structural basis for oligosaccharide recognition by pyrococcus

14
Structural Basis for Oligosaccharide Recognition by Pyrococcus furiosus Maltodextrin-binding Protein Artem G. Evdokimov 1 *, D. Eric Anderson 2 , Karen M. Routzahn 2 and David S. Waugh 1,2 * 1 Protein Engineering Section Macromolecular Crystallography Laboratory 2 Structural Biology Core Facility, Program in Structural Biology, National Cancer Institute - Frederick Cancer Research and Development Center, P.O. Box B, Frederick MD 21702-1201, USA A maltodextrin-binding protein from Pyrococcus furiosus (PfuMBP) has been overproduced in Escherichia coli, puri®ed, and crystallized. The crys- tal structure of the protein bound to an oligosaccharide ligand was deter- mined to 1.85 A Ê resolution. The fold of PfuMBP is very similar to that of the orthologous MBP from E. coli (EcoMBP), despite the moderate level of sequence identity between the two proteins (27 % identity, 46 % simi- larity). PfuMBP is extremely resistant to heat and chemical denaturation, which may be attributed to a number of factors, such as a tightly packed hydrophobic core, clusters of isoleucine residues, salt-bridges, and the presence of proline residues in key positions. Surprisingly, an attempt to crystallize the complex of PfuMBP with maltose resulted in a structure that contained maltotriose in the ligand-binding site. The structure of the complex suggests that there is a considerable energy gain upon binding of maltotriose in comparison to maltose. Moreover, isothermal titration calorimetry experiments demonstrated that the binding of maltotriose to the protein is exothermic and tight, whereas no thermal effect was observed upon addition of maltose at three temperatures. Therefore, PfuMBP evidently is designed to bind oligosaccharides composed of three or more glucopyranose units. Keywords: thermostable protein; carbohydrate-binding; maltose-binding protein; maltodextrin-binding protein; Pyrococcus furiosus *Corresponding authors Introduction ATP-binding cassette (ABC) transporters com- prise one of the largest superfamilies of proteins (Tatusov et al., 1997). They orchestrate the ATP- dependent transport of a wide variety of solutes across biological membranes in both prokaryotes and eukaryotes (Higgins, 1992; Croop, 1998). In bacteria and archae, the majority of ABC transpor- ters consist of a high-af®nity substrate-binding pro- tein, two integral membrane proteins, and a pair of membrane-associated ATPase subunits (Ehrmann et al., 1998; Horlacher et al., 1998). In Gram- negative bacteria (e.g. Escherichia coli), the binding protein is a soluble constituent of the periplasm, whereas in Gram-positive bacteria and archae it is a lipoprotein that is anchored in the cytoplasmic membrane and exposed like a receptor on the cell surface (Wu, 1996). Much of the existing knowledge about microbial ABC transporters has been gleaned from studies of the high-af®nity maltose transport system in E. coli. The E. coli maltodextrin-binding protein (EcoMBP), in particular, has been the subject of intensive study. A battery of genetic, biochemical, and biophysical methods have produced a wealth of information about the structure and ligand- binding properties of EcoMBP (e.g. see Martineau et al., 1990; Spurlino et al., 1991; Sharff et al., 1992, E-mail addresses of the corresponding authors: [email protected]; [email protected] Present address: D. E. Anderson, Laboratory of Molecular Biology, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892-0580, USA. Abbreviations used: ABC, ATP-binding cassette; EcoMBP, Escherichia coli maltodextrin-binding protein; HIC, hydrophobic interaction chromatography; ITC, isothermal titration calorimetry; MS, mass spectrometry; ORF, open reading frame; PfuMBP, Pyrococcus furiosus maltodextrin-binding protein; PMSF, phenylmethylsulphonyl chloride; PCR, polymerase chain reaction; rmsd, root mean square deviation; TCEP, tris-carboxyethyl phosphine hydrochloride; TliMBP, Thermococcus litoralis maltose-binding protein; TmaMBP, Thermotoga maritima maltodextrin-binding protein. doi:10.1006/jmbi.2000.4202 available online at http://www.idealibrary.com on J. Mol. Biol. (2001) 305, 891±904 0022-2836/01/040891±14 $35.00/0

Upload: dinhtram

Post on 28-Jan-2017

215 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

��������������� ����� � ��������� ������ �� ������������������������ �� �� ���� ����� � ���� *+,� ��� ���

���������� �� ��� ����������� ��������� ������������ ������� ����������������� ������

����� �� ���� ���!"# $� ��� �������%# &���� �� ����'���%

��� $��� �� (����!#%"

�������� ��������� ������� ���������� ������ ���� ��� � ��� ������������ � ������ ����� ������� ���� � �� ������� �������� � ���� � � ������������� � ��������� � ���� ��� ��� �� !�"��������������� �#$# ��% �� ����������! &'()&�'&)'� *+

5��� � ����� �� �� ����������- ��:�� �"�� ����"���/ $����

����� ����9 ;" 5" ��������������� � ���� � =�� ���� 3��� ��; ��� � �� > � ; ����� =�2����� ������ �; �8%1��8&%8� ?����� �� ��� ��9 ��0� �#���

������� ���������� ���� �������� 230� � ������ � ������ �� ����� �������� � ���� �� ����� ��� / �.@AB� ��� �� �� ����/ �,������������� ��� � �� ���� �/ ��.B��� ���� �������� � ����� / �0��� � ���� ��/ ���� ���� ��� �(��� �������� �� � ������ � � ���1����������� ����� ��� �������� � �1������� � ����� �������� ���

88����%C,D8�D8+8%1�E�+ FC&"88D8

� �������� ��� � �� ���� � ���� ���������� ,������� ��,����� ����� �������� � ���������� ����� ��� �� �� �� ����� !" #� �� ����� �������� �� �� ���� � ���� �� �� �� ��������� � ��� $�� ���� � �� �"%& �' ������ ��" #� ��� �� �,���� � �� � � ��� �� ���� ���� ����������� ��� ���� �# ���� ��������� �� � �� ����� ��� ���(��� �� � ��$� �� �$� ���� �� ��)* �� � � +,* � � ���� � �" �,���� � ����� �� ����� �� ��� �� ��� ��� ������� ���$� �� �� � ���� ��� �� � ����� �� �������� ���� �� � � ���� ���-� ������ � ���� ������� �� ����� � �� ��� ������� ��� �� ������� �� ���� � �� �� � - ��� � ���" .���� � ��� � �� ������ ���� ����� ! �� ������ �� �,���� $ �� ������ ����� � � ������������ ����� � ������� �� � �� � ����� � �� � �" #� �������� �� �������� ������� ���� ��� � � ���� ���� ��� �� � ���� � � ���� ������� �� � ������ ��� �� ������" ������� �������� � ���� ������� ��� ��� ���� �������� ���� �� � � �� �� ������� �� ���� ���� � � ������ � �� � ���� $���� �� ������ ���� $������� ���� � � �� �� ������ �� ��� ���������" #�������,���� � ��� � � �� �� � � �� ��������� � ������ ����� �� ��� ������ ����� �� ��"

-��.����/ ���������� ���� �/ ������ ����� � ��/ �������� � ������ �/ �������� ��� � �� ���� �/ ���������� ,�������

0������������ ������

)����������

�#��� � �� ������ ���0� ����������� ������ � �� �� �� ������ ������� � � �� ���� ���#������ �� �"� �11)�" #� ��������� �� �#������ ��������� �� � $ ��� � �� ������

�� �������9:�� ����"���

<�������� ��� �� ; ���� ��� ���� 3��� ���� ��.�"

� �� ������/��� � �� ���� �/�������� / 3#0�� ���� ��������� /���������� ,��������A� ��� ������ � �� ��/ #05������ / 1������� ���� �/ 1� ���� � �� ���� �"

������ � ���� ��� ������� � ���� ���-�� ����� �-�� ��� �2 �� ��� �11�/ 0����� �11%�" 3������ � �� ������ �� ��4�� � �� ��0 ������������ ���� �� �� � � ������� � ���������� � �� ����� �� �$� ������ ������ ���� ��� �� � �� � �������������� �� �#��� ����� �� �5�������� �"� �11%/ 2������� �� �"� �11%�" 3� 6�������� � ����� � �"�" ���������� ������ �� � � ������ � � � ������ ����� ���� �� �� �� ������$���� � 6������� � � ����� � �� ����� � �� � ������ � ���� � ������ � �� � ������� ������� �� ���� � - � ������ �� �� ��������� �7�� �11,�"���� �� �� � �� �� -��$�� ����� � ���� ��

��0 ����������� ��� �� ���� ���� ��� � ���� � ������� � ������ ��������� � ��� ��# ����" #� �# ���� �������� ��� � �� ���� ���������� � ���� ������ ��� �� �� ���4�� �� ���� � ��� " � ����� �� ��� �� � ���� ������ � ��� � ��� ����� ��� ����� � $������ ������� �� ����� �� �������� �� � ����� � �� ������ � �� ������ �"�" � ���� ����� �"� �118/ .���� �� �� �"� �11�/ .����� �� �"� �11��

�� ���� �� !� "#���$#$ ���

�11C/ 2��� �� �"� �11)�����/ =���-���� G 3�������11)/ 6���� �� �"� �11%/ #������ �� �"� �11%�"3� � ������� ��$��� �� $��� �� ��� �������� ��� ��� � ����� !" #��� �� $��� �� ��� � ��� � � �� ������ ��$� ������ �� �� ����� ���� ��H #� ���� �� � (��� ��� $��� �����-� � ��� �� �� ��� ���� ��� ��������� � � ������ ���������� ,���������,�����"2�� $ ��� � �� �� ���� �������� ��

�,���� � ������ $ �� ������� �� �� � ������� �� �� �"%& �' " ;�� � �� ����� ��� ���(��� �� � ��$� �,���� �� ��������)* �� � � +,* � � ��� � �� �� �$� ����������� � � ��� � ��� ������" #� ���� �� ���������� � ����� � � � ���� ���� � � �$ �� � ������ � � ���� