqu'à présent, la mort induite par la
paromomycine n'a pas été associé à la mort par apoptose.
2.1.6 Autres molécules : sitamaquine, terbinafïne et methotrexate Le mécanisme d'action de la sitamaquine est inconnu. La sitamaquine est une base faible
lipophilique qui s'accumule rapidement dans les compartiments subcellulaires acidiques du
parasite, principalement les acidocalcisomes. Il a été suggéré que l'alkanylisation induite
par la sitamaquine dans les acidocalcisomes pourrait être impliquée dans son action anti-
Leishmania. Par ailleurs, il a également été démontré que la sitamaquine possédait une
affinité pour les phospholipides de la membrane plasmique du parasite, et que lors de son
30
accumulation, elle altérait les fonctions mitochondriales, ce qui pourrait également
contribuer à son mode d'action [86-88]. Le mécanisme d'action de la terbinafïne repose sur
sa capacité à inhiber la synthèse de l'ergostérol membranaire, principal sterol constituant la
membrane plasmique du Leishmania. La terbinafïne inhibe la squalène-2,3-epoxidase ce
qui résulte en une accumulation de squalène et une diminution de la quantité de sterols C28
et C29 essentiels à la composition de la membrane. Ceci constitue la base de l'activité
cytotoxique de la terbinafïne [89].
Le methotrexate n'est pas une drogue utilisée dans les traitements de la leishmaniose (et ne
figure pas non plus parmi la liste des drogues en phase clinique). Néanmoins, cette drogue
utilisée en chimiothérapie contre les cancers ou l'arthrite à été très utilisée dans l'étude des
mécanismes de résistance de Leishmania et constitue en ceci un modèle [90, 91]. Le
mécanisme d'action du methotrexate repose sur l'utilisation des transporteurs de folates
comme voie d'entrée dans la cellule (par analogie structurale) et l'inhibition de la
dihydrofolate-réductase (DHFR), enzyme essentielle au métabolisme des folates.
Leishmania est auxotrophe pour les folates et dépend de son système de transporteurs
membranaire (famille FBT, revue dans [90]) pour ses besoins. De plus, les folates réduits,
produits de l'activité enzymatique de la DHFR, sont des composés essentiels à divers
métabolismes cellulaires car ils assurent la fonction de donneurs d'unités mono-carbonées.
2.1.7 L'induction de l'apoptose par les drogues anti-Leishmania Les mécanismes cellulaires conduisant à la mort cellulaire programmée (PCD) par apoptose
ont originellement été découverts en 1972 par Kerr et al. La PCD constitue une partie
essentielle de la biologie cellulaire et on pense qu'elle à évolué non seulement pour réguler
la croissance et le développement des organismes pluricellulaires [92, 93], mais également
pour protéger contre les infections virales, bactériennes et parasitaires [94-98] et
l'émergence de cancers [99-102]. L'élimination des cellules indésirables par la voie
apoptotique est efficace et prévient l'initiation de la réaction inflammatoire. La PCD peut
être initiée par de multiples signaux intra- et extracellulaires, et elle est coordonnée par un
réseau complexes de régulateurs et d'effecteurs. Brièvement, chez les eucaryotes supérieurs
ils existent deux voies principales d'induction de l'apoptose : 1) la voie extracellulaire qui
31
fait intervenir des couples récepteurs-ligands dits « récepteurs-ligands de mort, et dont nous
ne parlerons pas car son existence n'a jamais été démontré ni même suggéré chez les
organismes unicellulaires, et il à été suggéré que l'apparition de cette voie d'activation de
l'apoptose serait un événement évolutif lié à l'apparition de la multi-cellularité. 2) la voie
intracellulaire, dont le point de contrôle principal est la mitochondrie. Cette organelle joue
un rôle prépondérant dans le mécanisme apoptotique et est considéré comme un « point de
non retour » dans le cheminement vers la mort de la cellule. À partir de ces deux voies,
l'algorithme de l'apoptose fait intervenir plusieurs acteurs moléculaires conduisant aux
modifications morphologiques et à la destruction de la cellule telle que décrite plus haut.
Parmi ces acteurs moléculaires, les caspases (de l'anglais Cystéine-dependent ASpartate-
cleaving ProteASES) sont parmi les effecteurs finaux qui orchestrent la destruction de la
cellule. Plusieurs molécules sont également relâchées à partir de la mitochondrie, suite à sa
perméabilisation, notamment le cytochrome c et l'AIF (Apoptosis Inducing Factor ou
Facteur Induisant l'Apoptose). Il est classiquement admis que la voie caspases-dépendante,
est la voie de prédilection, bien qu'une voie caspases-indépendante a clairement été
démontrée [103-107]. Parmi les signaux initiateurs de la PCD, on trouve les stress
cellulaires et la depletion en facteurs de croissance ou en sérum, [93, 108, 109]. Au final, et
indépendamment du stimulus, la PCD sera marquée par des modifications de la
perméabilité de la membrane plasmique, la condensation nucléaire, la fragmentation de
l'ADN et ultimement celle de la cellule en corps apoptotiques qui seront phagocytés par les
cellules environnantes [108]. En plus de ces modifications morphologiques grossières, il
existe d'autres changements physiologiques cellulaires plus subtils, comme l'altération de
la perméabilité membranaire de la mitochondrie résultant en la perte du potentiel
transmembranaire mitochondrial (Avj/m), l'augmentation du niveau intracellulaire
d'oxydants et l'activation de proteases et de nucleases. Ces modifications physiologiques
constituent les caractéristiques principales de la mort cellulaire programmée par apoptose
[110,111].
Malgré les controverses des dix dernières années relatives à l'existence de la mort cellulaire
programmée par apoptose chez les organismes unicellulaires comme les protozoaires (revue
dans [72, 112]), il est désormais bien établi que ces mécanismes existent et qu'ils jouent
plusieurs rôles importants dans la biologie de ces organismes, comme Leishmania [15, 72,
32
112-122]. Parmi ces rôles importants, on retrouve notamment le contrôle de la population
via un mécanisme de sélection clonale et l'échappement face au système immunitaire. Les
concepts de « mort altruiste » et de «mimétisme apoptotique» [15] illustrent ces rôles
fondamentaux que jouent ce type de mort dans l'établissement de l'infection par les
Leishmania. Ces deux concepts concernent la capacité du parasite à utiliser la mort
cellulaire par apoptose, immunologiquement silencieuse, pour déjouer le système
immunitaire et favoriser ainsi son développement au sein de l'hôte mammifère. Certains
des mécanismes cellulaires conduisant à la mort par apoptose ont été caractérisés.
Néanmoins, et contrairement aux mécanismes de l'apoptose qui sont maintenant bien
connus chez les eucaryotes supérieures, les acteurs moléculaires et cellulaires qui
constituent l'algorithme de ce type de mort sont beaucoup moins bien connus chez les
parasites. Néanmoins, les modifications morphologiques et biochimiques mentionnées
précédemment et caractéristiques de l'apoptose, sont tous présents chez Leishmania. On
retrouve notamment l'accumulation d'oxydants intracellulaires, la perte du potentiel
mitochondriale (Ai|/m), la dégradation de l'ADN génomique, l'externalisation de la
phosphatidylsérine (PS) et la décomposition de la cellule en corps apoptotiques [120, 123].
Le calcium intracellulaire (Ca2+) ainsi que le fer (Fe2+) jouent un rôle important dans le
mécanisme conduisant à la mort [70]. Des controverses subsistent cependant relativement à
l'activité de type « caspases » puisque ces effecteurs protéiques ne sont pas codés par le
génome du parasite [15, 72, 112]. Il a été montré que l'apoptose est induite chez
Leishmania en réponse à divers traitements, dont certains nous intéressent particulièrement.
En effet, le SblII [71], la miltéfosine [80, 81, 124], l'amphotéricine B [125] ainsi que la
pentamidine, induisent la mort par apoptose chez Leishmania. Plus précisément, il a été
montré que ces composés induisaient au moins une des caractéristiques de l'apoptose
(incluant une augmentation du Ca2+ intracellulaire, l'accumulation d'oxydants, une perte
du A\)/m, la dégradation de l'ADN génomique et l'externalisation de la PS, ainsi que des
activités de type caspases).
Il est intéressant de noter que plusieurs des drogues anti-Leishmania, possédant des cibles
cellulaires et des mécanismes d'actions a priori très différents, induisent le même type de
mort cellulaire. Ce constat de l'existence d'un mécanisme effecteur commun, et les données
bibliographiques relatives aux mécanismes d'action des antibiotiques et des drogues
33
anti cancéreuses nous ont conduit à formuler l'hypothèse d'un mécanisme commun de mort
cellulaire induite par les anti-Leishmania, indépendant de la drogue utilisés, de sa cible
cellulaire et du mécanisme d'action. Ceci fait l'objet du troisième article présenté dans cette
thèse.
2.2 Nouveau paradigme pour le mode d'action des antibiotiques et des drogues anticancéreuses. Les antibiotiques ont traditionnellement été classés en fonction de leur mode d'action. Ce
mode d'action étant généralement défini par leurs cibles cellulaires, ils ont classiquement
été classés en groupes déterminés par cette cible: les antibiotiques ciblant la synthèse de la
paroi cellulaire (e.g. pMactam), les ribosomes et la synthèse protéique (e.g aminoglycosides,
macrolides) ou l'ADN et les mécanismes de replication ou réparation (e.g quinolones,
sulfamides) ou les voies métaboliques essentiels (sulfamides, friméthoprime). Les
antibiotiques ont également été sous-divisés en deux classes : bactéricides (létales pour la
cellule bactérienne) ou bactériostatiques (qui arrêtent la croissance mais permettent sa
reprise si la drogue disparaissait avant que la population bactérienne n'est totalement
disparue). Les drogues anticancéreuses sont également classées en fonction de leur mode
d'action, basé principalement sur leurs cibles cellulaires. De manière similaire pour ces
deux types de drogues, la cascade d'événements qui conduit à la mort de la cellule, en aval
de leur interaction primaire avec leur cible cellulaire (putative ou établie), est resté
largement elusive. Il a déjà été suggéré que les drogues anticancéreuses pouvaient induire la
mort cellulaire par apoptose, et que cela impliquait la production d'oxydants intracellulaires
[126-128]. Par ailleurs, il est intéressant de noter que la résistance à l'apoptose est une
caractéristique commune à plusieurs types de cellules cancéreuses réfractaires aux
chimiothérapies (discuté ci-après, partie 2.3.2). Les récents résultats des études conduites
par le groupe de J J . Collins [129-135] ont radicalement changé la vision classique du mode
d'action des antibiotiques. Cette étude a montré que trois antibiotiques bactéricides de
différentes classes (une quinolone, un P-lactame et un aminoglycoside) et possédant des
cibles cellulaires différentes, induisaient un mécanisme de mort cellulaire commun.
Quelque soit la cible primaire, le mécanisme effecteur conduisant à la mort cellulaire, en
aval de l'interaction primaire, est le même. Par ailleurs, la production d'oxydants comme le
34
radical hydroxyle constitue le point de convergence de ce mécanisme effecteur final.
L'étude indiquait également que l'utilisation de « scavengers » métaboliques ou de souches
génétiquement modifiées pour inhiber la production d'oxydants suite aux traitements avec
des antibiotiques bactéricides induisaient l'arrêt de la croissance, mais pas la mort. En
conséquence, ces études établissent l'accumulation d'oxydants intracellulaires comme le
mécanisme effecteur de la mort cellulaire induite par les antibiotiques et suggèrent la
possibilité d'un mécanisme « cible-indépendant » pour la résistance aux antibiotiques.
L'ensemble de ces études suggère un lien de causalité entre des événements évolutifs
conservés conduisant à la mort de la cellule et le mode d'action de divers composés
cytotoxiques. Ces études soulignent également l'importance de comprendre le mode
d'action de ces drogues dans le but de comprendre et prévenir l'émergence de la résistance.
2.3 Mécanismes de résistance La chimiothérapie anti-Leishmania repose sur un nombre limité de molécules, et les
phénomènes de résistance associés à ces traitements existent et sont actuellement en
émergence. Il est important de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-
jacent à ces phénomènes de résistance. Cette partie couvrira les mécanismes de résistance
aux anti-Leishmania, puis abordera les mécanismes de résistance aux antibiotiques et aux
drogues anticancéreuses. Enfin, nous conclurons ce chapitre par la présentation d'un
nouveau paradigme relatif au mode d'action des drogues et à l'acquisition de la résistance.
2.3.1 Mécanismes de résistance spécifiques De manière générale, les mécanismes de résistances aux drogues convergent vers un
objectif commun : la diminution de l'interaction entre la drogue et sa ou ses cible(s)
cellulaire(s), même lorsque celle(s)-ci n'est (ne sont) pas clairement identifiées. Les
moyens mis en place par la cellule pour parvenir à un tel résultat sont résumés dans la
Figure 5.
35
mlribftinn
drogue —II
Eflha
Figure 5 : Mécanismes de résistances aux drogues (adaptés de Borst, 1995 [136])
Le parasite Leishmania a développé de la résistance, au moins en laboratoire, à toutes les
drogues utilisées à jour. Nous allons revoir ici l'ensemble des mécanismes de résistance
connus.
2.3.1.1 Mécanismes de résistance à l'antimoine Depuis maintenant plusieurs années, Leishmania présente un niveau de résistance élevé aux
traitements à base d'antimoine. Ceci est particulièrement important en zone d'endémie et
notamment en Inde, dans la province du Bihar, où la résistance atteint 60% des cas
cliniques et est responsable des échecs thérapeutiques. Le mécanisme de résistance aux
dérivés de l'antimoine est de nature multifactorielle. Du fait de la très grande utilisation de
l'antimoine contre la leishmaniose, les mécanismes de résistance à cette drogue sont les
mieux connus, car ils ont fait l'objet de plusieurs études. L'ensemble des mécanismes
connus sera présenté.
Plusieurs mécanismes de résistance tendent à réduire la capacité de la drogue à agir sur la
cellule. Parmi ceux-ci, on retrouve 1) la diminution de l'entrée de la drogue dans le
parasite; 2) la diminution de la réduction de la forme pentavalente (SbV) sous sa forme
active trivalente (SblII); 3) une augmentation du niveau des thiols intracellulaires (voir
partie 3.2.1); 4) la conjugaison du SblII avec le trypanothion (TSH, voir partie 3.2.1); et 5)
36
la séquestration des conjugués SblII-tbiols par un transporteur ABC intracellulaire
(MRPA). À chacun de ses mécanismes correspond une modification phénotypique du
parasite causée la plupart du temps par un mécanisme d'adaptation de type mutation,
deletion ou amplification [137, 138].
Dans le cas de la diminution de l'entrée de la drogue dans le parasite, il a récemment été
démontré que la transfection du gène AQP1 codant pour une aquaglycéroporine, provoque
une augmentation de l'accumulation de SblII chez différentes espèces de Leishmania [139,
140]. Réciproquement, l'inactivation du gène conduit à la diminution de l'accumulation de
SblII dans le parasite et de manière corrélative, à la diminution de la sensibilité du parasite
pour la drogue. Ceci suggère que cette aquaglycéroporine constitue la principale voie
d'entrée du SblII dans la cellule. Par ailleurs, le niveau d'expression à'AQPl est
fréquemment diminué chez les mutants résistants à l'antimoine. L'accumulation de la
forme pentavalente (SbV) de la drogue n'est cependant pas affectée par la variation du
niveau d'expression d'AQPl, suggérant une voie d'entrée différente pour la forme non-
réduite de l'antimoine.
En ce qui concerne la diminution de la réduction de la forme pentavalente inactive (SbV)
en forme trivalente active (SblII) comme mécanisme de résistance, il convient tout d'abord
d'apporter quelques précisions relatives à cette étape liée au mécanisme d'action de la
drogue. Le mécanisme de réduction ainsi que le lieu exact de la réduction demeure
relativement mystérieux. Plusieurs études ont montré que seuls la forme amastigote
intracellulaire du parasite, et non la forme amastigote axénique, serait sensible à
l'antimoine pentavalent [141, 142]. En conséquence, le lieu de réduction de la pro-drogue
serait donc le macrophage. Néanmoins, d'autres études suggèrent que les amastigotes
axéniques (mais pas les promastigotes) seraient également sensibles à l'antimoine
pentavalent, leur attribuant ainsi une capacité de réduction [143]. Enfin, une autre étude
semble réconcilier l'apparente contradiction de ces observations en suggérant que la
réduction pourrait avoir lieu à la fois dans le macrophage et dans le parasite amastigote
[144]. Leishmania possède en effet les enzymes nécessaires à la réduction de l'Antimoine
pentavalent. Son génome code en effet pour une reductase thiols-dépendante (TDR1) et
possède un homologue de la reductase ACR2 de S. cerevisae responsable de la réduction de
37
l'arsenic pentavalent chez la levure [145]. La protéine ACR2 de Leishmania est capable de
réduire l'antimoine pentavalent et sa surexpression (par transfection génique) au stade
amastigote induit une hypersensibilité au SbV. TDR1 est également capable de réduire le
SbV et présente une différence d'expression entre les stades promastigote et amastigotes(en
faveur du stade amastigote) ce qui pourrait expliquer la plus grande sensibilité de ce dernier
à la drogue sous sa forme pentavalente [146]. Enfin, la diminution de l'expression de ces
enzymes pourrait conduire à une résistance accrue à l'antimoine pentavalent [143].
L'augmentation du niveau de thiols intracellulaires contribue également à la résistance à
l'antimoine. Le principal thiol du Leishmania est le trypanothion (TSH) et se compose de
deux molécules de glutathion (GSH, principal thiol des cellules d'eucaryotes supérieures)
conjuguées à une molécule de spermidine [147]. Les thiols jouent un rôle important dans le
maintien du potentiel d'oxido-réduction de la cellule (voir partie 3.2.1). L'augmentation du
niveau de TSH est associé à l'amplification et de la surexpression [148, 149] des gènes
codant pour les enzymes de la voie de synthèse du GSH, c'est à dire la y-glutamylcystéine
synthetase) et la spermidine (ornithine decarboxylase). Ces phénomènes ont été observés
chez des mutants sélectionnés en laboratoire et chez des souches cliniques résistantes [150,
151] (chez lesquels l'inhibition de ces enzymes induit la réversion de leur phénotype de
résistance). Cependant, l'augmentation des niveaux de thiols intracellulaire n'est pas
suffisante pour induire une augmentation du niveau de résistance chez une souche sauvage
[152].
Enfin, la séquestration de l'antimoine conjugué aux thiols est assurée par un transporteur
intracellulaire pour lesquels une augmentation de l'activité de transport a été observée chez
des mutants résistants. Ce transporteur nommé MRPA appartient à la famille des
transporteurs ABC [153]. MRPA est fréquemment amplifié chez les mutants résistants et
cette amplification génique fait intervenir des séquences répétées flanquant le locus
génomique [137, 154, 155]. MRPA est le premier gène dont l'amplification à été corrélée
avec la résistance aux métaux [156, 157] mais son amplification n'est pas suffisante pour
atteindre des niveaux de résistance élevés. L'augmentation du niveau de thiols
intracellulaires couplée à l'amplification de MRPA semble être une combinaison capable
de conférer de hauts niveaux de résistance.
38
2.3.1.2 Mécanismes de résistances à la pentamidine La résistance à la pentamidine est facilement induite in vitro chez plusieurs espèces de
Leishmania. Cette résistance est associée à des changements des concentrations
intracellulaires en glutamine arginine et polyamines [74, 158]. Des mutants résistants
générés in vitro ne présentent pas d'accumulation de la drogue au niveau mitochondrial, et
la fraction cytosolique de la drogue est expulsée à l'extérieur de la cellule [74]. Le
transporteur ABC (ATP Binding Cassette), PRP1 pourrait être responsable de cette activité
d'exclusion de la drogue [159-161]. Cette résistance est bloquée par l'action du verapamil,
un inhibiteur des canaux calciques, connu pour induire la réversion de phénotypes de
résistances multiples chez des cellules cancéreuses [74].
2.3.1.3 Mécanismes de résistance à l'amphotéricine B L'amphotéricine B est la drogue de choix dans les zones de forte résistance à l'antimoine.
Sa formulation liposomale, bien qu'extrêmement dispendieuse, réduit considérablement sa
toxicité. Par ailleurs, la résistance à cette drogue ne semble pas apparaître rapidement. Une
nouvelle augmentation de la charge parasitaire à été observée chez des patients co-infectés
par VIH après des traitements à l'amphotéricine B. Cependant, ces rechutes ne sont pas
associées à des phénomènes de résistance [162]. La résistante à l'amphotéricine B à
cependant facilement été généré in vitro et il à été montré qu'elle était associée à des
mécanismes d'amplifications géniques. Cependant, le lien entre ces amplifications géniques
et la résistance à cette drogue nécessite des confirmations et caractérisations
supplémentaires [163]. Une autre étude a corrélé la résistance avec la modification de la
fluidité de la membrane et montré que le principal sterol des souches résistantes était en fait
un précurseur et qu'il était différent de celui des souches sauvages. Ce changement induit la
diminution de l'affinité de la drogue pour la membrane du parasite [164]. Enfin, la
résistance à l'amphotéricine B à également été associée à l'augmentation de la résistance à
la mort cellulaire programmée par apoptose [68].
2.3.1.4 Mécanismes de résistance à la miltéfosine
En raison de son introduction récente dans le traitement des leishmanioses, aucune souche
clinique résistante pour la miltéfosine n'a encore été reportée. Cependant, la résistance est
39
facilement générée in vitro et certains des mutants résistants ont été caractérisés [165-169].
Les mécanismes de résistance incluent une réduction de l'accumulation de la drogue, une
variation de la perméabilité de la membrane plasmique et un efflux de la drogue. La
réduction de l'accumulation de la drogue constitue le premier mécanisme de résistance à la
miltéfosine. Pour y parvenir, l'altération des capacités de transport d'une drogue est un
moyen classiquement utilisé par une cellule pour devenir résistante. Des mutations au
niveau du gène codant pour le transporteur de la miltéfosine (LdMT) sont responsables de
la diminution drastique de l'accumulation de la miltéfosine et contribue grandement à la
résistance [167, 168]. LdMT possède une activité de flippase (plus précisément une activité
de translocation orientée vers l'intérieur à travers la membrane plasmique) responsable de
l'accumulation de la drogue dans le parasite. Récemment, un nouveau partenaire protéique,
LdRos3, a été identifié et caractérisé comme essentiel à l'activité de la flippase [165, 166].
LdMT nécessite une localisation membranaire spécifique et dépend pour cela de LdRos3.
LdRos3 contient deux domaines transmembranaires séparés par un large domaine
extracellulaire et sa localisation membranaire dépend de la présence d'une protéine LdMT
fonctionnelle. Les deux protéines sont donc mutuellement dépendantes pour leur fonction
et leur localisation cellulaire [165, 166]. L'inactivation de LdRos3 correspond également à
un mécanisme de résistance et à été rapporté dans un mutant généré en laboratoire [165,
166]. Cependant nous ne connaissons rien de l'importance de tels mécanismes dans le cas
de souches cliniques. Un second mécanisme conduisant à la réduction de l'accumulation
d'une drogue consiste en l'augmentation de la capacité d'efïlux de la cellule. Dans le cas de
la miltéfosine, la surexpression du transporteur de type ABC, MDRl à été associée à
l'augmentation de la résistance à la miltéfosine [170]. MDRl est une P-glycoprotéine
capable de transporter une grande variété de drogues hydrophobiques vers l'extérieur d'une
cellule, leur conférant une résistance multi-drogue [171]. Récemment, une étude a identifié
un autre transporteur de la famille ABC (LiABCG4) comme étant responsable de la
diminution de l'accumulation de la miltéfosine [172, 173]. Enfin, l'altération de la
composition de la membrane plasmique du parasite, et conséquemment de sa perméabilité
constitue un autre mécanisme de résistance à la miltéfosine. Il à été montré que chez les
mutants sélectionnés pour leur résistance à la miltéfosine, la depletion en sterols était
responsable de la diminution de leur sensibilité pour la miltéfosine [174]. L'ensemble de
40
ces mécanismes contribue certainement de manière synergique à l'acquisition de hauts
niveaux de résistance à cette drogue. Cependant jusqu'à présent personne n'est capable de
dire quel rôle ces mécanismes joueront dans l'acquisition probable de cette résistance dans
des souches cliniques.
2.3.1.5 Mécanismes de résistance à la paromomycine
Étant donné sa récente utilisation en clinique, il n'est pas surprenant qu'aucun cas de
résistance n'a encore été déclaré. Cependant, la résistance aux aminoglycosides auxquels
appartient la paromomycine est bien documentée chez les bactéries. Chez ces dernières elle
est liée à la diminution de l'accumulation de la drogue dans la cellule, à l'altération de son
interaction avec les ribosomes, et à la modification des groupes amino et hydroxyl par des
enzymes inactivantes comme les Af-acetyltransférases, O-phosphotransférases et O-
nucléotidyl transferases [175]. Ces phénomènes n'ont jamais été décrits chez Leishmania.
Une seule étude a fait le lien entre la diminution de l'accumulation de la drogue et la
résistance à la paromomycine chez des mutants sélectionnés en laboratoire [176, 177] bien
qu'aucune protéine n'ait été identifiée comme responsable de cette diminution.
2.3.1.6 Mécanismes de résistance aux autres molécules : sitamaquine, terbinafïne et methotrexate Peu de données sont disponibles sur les mécanismes de résistance à la sitamaquine et à la
terbinafïne chez Leishmania. Cependant, une étude récente à montré que la surexpression
d'un transporteur ABC conférait la résistance à la sitamaquine [172, 173] en lien avec une
réduction de l'accumulation de la drogue. Ceci ouvre les voies de nouvelles investigations
nécessaires à la fois à la compréhension des mécanismes d'action et de résistance de ces
drogues.
Les mécanismes de résistance au methotrexate chez Leishmania, drogue non-utilisée
contre les leishmanioses mais ayant servi de modèle d'étude, sont bien documentés. En fait,
c'est de l'étude de ces mécanismes que découle une grande partie de nos connaissances du
métabolisme des folates du parasite. La résistance à cet anti-métabolite se développe de
trois manières classiques déjà mentionnées pour d'autres drogues : la diminution de
l'accumulation de la drogue par diminution de son entrée dans la cellule; l'amplification de
41
l'enzyme qui constitue sa cible cellulaire; l'amplification d'une enzyme beaucoup moins
sensible et capable d'assurer la même fonction métabolique. Comme mentionné
précédemment, l'entrée du MTX dans la cellule se fait par les transporteurs de folates
(FBTs). L'inactivation génique par deletion du principale transporteur de folates (FT1),
observée chez plusieurs souches de mutants résistants sélectionnés en laboratoire, confère à
elle seule une résistance importante au MTX [178, 179] en induisant la diminution de
l'entrée de la drogue dans la cellule. L'amplification génique de la DHFR-TS, cible du
MTX, ou de la pteridine reductase PTR1, beaucoup moins sensible au MTX mais capable
d'assurer la même fonction métabolique que DHFR-TS, constituent les autres alternatives
d'acquisition de la résistance. Enfin, le gène codant pour la folylpolyglutamate synthetase
(FPGS) à également été associé à la résistance au MTX en corrélation avec le niveau de
folate disponible por le parasite. Brièvement, la FPGS est responsable de la
polyglutamylation des folates et du MTX celle-ci semble affecter l'accumulation du MTX
dans la cellule, altérant ainsi le niveau de sensibilité à la drogue [180].
2.3.2 Mécanismes de résistance généraux et nouveau paradigme Les études conduites sur les mécanismes d'actions des drogues, qu'elles soient
anticancéreuses, antibactériennes, antivirales ou antiparasitaires, ont longtemps été basées
sur le postulat que le mécanisme d'action d'une drogue est nécessairement dépendant de sa
cible cellulaire. De plus les principaux mécanismes de résistances soulignaient également
l'importance de la cible puisque les diverses voies prises par un pathogène (et également
par les cellules cancéreuses) pour acquérir la résistance à une drogue convergent toutes, de
manière directe ou non, vers la protection de cette cible. Au cours des dernières décennies,
les efforts se sont donc principalement concentrés (et continuent de l'être) sur la
compréhension des interactions entre la drogue et sa cible cellulaire, mettant ainsi à jour les
mécanismes de résistance précédemment mentionnés. Cependant, grâce à ces études, un
certain nombre de gènes, dont la fonction n'est pas directement reliée au mode d'action de
la drogue, sont apparus comme modulés suite à une exposition à une drogue ou encore chez
des lignées cellulaires résistantes à cette drogue. On retrouve notamment des gènes qui
codent pour des protéines impliqués dans la protection contre les stress cellulaires
(protéines chaperonnes, HSP, enzymes des voie de synthèses des antioxydants, enzymes
42
des voies métaboliques [181]) et dans les voies conduisant à la mort cellulaire programmée
(caspases, calpaines, nucleases, facteurs mitochondriaux [182]). En effet, il est intéressant
de noter le lien qui à été établi chez les cellules cancéreuses entre la résistance aux
chimiothérapies et la résistance à la mort cellulaire programmée par apoptose. Cette
caractéristique des cellules cancéreuses peut également être rapprochée d'un autre
phénomène mis en évidence par Otto Warburg il y a plus de 80 ans et nommé en son
honneur, « effet Warburg ». Brièvement, il correspond à un changement métabolique qui
favorise la voie de la glycolyse anaérobique aux dépens de la voie aérobique classique qui
produit pourtant plus d'énergie en termes d'équivalents ATP. Une des conséquences de ce
déroutage métabolique est de favoriser la voie des pentose-phosphates, productrices de
NADPH, un équivalent de réduction et cofacteur essentiel des enzymes de la voie de
detoxification des oxydants (glutathion reductase, peroxidases etc). La résistance au stress
oxydatif semble donc être chez les cellules cancéreuses étroitement associée à la résistance
à l'apoptose induite par les drogues [126-128, 183]. Un autre exemple intéressant de
déroutage métabolique à récemment été mis en évidence chez les bactéries. De manière
adaptative, la cellule favorise la voie des pentoses-phosphates en réponse à un stress
oxydatif. Ces études ont clairement mis en évidence l'intérêt d'un tel déroutage
métabolique pour la cellule en termes de résistance aux stress oxydatifs. Enfin, ces études
ont non seulement montré que des antibiotiques ayant des cibles cellulaires très différentes
induisaient la mort cellulaire par un mécanisme effecteur faisant intervenir la génération et
l'accumulation d'oxydants, mais elles ont également montrés que la prévention de
l'accumulation de ces oxydants (notamment par manipulation génétique de la voie
métabolique conduisant à la phosphorylation oxydative et par prévention de la réaction de
Fenton) (Figure 6) protégerait la cellule contre l'action bactéricide des antibiotiques,
43
AnanogtycoriJo Quhwrtnw (3-iactam
Primary Drug-Target Interact ion
Metabolic Feedback
Depletion of Reducing Equivalants (NADH)
Redox Cycling
Fenton F a 2 * ] » * Reaction
Hydroxy) Radical 4 4 OH* Damage
)*aW Synthesis
Cell Death
Figure 6 : Mécanisme de mort cellulaire commun induit par les antibiotiques bactéricides (issue de
Kohanski et al, 2007)
de manière indépendante de la cible primaire [129-132, 134, 135]. Ces études établissent
donc pour la première fois un mécanisme commun de mort cellulaire induit par des
antibiotiques différents, mais également un lien clair entre la résistance au stress oxydatif et
à la mort cellulaire programmée, et la résistance aux drogues. Cette notion de mécanismes
de résistance indépendants des drogues et de leur cible primaire a conduit à l'établissement
d'un nouveau paradigme. L'établissement d'un mécanisme commun conduisant à la mort
de la cellule souligne l'importance de comprendre comment les drogues tuent et comment
les cellules peuvent être conduites à résister à l'induction de cette mort programmée.
44
Chapitre III. Leishmania et les stress oxydatifs
3.1 Cycle de vie et stress oxydatif Au cours de son cycle de vie, le parasite Leishmania est soumis à des stress oxydatifs lors
de sa rencontre avec le système immunitaire de l'hôte mammifère. Les cellules hôtes du
Leishmania sont les cellules phagocytaires, principalement les macrophages et les cellules
dendritiques. Ces cellules sont spécialisées dans la production d'intermédiaires oxygénés
(ROI) et nitrogénés (RNI) réactifs (Figure 7).
Reactive Oxygen Intermediates (ROI)
oxygen O2 + 1 e I phagocyte
| oxidase superoxide O f
1 I superoxide 1 dismutase
hydrogen peroxide H A
+1e I hydroxyl Q H . radical
water
+1e I
HP
Reactive Nitrogen Intermediates (RNI)
guanidino RNHj nitrogen of
nitric oxide synthase I
NO
5e L-arginine
MO" r* I OONO-peroxynitrite r
OONOH peroxynitrous
acid 1 i
t [•NO2-OI+J
RSOH sulfenic acid
nitric oxide RSH
+ e RSNO
NOT nitnte n j t r o s o t h j o ,
•NO2 nitrogen dioxide
J.,. NO3" nitrate
Figure 7 : ROI and RNI produites par les systèmes enzymatiques Phox et iNOS dans les cellules
phagocytaires des mammifères (adapté de Nathan, 2000)
Les cellules phagocytaires possèdent deux systèmes enzymatiques très bien caractérisés et
responsables de la production d'oxydants en tant que molécules de défenses destinés à
l'élimination des agents infectieux qu'elles rencontrent et phagocytent. La NADPH-
oxydase (gp91phox ou phagocyte-oxydase) est responsable de la production
d'intermédiaires oxygénés réactifs tandis que l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS)
est responsable de la production d'intermédiaires nitrogénés réactifs (principalement de
l'oxide nitrique qui réagit ensuite avec les dérivés de l'oxygène pour former les RNI). Ces
deux systèmes enzymatiques sont exprimés chez les macrophages. La NADPH oxydase est
exprimée de manière constitutive par les cellules phagocytaires mais son activité est régulée
et dépend du niveau d'activation de la cellule. L'oxyde nitrique synthase inductible est
45
quant à elle, comme son nom l'indique, induite en réponse à l'activation de la cellule.
[184-195]. Ces deux systèmes enzymatiques se retrouvent au niveau de la membrane
plasmique de la vacuole du phagolysosome et contribuent à l'élimination du parasite
lorsque celui-ci est phagocyté par la cellule. Etant donné que la production d'oxydants
constitue une stratégie microbicide très importante utilisée par l'hôte mammifère contre les
pathogènes, il est établi que la localisation du parasite à l'intérieur de son hôte (i.e. la
vacuole phagolysosomale) et les mécanismes biochimiques utilisés pour la detoxification
de ces oxydants forment un aspect fondamental de l'interaction hôte-pathogène. Il est
intéressant à noter que cet aspect de l'immunité de l'hôte mammifère comporte encore
quelques zones d'ombres. En effet, le rôle de l'iNOS reste controversé relativement à son
potentiel microbicide puisque la production d'oxyde nitrique demeure indétectable bien que
l'induction de l'expression de l'enzyme soit quantifiable et réelle [196, 197]. En revanche,
un déficit génétique d'expression des composants de la NADPH oxydase conduit à
l'établissement de la granulomatose chronique, maladie caractérisée par des infections
sévères et récurrentes [198]. Il n'existe cependant pas d'équivalent connu de déficit
génétique d'expression de l'iNOS. Il est également intéressant de noter que les souris sont
capables de synthétiser de l'oxyde nitrique in vivo (et de manière quantifiable) et peuvent
ainsi compenser pour une déficience de la NADPH oxydase [198]. Elles ne survivent
cependant que dans un environnement aseptisé en cas de déficience conjointe des deux
enzymes. De manière intéressante, une étude a montré que chez les hamsters, la progression
qui conduit à la mort de la forme viscérale de la leishmaniose (reproduisant ainsi la
pathologie humaine), était due à une augmentation de l'expression de l'iNOS moins
prononcée que chez les souris qui sont, elles, capables de contrôler une infection par les
souches viscérotropiques principalement grâce à leur production d'oxyde nitrique [199].
Toutes ces données soulignent l'importance de ces mécanismes de défenses auxquels le
parasite devra faire face.
3.2 Mécanismes de résistance aux stress oxydatifs Leishmania a développé un certain nombre de stratégies afin de pouvoir faire face à ces
mécanismes de défense de son hôte. Ces stratégies font intervenir des molécules
synthétisées par le parasite et possédant des propriétés anti-oxydantes, assurant ainsi la
46
stabilité de son équilibre redox intracellulaire. Parmi ces molécules on retrouve les
composés de la famille des thiols dont le trypanothion. C'est le thiol le plus important chez
Leishmania et il est unique aux Trypanosomatidae (partie 3.2.1). Leishmania possède
également d'autres molécules anti-oxydantes dont les propriétés ont récemment été mises
en évidence : les ptérines réduites dont les propriétés anti-oxydantes ont été mises en
évidence au cours de mon doctorat, en sont un exemple (partie 3.2.1). Enfin, le parasite a
développé des moyens d'interférer directement avec le système immunitaire de l'hôte afin,
notamment, d'interférer avec l'activation des cellules phagocytaires, limitant ainsi
l'induction des activités microbicides des enzymes comme l'iNOS ou la NADPH oxydase
(partie 3.2.3)
3.2.1 Les thiols et le métabolisme du trypanothion En ce qui concerne leur système redox, les Trypanosomatidae diffèrent de tous les autres
eucaryotes connus. Celui-ci est en effet basé sur le conjugué thiol-polyamine trypanothion
(TSH) ou N ,N -bis(glutathionyl)spermidine (Figure 8) [147, 200] et sur une
r"^"" »* ° Figure 8 : Structure chimique du trypanothion ou
1/ bis(glutathionyl)spermidine (issue de Krauth-Siegel et al., 2003). Les deux
molécules de glutathion (en noir) sont conjuguées à une molécule de spermidine
en gris) o coo' v
flavoenzyme dépendante du NADPH, la trypanothione reductase (TR). Ce système basé sur
le trypanothion remplace chez ces parasites le système plus ubiquitaire basé sur le
glutathion (GSH) et les glutathione-reductases (GR), et que l'on retrouve dans la plupart
des cellules eucaryotes. Jusqu'ici, les TR ont été caractérisés chez Crithidia fasciculata,
[201, 202], Trypanosoma cruzi [203], Trypanosoma congolense [204], Trypanosoma brucei
[205], Leishmania donovani et Leishmania major [65]. Ces enzymes sont quasiment
exclusives aux Trypanosomatidae puisqu'elles n'ont été décrites qu'une seule fois chez un
organisme n'appartenant pas à cette famille, Euglena gracilis, qui possède en effet à la fois
laGRetlaTR[206].
47
La synthèse du trypanothion (Figure 9) fait intervenir trois voies enzymatiques essentielles:
la voie de synthèse du glutathion, la voie de synthèse de la spermidine et la conjugaison des
deux molécules de glutathion à la molécule de spermidine, de manière séquentielle. La
synthèse du glutathion débute par la synthèse de y-glutamylcystéine à partir de L-glutamate
et de L-cystéine. La réaction ATP-dépendante est catalysée par la y-glutamylcystéine
synthetase (y-GCS), qui est l'enzyme limitante dans la voie de synthèse du GSH chez les
cellules mammifère et du TSH chez L. tarentolae [207]. Cette enzyme est essentielle à la
survie du parasite [152]. La y-glutamylcystéine réagit ensuite avec la L-glycine pour former
le GSH. Cette réaction est catalysée par la glutathione synthase (GS). Cette enzyme n'a pas
encore été caractérisée chez les Trypanosomatidae mais un gène localisé sur le
chromosome 14 de Z,. major code potentiellement pour la GS. Par ailleurs, ce gène fait
partie d'un groupe de gènes surexprimés chez des mutants résistants aux drogues [208]. En
ce qui concerne la spermidine, il n'existe pas d'uniformité chez les Trypanosomatidae.
Leishmania, comme les trypanosomes africains, assure la synthèse de sa spermidine (alors
que les trypanosomes américains sont auxotrophes pour ce composé). La première étape de
la synthèse consiste en la decarboxylation de l'ornithine par l'ornithine decarboxylase
(ODC). La putrescine ainsi formée est le substrat de la spermidine synthase dans une
réaction qui requiert de la S-adénosylméthionine décarboxylée, fournie par la S-
adénosylméthionine decarboxylase à partir de la S-adénosylméthionine. Enfin, la
conjugaison des deux molécules de GSH à molécule de spermidine se fait de manière
séquentielle (Figure 9). La glutathionylspermidine synthase génère de la glutathionyl-
spermidine, reprise ensuite par la trypanothione synthetase qui produit du TSH. Le
maintien du TSH sous sa forme réduite est assuré par la trypanothione reductase,
dépendente du NADPH.
48
cMcJenotyl. Methylth.o-CO, m<thi<wi>r>« jd«no*ine
» » Putreicnc »J ^ » Ornithine * <J> Putrescnc » » ► So»rr*.ei'*
Sptrmidin* . GluUthiooyl»p^midin« w SynthaM \ Synthta— (
iptrmtdîrto
^ GSH
DtcartooxylaM SynthaM \ SynlhtU— Glutathione . VJ>UL
lGly
LGlu ♦ LCy» » Gluta«nykv»t»ine * » Glutathione Trypanothicn» GluUmylcytte.ne Glutathion* (GSH) SyntfieUM
SynttitttM Synth«Ut«
. . Trypanothion* R*ductaM _ . . . Trypanothione Disulfide r » » Trypanothione
TS, ' > T(SH), NAOPH ♦ H* NAOP
Figure 9 : Voie de synthèse et de réduction du trypanothion (TSH) (issu de KrauthSiegel, 2003)
Le TSH est une molécule beaucoup plus réactive que le GSH ce qui lui confère une
propriété antioxydante très importante pour le parasite. Cette différence de réactivité réside
dans le fait que c'est un dithiol, ce qui augmente sa capacité de réduction [209]. Le TSH
possède la capacité de réduire directement les tryparédoxines. Les tryparédoxines sont les
enzymes qui assurent la detoxification des stress de nature oxygénée au sein du parasite
(Figure 10).
NADPH x / TR0Xv ^ T ( S H ) 2 N / Tpxoxv * Pxred x s ROOH
NADP ^ V T R r e d A TS2 > ^ T p x r e d A P x ^ A ^ R O H
Figure 10 : Cascade de réduction des tryparédoxines. (TR, trypanothion reductase; Tpx,
tryparédoxine; Px, peroxidase)
Leishmania ne possède pas deux enzymes clés : la catalase et la glutathione peroxidase
classique et son métabolisme antioxydatif est basé sur le trypanothion. Les tryparédoxines
transfèrent les équivalents de reduction au tryparédoxines peroxidases. Ces enzymes sont
impliquées dans la detoxification des ROS (revue dans [210212]). Leishmania possède
également la superoxide dismutase impliquée dans la detoxification de l'anion superoxide
[213].
49
Les Trypanosomatidae tolèrent seulement des niveaux relativement faibles de peroxyde
d'hydrogène (H2O2) probablement en raison du fait qu'ils ne possèdent pas de catalase.
Cette molécule est produite en quantité abondante par les macrophages (Figure 6). Les
tryparédoxines peroxidases constituent donc une ligne de défense importante contre les
espèces oxygénées réactives produites par les cellules de l'hôte. D'autre part, le TSH est
impliqué dans la séquestration et l'extrusion de drogue comme l'antimoine, connu pour
induire des niveaux d'oxydants importants dans la cellule. La conjugaison de la drogue aux
thiols et la séquestration ou l'extrusion sont des mécanismes de résistance importants du
Leishmania (voir partie 2.3.1.1) [214, 215]. Enfin, Leishmania possède un autre thiol,
l'ovothiol, également impliqué dans la réduction des oxydants intracellulaires [216].
3.2.2 Les ptérines Les ptérines ou bioptérines sont des composés reliés au métabolisme des folates (Figure 10)
Figure 10 : Métabolisme des folates et des ptérines chez Leishmania (issu de Ouellette, 2002). (B, bioptérine, BT1, transporteur de bioptérines; BH2, dihydrobioptérine; BH4, tétrahydrobioptérine; PTR1, ptéridine reductase 1; DHPR, dihydroptérine reductase; FA, acide folique; FT1, transporteur de folate 1; DHF, dihydrofolate, THF, tétrahydrofolate; DHFR-TS, dihydrofolate reductase-thymidilate synthase)
Leishmania est auxotrophe pour les ptérines et possède un transporteur de bioptérine
unique, BT1 [217, 218]. Une fois transportées dans la cellule, les ptérines sont réduites sous
leur formes actives par la ptéridine reductase PTR1 [219, 220]. Leishmania possède
également la machinerie enzymatique nécessaire à la régénération des ptérines [221]. Le
50
rôle des ptérines réduites demeure relativement vague. L'un des premiers rôles connus de
ces composés a été d'être un facteur de croissance pour C. fasciculata [222] et plusieurs
études ont indiqué qu'elles constituent également un facteur de croissance essentiel pour
Leishmania [223, 224]. Les ptérines réduites sont également des cofacteurs de certaines
enzymes incluant l'iNOS [225]. Cependant, aucunes de ces enzymes ne sont présentes chez
Leishmania ou ne requièrent pas ces cofacteurs [220, 226]. Les ptérines réduites jouent
néanmoins un rôle très important dans la métacyclogénèse du parasite. Il a été montré que
le niveau de bioptérine réduite contrôlait le nombre de parasites métacycliques. Le
mécanisme sous-jacent demeure néanmoins inexpliqué [227]. D'autre part, des études ont
mis en évidence la nature réactive des ptérines réduites en tant qu'agent détoxifiant des
espèces oxygénées réactives [228, 229]. Au cours de mon doctorat, nous avons confirmé
cette propriété au sein du parasite Leishmania et ainsi nous avons pu proposer un nouveau
rôle pour ces composés dans la biologie du parasite. Les ptérines réduites participent à la
lutte contre le stress oxydatif et contribuent à la résistance à ce stress généré par les
macrophages. Elles favorisent la résistance et facilitent l'invasion de la cellule hôte. Elles
font donc désormais partie des composés permettant de résister à l'action destructrice du
macrophage.
3.2.3 Autres mécanismes de défense contre le stress oxydatif Leishmania à développer d'autres stratégies, principalement non-enzymatiques, lui
permettant d'interférer avec le système immunitaire de son hôte et notamment avec
l'activation des cellules phagocytaires qui conduit à la flambée oxydative. Il est notamment
reconnu que le parasite inhibe l'induction de l'iNOS et que ceci semble dû à la diminution
de la réponse l'interféron-y [7, 230]. Leishmania bloque également l'activation du
macrophage en inhibant l'activité de la protéine kinase C, enzyme importante dans la voie
de signalisation du phagocyte [231, 232]. Une autre propriété remarquable du parasite est
sa capacité d'inhiber le recrutement des sous-unités formant la NADPH-oxydase au niveau
de la membrane du phagolysosome, empêchant ainsi la génération de radicaux oxygénés.
Cette capacité inhibitrice est associée au LPG qui semble également posséder des propriétés
anti-oxydantes intrinsèques [233]. Enfin, la chaperonne cellulaire HSP70 est également
impliquée dans la défense contre le stress oxydatif [234]. Leishmania possède donc des
51
mécanismes multiples et redondants de défense contre les stress oxydatifs et nitrosatifs qui
lui sont essentiels pour sa survie, particulièrement lors de sa rencontre avec le système
immunitaire de l'hôte mammifère.
Chapitre IV. Problématiques, hypothèses et objectifs
Problématiques La leishmaniose fait partie des maladies dites « négligées » et figure sur la liste des
priorités établies par l'OMS. Ajoutons à cela l'absence patente de nouvelles thérapies
efficaces contre ces pathologies et le développement des résistances contre les thérapies
existantes. Il devient alors aisé de comprendre la nécessité de poursuivre la recherche sur ce
pathogène, afin de parfaire la compréhension de sa biologie dans le but de mieux lutter
contre lui. Ceci étant dit, les champs d'études du Leishmania sont multiples et certains
présentent un intérêt particulier. Parmi ceux-ci, la résistance aux anti-parasitaires demeure
un axe de recherche essentiel, en raison des échecs thérapeutiques qui sont associés au cas
de résistance et la proportion épidémique que ces phénomènes tendent à prendre. Les
mécanismes de résistance étant vraisemblablement étroitement liés aux mécanismes
d'actions des drogues, il apparait également essentiel de comprendre comment ces drogues
conduisent à la mort du parasite. La disponibilité de souches de Leishmania résistantes aux
différentes drogues représente un outil d'étude adéquat à l'élucidation de tels mécanismes.
La biologie du parasite, et notamment son processus de differentiation constituent
également un domaine d'étude important. Une meilleure compréhension du processus de
métacyclogénèse, essentiel au parasite pour l'acquisition de sa forme infectieuse,
permettrait de cerner la manière dont le parasite se prépare aux stress qu'il rencontrera chez
l'hôte mammifère, et éventuellement de mettre à jour des voies métaboliques ou des
mécanismes de défense importants. Enfin, le métabolisme des ptérines, demeure
relativement méconnu. Au regard du rôle joué par des enzymes comme PTR1, à la fois
dans la résistance à une drogue modèle comme le MTX ainsi que dans la métacyclogénèse
du parasite, il est nécessaire d'approfondir la compréhension de ce métabolisme.
Hypothèses Trois hypothèses seront présentées dans cette thèse. Elles correspondent aux trois objectifs
qui ont été fixés et qui seront présentés ci-après. La première hypothèse concerne le rôle
des ptérines réduites dans la résistance aux stress oxydatifs rencontrés par le parasite au
53
cours de son cycle de vie. Les ptérines réduites étant connus chez d'autres organismes pour
jouer un rôle dans la detoxification des oxydants, nous avons posé l'hypothèse qu'elles
jouaient un rôle similaire chez Leishmania. La seconde hypothèse concerne le rôle joué par
ces mêmes ptérines réduites dans la métacyclogénèse du parasite [227]. Ce processus de
differentiation correspond à une adaptation du parasite aux stress qu'il rencontrera dans son
hôte mammifère, notamment les stress oxydants. Etant donné que l'inactivation du gène
codant la ptéridine reductase PTR1 conduit à l'augmentation du nombre de parasites
métacycliques, nous avons émis l'hypothèse qu'une approche protéomique globale pourrait
suggérer le rôle des ptérines dans ce processus de differentiation. Enfin, la troisième
hypothèse était relative aux mécanismes d'action des drogues anti-Leishmania et à
l'acquisition de la résistance à ces drogues. Plusieurs drogues étant connues pour induire
l'accumulation d'oxydants et l'apoptose, nous avons émis l'hypothèse qu'un mécanisme
commun de mort cellulaire pouvait être induit par ces drogues et que l'existence d'un tel
mécanisme pouvait favoriser l'acquisition de multi-résistances.
Objectifs Comme les hypothèses susmentionnées, les objectifs généraux des travaux présentés dans
cette thèse étaient au nombre de trois et consistaient en la vérification de ces hypothèses.
Les travaux présentés dans le chapitre 5 avaient pour objectif général la confirmation du
potentiel antioxydant des ptérines réduites dans les espèces L. major et
L. infantum (respectivement responsables des formes cutanée et viscérale de la
leishmaniose) avec les objectifs spécifiques suivant de: 1) vérifier le rôle de PTR1 et des
ptérines réduites dans la résistance à des stress oxydatifs et nitrosatifs exogènes (générés
par des agents chimiques); 2) évaluer la capacité de complémentation métabolique des
ptérines réduites dans des souches PTRl7" avant exposition à un agent oxydant comme
FH2O2; et 3) vérifier le rôle joué par les ptérines réduites dans un modèle cellulaire
d'infection de macrophages (murins et humains) activés pour la production de ROI et de
RNI.
Les travaux présentés dans le chapitre 6 avaient pour objectif général d'identifier, par des
méthodes de protéomique d'enrichissement au FFE (Free Flow Electrophoresis), les
54
protéines différentiellement exprimées dans le processus de métacyclogénèse d'une souche
sauvage et d'une souche PTR1"" de L. infantum, afin d'éventuellement déterminer quel rôle
joue le métabolisme des ptérines dans ce processus de differentiation.
Plusieurs travaux ont montrés que des drogues anti-Leishmania induisaient la production
d'oxydants dans la cellule et la mort cellulaire pas apoptose [68, 70, 71, 75, 124, 235]. Les
travaux présentés dans le chapitre 7 avaient donc pour objectif général de vérifier s'il existe
un mécanisme commun de mort cellulaire induit par les drogues anti-Leishmania
classiquement utilisées (antimoine, miltéfosine, amphotéricine B, pentamidine
paromomycine) ainsi que par la drogue utilisée en tant que modèle (methotrexate), et de
déterminer quelles seraient les conséquences d'un tel mécanisme sur l'acquisition de multi-
résistances. Les objectifs spécifiques étaient de: 1) confirmer si toutes les drogues induisent
l'apoptose en mesurant trois caractéristiques de cette forme de mort cellulaire programmée
(accumulation d'oxydants, perte du potentiel mitochondriale et dégradation de l'ADN
génomique); 2) déterminer le rôle joué par le fer dans l'accumulation d'oxydants et de
confirmer la localisation mitochondriale de cette accumulation; 3) analyser les paramètres
de l'apoptose chez des mutants résistants à ces drogues, en soumettant ces mutants à la
drogue pour laquelle la résistance à été sélectionné ainsi qu'à d'autres drogues; et 4)
déterminer quelles sont les conséquences de l'existence d'un mécanisme de mort cellulaire
commun sur l'acquisition de multi-résistances, en mesurant la fréquence de génération de
mutants multi-résistants après exposition à une autre drogue.
Chapitre V. Le rôle des ptérines réduites dans la résistance au
stress oxydatif et nitrosatif chez le parasite Leishmania
Ce chapitre à fait l'objet d'une publication dans la revue Free Radicals in Biology and Medicine
(2009 Feb l;46(3):367-75) et est constitué de la version finale telle que publiée.
5.1 Résumé
Au cours de son cycle de vie, le parasite Leishmania est soumis à des stress oxydatifs lorsqu'il
rencontre le macrophage. Les ptérines réduites sont connues pour être des « scavengers » des
espèces oxygénées et nitrogénées réactives (ROIs and RNIs). Leishmania possède une ptéridine
reductase PTR1 dont la principale fonction est de fournir le parasite en ptérines réduites. Nous avons
étudié le rôle de PTR1 dans la résistance aux stress oxydatifs et nitrosatifs chez Leishmania
tarentolae, Leishmania infantum et Leishmania major PTRl" null mutants. Les cellules PTRY ' des
trois espèces étaient toutes plus sensibles aux stress induits par H202 et NO. En utilisant une sonde
fluorescente qui permet la quantification des ROIs, nous avons démontré une augmentation du
niveau d'oxydants intracellulaires chez les mutants PTRY1'. L'inactivation de PTRl augmentait
également la métacyclogénèse de L. infantum et L. major. Nous avons purifié les parasites
métacycliques à partir des mutants PTRY1' et des cellules contrôles et nous avons testé leur survie
intracellulaire dans des cellules macrophagiques J774 murines et des macrophages dérivés de
monocytes (MDMs) humains. Nos résultats ont montré que les mutants PTRY1' survivaient moins
dans les deux modèles de macrophages comparativement aux cellules contrôles et que cette
diminution de la survie était plus prononcée dans des macrophages activés pour la production
d'oxydants. Cette étude a montré qu'un des rôles physiologiques des ptérines réduites chez
Leishmania était de protéger le parasite contre les stress oxydatifs et nitrosatifs et qu'une diminution
de la disponibilité en ptérines réduites conduisait à une diminution de la survie intracellulaire.
55
5.2 Article
The role of reduced pterins in resistance to reactive oxygen and nitrogen intermediates in the
protozoan parasite Leishmania
Wilfried Moreira, Éric Leblanc and Marc Ouellette*
Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL, Université Laval, Québec, Canada.
* Corresponding author : Marc Ouellette Ph.D.
Centre de Recherche en Infectiologie
2705 Boul. Laurier
Québec, QC
Canada
Gl V 4G2
Tel : 1-418-654-2705
Fax : 1-418-654-2715
E-mail : [email protected]
Running title: Pterins and oxidative stresses in Leishmania
Keywords: pterins, macrophages, nitric oxide, reactive oxygen species, ptéridine reductase
56
ABSTRACT
During its life cycle, the protozoan parasite Leishmania experiences oxidative stresses when
interacting with macrophages. Reduced pterins are known scavengers of reactive oxygen and
nitrogen intermediates (ROIs and RNIs). Leishmania has a ptéridine reductase PTR1 whose main
function is to provide reduced pterins. We investigated the role of PTR1 in resistance to oxidative
and nitrosative stresses in Leishmania tarentolae, Leishmania infantum and Leishmania major PTRÏ
' mutants. The PTRV1' cells of the 3 species were more sensitive to H2O2 and NO-induced stresses.
Using a fluorescent probe allowing ROIs quantification, we demonstrated an increase in intracellular
oxidant molecules in the PTR1" mutants. The disruption of PTR1 increased metacyclogenesis in L.
infantum and L. major. We purified metacyclic parasites from PTR1 ' mutants and control cells and
tested their intracellular survival in J774 mouse cell line and in human monocyte-derived
macrophages. Our results showed that PTRï' ' null mutants survived less in both macrophage models
compared to control cells and this decrease was more pronounced in macrophages activated for
oxidants production. This study demonstrates that one physiological role of reduced pterins in
Leishmania is to deal with oxidative and nitrosative species and a decreased ability to provide
reduced pterins leads to decreased intracellular survival.
57
List of abbreviations
DAF-FM, 4-Amino-5-methylamino-2',7,-difluorofluorescein-diacetate; DCF-DA, 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate; H2B/H4B, dihydro/tetrahydrobiopterin; H2O2, hydrogen peroxide; INFy, interferon gamma; iNOS, inducible nitric oxide synthase; LPS, lipopolysaccharide; MDMs, monocyte-derived macrophages; MTX, methotrexate; NO, nitric oxide; PKC, protein kinase C; PNA, peanut agglutinin; PTR1, ptéridine reductase 1; RFU, relative fluorescence unit; RNI, reactive nitrogen intermediates; ROI, reactive oxygen intermediates; SNAP, s-nitro-acetylpenicillamine
58
.INTRODUCTION
Leishmania is a human protozoan parasite infecting cells of the monocyte/macrophage
lineage. This parasite has a relatively simple life cycle with promastigotes found in the phlebotomine
sand flies. A proportion of the promastigotes in the sand fly will differentiate into the infectious
metacyclic form. Following a bite of the sand fly, the metacyclic parasites will be delivered into
blood and the parasites will be engulfed by macrophages through conventional receptor-mediated
phagocytosis. The parasite will then develop into an amastigote form where it will survive and
replicate within phagolysosomes (reviewed in [7]). Macrophages possess a number of primary
defence mechanisms against microbial pathogens including the production of reactive oxygen
intermediates (ROIs) and reactive nitrogen intermediates (RNIs) (reviewed in [236-238]).
Leishmania promastigotes were shown to be susceptible to both ROIs [239] and RNIs [240].
Macrophage derived ROIs are primarily produced by the NADPH oxidase (gp91phox) while RNIs are
produced mainly by the inducible nitric oxide synthase (iNOS). Data gathered from a number of
studies and using different approaches have clearly demonstrated that both ROIs and RNIs
contribute to the killing of a number of Leishmania species in both human and murine macrophages
[198,241,242].
However, Leishmania has developed a number of strategies to deal with ROIs and RNIs
produced by the macrophages. Leishmania can interfere with the induction of iNOS and this appears
to be due to a diminished response to IFN-y from the macrophage (reviewed in [7]). Leishmania
also appears to decrease the oxidative burst by inhibiting PKC activity [231, 232]. The parasite itself
is also well equipped to deal with ROIs and RNIs. Leishmania has glutathione, trypanothione [147]
and ovothiol A [216] as reduced thiols and these were found to be non enzymatic scavengers of
ROIs [243]. Leishmania lacks the two key antioxidant enzymes catalase and classical glutathione
peroxidise and its redox metabolism is based on trypanothione. Tryparedoxin (TXN) will transfer the
reducing equivalent of reduced trypanothione to the peroxidoxin tryparedoxin peroxidase (TXNPx)
or to the cysteine-homologue of glutathione peroxidase. The latter enzymes are involved in the
detoxification of ROIs and RNIs (reviewed in [212, 244]). Most of the published studies on these
antioxidant enzymes were carried out in the related African trypanosome parasite but TXNPx was
also shown to detoxify ROIs and RNIs in Leishmania [210]. The trypanosomatids iron superoxide
dismutases were also shown to have a role in dealing with superoxide toxicity [213, 245]. The
surface lipophosphoglycan (LPG) of Leishmania was suggested to scavenge oxygen radicals [246]
59
and genetically derived LPG deficient Leishmania cells were indeed found to be more sensitive to
ROIs [247]. Recent evidences suggest that LPG can block the assembly of the NADPH oxidase at
the membrane of the phagolysosome [233]. Finally, the cellular chaperone HSP70 was also shown to
be involved in antioxidant defense [248]. Leishmania has therefore redundant mechanisms to deal
with oxidative stresses and in this study we wanted to test whether reduced pterins are also important
scavengers of ROIs and RNIs.
Leishmania is auxotroph for pterins but it possess BT1, a unique plasma membrane pterin
transporter [249, 250]. Following BT1-mediated uptake, pterins are reduced within the parasite into
its active form by the enzyme ptéridine reductase PTR1 [251, 252]. Leishmania also contains the
enzymatic machinery for regenerating reduced pterins [253]. One of the earliest cellular function of
(6R)-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin (H4B) was as a growth factor for the parasite Crithidia fasciculata
(reviewed in [254]) and many studies have indicated that it is an essential growth factor for
Leishmania [224, 255-257]. H4B serves as a co-factor for a number of enzymes, including iNOS
(reviewed in [254, 258]) but so far these enzymes were either not present or shown not to require
H4B in Leishmania (reviewed in [259, 260]). In addition of being a growth factor, H4B levels were
found to be an important factor controlling metacyclogenesis where low H4B levels increased the
number of metacyclic parasites [261]. H4B was shown to react readily with oxygen, superoxide,
H2O2 and peroxynitrite and it was suggested and eventually demonstrated that it can protect cells
against oxidative damages (reviewed in [228, 229]). Clinical trials in humans have shown that H4B,
through its antioxidant properties can decrease oxidative stresses mediated pathologies [262].
Because of the essential role of pterins in Leishmania , of the oxidant stresses that Leishmania
naturally encounters and of the role of H4B in dealing with oxidants, we tested the role of reduced
pterins in dealing with ROIs and RNIs in Leishmania.
60
MATERIALS AND METHODS
Leishmania strains and culture conditions
Leishmania tarentolae Tarll WT, Leishmania infantum (MHOM/MA/67/ITMAP-263) and
Leishmania major (UV39; wild-type, PTR1 null mutants (PTRl'') and PTR1 add-back mutants
(PTR1'A + PTR1) promastigote cells were grown in SDM-79 (containing 15uM folic acid), or in
M199 (23nM folic acid) media supplemented with 10% fetal bovine serum, 5pg/ml of haemin and
5uM biopterin (Sigma Aldrich) at pH 7.0 and 25°C. Susceptibility to methotrexate (MTX) was
carried out as described while measuring ODôoonm [153]. Susceptibility to H2O2 was carried out
similarly. Resistance to nitrosative stresses was measured using the NO donor S-nitroso-N-
acetylpenicillamine (SNAP) that spontaneously releases NO [263]. Briefly, 5 x IO7 cells were
resuspended in 5 ml of media and H2O2 or SNAP were added at different concentrations and
ODôoonm values were taken at 72 hrs.
PTR1 gene replacement in Leishmania
The generation of Leishmania tarentolae PTR1 null mutants (PTR1 ") has already been
described [256]. The Leishmania infantum and Leishmania major PTR1 null mutants (PTR1") were
obtained by targeted gene replacement. Briefly, PTR1 flanking regions were amplified from L.
infantum (or L. major) wild-type genomic DNA and fused to both neomycin phosphotransferase
(NEO) and hygromycin phosphotransferase (HYG) genes using a PCR-fusion based strategy adapted
from [264]. All primer sequences can be found in Supplementary Table 1. The 5' UTR of L.
infantum PTR1 was obtained by PCR amplification with primers A and B, the latter containing a tail
of 25 nucleotides (underlined) corresponding to the first 25 bases of the NEO gene. The NEO gene
was obtained from pSP72aA/£'Oa [265] with primers C and D, the latter containing a tail of 25 bases
(underlined) corresponding to the first 25 bases of the 3' UTR of L. infantum PTR1. The 5'UTR of
L. infantum was then fused to the NEO gene by PCR using primers A and D giving the fragment
5'UTR-A^O with a tail corresponding to the first 25 bases of the 3'UTR ofPTRl. The 3' UTR of L.
infantum PTR1 was obtained by PCR amplification with primers E and F. The fragment 5'UTR-
NEO was then fused to the 3'UTR by PCR using primers A and F yielding the fragment 5'UTR-
NEO-3 'UTR. After each round of PCR, fragments were isolated on agarose gels and purified using
the Gel Extraction Kit (Sigma Aldrich). The same strategy was used for the L. infantum 5'UTR-
//7G-3'UTR construct (primers A and G, H and I and E and F) and for L. major (primers A-J, C-K
and N-0 for the NEO construct, and primers A-L, C-M and N-O for the HYG construct). The
61
S'UTR-A^O^'UTR and 5'UTR-/7yG-3'UTR were successively transfected into either L. infantum
or L. major in order to replace sequentially the two PTR1 alleles. Null mutants were cultivated in
SDM-79 and selected for resistance to both hygromycin (New England Biolab) and G418
(Geneticin, Sigma Aldrich).
PCR and Southern blot analysis
PTR1 alleles replacement was confirmed by both PCR, using primers P and Q for L. infantum
and primers P and R for L. major, and Southern blot analysis using a 3'UTR PTR1 probe obtained
with primers E and F for L. infantum and with N and O for L. major (see also Fig. 2). The PTR1
gene and its flanking regions have also been amplified by PCR using primers S and T that contained
the restriction site Xbal and Hindlll (underlined). The fragment 5'UTR-P77?7-3'UTR was then
cloned between the Xbal and Hindlll sites of the vSPaZEOa expression vector. This construct was
electroporated in Leishmania cells and selected for zeocin resistance. The resulting transfectants
were used in functional complementation experiments of the PTR1 null mutants.
Purification of Metacyclic parasites
Metacyclics of Leishmania species were obtained using the peanut agglutin assay as
described [266].
Dichlorofluorescein-diacetate (DC FDA) fluorescence and intracellular oxidants level:
Leishmania promastigote cells were exposed to H2O2 and intracellular oxidant content was
measured using the fluorescent Dichlorofluorescein-diacetate (DCFDA) dye (Invitrogen). DCFDA is
cell permeant and nonfluorescent. Upon its entry in live cells, the diacetate groups are cleaved by
cellular esterases. Oxidation of the reduced dye will occur in the presence of ROIs, causing
fluorescence. Promastigotes were harvested from a mid-log phase M199 culture, centrifuged,
washed twice in Hepes-NaCl and counted. IO7 promastigotes were then centrifuged and resuspended
in 1ml Hepes-NaCl. For metabolic rescue, 10 uM of biopterin, or 10 uM of reduced biopterin (H2B
and H4B) or HEPES-NaCl were added for 45 minutes. Cells were centrifugated, washed and
resuspended in 1 ml of HEPES-NaCl buffer, prior to the addition of 250 uM of H2O2 or 100 uM of
SNAP for another 45 minutes. Cells were then centrifuged, washed and resuspended in 1ml of
HEPES-NaCl containing 5uM of DCFDA and left 45 minutes at 37°C in the dark. After a last
centrifugation-washing step, 200 JJ.1 of the promastigote resuspensions were analyzed with a
62
fluorometer (VictorPerkinElmer) at 485nm excitation and 535 nm emission wavelengths. Results are
expressed in Relative Fluorescence Unit (RFU) and are the average of three independent
experiments. A Mann Whitney test was conducted on raw data for statistical analysis *p <0.05,
**p<0.01 and ***p<0.001.
Macrophage infections
We tested the capacity of the L. infantum and L. major wild-type, PTR1 null mutants (PTRl'''
) and PTR1 add-back mutants (PTR1'A + PTR1) promastigotes to infect the murine macrophage cell
line J774 (ATCC J774 Al). Macrophages were seeded (25x104 cells/well) in 24 wells plate and
activated 24h either with INFy (100U/ml) and LPS (100ng/ml) in order to trigger an NO production
by iNOS [267, 268], or with complement-opsonized zymozan (100|xg/ml) in order to trigger an
oxidative burst and production of O2* and H2O2 [269]. Prior to infection, oxidative burst and nitric
oxide production were controlled using DCFDA dye [269, 270] and the Griess assay [271]
respectively. Infections were done with PNA purified metacyclic stationary phase parasites at a
parasite to cell ratio of 10:1 for a period of 3 hours. The non-engulfed parasites were removed by 2 -
3 washes with warm medium and chambers were replenished with 500 ul of fresh DMEM medium
supplemented with 10% FBS. Leishmania cells were transfected with the pSPaBLASTa-1.2LUC
expression vector, which carries the blasticidin resistance gene and the luciferase reporter gene. The
luciferase reporter gene expression was used as a measure of intracellular growth of the parasites as
validated previously [272, 273]. The relative rate of infection was measured using the luciferase
assay. Results are expressed in Relative Luminescence Unit (RLU) which is proportional to the
number of parasites that has survived the phagocytosis after 24h of infection. These experiments
have been done three times (L. infantum) and two times (L. major) in triplicate. Human peripheral
blood mononuclear cells were isolated by density-gradient centrifugation on Ficoll-Hypaque from
healthy blood donors with informed consent obtained in accordance with the Declaration of Helsinki.
Monocytes were purified and allowed to differentiate into macrophages (MDMs) in complete RPMI
1640 supplemented with human recombinant macrophage colony stimulating factor (100 ng/ml) for
6 days as described [274]. Once differentiated, MDM were recovered using PBS-EDTA and seeded
in 96 wells plate and activated 48h either with INFy (100U/ml) and LPS (100ng/ml) or with
zymozan (100ug/ml). Oxidative burst and nitric oxide production were controlled using DCFDA and
DAF-FM dyes as previously done by others in similar conditions [275]. These experiments were
63
done 3 times in triplicate. A Mann Whitney test was conducted on raw data and we considered
results as significant with *p <0.05, **p<0.01 and ***p<0.001.
64
RESULTS
L. tarentolae PTR1 " null mutants are sensitive to in vitro H2O2 and NO mediated stresses
The L. tarentolae PTR1~'~ null mutant has been previously generated in our laboratory and
was shown to be hypersensitive to MTX [256, 276]. We tested whether reduced pterins can serve in
protecting the parasite against oxidative stresses. Leishmania PTR1~'~ cells were shown to have less
H4B [261]. To assess the putative role of reduced pterins in dealing with oxidants, we tested the
susceptibility of L. tarentolae PTR1~'~ null mutant to oxidative and nitrosative stresses. The L.
tarentolae PTRV ' null mutant showed an increased sensitivity for H2O2 compared to control cells
(Fig. IA). The H2O2 EC50 of control parasites is approximately 500 uM whereas it is only about 100
uM for the PTRV ' null mutant parasites. This increased H2O2 sensitivity was reverted (partially) by
adding back an episomal copy ofPTRl in the L. tarentolae PTR1'A null mutant (Fig. 1 A). The PTRV
' null mutant also showed an increased sensitivity for SNAP mediated stresses (a nitric oxide donor)
[263], compared to the control cells (Fig. IB). The PTR1 add-back mutant regained the wild type
phenotype (Fig. IB). These data suggested that L. tarentolae PTR1, through the generation of
reduced pterins, contributed to the ability of the parasite to survive to oxidative and nitrosative
stresses and these novel observations warranted further investigations with human Leishmania
pathogenic species.
PTR1 gene replacement in L. infantum and L. major
The PTR1 genes of L. infantum and L. major were replaced by NEO and HYG markers with
cassettes allowing homologous recombination (Fig. 2A). To confirm the integration of the drug
resistance markers at the PTR1 locus we performed PCR amplifications and Southern blot analysis
on genomic DNA isolated from putative null mutants and wild type parasites of both species (Fig.
2). With the selected primers, PCR amplification from wild type parasites of both species should
give a band of 2,1 kb (Fig. 2A) and this is indeed what we observed (Fig. 2B, 2C,lanes 1). This band
was absent in the null mutants of both species and instead, we observed PCR amplicons of 2 kb and
2.3 kb, consistent with the integration of the NEO and HYG markers respectively (Fig. 2B, 2C, lanes
2). The generation of null mutants was further confirmed by Southern Blot analysis where DNA was
digested with Xbal and NotI and hybridised to a probe recognizing the PTR1 3'UTR region. The
digested DNAs of L. infantum and L. major wild type cells gave rise to 1,3 kb and 2,3 kb bands
respectively due to the presence of a NotI site in L. infantum only. Upon the integration of NEO and
65
HYG at the PTR1 locus, a digestion with Xbal should give rise to 2,2 kb and 2,4 kb hybridising
bands (Fig. 2A) and this is indeed what was observed when the Southern blot was hybridized to the
3'UTR PTR1 probe (Fig. 2B, 2C, lane 2). These novel bands hybridized also with either the NEO
and HYG probes (results not shown).
Phénotypes of h . major and L. infantum PTR1"/"null mutants
PTR1 is a well established marker of MTX resistance [265, 277]. The newly generated L.
infantum and L. major PTRV1' null mutants were both hypersensitive to MTX (Fig. 3A) compared to
control cells. This hypersensitivity phenotype could be rescued by complementation with an
episomal copy oiPTRl and wild-type cells overproducing PTR1 were resistant to MTX (Fig. 3A). A
link between reduced pterins and metacyclogenesis has previously been described for L. major [261]
and constituted as such the first defined cellular role of pterins in Leishmania. In our analysis of
metacyclogenesis, we also found a significant change in the procyclic/metacyclic ratio in both L.
infantum and L. major PTRV ' null mutants (Fig. 3B). This was clearly related to PTR1 inactivation
since the add-back mutants displayed a procyclic/metacyclic ratio similar to the control parasites
(Fig. 3B). In contrast to previous results [255], L. infantum and L. major PTR1~'~ null mutants didn't
require any addition of reduced biopterins to grow. Even in the poor folate medium M199
completely depleted in foetal bovine serum as well as in reduced biopterins, the L. infantum and L.
major PTRV ' null mutants grew similarly to wild type cells (results not shown).
We tested the survival of L. infantum and L. major PTRV1' null mutants against H2O2 and
SNAP. The L. infantum and L. major PTRV ' null mutants exhibited an increased sensitivity for H2O2
mediated stresses, in comparison to the control cells (Fig. 4A). The EC50 for H2O2 of L. infantum and
L. major wild-type cells were about 70 uM and 100 uM respectively. These values decreased to -40-
50 uM for the PTR1' ' null mutants in both species (Fig. 4A). By adding back an episomal copy of
PTR1, this ~2 fold measured difference in sensitivity was reverted (Fig. 4A). In fact, in both L.
infantum and L. major, the add back not only restored the wild type phenotype as it even conferred
increased resistance to H2O2. Wild-type cells overproducing PTR1 were even more resistant to H2O2
(Fig. 4A). L. major and L. infantum PTRl' ' null mutants also exhibited an increased sensitivity for
SNAP mediated stresses, compared to the control cells (Fig. 4B). The SNAP EC50 of control cells of
both species was about 90 uM whereas it was only 30-50 \iM for the PTRV1' null mutants (Fig. 4B).
The PTR1-add back mutants exhibited a wild type phenotype (Fig. 4B).
66
Reduced pterins provided by PTRl as oxidant scavengers in Leishmania cells
Reduced biopterins are known to act as scavengers of oxidant molecules [228, 254]. We
monitored the oxidants in Leishmania cells exposed to H2O2 and SNAP using the membrane
permeable oxidant-dependent dichlorofluorescein-diacetate (DCFDA) fluorescent probe [235, 278].
Under standard growth conditions more fluorescence was observed with L. infantum and L. major
PTRV ' null mutants compared to wild-type cells (Fig. 5A). This increased presence of oxidants is
due to the lack of PTRl since mutant cells retransfected with an episomal PTRl construct had the
same fluorescence levels as control cells (Fig. 5A, 5B). The main function of PTRl is to reduce
pterins [251, 252]. Supplementation with biopterin (Fig. 5, bars marked 'c') did not rescue this
phenotype. However, supplementation with dihydrobiopterin and tetrahydrobiopterin resulted in less
intracellular fluorescence both in the wild-type or PTRV1' null mutants with a significant decrease of
the fluorescence levels (Fig. 5, bars marked 'b'). When control L. infantum and L. major parasites
were subjected to an H202-induced oxidative stress, we observed a marked increase in fluorescence
compared to the non treated cells (Fig. 5A). The largest increase in fluorescence was observed in the
PTRV1' null mutants of both species (Fig. 5 A). This phenotype could be reversed in cells transfected
back with an episomal PTRl construct or by supplementing cells with reduced biopterins but not by
supplementing with oxidized pterins (Fig. 5 , bars marked 'b' and 'c'). Overall, similar albeit smaller
effects were observed in L. infantum cells subjected to a nitric oxide-induced nitrosative stress using
SNAP (Fig. 5B). Indeed, a statistically significant increase in fluorescence was observed in the
PTRl null mutant compared to control cells (Fig. 5B).
Intracellular survival of the L. infantum and L. major PTR1V~ null mutants
We tested the survival of L. infantum and L. major PTRV ' null mutant in the murine
macrophage cell line J774. Parasites were transfected with a construct coding for the firefly
luciferase and the survival of the transfectants was followed by measuring luciferase activity [272].
The intracellular survival of PNA-purified metacyclic L. infantum (Fig. 6B) or L. major (Fig. 6C)
PTRV1' null mutants were significantly reduced compared to PNA-purified metacyclic control cells
(Fig. 6B, C). This phenotype was specific to the lack of PTRl has it could be rescued for both
species by adding back PTRl (Fig. 6B, C). J774 can be readily activated for producing ROIs and
RNIs with opsonized zymozan and INFy/LPS, respectively [267, 269]. Treating J774 with INFy and
67
LPS indeed induced RNI as measured using the classical Griess reagent assay for measuring RNI
production (Fig. 6A, left panel). J774 activation with 100 pg/ml zymozan for 24 hours clearly
produced ROI compared to the non activated J774 as measured using the DCFDA probe (Fig. 6A,
right panel). Metacyclic L. infantum cells transfected with a control vector have decreased survival
in J774 cells activated with INFy/LPS but this was even more pronounced for the PTRl' ' null
mutants (Fig. 6B, middle panel). The difference between PTRV/' null mutants and control cells in
INFy/LPS activated cells was statistically significant (p<0.01) compared to the survival of the PTRV
' null mutant in the non activated J774 cells. A similar observation was done for L. major (Fig. 6C).
Surprisingly, L. infantum control cells infected better Zymozan activated J774 compared to cells
treated with Hepes-NaCl (Fig. 6B). This latter phenomenon was only observed for L. infantum,
however (Fig. 6B, C). Nevertheless, when compared to control cells, metacyclic parasites of both L.
infantum and L. major PTRV1' null mutants were killed in significantly higher proportion in the
Zymozan treated macrophages compared to the survival in non activated macrophages (Fig. 6B, C).
The phénotypes observed were rescued by transfecting back PTRl in the PTRl''mutants (Fig. 6B,
C).
We also tested the survival of the L. infantum PTRl null mutant in human monocytes-derived
macrophages (MDMs). As reported extensively in the literature [279], we could not measure
changes in RNIs in human MDM activated with INFy/LPS using either the Greiss reagent (result not
shown) or even the more sensitive fluorescent probe DAF-FM (Fig. 7A). However, treatment of
human MDM with Zymosan induced ROIs as measured using DCFDA probe (Fig. 7A, right panel).
PNA-purified PTRV1' metacyclic parasites had reduced intracellular survival and this could be
rescued by the reintroduction of PTRl (Fig. 7B). Despite our inability to detect RNIs in MDMs, the
survival of the L. infantum PTRl'' null mutant was significantly lower (p<0,05) in cells treated with
INFy/LPS compared to their survival in non activated MDMs when compared to control cells (Fig.
7B). A similar observation was also made for the Zymosan treated cells where the survival of the
purified metacyclics of L. infantum PTRl' ' were significantly reduced in the treated cells compared
to the non treated cells (Fig. 7B). Interestingly in MDMs (but not in J774 cells), we found more L.
infantum parasites in the PTRl add-back transfecteants under all conditions (Fig. 7B).
68
DISCUSSION
Pterins are known as important growth factors for Leishmania (reviewed in [259, 260]),
although their exact cellular role(s) have not yet been established in this parasite. Reduced pterins
such as H4B serve as co-factors for a number of enzymes [254, 258] including iNOS. One report has
described iNOS activity in Leishmania [280] but the genome sequence has not revealed any iNOS
homologue in Leishmania (www.genedb.org). Other enzymes known to require H4B in mammalian
cells are either absent or shown to utilise other co-factors or have not yet been studied in Leishmania
[259, 260]. Thus, it is likely that reduced pterins play other roles in Leishmania. One role that was
established consisted in a correlation between low levels of H4B and metacyclogenesis in L. major
[261]. The L. major PTRl' ' null mutant was found to be more virulent in mice and this was
suggested to be due to an increase in metacyclogenesis [261]. We confirmed that L. major PTRl' '
had increased levels of metacyclics (result not shown) and we showed here that the L. infantum
PTRl' ' mutant also had increased metacyclogenesis (Fig. 3B). Since PTRl' ' cells have increased
metacyclic parasites, we opted to purify metacyclic parasites from control cells and PTRl' ' mutants
prior to macrophage infections. This has allowed to demonstrate a marked reduced intracellular
survival of the L. infantum PTRV ' mutant compared to control cells when metacyclic parasites
infected macrophages either of murine or human origin (Fig. 6B, 7B). The same observation of
reduced survival was made with L. major PTRl' ' purified metacyclics (Fig. 6C). We choose to look
at 24hr infections as we had expected that it is in the first hours of contact, when promastigotes
interact with the macrophages, that the parasites would experienced the most ROIs. Indeed,
promastigotes are known to induce more ROIs than amastigote parasites when infecting the
macrophages [281]. Longer infection times with metacyclic parasites were also studied and we also
observed that the growth of the L. infantum PTRl' ' mutant was also decreased compared to control
parasites (results not shown). Thus a lack of PTRl increases metacyclogenesis and this contributes
to the reported increase in vivo infection [261]. However, if macrophage infections are carried out
with purified metacyclic parasites, then we showed an important function of PTRl in intracellular
survival (Fig. 6, 7). Several reports have dealt with the generation of inhibitors against PTRl [282,
283] and these efforts appear justified in light of the role of PTRl for the intracellular survival of the
parasite.
The main research question that was sought in this study was whether reduced pterins can
serve as defence mechanisms against ROIs and RNIs in Leishmania. Reduced pterins are established
radical scavengers (reviewed in [228]) although this is not known for Leishmania. Multiple drugs,
69
some putatively inducing ROIs, can induce amplification of the DNA locus encoding PTRl [90]. It
has been argued that amplification of PTRl may be due to the requirement of PTRl-produced
reduced pterins to deal with drug-induced ROIs [259]. To test this, we generated PTRl''mutant of
different Leishmania species (Fig. 2). Both the molecular (Fig. 2) and functional characterization of
the mutants confirmed that we had generated PTRl null mutants with the expected phenotype of
MTX susceptibility (Fig. 3). We did not need to supplement the growth media with reduced pterins
to sustain the growth of PTRl null mutants. As pterins are essential co-factors, we cannot exclude
small contaminating amounts in some components of the media used or that, as suggested [259],
Leishmania may have another elusive enzyme that can reduce a small amount of pterins.
The PTRl' ' cells of three Leishmania species were found to be more sensitive to RNIs and
ROIs (Fig. 1, 4). This novel phenotype was specific as it could be rescued either genetically by
transfecting back PTRl, or metabolically by supplementing the medium with reduced but not
oxidized pterins (Fig. 4). Interestingly, even under standard conditions, we observed an increased
level of oxidants in PTRl' ' cells (Fig. 5), suggesting that the maintenance of a reduced environment
is one of the physiological roles of reduced pterins that are provided in part by PTRl. Cells
transfected with PTRl were even more resistant to H2O2 compared to control cells (Fig. 4).
Interestingly, the overexpression of PTRl provided a significant advantage in growth in MDMs,
even in cells primed to produce ROIs or RNIs (Fig. 7). This supports a role for reduced pterins as a
non-enzymatic scavengers of ROIs and RNIs in Leishmania and this is consistent with the proposed
role of pterins in dealing with ROIs [284] and RNIs [285]. As discussed above, the PTRl' ' parasites
were already crippled when grown in macrophages but when ROIs or RNIs were induced in
macrophages, we observed a larger reduction of PTRV1' cells compared to control cells, further
supporting a role of reduced pterins in dealing with oxidative and nitrosative stresses. PTRl main
role is to reduce pterins obtained for the environment. Once H4B is used in the cell, it will eventually
yield quinonoid-dihydrobiopterin which is regenerated into H4B by the enzyme quinonoid
dihydropteridine reductase [254]. It would be interesting to inactivate this gene in Leishmania and, if
non essential, test its role in dealing with ROIs and RNIs. This is complicated in L. major, however,
since it is encoded by a tandemly repeated array of genes [253] although in L. infantum it would
appear to be single copy (www.genedb.org).
Leishmania often amplifies specific portions of its genome to respond to environmental
stresses such as drugs [136, 286]. A small number of loci are also found naturally amplified in field
isolates [286]. Two of those loci encode for Biopterin Transporter BT1 and PTRl [260]. It has been
70
proposed that the requirement for pterins has led to the selection of events leading to
extrachromosomal amplification of BT1 and PTRl. In light of the results presented here, one
possible driving force for gene amplification would be ROIs or RNIs that are encountered by the
parasites in its environment. Clearly, during its life cycle, the parasite, either in the sand flies or
when interacting with macrophages, is experiencing a number of stresses including ROIs and RNIs.
The parasite is well equipped with enzymatic and non enzymatic mechanisms to cope with these
molecules (see introduction) and to this list, we can now added reduced pterins.
71
ACKNOWLEDGMENTS
This work was funded in part by a CIHR group grant and operating grants to MO. We thank
Juliette Diou and Dr. Michel Tremblay for the generous gift of MDM cells. WM is a Strategic
Training Fellow of the Strategic Training Program in Microbial Resistance, a partnership of the
CIHR Institute of Infection and Immunity and the Fonds de Recherche en Santé du Québec. MO is a
Burroughs Wellcome Fund Scholar in Molecular Parasitology and holds the Canada Research Chair
in Antimicrobial Resistance.
72
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76
Fig. 1. Susceptibility of the L. tarentolae PTRV7' null mutant to oxidative and nitrosative
stresses. A. Growth of L. tarentolae cells at 72 hours with varying concentrations of H2O2. B.
Growth of L. tarentolae cells at 72 hours with varying concentrations of SNAP. Average of
triplicates repeated twice. • , L. tarentolae wild type cells transfected with pGEM-7ZF-aNEOa; ■. L.
tarentolae PTRl' ' null mutant; o, L. tarentolae PTRl' ' null mutant transfected with a PTRl
episomal construct.
Fig. 2. PTRl gene replacement in L. infantum and L. major. A. PTRl locus in L. infantum and L.
major and expected size of PCR amplicons (below the maps; dashed lines) and expected size of
hybridizing bands (above the maps) in wild type and recombinant parasites digested with Xbal and
NotI and hybridized to a 3'UTR probe. B. PCR and Southern blot analysis of L. infantum wild type
(lane 1) and the PTRl' ' null mutant (lane 2). C. PCR and Southern blot analysis of L. major wild
type (lane 1) and PTRl' ' null mutant (lane 2). X, Xbal; N, NotI. The NotI site (N) is present only in
the L. infantum PTRl gene.
Fig. 3. Susceptibility to methotrexate and metacyclogenesis of L. infantum and L. major PTRl"''
null mutants. A. Growth of L. infantum and L. major cells at 72 hours with varying concentrations
of methotrexate. Average of triplicates repeated twice. • , wild type cells transfected with
pSPaNEOa; ■, PTRl' ' null mutants; o, PTRl' ' null mutants transfected with an episomal PTRl
construct; A, wild type transfected with an episomal PTRl construct. B. Percentage of metacyclic
promastigotes in 7 days old cultures of L. infantum (left) and L. major (right). Metacyclic parasites
were separated from procyclics and counted using PNA as described in Materials and Methods.
Average of three independent experiments. *, p<0,05
Fig. 4. Susceptibilities of L. infantum and L. major PTR1V~ null mutants to oxidative and
nitrosative stresses. A. Growth of L. infantum and L. major cells at 72 hours with varying
concentrations of H2O2. B. Growth of L. infantum and L. major cells at 72 hours with varying
concentration of SNAP. Average of triplicates repeated twice. • , wild type cells transfected with
pSPaNEOa; ■, PTRl' ' null mutants; o, PTRl' ' null mutants transfected with an episomal PTRl
construct; A, wild type transfected with an episomal PTRl construct.
77
Fig. 5. Intracellular oxidative species levels and reduced pterins in Leishmania infantum and
Leishmania major. A. The level of oxidative species was measured in Leishmania cells under
standard growth conditions (left panel) or after being exposed to 250 uM of H2O2 (right panel) using
the DCFDA probe in L. infantum (upper panel) or L. major (lower panel) transfected with
pSPaNEOa (white bars) in the PTRl' ' null mutants (black bars) or in the PTRl' ' null mutants
transfected with an episomal PTRl construct (grey bars). The cells were metabolically rescued with
Hepes-NaCl buffer ('a'); 10 pM dihydrobiopterin/tetrahydrobiopterin ('b'); 10 pM biopterin ('c'). B.
We also monitored the level of oxidative species in the same L. infantum transfected cells under
normal conditions (left panel) and after being exposed to 100 pM of SNAP, a nitric oxide donor
(right panel). Results are the average of 3 independent experiments *, p<0,05 ; **, p<0,01.
Fig. 6. Intracellular survival of Leishmania PTRl''' null mutants in the murine macrophage
J774 cell line. A. J774 were activated during 24 hours with INFy (100 U/ml) and LPS (100 ng/ml)
prior to infection and nitric oxide production was measured using the Griess assay (left panel). J774
were activated during 24 hours with zymozan (100pg/ml) prior to infection and the production of
oxidants species was measured using the DCFDA oxidant-dependent fluorescent probe (right panel).
B-C. L. infantum (B) and L. major (C) cells were transfected with a construct coding for the firefly
luciferase and the survival of PNA-purified metacyclic parasites within J774 macrophages was
assessed by measuring luciferase activity after 24 hours of infection. L. infantum (B) or L. major (C)
cells transfected with pSP72aNEOa (white bars) in the PTRl null mutants (black bars) or in PTRl' '
null mutant transfected with an episomal PTRl construct (grey bars). J774 macrophages infection
was done in 24 wells plates using a 10:1 parasite to macrophage ratio. Macrophages were either
treated with the buffer (HEPES-NaCl); primed to produce RNIs (INFy/LPS) or ROIs (Zymosan).
Results are expressed as the average relative luminescence unit (RLU) of three (L. infantum) and two
(L. major) independent experiments done in triplicate. *, p<0,05 ; **, p<0,01 ; ***, p<0,001 .
Fig. 7. Intracellular survival of the L. infantum PTRl ' null mutant in human monocyte-
derived macrophages. A. MDM were activated during 48 hours with Inf-y (100 U/ml) and LPS
(100 ng/ml) or with zymozan (100pg/ml) prior to infection and the production of oxidants species
was measured using either the DAF-FM nitric oxide dependent fluorescent probe (left panel) or the
DCF-DA oxidant dependent fluorescent probe (right panel). B. L. infantum cells were transfected
with a construct coding for the firefly luciferase and the survival of metacyclic promastigotes within
78
MDM was followed by measuring luciferase activity after 24 hours of infection in L. infantum cells
transfected with pSP72aNEOa (white bars), in the PTRl null mutants (black bars) or in the PTRl' '
null mutant transfected with an episomal PTRl construct (grey bars). MDM macrophage infection
was done in 96 well plates using a 10:1 parasite to macrophage ratio. Results are expressed as the
average relative luminescence unit (RLU) of three independent experiments done in triplicate. *,
p<0,05 ; **, p<0,01.
79
1000 [ H O ] M M
100 [SNAP] pM
500
Fig. 1
80
Fig.2
2.3 kb
5'UTR
XA j 5'UTR
(N)«— _ | PTR1
1.3 kb
3'UTR x j _
2.1 kb
2.4 kb
HYG 3'UTR ■ 2.3 kb
XM J 5'UTR
2.2 kb
NEO 2kb
5'UTR
PTR1
kb
3
2 PTR1
81
L. infantum L. major
50 100
[MTX] MM
500 100
[ M T X ] M M
500
WT PTR1 -/- PTR1 -/-+ PTR1
D Procyclics ■ Metacyclics
WT PTR1 -/- PTR1 -/-+ PTR1
Fig. 3
82
L. infantum L. major
25 50 100 250 500
[H2OJ MM 25 50 100 250 500
[H202] uM
100 250
[SNAP] uM 500
100
500 [SNAP] uM
Fig. 4
83
A 40000
30000-
2 20000 QC
10000-
40000
30000-
2 20000 S
10000
B 40000
30000
20000
10000
D WT + a-NEO-a ■ PTR1 -/-m PTR1 add black
250 [H202] MM
[SNAP] pM
Fig. 5
84
o z
50-
40-
30-
20-
10-
o-untreated INF-y
LPS
250000-
200000-
3 150000-u. S 100000
50000
0 I -■- I
Y
untreated Zymozan
B
- i on
□ WT + ct-NEO-a ■ PTR1 -/-m PTR1 add black
Hepes-NaCl INFy / LPS Zymozan
où
Hepes-NaCl INFy / LPS
Fig. 6
Zymozan
85
8000-
7000-
6000-
= 5000-
U- 4000-3000-
2000-
1000-
o -untreated INF-y
LPS
25000-
20000-
3 15000-u. K 10000-
5000-
o -untreated Zymozan
B 400
300-
200-
100-
□ WT + a-NEO-a ■ PTR1 -/-M PTR1 add black
Hepes-NaCl INFy / LPS Zymozan
Fig. 7
86
Chapitre VI. Analyse de la métacyclogénèse et du rôle des
ptérines réduites chez Leishmania infantum Ce chapitre fera bientôt l'objet d'une soumission au Journal of Proetome Research et est constitué de
la dernière version du manuscrit qui sera soumis pour publication.
6.1 Résumé Leishmania, l'agent étiologique de la leishmaniose, possède un cycle de vie dimorphique et se
retrouve sous la forme promastigote flagellée dans son vecteur, la mouche des sables, et sous la
forme amastigote intracellulaire non-mobile dans les macrophages de son hôte mammifère. Les
promastigotes acquièrent leur maturité dans la mouche des sables en passant par deux stades
importants bien distincts. Ce développement séquentiel des promastigotes procycliques non-
infectieux vers les promastigotes métacycliques infectieux se nomme métacyclogénèse et constitue
une étape importante pour l'infectivité du parasite. Plusieurs modifications biochimiques et
moléculaires ont été associées à la métacyclogénèse. L'inactivation de la ptéridine reductase PTRl
provoque une augmentation du nombre de parasites métacycliques comparativement à une souche
sauvage. Peu d'études ont porté sur les changements du protéome durant la métacyclogénèse du
Leishmania et aucune, jusqu'à présent, n'a étudié le rôle des ptérines dans ce processus de
differentiation. Dans cette étude, nous avons utilisé la technique du FFE (Free Flow Electrophoresis)
pour analyser la métacyclogénèse d'une souche de L. infantum sauvage et une souche déficiente en
PTRl suite à une inactivation génique. L'utilisation du FFE améliore significativement le niveau de
résolution du protéome et nous avons pu identifier plus de 460 protéines potentiellement exprimées
de manière différentielle durant le processus de métacyclogénèse, ou bien entre la souche sauvage et
la souche PTRl''. Des voies métaboliques importantes, comme le métabolisme énergétique, les
mécanismes de défenses anti-oxidatives, la dégradation des protéines, et la mobilité du parasite
semblent jouer un rôle dans la métacyclogénèse du Leishmania et ceci paraît encore plus flagrant
chez le mutant PTRl''.
87
6.2 Article
Proteomic analysis of metacyclogenesis in Leishmania infantum and the role of
reduced pterins
To be submitted in Journal of Proteome Research
Wilfried Moreira, Gina Racine, Danielle Légaré and Marc Ouellette*
Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL, Université Laval, Québec, QC, Canada.
*Corresponding author: Marc Ouellette Ph.D.
Centre de Recherche en Infectiologie
2705 Boul. Laurier
Québec, QC
Canada
Gl V 4G2
Tel : 1-418-654-2705
Fax : 1-418-654-2715
E-mail : Marc.Ouellette(2),crchul.ulaval.ca
Running title: Proteomic analysis of metacyclogenesis in Leishmania
Keywords: Leishmania, reduced pterins, metacyclogenesis, free-flow electrophoresis
88
Summary
Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, has a dimorphic life cycle alternating as a
flagellated promastigote within the sand fly midgut and an intracellular nonmotile amastigote within
mammalian macrophages. Promastigotes maturate in the sand fly and progress through two major
and distinct stages. This sequential development of non-infective procyclic promastigotes towards
infective metacyclic promastigotes is called metacyclogenesis and is important for parasite's
infectivity. Several biochemical and molecular differences have been associated to
metacyclogenesis. Among these, reduced pterins have been identified as an important factor
controlling the metacyclogenesis process. Indeed, inactivation of the ptéridine reductase gene PTRl
leads to an increase in metacyclic parasites compared to a wild-type strain. Only few studies have
investigated specifically the proteome changes during metacyclogenesis and none has studied the
role for reduced pterins in this process so far. In this study, we applied the liquid based free-flow
electrophoresis (FFE) technique for the analysis of L. infantum wild-type and PTRl null-mutant
(PTRV ') proteomes during the metacyclogenesis process. The use of the FFE technique greatly
improved proteome resolution and we report here the identification of more than 460 proteins
thought to be differentially expressed either during the differentiation process or between wild-type
and PTRl null-mutant metacyclic promastigotes. Important metabolic pathways such as energy
metabolism, antioxidant defences, protein degradation and motility are modulated during
Leishmania metacyclogenesis.
89
Introduction
Leishmania parasites are responsible for a wide range of diseases affecting 12 million people
worldwide with 1.5-2 million new cases each year. Leishmania has a dimorphic life cycle and is
found as a flagellated promastigotes within the sandfly midgut, and as an intracellular nonmotile
amastigotes within mammalian macrophages. Promastigotes maturate in the sandfly and progress
through two major and distinct stages. This sequential development involves the rapid division of
non-infective procyclic promastigotes in the midgut that ultimately leads to the formation of the non-
dividing and infective metacyclic promastigotes in the anterior parts of the digestive tract [1,2]. This
differentiation process of procyclic promastigotes into metacyclic promastigotes (metacyclogenesis)
is a key step for infectivity [2-4]. It has been shown that promastigotes recovered from laboratory
infected sandfly displayed a significant increase in infectivity in Balb/c mice [2]. An increase in
promastigotes infectivity was also observed in culture when promastigotes from logarithmic phase
(day 3) were compared to promastigotes from the stationary phase (day 6), the latter being more
infective [1-4]. The infectivity of stationary phase promastigotes has been attributed to the change in
their surface carbohydrates [4].
Metacyclogenesis is accompanied by a number of morphological changes that allow the
distinction of the metacyclic form. Procyclics possessed a flagella approximately one body length
whereas metacycles are shorter cells of reduced body width and flagella longer than one body length.
The mechanism underlying this differentiation has been the subject of many studies and several
investigations have been conducted in order to identify specific metacyclic stage antigens [4-6]. It is
important to note that within the Trypanosomatidae, including Leishmania spp., regulation of gene
expression mostly occurs at the post-transcriptional level, suggesting that changes in the proteome
during differentiation must be controlled by post-transcriptional mechanisms, including modulation
of mRNA stability, regulation of translation and post-translational modifications [7]. It is also known
90
that metacyclogenesis occurs in a nutrient-depleted environment [2], curtailing the resources for
protein de novo synthesis, suggesting a role for post-translational modifications in this differentiation
process. Clear biochemical and molecular differences have already been established during
metacyclogenesis. That includes a lower amount of total protein content associated to a decrease in
protein synthesis in the metacyclics compared to procyclics, as well as an increase in proteases
activity [8]. Secretory acid phosphatase and nuclease activity have also been reported to be
decreased in metacyclic parasites [8]. As mentioned earlier, there are also changes in surface
carbohydrates composition between procyclics and metacyclics.
Reduced pterins have been identified as an important factor controlling the metacyclogenesis
process [9]. Leishmania is an auxotroph for pterins but it possesses the biopterin transporter BT1
[10-12]. After BT1-mediated uptake, pterins are reduced into their active form by the enzyme
ptéridine reductase (PTRl) [13-15]. One of the earliest known cellular functions of H4B was as a
growth factor for the parasite Crithidia fasciculata [16], and many studies have indicated that it is an
essential growth factor for Leishmania [17-20]. H4B serves as a cofactor for a number of enzymes
[16, 21] but so far these enzymes were either not present or shown not to require H4B in Leishmania
[14, 22]. H4B was also shown to react readily with oxygen, superoxide, H202, and peroxynitrite and
it was demonstrated that it protects cells against oxidative damages [23, 24] (and reviewed in [25,
26]). PTRl and reduced pterins thus play important roles in Leishmania differentiation and life
cycle, in which the infective metacyclic form encounter oxidative stress as it meets with its host
immune system.
Few studies have investigated the proteome changes during the metacyclogenesis of
Leishmania [27, 28] and none related to a role for reduced pterins in this process. In this study, we
applied free-flow electrophoresis (FFE), a liquid based IEF separation technique that we recently
used for Leishmania proteins [29], for the analysis of the metacyclogenesis process in L. infantum
91
wild-type cells and in a PTRl null-mutant (PTRl') [23]. This proteomic approach was useful to
detect proteins differentially expressed during metacyclogenesis and to pinpoint possible roles for
reduced pterins in this process.
92
Material and Methods
Cell Culture, Lectin-Mcdiated Purification of Metacyclics and Protein Sample Preparation. L.
infantum (MHOM/MA/67/ITMAP-263) wild-type and PTRl' ' [23] promastigotes were grown in
SDM medium as described previously [30] and parasites (IO9 cells) in their exponential phase (3
days of culture) and stationary phase (6 days) of growth were pelleted by centrifugation (3000 rpm,
5 min). Pellets were washed twice in Hepes-NaCl (21 mM Hepes, 137 mM NaCl, 5 mM KC1, 0.7
mM Na2HP04-H20, and 6 mM Dextrose, pH 7.05). Purification of metacyclics parasites was made
as previously described [3] from the parasites population isolated in stationary phase using a final
concentration of 100pg/ml of peanut-agglutinin protein (PNA). Protein extractions were prepared by
incubating cell pellets in 300 pi of 2D lysis buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 3% (w/v) Chaps, 20 mM
DTT, 5 mM TCEP, 50 mM Tris-base 0.5% IPG buffer pH 4-7, and 0.25% IPG buffer pH 3-10)
supplemented with 10 pi of protease inhibitors cocktail (2 mM AEBSF, 14 pM E-64, 130 pM
Bestatin, 0.9 pM Leupeptin, 0.3 pM Aprotinin, and 1 mM EDTA) (Sigma-Aldrich) for 2 h at room
temperature with frequent vortexing. The supematants were collected after centrifugation (10000
rpm, 2 min) and total protein preparations were quantified using the 2-D Quant Kit (GE Healthcare).
Free-Flow Electrophoresis (FFE) Continuous liquid-based isoelectro-focusing (IEF) was
performed using a BD FFE System (BD Diagnostics) essentially as described [29]. Briefly, the
Leishmania proteins (3 mg) were fractionated under denaturing conditions in a pH gradient ranging
from 3 to 10 using standard electrophoretic conditions (10 °C, 750 V, media flow rate of 57 ml/h)
[29]. Four independent biological replicates for each stage were processed. Individual fractions were
pooled to cover 3 pH ranges; 4.5 to 5.8 (fractions 27-33), 5.9 to 6.9 (fractions 34-40) and 6.9 to 8
(fractions 41-48). Proteins were concentrated using Ami con Ultra-15 columns (Millipore) and
desalted by three successive centrifugation/wash steps with 1 ml of 2D lysis buffer followed by
resuspension in the same buffer and proteins quantification using the 2DQuand Kit (GE Healthcare).
93
2D Gel Electrophoresis. Total cell extracts of procyclics and metacyclics were precipitated using
the 2-D Clean-up Kit (GE Healthcare) whereas pooled FFE fractions remained unprecipitated. One
hundred and fifty micrograms of sample (total cell extracts or pooled FFE fractions) were loaded
onto 18-cm Immobiline DryStrips of pH ranges 4,5-5,5, 5-6 and 5,5-6,7 (GE Healthcare). The first
dimension was performed in Ettan IPGphor II isoelectric focusing system (GE Healthcare) as
recommended by the manufacturer. IPG Strip equilibration and second-dimension SDS-PAGE were
done as described previously [31].
Gel Staining, Imaging, and Analysis. Proteins were visualized using SYPRO Ruby Protein Gel
Stain (Invitrogen) as described previously [32]. Gels were digitalized on the ProXPRESS 2D
Proteomic Imaging platform (PerkinElmer Life Sciences) and images were analyzed using the
Progenesis PG240 software (Nonlinear Dynamics, version 2006) in which spots were detected and
matched automatically. The data were inspected visually and edited manually when required. Spots
with differences in normalized spot volume (% Vol) greater than 1.5-fold in the four biological
replicates were considered as significantly differentially expressed. Significance levels of differences
observed were determined by the Progenesis software using the Student's two-tailed t test. P-values
< 0.05 were considered as statistically significant.
In-Gel Protein Digestion. Gel plugs containing proteins of interest were excised using a ProXcision
robot (PerkinElmer Life Science), deposited into a 96-well plate (Coming) and washed with distilled
water. In-gel protein digestion was performed at the Proteomics Platform of the Eastern Quebec
Genomics Center (http://proteomique.crchul.ulaval.ca/en/index.html) on a MassPrep liquid handling
station (Waters, Corporation) according to the manufacturer's specifications as described previously
[29, 31-33]. Digestion products were extracted from gel plugs using 1% formic acid, 2% acetonitrile
followed by 1% formic acid, 50% acetonitrile. Peptides were lyophilized in a speed vacuum and
94
resuspended in 8 pi of 0.1% formic acid and 4 pi of this peptide preparation was used for mass
spectrometry analysis.
Mass Spectrometry. Peptide MS/MS spectra were obtained by capillary liquid chromatography
coupled to an LTQ linear ion trap mass spectrometer equipped with a nanoelectrospray ion source
(Thermo Fisher Scientific). Peptides were loaded onto a reversed-phase column (PicoFrit 15-pm tip,
BioBasic C18, 10 cm x 75 pm; New Objective) and eluted with a linear gradient from 2% to 50%
acetonitrile in 0.1% formic acid at a flow rate of 200 nl/min. Mass spectra were acquired using a
data-dependent acquisition mode (Thermo Fisher Scientific Xcalibur software, version 2.0) in which
each full scan mass spectrum was followed by collision-induced dissociation of the seven most
intense ions. The dynamic exclusion function was enabled (30 ns exclusion), and the relative
collisional fragmentation energy was set to 35%.
Interpretation of Tandem Mass Spectra and Protein Identification. MS/MS spectra were
analyzed using MASCOT (Matrix Science, version 2.2.0) and searched in the GeneDB Leishpep
database assuming a theoretical digestion with trypsin. A mass tolerance of 2.0 Da for peptides and
0.5 Da for fragments were tolerated, with 2 trypsin missed cleavages allowed. The Scaffold software
(Proteome Software, version 2 0 1 0 1 ) was used to validate MS/MS-based peptide and protein
identifications. Peptide identifications were accepted if they reached greater than 95% probability as
specified by the Peptide Prophet algorithm [34]. Protein identifications were accepted if they reached
greater than 95% probability and contained at least three unique peptides as specified by the Protein
Prophet algorithm [35]. Proteins that contained similar peptides and could not be differentiated
according to MS/MS spectra alone were grouped to satisfy the principle of parsimony. The
assignment of functional classes was performed using the GeneDB database information's.
95
Results
Enrichment of procyclics and metacyclics proteins by FFE. L. infantum proteins derived
from WT and PTRl' ' procyclics and PNA purified metacyclics were fractionated by FFE in IEF
mode into about 70 fractions recovered in 96-well plates (~ 3mL/fraction). The pH of each fraction
was measured and fractions with pH between 4.5 and 5.8 (fractions 27-33), between 5.9 and 6.9
(fractions 34-40) as well as between 6.9 and 8 (fractions 41-48) were pooled. The FFE enrichment
of proteins for each condition was confirmed by 2D gel electrophoresis using IEF strips with pH
between 4.5 and 5.5, between 5 and 6 as well as between 5,5 and 6,7 by comparing FFE-enriched
proteins to whole cell extracts (total proteins) for each range of pH (Supplementary Fig. 1 and results
not shown).
Changing proteomes ofL. infantum WT and PTR1'A during metacyclogenesis. Since FFE
enriched effectively for the procyclics and metacyclics proteomes of WT and PTRl' '
(Supplementary Fig. 1) we carried out several comparative analyses of their respective proteomes
during metacyclogensis. We first compared meytacyclogenesis of L. infantum WT (Fig. 2,
comparison 1) and PTRl' ' null-mutants (Fig. 2, comparison 2) independently. This allowed the
identification of proteins differentially expressed during the transition from procyclics to
metacyclics. Fractions were separated by 2-DE with the first dimension respectively spanning pH
4.5-5.5, 5-6 and 5.5-6.7. The number of spots analyzed and proteins differentially expressed are
summarized in Supplementary Table 1. Globally, the numbers of protein spots detected over the
three pH ranges were 5323 and 5984 for L. infantum WT procyclic and metacyclic stages
respectively, and 5006 and 5207 for L. infantum PTRl' ' procyclic and metacyclic stages
respectively. We selected 20 spots that were derived from the WT cells undergoing
metacyclogenesis (Fig. 2, comparison 1); 7 were either unique or overexpressed in procyclics while
13 were either unique or overexpressed in the metacyclic stage respectively. We also selected 18
96
spots that were derived from the PTRl' ' cells undergoing metacyclogenesis (Fig. 2, comparison 2): 2
were either unique or overexpressed in procyclics while 16 were either unique or overexpressed in
the metacyclic stage of the PTRl null-mutant, respectively. Spots were excised and sent for MS/MS
identification. Out of these 38 spots, 36 spots fitted into the Scaffold software parameters (see
Material and Methods) which yielded 116 proteins: 15 unique or overexpressed in the procyclics and
101 unique or overexpressed in the metacyclic stage (Supplementary Table 1). As reported
extensively, there are extensive post-translational modifications in Leishmania and related parasites
(Jones et al., 2005, McNicoll et al., 2006, Rosenweig et al., 2008) including protein fragments
(Brotherton, 2010). Proteolysis has been shown to be a highly dynamic process in Leishmania as
experimentally validated with the tubulins (Drummelsmith et al., 2003), heat shock proteins (Bente
et al., 2003) and elongation factor-la (Brotherton, 2010). Several of the spots identified correspond
to protein fragments and are considered as a physyiological response occurring during
metacyclogenesis.
Both for the wild type cell and the PTRl null-mutants differentiating from procyclics to
metacyclics, we observed an alteration in the expression of several proteins (or fragments of)
including ones related to energy metabolism (Table 1), antioxidants metabolism (Table 2), stress
(Table 3), protein degradation (Table 4) and finally motility (Table 5). During metacyclogenesis of
wild-type cells, protein fragments related to the energy metabolism were found to be differentially
expressed (Table 1). Among these, we found the pyruvate dehydrogenase El beta subunit (LinJ
25V3.1790), which belongs of the glycolysis and TCA cycle pathway, either upregulated or
uniquely present in the metacyclic stage (Table 1). A fragment of prteins involved in GDP-mannose
biosynthesis (LinJ23_V3.0120) and the enolae were found to be increased in PTRl (Table 1). We
also identified fragments of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD, LinJ34_V3.0080) and
the fructose-1,6-biphosphate aldolase (LinJ36_V3.1320), involved in the glycolysis and the pentose
97
phosphate pathway, that are uniquely observed in the metacyclic stage of either the wild-type or
PTRl ' ' (Table 1).
A number of proteins (or fragments of) associated with antioxidants metabolism were
differentially expressed when analyzing conditions 1 and 2 (Table 2). A fragment of the
trypanothione reductase (LinJ05_V3.0350) was increased during metacyclogenesis while one
tryparedoxin peroxidase isoform (LinJ23_V3.0050) was exclusively expressed in both the wild-type
and PTRV ' procyclics (Table2). Several chaperonin isoforms (or their proteolytic fragments) were
also differentially expressed, most of which were unique to procyclics (Table 3). These
promastigotes specific chaperonin includes the mitochondrial Hsp60 chaperonin (LinJ36_V3.2130),
a putative chaperonin (LinJ36_V3.7240), the heat shock protein 83-1 (LinJ33_V3.0350) and the
Hsp70 (LinJ28_V3.2960). Fragments of a putative HSP70 (LinJ28_V3.2960), of a putative
mitochondrial Hsp70 related protein (LinJ30_V3.2470) and of Hsp83-1 (LinJ33.0370) were higher
or exclusively present in the metacyclic stage (Table 3). The presence of protein fragments derived
from proteins involved in protein degradation differed between procyclics and metacyclics (Table 4).
Fragments of the dipeptidyl-peptidase III (LinJ05_V3.0960) of a calpain-like cysteine peptidase
(LinJ27_V3.0510) and the putative protéasome beta 7 subunit (LinJ34_V3.4390) were uniquely
found in the procyclic stage while a protein fragment derived from an aminoacylase
(LinJ20_V3.1740) or protéasome related subunits (LinJ27_V3.1370, linJ29_V3.0120,
LinJ35_V3.0770) were found uniquely (or in higher amount) in the metacyclic stage (Table 4).
Tubulins are abundant proteins extensively processed in Leishmania (Drummelsmith 2003, autre ref)
and a high number of spots with varing molecular weights and pis contained either the beta tubulin
(LinJ08_V3.1280), or alpha tubulin (LinJ13_V3.0330), which seems to vary between procyclics and
metacyclics (Table 5). The presence and abundance of several other proteins and fragments involved
in motility differed between procyclics and metacyclics (Table5).
98
Comparative analysis L. infantum WT and PTRl'' ' proteomes during metacyclogenesis.
In the above analysis we listed a number of changes occurring during metacyclogenesis of L.
infantum. In order to identify proteins potentially correlated with pterin metabolism and putatively
involved in the metacyclogenesis process, we next carried out a subtractive comparative analysis of
the metacyclogenesis process by looking at differences between comparisons 1 and 2 (Figure 2,
comparison 3). A total of 51 spots that were differentially expressed between conditions 1 and 2
were sent for MS/MS identification and 42 spots fitted into the Scaffold software parameters (see
Material and Methods) which yielded 143 proteins identifications (Supplementary Table 1). Several
of the protein fragments identified were corresponding to the same proteins identified in our above
comparison of metacyclogenesis and felt within the category of energy metabolism, antioxidants
metabolism, stress, protein degradation and finally motility.
For proteins involved in energy metabolism, fragments of the acetyl-CoA synthetase
(LinJ23.0880), the L-ribulokinase (LinJ36_V3.0060) and the ribokinase (LinJ27_V3.0430) were
either increased or unique in the metacyclic stage of the PTRl null-mutant while a fragment of the
malate dehydrogenase (LinJ34_V3.01500) was unique in the metacyclics of wild-type cells (Table
1). . A putative tryparedoxin isoform (LinJ29_V3.1240) was unique to the procyclic stage while the
tryparedoxin peroxidase (LinJ15V3_1100) and a fragment of the trypanothione synthetase
(LinJ27_V3.1770) were upregulated in the metacyclic stage of the wild-type cell in comparison to
the PTRl null mutant (Table 2). We found the presence of several chaperonin fragments, the vast
majority in either the procyclics or metacyclics of the PTRl null-mutant (Table 3). The fragments of
several protéasome subunits (e.g. LinJ06_V3.0140, LinJ13_V3.0990, LinJ21_V3.0840,
LinJ27_V3.0190, etc..) and of peptidases/proteases (e.g. LinJ03_V3.0520, LinJ05_V3.0960,
LinJ13_V3.0090, etc..) were observed in comparison 3 (Fig. 1) but differences were equally found
in wild-type and PTRl null mutants with no clear trends (Table 4). A much higher number of unique
99
fragements corresponding to the beta or alpha tubulins (LinJ08_V3.1280 and LinJ13_V3.0330) was
observed in the PTRl null mutant in contrast to wild-type cells (Table 5).
Comparative analysis of the proteome of L. infantum WT and PTRï' ' in the metacyclic
stage. Finally, we contrasted the proteome of the metacyclics of wild-type cells and the PTRl null-
mutants (Fig. 1, comparison 4) that may highlight proteins correlated with pterin metabolism and
expressed in metacyclics. A total of 49 spots, 26 and 23 either present in the WT or the PTRl null-
mutant metacyclic stage respectively, were excised and sent for MS/MS identification. This led to
the identification of 208 proteins, 48 in the wild-type and 160 in the PTRl' ' cells (Supplementary
Table 1). Interestingly, the ptéridine reductase PTRl (LinJ23_V3.0310) was only present in the
metacyclic stage of the WT but not in the PTRl null-mutant showing the resolution power of our
proteomic approach (Table 2). Proteins involved in energy metabolism were among the most
abundant in our identifications. In comparison 4, 9 protein fragments were found to be upregulated
in the PTRl null-mutant metacyclics and 16 upregulated or unique in the WT metacyclics (Table 1).
A similar number of proteins or proteins fragments were either increased in the PTRl null-mutant or
WT metacyclics for proteins involved in antioxidants response (Table 2), to stress (Table 3), to
protein degradation (Table 4) or to proteins related to motility (Table 5)..
Other groups of proteins as well as many hypothetical proteins were identified during the
différents comparisons and are presented in the Supplementary Tables 2, 3 and 4
100
Discussion
Metacyclogenesis in Leishmania involves the differentiation of replicating non-infective procyclic
promastigotes into non-replicating but highly infective metacyclic forms. This differentiation
process occurring within the alimentary tract of sandfly vectors pre-adapts the parasites for infection
of the mammalian host. Several morphological and biochemical changes are operating during
metacyclogenesis, some have been already described previously, mostly at the transcriptomic level
[36-40] with some studies at the proteomic level [27, 28]. We have used isoelectric focusing-free-
flow electrophoresis (IEF-FFE) to enrich for a subset of soluble proteins from procyclic and
metacyclic parasites of both a wild-type Leishmania infantum and a PTRl null mutant. As already
reported from our group [29] and others [41, 42], IEF-FFE pre-fractionation combined with a series
of overlapping IPG strips is a powerful way to increase the proteome coverage visualised on 2D
gels, as exemplified in Supplementary Figure 1.
To ensure an adequate coverage of differentially expressed proteins potentially involved in
metacyclogenesis and/or potentially involved in the pterins metabolism, we selected 138 protein
spots (Supplementary Table 1) statistically shown to be differentially expressed and covering the 4
studied comparisons (Fig. 1). They were processed for MS analysis. Out of these 138 spots, 467
protein identifications were obtained (Supplementary Table 1), and were classified in metabolic
pathways according to the curated LeishCyc metabolic database ([43];
http://leishcvc.bio21 .unimelb.edu.au/). It is striking to note, that the number of proteins differentially
expressed and identified in metacyclic parasites is higher (e.g. 117 in metacyclic WT + 277 in
metacyclic PTRl KO = 394) than in procyclic parasites (e.g. 35 in procyclic WT + 38 in procyclic
PTRl KO = 73). This might further link pterins and metacyclogenesis since the PTRl KO cells were
shown to have an increased metacyclogenesis (REF). However, no obvious proteins involved in the
pterins metabolism were identified from our global scale analysis in any of the 4 conditions tested
101
(Fig. 1). It will remain to be tested whether some of the hypothetical proteins highlighted
(supplementary Fig. 4) have a link with pterins and metacyclogenesis. Foe example,
LinJ24_V3.2200, LinJ27_V3.1100, Linj28_V3.1210 and LinJ30_V3.3740 were found to be
upregulated or unique in the PTRl null mutant but were not identified in WT cells.
Nonetheless, our proteomic analysis revealed interesting features of metacyclogenesis operating in
L. infantum, either in WT or PTRl"7" cells. Indeed, in both parasite lines at least 5 major metabolic or
cellular processes were extensively modulated (Tables 1-5)., Antioxidants/dctox ill cation metabolic
pathways
Metacyclogenesis accelerates the production of reactive oxygen species (ROS) in Leishmania(REF).
Mitochondria are the major source generating ROS which may in rum damage these organelles. Our
proteomic analysis is suggesting that metacyclic parasites are trying to protect themselves from ROS
mitochondrial damage likely through an active antioxidant mechanism (Fig. 2, Table 2). Indeed, two
superoxide dismutases (LinJ32_V3.1910, LinJ30_V3.2780), the trypanothione redox system
(LinJ05_V3.0350, LinJ15_V3.1100, LinJ23_V3.0050), the trypanothione biosynthesis pathway
(LinJ27_V3.1770), PTRl (LinJ23_V3.0310) that was recently shown to help the parasite in dealing
with oxidative as well as nitrosoactive stresses (Moreira et al, 2009) and one cytochrome cl heme
protein (LinJ07_V3.0210) were upregulated in metacyclics compared to procyclics parasites (Table
2). An increase in the pentose phosphate (PPP) metabolism was also proposed to have a protective
role against oxidative stress (Maugeri et al, 2003) and two enzymes belonging to this pathway were
identified, namely the glucose-6phosphate dehydrogenase (LinJ34_V3.0080, Table 2) and the 6-
gluconate dehydrogenase (LinJ35_V3.3390; Table 2). Both enzymes were differentially expressed in
the metacyclic stages of both WT of PTRl KO cells (Comparison 1, 2 and 4). We have also
identified an ascorbate-dependent peroxidase (LinJ34_V3.0070, Table2) that was 1.72 times
102
upregulated in the metacyclic PTRl null mutant (Table 2). Ascorbate peroxidase in Leishmania has
already been shown to be central to the redox defence system of this parasite [45, 46]. An ascorbate
peroxidase null mutant produced a higher percentage of metacyclics compared to both the parental
WT cells and ascorbate peroxidase overexpressors [47]. Our proteomic analysis also revealed a
prostaglandin f2-alpha synthase (LinJ_V31.2210, Table 2), also part of the ascorbate biosynthesis
pathway that was upregulated in metacyclics PTRl KO parasites or unique in metacyclic WT cells,
further demonstrating the development of an effective response to oxidative stress during
metacyclogenesis.
Several energetic metabolic pathways highlighted during metacyclogenesis
Metacyclics in the sand fly are within nutrient-limited environment (REF), so intracellular
remodelling is crucial at this stage of the life cycle to generate energy necessary for its replication
and differentiation. Several enzymes part of important energetic pathways were shown to be
differentially expressed in metacyclic parasites (Table 1). The most striking observations are related
to the gluconeogenesis pathway (Fig. 3) that was strongly activated to increase the glucose-6 P
production and the parallel consumption of these through the pentose phosphate pathway (PPP) and
TCA cycle (Fig. 4). It seems that metacyclic Leishmania favour a high rate of glycolysis to generate
ATP in sufficient amount necessary for their intracellular remodelling and morphological
differentiation. We have depicted in red in Figures 3 and 4 the enzymes that were upregulated in
metacyclic parasites compared to procyclic forms. Most enzymes in these pathways were identified
in our study. Metacyclics are adapted for an exclusively glycolytic metabolism in the mammalian
host. As our proteomic study was performed with in vitro cultures of both procyclic and metacyclic
parasites, the expression patterns observed in figures 3 and 4 (and Table 2) reflect probably an
adaptation to changes in the culture medium in the levels of glucose and amino acids, since old
cultures (e.g. stationary phase where are found metacyclics) are depleted in these nutrients.
103
Protein degradation
During differentiation, Leishmania proceeds to an important protein turnover. A vast repertoire of
proteolytic enzymes (Table 4) is deployed during the transition between procyclic to metacyclic
stages. The genome of Leishmania contains at least 150 peptidases [48] and several of these seem to
be differentially expressed during metacyclogenesis. Two lysosomal cysteine peptidases, CPA and
CPB, have been directly implicated in both autophagy and development in this parasite (REF). Two
cysteine proteinases have been identified in our study, the first one (LinJ27_V3.0510) being unique
in procyclic WT (comparison 1) and the second one termed CPC (LinJ29_V3.0860) being
upregulated in metacyclic PTRl KO (comparison 2) (Table 4).
Interestingly, the oligopeptidase b enzyme (OPB, LinJ09_V3.0820, Table 4) was identified as
unique in metacyclic WT parasites (Comparison 4). A L. major null mutant of OPB [50] showed a
small deficiency in their ability to undergo differentiation to metacyclic promastigotes. Recently
[51], OPB was shown to act as a regulator of the Leishmania enolase which has a classical role in
carbohydrate metabolism.
The protéasome has been linked with Leishmania differentiation and replication [52-54], and several
proteasome-related proteins were observed in our analysis being mostly either unique or upregulated
in the metacyclic stages of both the WT and PTRl KO cells (Table 4). In addition, a polyubiquitin
protein (LinJ09_V3.0950) was identified as unique in metacyclic forms of the PTRl null mutant and
seems absent in the metacyclic WT parasites (comparison 4) (Table 4). Interestingly, the ptéridine
reductase 1 (PTRl) was shown to be degraded in the stationary phase of growth at the time when the
parasites were undergoing metacyclogenesis [55] and degradation of PTRl proceeds through the
ubiquitylation-proteasome system. A decrease in the protein level of PTRl leads to low levels of
tetrahydrobiopterin (H4B) which favours metacyclogenesis [9].
Heat-shock, chaperonins and stress-related proteins
104
We have identified several fragments of heat-shock proteins and chaperonins either differentially
expressed or being unique in the metacyclic stages, mainly in the PTRl null mutant (Table 3). One
member of the chaperonin group of proteins identified in our proteomic study is TCP1 (chaperonin
containing t-complex polypeptide) (Table 3). whose primary substrates appear to be the cytoskeletal
proteins including the tubulins and actins, (REF). Our proteomic analysis have identified the T-
complex protein 1 in Leishmania as differentially expressed in metacyclic parasites compared to
procyclics, with the subunits gamma, beta and eta as well as one other putative TCP1 subunit
(LinJ13_V3.1400) either uniquely expressed in metacyclics or significantly upregulated in this stage
(Table 3-T complexe). The functional significance of this will need to be investigated further but it is
interesting to note that several peptides derived from putative substrates including cytoskeletal
proteins (LinJ26_V3.1950, LinJ31V3_.0450, LinJ36_V3.4780; Table 5) and the tubulins
(LinJ08_V3.1280 and LinJ13_V3.0330; Table 5) were identified in our proteomic analyses. Other
fragments of chaperonins that were upregulated or unique to metacyclics include the co-chaperone
GrpE (LinJ30_V3.0760, Table 3) and the heat shock 70-related protein (mitochondrial precursor,
LinJ30 V3.2470, Table 3). Interestingly, chaperonins (and more recently ubiquitine) are also known
to be involved in autophagy (Chaperone-mediated autophagy, CMA). The primary role of autophagy
is to protect cells under stress conditions, such as starvation, low level of oxygen and oxidative stress
(REF). Autophagy is required for metacyclogenesis in this parasite [48, 57]. Leishmania has at least
6 autophagy-related genes (termed Atg) [58-61]. In mammals, some Atg proteins contain C-terminal
WD40 repeats. Three hypothetical proteins identified in our study being either upregulated or unique
in metacyclics WT and/or PTRl7" (LinJ06_V3.0030, LinJ25_V3.1660 and LinJ28_V3.1210,
Supplementary Table 3) share this motif and their putative role in autophagy/metacyclogenesis could
be investigated. Our data demonstrate that molecular chaperones and heat shock proteins are
105
implicated in the necessary adaptations sustaining the obligate passage from procyclic to metacyclic
promastigote forms in Leishmania.
Motility and morphology-related proteins
Several morphological changes are taking place during metacyclogenesis and the proteome analysis
revealed likely candidates involved in these changes (Table 5). The paraflagellar rod (PFR) of
kinetoplastid parasites are important for flagellar motility since ablation of PFR in Leishmania
prevent movement [64]. Three PFR proteins were pinpointed in our proteomic study, namely
LinJ05_V3.0040 (PAR4), LinJ16_V3.1510 (PFR2C), and LinJ29_V3.1880 (PFR1D) (Table 5).
These 3 PFR proteins were shown to be down regulated in metacyclics PTRl KO cells compared to
metacyclic WT cells (comparison 4).
We have also detected 3 kinesins (Table 5), either upregulated in procyclic forms of the PTRl KO
(LinJ14_V3.1190, in comparison 3) or unique to the metacyclics PTRl null mutant
(LinJ14_V3.1600 and LinJ30_V3.0350, in comparison 2). Kinesins regulates flagellar length via
microtubule binding and depolymerisation activities [65]. Myosin is also a component of the PFR
structure and we have identified a myosin heavy chain kinase A (LinJ36_V3.4780, Table 5) that
seems to be absent in metacyclic WT cells (in comparison 3). Finally, the i/6 autoantigen protein
(LinJ22_V3.1310) identified in comparisons 3 and 4 was shown to be either highly upregulated in
metacyclic PTRl KO or unique in metacyclic WT cells compared to metacyclic PTRl KO parasites.
In T brucei, this protein was shown to be shown to be a microtubule-associated protein and may be
involved in crosslinking microtubules [67].
Others interesting metabolic features in Leishmania metacyclic parasites
In our global scale analysis of the metacyclogenesis process operating in Leishmania, we have not
detected notable metacyclic proteins such as the HASPB (hydrophilic acylated surface protein B)
and SHERP (small hydrophilic ER-associated protein) proteins, [68-72].. The membranous-
106
associated nature may explain why we were unsuccessful in detecting them. We have identified a
sterol 24-c-methyltransferase (SMT, LinJ36_V3.2510) that is unique to metacyclics, both in WT and
PTRl KO cells (Supplementary Table 2-Ergosterol biosynthesis). This enzyme is required for the
biosynthesis of ergosterol, the major membrane sterol in Leishmania. The leishmanolysin (GP63)
metalloprotease (LinJ10_V3.0490; Supplementary Table 2), the most abundant surface protein of
Leishmania promastigotes, was upregulated in metacyclic parasites. GP63 was recently described as
a surface protease able to cleave multiple intracellular host proteins and actively participate in
mitogen-activated protein kinase inactivation during infection [80] but its role in the insect stage is
not well defined [81].
The insect-stage specific protein META-1 that is more expressed in metacyclics parasites [82] was
not detected in our study but a META-domain containing protein (LinJ17_V3.0970; Supplementary
Table 2 -unclassified) that was upregulated in metacyclic PTRl null mutant when compared to
metacyclic WT cells (Comparison 4). A role in cytoprotection against oxidative stress is suspected
for this class of meta-domain containing proteins [83].
Another cytochemical peculiarity of metacyclic promastigote Leishmania includes an extreme
depletion of RNA (REF). Our proteomic analysis revealed an important modulation of several
enzymes related to the RNA metabolism and post-transcriptional gene expression (Supplementary
Table 4). Moreover, most of these changes were detected in the PTRl mutant cells. For example,
two RNA helicases (LinJ21_V3.1820 and LinJ32_V3.0410) were found unique or upregulated in the
metacyclic stage of the PTRl KO parasites (Supplementary Table 4). Another RNA helicase
belonging to the DEAD-box family (LinJ35_V3.0370) was detected as unique in metacyclic WT
cells. The genome of Leishmania encodes 29 RNA helicases [84]. RNA helicases are enzymes
responsible for ATP-dependent unwinding of RNA secondary structures, but they have been also
described as regulatory factors for cellular growth and differentiation [85, 86]. Most RNA helicases
107
belong to the DEAD-box family whose prototype is the eukaryotic eIF-4A translation initiation
factor [87, 88]. As reported in Supplementary Table 4, we have identified many translation initiation
factors (LinJ08V3.0570, LinJ17V3.0090, LinJ17V3.1390, LinJ18V3.0740, LinJ36_V3.0200 and
LinJ36_V3. 4070) including eIF-4a (LinJ01V3.0790), as well as a translation release factor
(LinJ27_V3.1610). These proteins could play a role in metacyclogenesis in Leishmania.
This report represents a detailed proteomic analysis of metacyclogenesis. . Several proteins and
enzymes involved in 5 main metabolic or cellular processes are particularly altered during
metacyclogenesis but none seems to be linked to the levels of reduced pterins. However, numerous
hypothetical proteins have been identified, some being unique or highly upregulated in metacyclic
stages and some correlated to reduced pterins, hence leading to hypotheses than could eventually be
experiementally tested for a better understanding of the roles of pterins in differentiation..
108
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112
Acknowledgements
We would like to thank Sylvie Bourassa and Isabelle Kelly for helpful proteomic discussions and the
people from the Proteomics platform of the Eastern Quebec Genomics Center for the mass
spectrometry analysis. This work was funded by a CIHR grant to M.O. WM is a Strategic Training
Fellows of the Strategic Training Program in Microbial Resistance, a partnership of the CIHR
Institute of Infection and Immunity and the Fonds de Recherche en Santé du Québec. M.O. is a
Burroughs Wellcome Fund Scholar in Molecular Parasitology and holds the Canada Research Chair
in Antimicrobial Resistance.
113
Figure Legends
Fig. 1 Experimental design of proteomes comparisons. Four 2D-Gels were analysed for each
condition described here. 1, WT procyclic to metacyclic promastigotes comparison; 2, PTRl' '
procyclic to metacyclic promastigotes comparison; 3, subtractive analysis of non common spots
between 1 and 2; 4, WT and PTRl' ' metacyclic promastigotes comparison.
Fig. 2. Antioxidants related pathways in Leishmania. Proteins involved in the antioxidants and
related pathways of L. infantum. Proteins indicated in red have been identified as modulated in the
metacyclogenesis. Related pathways are indicated in grey boxes. T(SH)2, trypanothione; TS2,
oxidized trypanothione; TXNo, oxidized tryparedoxin; TXNR, reduced tryparedoxin; TR,
trypanothione reductase; GPX, glutathione-dependent peroxidise, CPX, cytosolic peroxiredoxin;
H2O2, hydrogen peroxide; ONOO", peroxynitrite; N02, nitrite; FeSOD, iron superoxide dismutase;
NO", nitric oxide; 02'", anion superoxide; NADPH, reduced nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate; NADP+, oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. G6PDH, Glucose-6-
phosphate dehydrogenase; 6PGDH, 6-phosphogluconate dehydrogenase;
Fig. 3. Gluconeogenesis and related pathways. Proteins involved in gluconeogenesis and related
pathways of L. infantum. Proteins indicated in red have been identified in this proteomic analysis as
modulated in the metacyclogenesis oî Leishmania. Related pathways are indicated in grey boxes.
Fig. 4. Pentose phosphate, TCA cycle and related pathways Proteins involved in the pentose
phosphate, TCA cycle and related pathways of L. infantum. Proteins indicated in red have been
identified as upregulated during metacyclogenesis. Related pathways are indicated in grey boxes.
114
Table 1. Energy metabolism-related proteins identified by MS/MS. Mr, molecular weight; exp,
experimental; pred, predicted; pro, procyclic promastigotes; meta, metacyclic promastigotes; All
statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using Student's two-tailed t
test.
Table 2. Antioxidant-related proteins identified by MS/MS. Mr, molecular weight; exp,
experimental; pred, predicted; pro, procyclic promastigotes; meta, metacyclic promastigotes; All
statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using Student's two-tailed t
test.
Table 3. Heat shock, stress-related proteins and chaperonins identified by MS/MS. Mr,
molecular weight; exp, experimental; pred, predicted; pro, procyclic promastigotes; meta, metacyclic
promastigotes; All statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using
Student's two-tailed t test.
Table 4. Protéasome, protein degradation and ubiquitination-related proteins identified by
MS/MS. Mr, molecular weight; exp, experimental; pred, predicted; pro, procyclic promastigotes;
meta, metacyclic promastigotes; All statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis
Software using Student's two-tailed t test.
Table 5. Flagellum, motility and morphology related-proteins identified by MS/MS. Mr,
molecular weight; exp, experimental; pred, predicted; pro, procyclic promastigotes; meta, metacyclic
promastigotes; All statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using
Student's two-tailed t test.
115
Supplementary Fig. 1. IEF-FFE Enrichment of metacyclic promastigote proteins from WT
and P T R l ' . 2D gels pictures of total cell extracts of L. infantum metacyclic promastigotes WT (A)
and PTRl'fC) compared to IEF-FFE fractionated proteins of L. infantum metacyclic promastigotes
WT (B) and PTRl (D). A number of FFE fractions were pooled and first resolved on IPG strips of
pH 4.5-5.5, 5-6 and 5.5-6.7 before being run on SDS-PAGE in the second dimension. Only gels for
the pH 5-6 conditions are presented for total protein extract and the pooled fraction number 34-40
for FFE. The same extend of enrichment was observed for procyclic promastigote proteins extracted
from either wild-type or PTRl null mutant.
Supplementary Table 1. Global data on proteome analyses. Summary of proteome conditions
analysis including pH ranges, number of spots analyzed, and number of identifications for each
condition. Pro. WT, procyclic promastigotes of WT parasites; Meta. WT, metacyclic promastigotes
of WT parasites; Pro KO, procyclic promastigotes of PTRl' ' parasites; Meta. KO, metacyclic
promastigotes oîPTRl ' ' parasites.
Supplementary Table 2. Functional classes of proteins identified by MS/MS. Mr, molecular
weight; exp, experimental; pred, predicted; pro, procyclic; meta, metacyclic; All statistically
significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using Student's two-tailed t test.
Supplementary Table 3. Hypothetical proteins identified in the different comparisons. Mr,
molecular weight; exp, experimental; pred, predicted; pro, procyclic; meta, metacyclic; All
statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis Software using Student's two-tailed t
test.
116
Supplementary Table 4. Proteins involved in RNA metabolism and post-transcriptional gene
regulation identified by MS/MS. Mr, molecular weight; exp, experimental; pred, predicted; pro,
procyclic; meta, metacyclic; All statistically significant (p <0.05) as determined by Progenesis
Software using Student's two-tailed t test.
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Chapitre VII. La tolérance à la mort cellulaire induite par les drogues favorise l'acquisition de résistances multiples chez Leishmania,
Ce chapitre à été accepté avec modifications dans le journal Cell Death and Disease. Une
version similaire au manuscrit soumis est présentée ici.
7.1 Résumé
Le contrôle du parasite Leishmania repose sur l'utilisation d'une poignée de drogues
(dérivés d'antimoine (SblII), amphotéricine B (AMB), pentamidine, miltéfosine (MF) et
paromomycine (PARO)). Bien que les cibles cellulaires exactes ainsi que les modes
d'action de ces drogues demeurent élusives, il est supposé que leurs cibles primaires sont
substantiellement différentes. Néanmoins, il a été montré que plusieurs anti-Leishmania
induisaient l'apoptose chez ce parasite. Nous avons donc étudié les conséquences de ce
type de mort chez des L. infantum sensibles et résistants aux drogues. Chez des parasites
sensibles, SblII, MF et AMB, mais pas PARO, induisaient la mort par apoptose. Cette mort
est associée à une production d'espèces oxygénées réactives (ROS). Les Leishmania
résistants au SblII, MF ou AMB ne produisaient pas de ROS et ne subissaient pas la mort
par apoptose après exposition à la drogue à laquelle ils étaient résistants. De manière plus
surprenante, ils étaient également plus tolérants à la mort induite pas les autres drogues, à
partir du moment où ces drogues induisaient la mort via la production d'oxydants. Cette
tolérance favorisait l'acquisition rapide de multi-résistances. La paromomycine tuait
Leishmania d'une manière non-apoptotique et ne provoquait pas la production de ROS. La
résistance à la paromomycine ne protégeait d'ailleurs pas contre la mort par apoptose
induite par les drogues et ne permettait pas l'acquisition de multi-résistances. Cependant, le
mutant résistant à la paromomycine, mais pas les mutants résistants au SblII, MF et AMB,
est devenu rapidement également résistant au methotrexate (MTX), une drogue modèle qui
ne produit également pas de ROS. Nos résultats établissent donc un modèle dichotomique
151
d'action des drogues anti-Leishmania ainsi qu'un lien entre la manière dont les drogues
tuent, la tolérance à la mort cellulaire, et la facilitation de l'émergence de multi-résistances.
Ces résultats ont des implications potentielles importantes en termes de chimiothérapie.
151
152
7.2 Article
Tolerance to Drug-Induced Cell Death Favours the Acquisition of Multi-Drug
Resistance in Leishmania
Running title: Mode of tailing and drug resistance in Leishmania
Wilfried Moreira, Philippe Leprohon and Marc Ouellette*
Centre de Recherche en Infectiologie du CHUL, Université Laval, 2705 Laurier bid,
Québec, Canada, G1V 4G2.
Corresponding author : Marc Ouellette Ph.D.
Centre de Recherche en Infectiologie
2705 Boul. Laurier
Québec, Qc.
Canada
Gl V 4G2
Tel : 1-418-654-2705
Fax: 1-418-654-2715
E-mail : Marc.Ouellette(S),crchul.ulaval.ca
Abstract 152
153
The control of the protozoan parasite Leishmania relies on few drugs with unknown
cellular targets and unclear mode of action. Several antileishmanials, however, were shown
to induce apoptosis in Leishmania and this death mechanism was further studied in drug-
sensitive and drug-resistant Leishmania infantum. In sensitive parasites, antimonials
(SblII), miltéfosine (MF) and amphotericin B (AMB) but not paromomycin (PARO)
triggered apoptotic cell death associated with reactive oxygen species (ROS). In contrast,
Leishmania mutants resistant to SblII, MF or AMB not only failed to undergo apoptosis
following exposure to their respective drugs, but were also more tolerant towards apoptosis
induced by other antileishmanials provided that these killed via ROS production. Such
tolerance favored the rapid acquisition of multidrug resistance. PARO killed Leishmania in
a non-apoptotic fashion and failed to produce ROS. PARO resistance neither protected
against drug-induced apoptosis nor provided an increased rate of acquisition of resistance
to other antileishmanials. However, the PARO-resistant mutant, but not SblII-, MF- or
AMB-resistant mutants, became rapidly cross-resistant to methotrexate, a model drug also
not producing ROS. Our results therefore link the mode of killing of drugs to tolerance to
cell death and to a facilitated emergence of multidrug resistance. These findings may have
fundamental implications in the field of chemotherapeutic interventions.
153
154
Keywords: Leishmania, apoptosis, multidrug resistance, reactive oxygen species
154
155
Introduction
The bactericidal mode of action of antibiotics has recently been shown to
depend less on their primary target, and more on the induction of common downstream
effector mechanisms leading to cell death. Indeed, the generation of oxidants has been a
unifying step of such common death mechanisms (reviewed in [1]). Similarly, the
induction of apoptosis by several anticancer drugs has been suggested to occur through
the generation of oxidants and a characteristic feature of drug resistant neoplasic cells
seems to be their ability to evade drug-induced apoptosis [2,3]. These studies suggested
a causal link between evolutionary conserved cellular events leading to death and the
mode of action of cytotoxic compounds and highlighted the importance of understanding
the mode of action of drugs in order to understand and prevent the emergence of drug
resistance.
Apoptotic features have also been reported in the eukaryotic parasite Leishmania
following exposure to several drugs [4-8]. Leishmania are unicellular parasites responsible
for a wide range of human diseases ranging from self-healing cutaneous lesions to fatal
visceral infections. Anti-Leishmania therapy relies on the use of a handful number of drugs
including pentavalent antimony (SbV), a prodrug that needs to be reduced to its trivalent
state (SblII) in order to acquire anti-parasitic activity, the polyene antibiotic amphotericin B
(AMB) and the phosphocholine analogue miltéfosine (MF) [9]. A phase 3 clinical trial has
also been successfully completed for the aminoglycoside paromomycin (PARO) [10],
leading to its approval for the treatment of visceral lesihmaniasis in India. Although the
mechanisms responsible for the anti-leishmania activities of any of these compounds have
been clearly established, their primary targets are thought to differ substantially. Indeed, 155
156
evidence suggests that antimony have a rather complex mode of action, acting at the level
of multiple cellular targets [11-18]. The leishmanicidal activity of MF has been associated
with perturbation of the metabolism of alkyl-phospholipids and the biosynthesis of alkyl-
anchored glycolipids and glycoproteins [19,20]. The cytotoxic activity of AMB has been
associated with its high affinity for ergosterol [21], the main sterol in the plasma membrane
of fungi and Leishmania [22]. Finally, PARO, which interferes with protein synthesis by
binding to ribosomes in bacteria, was also shown to affect translation in Leishmania [23] in
addition to alter the composition and fluidity of the plasma membrane of the parasite
[24,25].
Most antileishmanials were shown to induce apoptosis features in Leishmania
which include an increase in intracellular calcium levels, an accumulation of reactive
oxygen species (ROS), a drop of the mitochondrial membrane potential (A\|/m), genomic
DNA degradation, exposure of phosphatidyl serine and induction of caspase-like activity
[7,16,17,26,27]. Interestingly, the antimony resistance phenotype of field isolates was
reported to be accompanied by a decreased propensity to undergo apoptosis following
exposure to either SblII, MF or AMB [7]. Therefore, it is possible that the common
mechanisms involved in cell killing described for bactericidal antibiotics might hold true
for leishmanicidal compounds and that a decrease in sensitivity to one drug could favor
the development of resistance against other drugs.
In this study, we sought to determine the putative apoptotic features induced by SblII,
MF, AMB and PARO in Leishmania infantum drug-sensitive and drug-resistant
parasites and to assess whether an increased tolerance to apoptosis might accompanies
the selection of drug resistance. Our results are suggesting two types of drug-induced
156
157
death in Leishmania and are linking the mode of killing to tolerance to cell death and to
a facilitated emergence of multidrug resistance.
157
158
Results
Drug-induced accumulation of ROS in the Leishmania mitochondria.
As several drugs were shown to induce apoptosis in Leishmania, we first studied the
accumulation of reactive oxygen species (ROS) upon drug exposure in the context of drug
sensitivity and resistance. The L. infantum Sb2000.1, MF200.5, AMB 1000.1 and
PARO 1200.1 cell lines were respectively selected for resistance to SblII, MF, AMB and
PARO in a stepwise manner until they reached at least a ten-fold increased resistance
compared to the parental clonal strain (Table 1). None of the mutants showed marked
cross-resistance, with the exception of the SblII- and PARO-resistant mutants which were
5-6 times hypersensitive to MF (Table 1). The accumulation of ROS was measure using the
dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) dye whose fluorescence intensity is indicative of
the levels of intracellular ROS [28]. L. infantum sensitive parasites subjected to increasing
concentrations of SblII, MF and AMB exhibited a dose-dependent increase in DCFDA
fluorescence signals (Fig. IA), confirming increased ROS production upon exposure to
these antileishmanials. Pentamidine, another anti-Leishmania drug, also induced the
accumulation of ROS in sensitive L. infantum (Fig. SI A) and so was the classical
apoptosis-inducing drug staurosporine [29] (Fig. SIC). In contrast, no ROS production
could be measured by DCFDA fluorescence in the resistant mutants Sb2000.1, MF200.5
and AMB 1000.1 exposed to the drug defining their resistance phenotype (Fig. IA). PARO
behave differently as it failed to induce ROS accumulation irrespective of the PARO
susceptibility status of the parasites (Fig. IA). This was not unique to PARO as we found
158
159
that MTX, a model drug often studied in Leishmania [30,31], also failed to induce ROS in
Leishmania (Fig. S1B).
As the major source of oxidants in eukaryotes is the mitochondria, we used the MitoSox
dye to measure the mitochondrial accumulation of superoxide, which is an indicative
measure of ROS levels in the mitochondria [32]. As expected, SblII, MF and AMB
induced an increase in MitoSox fluorescence levels in sensitive but not resistant
parasites (Fig. 2A). Co-localisation experiments between DCFDA and mitotracker
fluorescence signals further confirmed that the mitochondria were the site of drug-
induced ROS accumulation (Fig. 2B). The accumulation of superoxide within the
mitochondria usually results in a misregulation of cellular iron homeostasis through the
oxidation of iron-sulfer clusters, which translates into the production of highly active
hydroxyl radicals via the Fenton reaction [4,33]. The role of iron in the drug-induced
accumulation of oxidants was confirmed by the reduced levels of ROS produced within
the mitochondria of sensitive L. infantum pretreated with the iron-chelating agent
deferoxamine before being exposed to increasing concentrations of SblII, MF and AMB
(Fig. 2C). The same protective effect against the accumulation of ROS was observed in
L. infantum parasites pretreated with the antioxidant glutathione (Fig. 2C).
Every experiments presented so far were performed with the more experimentally
tractable promastigote insect stage of the parasite. Accordingly, we tested whether a similar
drug-induced ROS accumulation could be observed with the more clinically relevant
intracellular amastigotes. MitoSOX-preloaded promastigotes were used to infect
macrophages and the resulting intracellular sensitive parasites, but not their resistant
159
160
counterparts, accumulated ROS when exposed to SbV (the prodrug that is converted to
SblII), MF or AMB (Fig. 2D).
Tolerance to drug-induced apoptosis in drug-resistant Leishmania.
As the accumulation of oxidants within the mitochondria is one of the hallmarks of
apoptosis [34,35] including in parasites [34,35], we tested whether other apoptotic features
could be observed following exposure to different antileishmanials. We monitored changes
in the mitochondrial membrane potential (ATm) using the tetramethylrhodamine ethyl ester
(TMRE) dye [7], a cationic fluorescent molecule whose accumulation within the
mitochondria is an indicative measure of the Av|/m, and tested for genomic DNA
degradation by gel electrophoresis. A significant drop in the A Fm was observed in
sensitive cells exposed to SblII, MF and AMB, but not with PARO (Fig. 3A). Similarly,
drug-induced DNA laddering occurred in L. infantum wild-type cells treated with SblII,
MF and AMB, but not with PARO (Fig. 3B). Interestingly, neither a decrease in A^m nor a
degradation of genomic DNA could be observed in the drug-resistant mutants exposed to
their selective drugs (Fig. 3A and B). In contrast, the protonophore carbonyl cyanide p-
trifluoromethoxy-phenylhydrazone (CCCP) remained potent at inducing a significant loss
in ATm in these mutants (Fig. 3A), suggesting that the proton gradient was still intact in the
resistant parasites.
Having found that SblII, MF, AMB but not PARO induced several apoptosis
features in drug-sensitive parasites but not in the Sb2000.1, MF200.5 and AMB 1000.1
resistant lines, respectively, we sought to understand whether a non-specific tolerance to
drug-induced-apoptosis occurred in these mutants. Interestingly, the Sb2000.1, MF200.5 or
160
161
AMB 1000.1 resistant mutants not only failed to produce ROS when challenged with the
drug used for their selection, there was also a significant lack of ROS production in these
mutants upon challenge with any of the ROS-inducing drugs (Fig. 4A). Again, the
PARO 1200.1 mutant behave differently as ROS levels comparable to wild-type cells were
observed in this mutant after a challenge with SblII and even higher levels were observed
after a challenged with MF or AMB (Fig. 4A). The drop in ATm following exposure either
to SblII, MF or AMB was also lower in the Sb2000.1, MF200.5 and AMB 1000.1 mutants
than in the sensitive cells or the PARO 1200.1 mutant (Fig. 4B). The modulation in ROS
production and change in A*Pm were further correlated with drug-induced laddering of
genomic DNA. Indeed, no DNA laddering was induced in the Sb2000.1, MF200.5 and
AMB 1000.1 mutants following exposure either to SblII, MF or AMB, while the same
drugs induced oligonucleosomal fragmentation in the PARO1200.1 mutant (Fig. 4C).
Tolerance to drug-induced cell death favors the acquisition of multidrug
resistance.
We showed that the tolerance to drug-induced apoptosis in the Sb2000.1, MF200.5
and AMB 1000.1 lines occurred not only against the drug initially used for the selection of
resistance but also extended to any apoptosis-inducing drugs. We hypothesized that this
phenomenon may facilitate the emergence of multi-resistance against other drugs, provided
that these shared similar killing effector mechanisms. We thus compared the rates of
selection of resistant parasites by plating 5 x IO6 drug-sensitive or drug-resistant parasites
in the presence of MF, AMB or PARO at a concentration inhibiting the growth of L.
infantum wild-type parasites. SblII was omitted as the susceptibility to this drug varied
between mutants (Table 1). The AMB1000.1, MF200.5, PARO1200.1 and MTX1000.3
161
162
mutants yielded from 6.9 x IO4 to 1.3 x IO5 colonies respectively, a plating efficiency of
-10% when plated with their respective drugs (Fig. 5). In contrast, the wild-type cells did
not yield any colony when plated in the presence of MF or PARO and on average 14
colonies were counted on the AMB plates (Fig. 5A). Remarkably, the L. infantum Sb2000.1
and MF200.5 mutants generated significantly more colonies on the AMB plate than the L.
infantum wild-type strain or the PARO 1200.1 mutant (Fig. 5A). Similarly, the AMB 1000.1
mutant yielded significantly more colonies under MF pressure than wild-type parasites or
the PARO 1200.1 mutant (Fig. 5A). The Sb2000.1 mutant behaved unexpectedly however,
as few colonies were observed on MF-containing plates (Fig. 5A). This is probably due to
the fact that Sb2000.1 is 5-fold hypersensitive to MF (Table 1).
In the presence of PARO, the MF200.5 and AMB 1000.1 mutants did not yield
significantly more colonies than wild-type parasites (Fig. 5A). Again, the Sb2000.1
behaved in an unexpected fashion, producing a very high number of colonies on PARO
plates (Fig. 5 A). This observation might be explained in part by the fact that the Sb2000.1
mutant initially exhibited a slight but significant cross-resistance to PARO (Table 1).
Although PARO and MTX did not induce ROS in wild-type parasites (Fig. 1), it is not
clear whether similar killing effector mechanisms are shared by both drugs. Nonetheless, it
is intriguing that the MTX-resistant mutant yielded more colonies than the MF200.5 mutant
or wild-type parasites in the presence of PARO (Fig. 5B) and that the PARO 1200.1 mutant
also yielded a higher number of colonies on MTX-containing plates than wild-type or
MF200.5 cells (Fig. 5B).
162
163
Discussion
Our study has revealed that anti-Leishmania compounds kill by at least two
different mechanisms, with SblII, AMB, MF and most likely pentamidine killing by
apoptosis, and PARO and the model drug MTX acting through another lethal mechanism.
In order to be classified as apoptosis-inducing drugs, compounds were required to fulfill a
number of criteria, including the induction of mitochondrial ROS, a drop in A\|/m and
genomic DNA degradation. Several studies had already reported on the role of redox
pathways in the increased survival of Leishmania in the presence of SblH [18,36,37], with
iron potentiating the antileishmanial activity of SblII [4]. Our results indicate that this is
probably valid for all drugs inducing ROS since experiments under iron-depleted
conditions demonstrated a key role for iron in drug-induced ROS production (Fig. 2C).
The dichotomy in the mode of killing between antileishmanials was further
reinforced by the observation that cells resistant to SblII, MF and AMB were tolerant to
apoptosis not only against the initial selective drug but also against all drugs sharing a
similar mode of killing. This tolerance is likely to arise by alterations in shared death
pathways. Obviously, alterations in these pathways do not lead to high-level cross-
resistance (Table 1) but can contribute to a decreased propensity to undergo apoptosis,
thereby favouring the emergence of more specific resistance mechanisms. For example,
although no specific mutations leading to a high level of AMB resistance are present in
Sb2000.1 or MF200.5 cells (Table 1), an alteration in a death pathway allowing tolerance to
AMB-induced apoptosis may likely be shared by these mutants, (Fig. 4). In contrast, since
PARO kills through a different mechanism, we did not observe tolerance to SblII-, MF-, or
AMB-induced apoptosis in the PARO-resistant mutant (Fig. 4). We are currently searching
163
164
for phenotypic features related to PARO and MTX killing as this would allow to test
whether non-ROS producing drugs constitute a distinct class of unrelated compounds that
also share similar killing mechanisms.
Such tolerance to drug-induced killing accelerated the emergence of cross-
resistance. Indeed, the SblII-, MF- and AMB-resistant mutants, but not the PARO-resistant
mutant, became more easily cross-resistant to the apoptosis-inducing drugs SblII, MF and
AMB. Conversely, the PARO- and MTX resistant mutants acquired cross-resistance to the
non-ROS producing drugs more easily. Two exceptions were noted, both involving the
Sb2000.1 mutant when plated with either MF or PARO. This could possibly be explained
by collateral hypersusceptibility or cross-resistance already present in this mutant (Table 1),
where a mutation leading to resistance or susceptibility may supersede alteration(s) in a
death pathway when cross-resistance is selected. Since SblII interferes with the thiol redox
metabolism [18], it is possible that oxidant-induced mutational events occurred specifically
in the Sb2000.1 mutant and led to increase PARO resistance (Fig 5A). This would be
reminiscent of bactericidal antibiotic-induced mutagenesis in bacteria [38].
The present results suggest that Leishmania parasites resistant to SblII, MF or AMB
in the field could be more prone at acquiring multidrug resistance to these antileishmanials,
while retaining sensitivity to PARO. These conclusions are supported by the observation
that field isolates resistant to SblII were less prone to undergo apoptosis following exposure
to either SblII, MF or AMB [7]. A recent study also suggested the possible cross-resistance
of L. donovani field isolates to SblII, MF and AMB in areas of endemicity [39]. Drug
combination is now an important strategy in our fight against infectious diseases and this
164
165
has now recently been shown to be effective in Leishmania [40]. Our data provide a
rationale for combining drugs with different modes of killing.
In summary, there are at least two effector mechanisms for anti-Leishmania drugs.
Resistance is accompanied by tolerance to drug-induced apoptosis not only against the
selective drug but also against drugs sharing a similar mode of killing. This cross-tolerance
leads to a facilitated emergence of cross-resistance against other drugs that have different
cellular targets but similar mode of killing.
165
166
Materials and Methods
Leishmania strains and culture conditions. Leishmania infantum
(MHOM/MA/67/ITMAP-263) and the drug resistant mutants L. infantum Sb2000.1, L.
infantum MF200.5, L. infantum AMB 1000.1 and L. infantum PARO 1200.1 (respectively
resistant to 2000 pM SblII, 200 pM miltéfosine, ImM amphotericin B and 1680 pM
paromomycin) were grown in SDM-79 medium supplemented with 10% fetal bovine serum
at 25 °C. Drug susceptibilities were obtained as described. Log-phase parasites were pre
incubated with deferoxamine (500 pM) or glutathione (2 mM) for 24 hours before being
washed and subsequently exposed to drugs for 48 hours. To determine apoptotic features
(ROS, Av|/m and gDNA laddering), log-phase cultures were exposed to toxic drug
concentrations for 48 hours in order to trigger apoptosis.
Measurement of ROS accumulation. Intracellular ROS accumulation was measured
using the DCFDA dye (Invitrogen, Burlington, CANADA) as described [28]. Briefly,
DCF-DA is cell permeant and nonfluorescent. Upon its entry into live cells, the diacetate
groups are cleaved by cellular esterases. Oxidation of the reduced dye occurs in the
presence of ROIs, causing fluorescence. After drug exposure (48 hours), parasites were
centrifuged at 3000rpm, washed, resuspended in 500 pi of Hepes-NaCl (21 mM Hepes, 137
mM NaCl, 5 mM KC1, 0.7 mM Na2HP04.7H20, 6 mM glucose) and incubated for 30
minutes in presence of DCFDA (40 nM). After another centrifugation-wash step, 200 pi of
the promastigote resuspension was analyzed with a fluorometer (Victor Perkin-Elmer) at
485 nm excitation and 535 nm emission wavelengths. Fluorescence was normalized with
proteins concentration measured using the 2D QuantKit (GE Healthcare). A similar
166
167
procedure was used with the MitoSOX dye (Invitrogen) to determine the ROS
accumulation occurring within the mitochondrion. MitoSOX is a live-cell permeant and
rapidly and selectively targets the mitochondria. Once in the mitochondria, the MitoSOX
probe is oxidized by superoxide hence exhibiting a red fluorescence (580nm).
Measurement of mitochondrial membrane potential ( \\\im) and gDNA laddering.
Mitochondrial membrane potential was measured using the cationic lipophilic fluorescent
tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) dye as described [7], Fluorescence was
normalized with proteins concentrations as described above. gDNA was harvested from
untreated and treated parasites using a method previously described [7]. Ten pg of gDNA
was loaded on a 1.3% agarose gel and migrated at 90V for 1 hour.
Mitochondrial localization of drug-induced ROS using fluorescence microscopy. After
drug exposure (48 hours), parasites were centrifuged at 3000rpm, washed, resuspended in
500 pi of Hepes-NaCl and co-incubated for 30 minutes in presence of both DCFDA (40
nM) and Mitotracker (40 nM). Parasite were subsequently centrifuged at 3000rpm, washed,
resuspended in 500 pi of Hepes-NaCl and 20 pi was layered on poly-L-lysine coated
microscope slides under a cover slips. Slides were analysed using a fluorescence
microscope (Nikon eclipse TE300 fluorescence microscope) using typical green and red
filters. Images were captured using Image Pro Plus 5.0 software. At least 20 microscopic
fields were observed for each sample.
167
168
Cross-resistance selection on drug-containing SDM-Agar plates. Equal number (5 x 106
) of wild-type or drug-resistant parasites were centrifuged at 3500 rpm, washed 2 times in
Hepes-NaCl, resuspended in 50 pi Hepes-NaCl and subsequently plated on SDM-Agar
plates containing either 0.24 pM of AMB, 80 pM of MF or 480 pM of PARO. These
concentrations, which corresponded to 6 times the EC50 of the wild-type strain, were the
lowest allowing minimal growth of wild-type parasites. Colonies were counted after 14
days. Plating was repeated at least three independent times.
168
169
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments
We thank Drs. Danielle Légaré and Richard Poulin for critical reading of the manuscript.
This work was funded in part by a CIHR group grant and operating grants to MO. WM is a
Strategic Training Fellow of the Strategic Training Program in Microbial Resistance, a
partnership of the CIHR Institute of Infection and Immunity and the Fonds de la Recherche
en Santé du Québec. MO holds the Canada Research Chair in Antimicrobial Resistance.
169
170
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172
173
Titles and legends to figures
Fig. 1. Drug-induced reactive oxygen species in L. infantum wild-type and drug
resistant mutants. Drug-induced ROS accumulation in L. infantum cells. L. infantum WT
or L. infantum Sb.2000.1, MF200.5, AMB 1000.1 and PARO 1200.1 log-phase cultures,
selected respectively for resistance to SblII, MF, AMB and PARO, were exposed to
increasing concentrations of drugs for 48 h. Aliquots (500 pi) were washed and incubated
in the presence of DCFDA for 30 min. Fluorescence was measured at 530 nm and
normalised according to protein concentrations.
Fig 2. Drug-induced ROS accumulation in L. infantum mitochondria. A. Log-phase
cultures of L. infantum WT or L. infantum Sb.2000.1, MF200.5 and AMB 1000.1 drug-
resistant mutants were pre-loaded with MitoSOX for 2 h, washed and exposed to two
concentrations of SblII, MF or AMB for 48 h. Aliquots (500 pi) were taken, washed and
the fluorescence was measured at 580 nm. B. ROS accumulation in Leishmania cells was
visualised with the fluorescent dye DCFDA and the mitochondria-specific dye Mitotracker.
Log-phase cultures were exposed to drugs for 48 h, washed and incubated with DCFDA
and Mitotracker for 30 min each. Fluorescence microscopy showed co-localisation of the
oxidant-dependent DCFDA and the mitochondria-specific Mitotracker in drug-treated cells,
i, brightfield; ii, DCFDA fluorescence; iii, Mitotracker fluorescence, iv, merge. C.
Protection against drug-induced mitochondrial ROS accumulation. Log-phase cultures of
WT and drug-resistant mutants were pre-loaded with MitoSOX for 2 h, washed,
preincubated with Hepes-NaCl (bars a), 500 pM of deferoxamine (bars b), or with 2 mM
glutathione (GSH) (bars c) for 24 h, washed and exposed to two concentrations of SblII,
MF or AMB for 48 h. Aliquots (500 pi) were taken, washed and the fluorescence was
173
174
measured at 580 nm. D. Drug-induced ROS accumulation within intramacrophagic
Leishmania infantum. L. infantum WT (black bars) Sb2000.1 (white bars, left panel),
MF200.5 (white bars, central panel), AMB 1000.1 (white bars, right panel) promastigotes
containing a luciferase expression vector were pre-loaded with MitoSOX and subsequently
used to infect J774 macrophages. The drug-induced ROS accumulation in intracellular
parasites was measured 48 h post infection and fluorescence (RFU) was normalised to
luciferase activity level (RLU). Results are the average of at least 3 independents
experiments. *,/?<0,05 ;**,/K0,01.
Fig. 3. Drug-induced apoptosis in Leishmania. Drug-induced loss of mitochondrial
membrane potential (A^m) (A) and gDNA laddering (B) in sensitive and resistant
Leishmania cells. Log-phase cultures were exposed to drugs (SblII, 400 pM; MF, 25 pM;
AMB, 0.2 pM; and PARO, 280 pM) or to saline buffer (control) for 48 h. A. For measuring
A^m, a 500-pl aliquot was washed, incubated with TMRE for 30 min, washed and the
fluorescence was measured (545 nm). Fluorescence was normalised to protein
concentrations. B. Genomic DNA degradation was investigated by analysing the isolated
gDNA on 1.3% agarose gels. Results represent the average of at least 3 independent
experiments and are expressed as percentage of the control. *, /K0,05 ; **, /K0,01. MW:
1KB Plus Ladder (Invitrogen).
Fig. 4. Cross-tolerance to drug-induced apoptosis in Leishmania drug-resistant
mutants. The accumulation of ROS (A), loss of ATm (B) and gDNA degradation (C)
were measured in Leishmania WT and resistant mutants (Sb2000.1, MF200.5,
AMB1000.1, PARO1200.1). Log-phase cultures were left untreated (controls, bars a) or
exposed to 400 pM SblII (bars b), 25 pM MF (bars c), 0.2 pM AMB (bars d) or 280 pM
174
175
PARO (bars e) for 48 h. Aliquots were washed and incubated in the presence of DCFDA
(ROS) or TMRE (A^m) for 30 min. Fluorescence was measured at 530 nm (DCFDA) or
545 nm (TMRE) and normalised to protein concentrations. Results are the average of three
independent experiments and are expressed as percentage of controls (A and B). *, p<0,0l
; **, statistically different from * with/?<0,01. Genomic DNA was analysed on 1.3%
agarose gels (C). MW: 1KB Plus Ladder (Invitrogen).
Fig. 5. Accelerated selection of multidrug-resistant Leishmania cells. Wild-type
parasites or drug-resistant mutants (5 x IO6 cells) were plated on drug-containing SDM-
agar plates and colonies were counted after 14 d. A. Wild-type (WT) cells and mutant cell
lines Sb2000.1, MF200.5, AMB1000.1 and PARO1200.1 were plated on AMB-, MF- and
PARO-containing plates. B. Wild-type cells and mutant cell lines MF200.5, PARO1200.1
and MTX1000.3 were plated on PARO- and MTX-containing plates. Results are the
average of 3 independents experiments. 1, WT;
2, Sb2000.1; 3, MF200.5; 4, AMB1000.1; 5, PARO1200.1; 6, MTX1000.1.
*,p<0,05 ;**,p<0,0l.
175
176
3000 9000
100 200 400 800 1600 Sb III [MM]
0.1 0.2 0.4 0.8 Amphotericin B [pM]
1.6
7000
o £ 3500-| 3 u-0u
5 10 20 40 Miltéfosine [pM]
6000-1
O £ 3000 3 E
Paromomycin [pM]
350 000
o £ 1 7 5 000 LL.
1000-
1.5 3 6 9 Pentamidine [pM]
50 100 250 500 1000 Methotrexate [pM]
Fig.l
176
177
X 300 O
200
'00
■ A T OSD2000.1
ii 400 300
SblII |pM]
25 SO Miltéfosine [uM]
0 2 0.4 Amphotericin B [pM]
B WT + HepesNaCl WT ♦ SblII 400 pM WT + Miltéfosine 25 |iM WT ♦ Amphotericin B 0.2 pM
i h k . b c 1 . S c a b c ■
400 600
SblII [pM]
400 800
S b V f j j M ]
225
150
Lk^ v a b c I J b c a b .
25 50
Miltéfosine [pM]
S 350
■ WT QMF2O0 5
iv tt 25
Miltéfosine [pM|
Amphotericin B [pM]
O
2
Fig.2
177
178
140.
CO zn O
ç 'o '*. OJ
o C Q. E <
ç o > s E o E o u CD
D.
en OJ CL OJ
I
O CD
</> OJ C L OJ
I
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U Z o o Z CD o cn
OJ c ÛJ
u U) OJ
— CL o n > OJ sz ai
I CL E <
X
o > s E o E 2 CD
D.
WT Sb2000.1 MF200.5 AMB1000.1 PARO1200.1
B WT Sb2000.1 MF200.5 AMB1000.1 PARO1200.1 m c c
z OJ c en
o ' l — 0) o
.JZ
o >s E o en
OJ CL
■2
o ' l — 0) o
.JZ F en OJ CL — CD CL
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X I CL E < CD
C L
O o co co Z Z cn U) OJ CD Q . — CL CD Q CD X co X
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a (D
CQ c:
C) o C) co i _ co Z CD Z 03 CD Cu
O SZ CL
en CD CL
CD E CD X < X
o > s E o E o S. MW
I l • " * ■ • ■»)■« —• ■ ■
Fig. 3
178
179
B 2400 2200 2000 1800 1600
en O 1400 LX — 1000 ? S 800
o s? B00 3 lier 400
200
111 liu liiii lim a b c d e i b e d l a b e d e a b c d e a b c d e
150-1
E
a. loo ê c o
50
il! Ikt a b e d e a b e d e a b c d e a b e d e a b c d
MF2005 AMB1000.1 PARO1200 1 MF200.5 AMB10001 PARO1200.1
WT Sb2000.1 MF200.5 AMB1000.1 PAROI 200.1
Fig. 4/
179
180
o 'c o o O
CD X) E
i
A 120 000-,
100 000-
80 000-
60 000 -
40 000-
20 000 -
75
50
25 H
0
1,1x10s
I
14 JL
* * 46 47 T . T
o 1 2 3 4 5
Amphotericin B [0,24pM]
6,9x104
28 X
o 1 2 3 4 5 Miltéfosine [80pM]
2,7x10*
1 2 3 4 5 Paromomycin [480pM]
B
eu O O
o
E
150 000 -, 1,3x10s
T 125 0 0 0 - ** 100 0 0 0 - 8.1X104
T 75 000 -50 000 - *
79
T *
90
m *
79
T *
90
m 100 -
* 79
T *
90
m 50 -
* 90
m 10
0 -2. o r-1-! ° 1 3 5 6 Paromomycin [480pM]
1 3 5 MTX [800pM]
Fig. 5
180
181
n- a»»B_
50 100 250 500 1000
[MTX] « m
Hepes- [Sta*ffodrxxine| NaO 25|jM
Fig. SI
181
182
Chapitre VIII. Discussion générale
Les mécanismes de résistance d'un pathogène comme Leishmania, que ce soit les
mécanismes de résistance aux drogues ou plus généralement les mécanismes de résistance
aux stress que le parasite rencontre au cours de son cycle de vie, constituent un domaine
d'étude particulièrement intéressant et important. Il conduit à la mise en évidence des
formidables capacités d'adaptation de cet organisme, fruit de sa coévolution avec l'insecte
vecteur et l'hôte mammifère. Un processus de differentiation comme la métacyclogénèse
correspond également, d'une certaine manière, à une adaptation évolutive en vue de
préparer le parasite au changement d'environnement (passage de la mouche des sables à
l'hôte mammifère) et pour garantir le succès de l'infection des cellules hôtes dont dépend
l'achèvement de son cycle de vie. L'étude de tels mécanismes de résistance et de
differentiation devrait donc conduire à une meilleure compréhension de la biologie du
Leishmania, dans l'objectif évident d'identifier de nouveaux moyens pour combattre ce
fléau. À défaut de permettre l'identification directe de nouvelles cibles thérapeutiques, ces
études pourraient néanmoins conduire à la mise en place de nouvelles stratégies de lutte.
Les objectifs de cette thèse étaient multiples et j 'ai volontairement divisé la discussion de
cette thèse en trois parties distinctes, correspondant au trois objectifs généraux présentés
précédemment.
8.1 Leishmania et les stress oxydatifs : un nouveau rôle dans la résistance au stress oxydatif pour PTRl et les ptérines réduites
Le rôle de PTRl et des ptérines réduites est demeuré relativement élusif depuis les
premières caractérisations de l'enzyme et la mise en évidence de son rôle dans la résistance
au MTX. La majeure partie de nos connaissances sur le métabolisme des folates et des
ptérines découlait d'ailleurs des études conduites avec cet anti-métabolite. L'implication de
PTRl dans la résistance au MTX, de part sa capacité à assurer la réduction des folates en
lieu et place de la DHFR (cible du MTX), avait dans un premier temps permis d'envisager 182
183
l'établissement de PTRl comme cible thérapeutique. Le rôle joué par PTRl et les ptérines
réduites dans la métacyclogénèse du parasite renforçait d'ailleurs cette approche.
Néanmoins, la mise en évidence des mécanismes d'amplifications géniques associés aux
phénotypes de résistance au MTX a rapidement rendu caduque cette voie de recherche.
Cependant, le métabolisme des ptérines et le rôle des ptérines réduites est demeuré
méconnu. Les ptérines sont connues pour être des facteurs de croissance importants du
Leishmania [219, 220] bien que leur rôle cellulaire exact n'ait pas encore été établi. Les
ptérines réduites, et notamment la tétrahydrobioptérine, est un cofacteur d'un certain
nombre d'enzymes incluant l'iNOS [222, 225], cependant ces enzymes n'ont encore jamais
été caractérisées chez Leishmania. L'un des rôles putatifs des ptérines fut établit avec la
corrélation entre le niveau de ptérines réduites et la métacyclogénèse du parasite [227] chez
L. major. Nous avons également confirmé ce phénotype chez L. infantum, en montrant
qu'un plus grand nombre de parasites métacycliques étaient générés en phase stationnaire
de culture. Ceci nous a permis de travailler avec des parasites métacycliques purifiés et
d'établir que le niveau de survie intracellulaire dans un modèle macrophagique murin ou
humain était moindre chez les souches PTRl''. La corrélation entre le niveau de ptérines
réduites et la métacyclogénèse (donc le nombre de parasites infectieux) était donc confortée
par nos résultats. Nous avons aussi clairement établit la diminution de la survie
intracellulaire des parasites n'exprimant plus PTRl, particulièrement lorsque les
macrophages étaient activés pour la production d'espèces oxygénées et nitrogénées
réactives. Il avait été établit chez d'autres organismes que les ptérines réduites possédaient
un potentiel antioxydant important [225]. Nous avons donc émis l'hypothèse que les
ptérines réduites pouvaient jouer un rôle dans la résistance aux stress oxydatifs et
nitrosatifs. Nos expériences en présence d'agent comme l'H2C>2 ou un donneur de NO ont
mis en évidence une accumulation plus importante d'oxydants intracellulaires dans les
souches PTRl'', suggérant un rôle de PTRl et des ptérines réduites dans la résistance à ces
stress. La complémentation métabolique à partir de ptérines réduites exogènes a clairement
mise en évidence les propriétés de « scavengers » d'oxydants des ptérines réduites. La
confirmation de notre hypothèse établissait donc les ptérines réduites comme un nouveau
moyen de défense contre les stress oxydatifs et nitrosatifs que le parasite rencontre au cours
de son cycle de vie et attribuait un nouveau rôle physiologique à ces molécules. Par 183
184
ailleurs, ce rôle semblait d'autant plus important que la disponibilité en ptérines réduites
semble affecter le niveau de survie intracellulaire dans un modèle d'infection de
macrophages, tant murins qu'humains. Leishmania amplifie souvent des portions
spécifiques de son génome en réponse à des stress environnementaux comme l'exposition
aux drogues. Un petit nombre de locus ont été caractérisé comme étant amplifiés chez des
souches du terrain issues de patients infectés [136, 286]. Deux de ces locus codent pour le
transporteur de bioptérine (BT1) et pour PTRl [226]. Il a été suggéré que l'amplification de
ces locus correspondait à la nécessité du parasite de s'approvisionner en ptérines. Au regard
de nos résultats, il est possible de proposer que les stress oxydatifs et nitrosatifs constituent
des pressions de sélection favorable à la génération de ces amplifications extra-
chromosomiques. Il est évident que le parasite subit, tout au long de son cycle de vie, des
stress oxydatifs, particulièrement lors de sa rencontre avec le système immunitaire de son
hôte. Leishmania possède un système enzymatique et non-enzymatique antioxydant très
performant et nous avons ajouté à cette liste les ptérines réduites. Si l'approche
thérapeutique ciblant le métabolisme des folates stricto sensu semblait compromise de part
les mécanismes d'amplifications géniques qui sont associés aux mécanismes de résistance
au MTX, il n'en demeure pas moins que PTRl constitue une enzyme importante et une
cible thérapeutique potentielle. Plusieurs études récentes soulignent d'ailleurs l'intérêt
thérapeutique de PTRl et ont conduit à 1'elucidation de la structure et à l'élaboration
d'inhibiteurs de cette enzyme [283, 366-370]. Il est intéressant de noter que PTRl est
essentielle chez Trypanosoma brucei. La compréhension des rôles physiologiques qu'elle
joue en fournissant Leishmania en ptérines réduites est une avenue de recherche
prometteuse. Par ailleurs, le lien encore inexpliqué entre le niveau de ptérines réduites et le
nombre de parasites métacycliques, que nous avons confirmé également pour l'espèce L.
infantum, souligne l'importance de la compréhension de ce métabolisme. La disponibilité
de souches PTRl' ' constitue d'ailleurs un outil d'étude privilégié pour la compréhension de
ce phénomène.
184
185
8.2 Rôle des ptérines dans la métacyclogénèse du parasite
Le lien entre les ptérines réduites et la métacyclogénèse (mentionné précédemment) à été
clairement établit, bien que le mécanisme sous-jacent demeure inexpliqué. L'approche que
nous avons favorisée, à savoir l'étude des changements dans le protéome entre une souche
PTRl' ' et une souche sauvage au cours de ce processus de differentiation, avait pour
objectif de mettre en évidence le rôle joué par ce métabolisme, et particulièrement par
PTRl, dans la métacyclogénèse. Les études protéomiques de la métacyclogénèse du
Leishmania sont relativement peu nombreuses. En raison du mode d'expression génique
particulier de ce parasite [371], ce type d'étude a l'avantage de permettre l'identification
des protéines différentiellement exprimées dans différentes conditions, ce qui est
vraisemblablement la meilleure manière de mettre en évidence la régulation des acteurs
moléculaires impliqués dans ce processus. En effet, en l'absence de régulation
transcriptionnelle, la régulation de l'expression chez Leishmania se fait presque
exclusivement au niveau post-transcriptionnel [372]. Notre approche protéomique
présentait également une particularité technique importante. Les extraits de protéines issus
de parasites métacycliques purifiés ont tous été enrichis par FFE (Free Flow
Electrophoresis). Cette méthode unique permet la concentration des protéines en fractions
dépendamment de leur point isoélectrique dans un système liquide. Ces fractions peuvent
ensuite être rassemblées en « groupes de pH », permettant leur séparation subséquente
selon la méthode classique de gels en deux-dimensions (première dimension consistant en
la séparation selon le point isoélectrique et seconde dimension consistant en la séparation
selon le poids moléculaire). Les études protéomiques classiques présentent généralement
une limite importante qui est la résolution, c'est-à-dire le nombre de protéines identifiables
en gels de 2 dimensions est relativement faible. Les protéines identifiées comme étant
différentiellement exprimées correspondent alors aux protéines les plus abondantes.
L'utilisation d'une approche incluant une étape de FFE permet de contourner ce problème
de faible résolution [304]. Notre étude présentait donc un avantage singulier par rapport à
l'ensemble des autres études protéomiques menées sur la métacyclogénèse du Leishmania.
Un autre aspect absolument essentiel de notre étude réside dans le fait que nous avons
considéré le processus de la métacyclogénèse en tenant compte du caractère « dynamique
185
186
dans le temps ». Ce processus de differentiation à lieu à l'intérieur de la mouche des sables,
et correspond à une l'acquisition de la forme infectieuse du parasite en vue de l'infection
des cellules phagocytaires de l'hôte mammifère suite à la piqûre de l'insecte. Il est admis
que ce processus peut être reproduit en laboratoire au cours de la culture du parasite en
milieu liquide, et qu'il correspond à la transition entre les phases de cultures dites
« logarithmique » et « stationnaire ». Les parasites métacycliques apparaissent au cours de
la phase stationnaire, à raison de 20 % des parasites totaux chez les souches sauvages et de
40 à 50% chez la souche PTRl''. Nous avons donc purifié les parasites métacycliques
provenant de la souche sauvage et de la souche L. infantum PTRl' ' et nous avons comparé
leur protéome à celui de parasites procycliques issus de la phase logarithmique. Ceci a
conduit à un premier niveau d'analyse qui a mis en évidence les protéines
différentiellement exprimées dans la métacyclogénèse d'une souche sauvage et d'une
souche PTRl''. La soustraction subséquente des protéines communément identifiées dans
les deux conditions indépendantes devait nous conduire à la mise en évidence de protéines
dont la différence d'expression serait potentiellement liée à l'inactivation de PTRl. En plus
de cette approche unique qui faisait appel à l'analyse simultanée de 4 conditions
différentes, nous avons également conduit des analyses comparatives des stades
métacycliques seuls entre la souche sauvage et la souche PTRl' ' ainsi que l'analyse
indépendante de la métacyclogénèse de la souche sauvage et de la souche PTRl''. C'était la
première fois que ce type d'analyses protéomiques était mené de cette manière. Notre
approche a permis l'identification d'un nombre très élevé de protéines différentiellement
exprimées. En considérant simplement l'approche soustractive entre la métacyclogénèse de
la souche sauvage et celle de la souche PTRl'', dont l'objectif était la mise en évidence du
rôle des ptérines réduites dans la métacyclogénèse, notre étude a conduit à l'identification
de 143 protéines différentiellement exprimées.
De l'ensemble de ces analyses, il est principalement ressorti un trait majeur lié à
l'inactivation de PTRl. Le nombre de protéines différentiellement exprimées au cours de la
métacyclogénèse d'une souche sauvage (c'est à dire une métacyclogénèse qu'on pourrait
qualifier de « normale »), était beaucoup plus important que chez une souche PTRl' ' (dans
des conditions qu'on pourrait qualifier d'une métacyclogénèse « supérieure »). Ceci corrèle
186
187
avec les observations faites qu'une souche PTRl''présente un niveau de métacyclogénèse
plus important conduisant à un nombre de parasites métacycliques plus élevé. Cette
observation suggère une interprétation importante : PTRl, ou les ptérines réduites, ou les
deux, sont clairement impliqués dans la métacyclogénèse du Leishmania d'une manière
probablement indirecte, en cela qu'elles semblent moduler l'expression de plusieurs
protéines qui ne sont pas nécessairement directement reliées au métabolisme des folates.
D'autre part, nous avons pu observer l'augmentation du niveau d'expression de protéines
impliquées dans des voies métaboliques importantes. Les métabolismes liés à la
detoxification des oxydants, notamment celle du métabolisme du trypanothion, ainsi que les
métabolismes énergétiques de la gluconéogénèse et le cycle de Krebs sont apparus
augmenté au cours du processus de differentiation. Il ressort donc clairement que le parasite
s'adapte, au cours de la métacyclogénèse, à l'environnement hostile qu'il rencontrera une
fois dans son hôte mammifère. Par ailleurs, les protéines liées à la structure du flagelle et à
la mobilité du parasite ont également un niveau d'expression plus important au cours de ce
processus de differentiation, en corrélation avec les observations faites d'une plus grande
mobilité chez les parasites métacycliques. Cette vaste étude, en termes techniques et
analytiques, engage des perspectives évidentes. Les variations d'expression de ces
nombreuses protéines, que l'on a pu regrouper selon des critères ontologiques de fonctions
métaboliques ou structurales, devraient conduire à l'établissement d'un profil de la
métacyclogénèse et à la caractérisation subséquente des candidats les plus intéressants
relativement à leur implication dans le dit processus. Si on considère que le processus de la
métacyclogénèse prépare le parasite à l'environnement de l'hôte mammifère, ces résultats
prennent une dimension particulièrement intéressante. Enfin, le nombre relativement élevé
de protéines hypothétiques souligne l'importance de continuer la caractérisation,
notamment fonctionnelle, d'un tel protéome.
187
188
8.3 Dichotomie du mécanisme d'action des drogues anti-Leishmania : implication pour l'acquisition de la résistance
Il a toujours été implicitement admis que les mécanismes d'action des drogues reposaient
principalement sur la nature de leurs cibles cellulaires. C'est d'ailleurs selon ce principe
que la plupart des drogues (anticancéreuses, antivirales, antibactériennes, antiparasitaires ou
autres) ont été classées. À la question : comment est-ce qu'une drogue tue une cellule ?,
était généralement apporté la réponse suivante : une drogue tue une cellule en altérant la
fonction de sa cible (que ce soit une enzyme, une structure cellulaire, un mécanisme de
réparation, une voie métabolique ou autre). Pourtant, dès la fin des années 80 [128] certains
chercheurs posaient clairement la question suivante : que se passe-t-il en aval de
l'interaction primaire entre la drogue et sa cible ? Se pourrait-il que cette interaction ne soit
que la première étape d'un mécanisme qui, éventuellement, va conduire à la mort de la
cellule via des voies de signalisation qu'il resterait alors à définir ? Les travaux du groupe
de J.J. Collins [129-132, 134] ont révolutionné le concept de mode d'action des drogues en
répondant à cette question. Ils ont en effet établi pour la première fois l'existence d'un tel
mécanisme, en aval de la cible primaire, qui s'est de surcroît avéré commun à des
antibiotiques très différents (pMactames, quinolones et aminoglycosides) et qui conduit à la
mort de la cellule via une voie commune qu'ils ont en partie déterminé. Des antibiotiques
ayant des cibles cellulaires très différentes (les P-lactames ciblent la paroi cellulaire, les
quinolones ciblent les enzymes impliquées dans la topologie de l'ADN et les
aminoglycosides ciblent les ribosomes et la synthèse des protéines) induisent un mécanisme
de mort cellulaire commun, redéfinissant ainsi le concept de mode d'action. Leurs études
mettaient également en évidence les bases moléculaires sous-jacentes à la notion de
d'antibiotiques bactéricides et bactériostatiques. Seuls les antibiotiques bactéricides
partagent l'induction de ce mécanisme de mort cellulaire. Le point de convergence de ce
mécanisme de mort cellulaire commun est l'induction d'oxydants suite au
disfonctionnement de la chaine respiratoire. L'induction d'oxydants est une des
caractéristiques principales de la mort cellulaire programmée par apoptose chez les cellules
eucaryotes. D'autre part, la chaine respiratoire est comprise dans la mitochondrie chez les
eucaryotes, et cette organelle est également le point de convergence des signaux conduisant 188
189
à l'apoptose chez ces cellules. La mort cellulaire programmée a récemment été caractérisée
chez les eucaryotes primitifs auxquels appartiennent les Leishmania [120, 361, 373, 374].
De manière indiscutable, ces organismes subissent ce genre de mort en réponse à une
variété de stress dont l'exposition aux drogues. Nous avons donc formulé l'hypothèse que
plusieurs drogues anti-Leishmania connues pour induire l'apoptose chez ce parasite
pouvaient induire un mécanisme de mort cellulaire commun impliquant, comme chez les
bactéries, l'induction de ROS. Notre hypothèse s'est avérée exacte et les conséquences sur
les modes d'acquisition de la résistance sont inédites. Nous avons en effet montré que
l'antimoine (SblII), la miltéfosine (MF) et l'amphotéricine B (AMB), mais pas la
paromomycine (PARO) ni le methotrexate (MTX), induisaient la mort cellulaire par
apoptose avec les caractéristiques suivantes : induction de ROS au niveau de la
mitochondrie, perte du potentiel mitochondrial et induction de la dégradation l'ADN
génomique. Nous établissions également par le fait même un modèle dichotomique
d'action des drogues anti-Leishmania : d'une part l'antimoine, la miltéfosine et
l'amphotéricine B induisant l'apoptose et d'autre part la paromomycine et le methotrexate
ne l'induisant pas. Ayant à notre disposition des mutants résistants pour chacune de ses
drogues, nous avons pu constater, comme nous nous y attendions, qu'aucun de ces mutants
ne présentaient ces caractéristiques lorsque soumis à la drogue pour laquelle la résistance
avait été sélectionnée. Puisque l'antimoine, la miltéfosine et l'amphotéricine B ont en
commun l'induction de la mort cellulaire par apoptose, nous avons souhaité vérifier quel
serait le comportement d'un mutant résistant qui serait soumis à une autre drogue qui induit
également l'apoptose. De façon intéressante, nous avons pu alors constater que dans ce cas
là, les mutants présentaient un phénotype de tolérance à l'apoptose induite pas les drogues.
Ceci était vrai pour les mutants résistants à l'antimoine, la miltéfosine et à l'amphotéricine
B, mais pas pour le mutant résistant à la paromomycine. Ce dernier mutant se comportait en
effet comme un parasite sauvage, présentant les caractéristiques de la mort cellulaire par
apoptose lorsqu'il était soumis à l'une des trois drogues mentionnées précédemment. Étant
donné que nous avions montré que la paromomycine n'induisait pas l'apoptose, cela nous a
conduit à formuler une seconde hypothèse selon laquelle le type de mort induit par les
drogues anti-Leishmania pouvait avoir une conséquence sur l'acquisition de résistance
secondaire (multi-résistance) chez les mutants résistants dont nous disposions. Afin de 189
190
vérifier l'hypothèse selon laquelle un mécanisme commun de mort cellulaire induite par les
drogues favoriserait l'acquisition de multi-résistance à une drogue partageant le même
mode d'action, nous avons étalé sur milieu gélose des mutants résistants en présence d'une
autre drogue pour laquelle ils n'étaient pas résistants. De plus, et afin de vérifier si
l'acquisition éventuelle d'une résistance secondaire était dépendante du mode d'action de la
drogue, nous avons également utilisé la paromomycine ainsi que le mutant résistant à cette
drogue en tant que contrôle. De manière tout à fait remarquable, nous avons alors mis en
évidence que la fréquence de génération de mutants multi-résistants était plus élevée chez
les mutants déjà résistants à une drogue présentant le même mode d'action. Ainsi, par
exemple, le mutant résistant à la miltéfosine acquérait plus facilement une résistance à
l'antimoine et à l'amphotéricine B, mais pas à la paromomycine. L'incapacité du mutant
résistant à la paromomycine à acquérir une résistance secondaire à l'antimoine, à la
miltéfosine ou à l'amphotéricine B confortait l'existence d'un modèle dichotomique
d'action des drogues ainsi que ses conséquences sur l'acquisition d'une résistance
secondaire. De la même manière, nous avons observé que les mutants résistants à la
paromomycine et au methotrexate pouvaient acquérir une résistance secondaire (au MTX et
à la paromomycine, respectivement), plus facilement que les autres mutants, qui en étaient
d'ailleurs incapables. Ceci suggère également que la paromomycine et le methotrexate
pourraient induire la mort cellulaire selon un mécanisme vraisemblablement similaire qu'il
reste néanmoins à définir.
Cette étude présente un certain nombre de conséquences relatives notamment à l'utilisation
de la chimiothérapie anti-Leishmania et au problème d'émergence de la résistance.
L'existence d'un phénomène de tolérance à la mort cellulaire induite par les drogues qui
facilitent l'acquisition de multi-résistances pose le problème du choix des thérapies
utilisées, et suggère une orientation vers des méthodes de bithérapies qui combineraient, de
manière optimale, des drogues utilisant des modes d'action différents. Ces résultats
suggèrent en effet qu'il serait plus facile pour un parasite résistant à une drogue qui induit
l'apoptose d'acquérir une résistance secondaire à une autre drogue qui induit également
l'apoptose. Par ailleurs, en terme d'élucidation du mode d'action de certaines drogues
comme l'antimoine, dont on ne connait ni les cibles cellulaires ni le mode d'action exactes,
190
191
ces résultats suggèrent d'orienter les recherches vers l'identification des acteurs
moléculaires impliqués dans les voies de signalisations qui conduisent à la mort cellulaire
par apoptose.
Les perspectives découlant de ces observations vont dans le même sens. La détermination
de l'algorithme de l'apoptose permettrait, outre l'identification des molécules effectrices de
ce type de mort, d'établir une liste de candidats potentiels, qui constitueraient de bonnes
cibles thérapeutiques et/ou éventuellement de bons candidats pour des stratégies vaccinales.
L'éventualité de pouvoir un jour «jouer» sur les mécanismes d'induction de la mort
cellulaire programmée ouvre des voies prometteuses. Enfin, la compréhension du
mécanisme effecteur de la paromomycine (vraisemblablement similaire à celle du
methotrexate), constitue un champ d'investigation important avec l'objectif d'affiner le
modèle dichotomique d'action des drogues que nous avons proposées. Il n'est d'ailleurs pas
exclu qu'on arrive un jour à la démonstration qu'il existe des drogues leishmanicides
(comme c'est clairement le cas pour l'antimoine, la miltéfosine et l'amphotéricine B) et des
drogues leishmanostatiques. La recherche de marqueurs biologiques associés aux autres
types de mort comme l'autophagie ou la nécrose pourrait notamment permettre la
caractérisation de la mort induite par ces drogues. Enfin, la détermination de l'effet
potentiellement bactériostatique de la paromomycine et du methotrexate pourrait être mise
en évidence par les méthodes classiquement utilisées pour les antibiotiques.
191
192
Conclusions Partant de l'étude du métabolisme des ptérines et du rôle de PTRl et des ptérines réduites
dans la biologie du parasite au sens large (résistance aux stress oxydatifs et
métacyclogénèse), mes travaux m'ont conduit à proposer, au cours d'un autre projet, un
mécanisme commun d'action des drogues anti-Leishmania et à discuter de son implication
dans l'acquisition de multi-résistances. Le stress oxydatif apparait comme l'élément liant
toute ces parties. Il n'est pourtant qu'un des composants de l'environnement auquel la
métacyclogénèse prépare le parasite. Mes travaux ont néanmoins permis d'établir un certain
nombre de faits nouveaux, contribuant ainsi à la meilleure compréhension du parasite
Leishmania. Les ptérines réduites, composés ne possédant jusqu'ici qu'un rôle indirect dans
la métacyclogénèse du parasite, ont rejoint l'arsenal de défense contre les stress oxydatifs
que rencontre le parasite. La démonstration de leur participation à la survie intracellulaire
du Leishmania lors de l'infection du macrophage illustre l'importance d'une telle fonction.
L'étude protéomique comparative de la métacyclogénèse entre une souche sauvage et une
souche PTRl7" a conduit à l'identification d'un très grand nombre de protéines
différentiellement exprimées au cours de ce processus de differentiation, essentiel à la
biologie du parasite. La mise en évidence de l'augmentation des voies métaboliques liées à
la résistance aux stress oxydants ainsi que l'adaptation métabolique souligne l'importance
de ce processus. Enfin, l'établissement de l'existence d'un mécanisme de mort cellulaire
commun induit par les drogues anti-Leishmania, basé sur l'induction de ROS, et ses
conséquences sur l'acquisition de multi-résistances, pose les bases d'une réflexion sur la
manière dont les drogues tuent le parasite et comment celui-ci acquière la résistance.
192
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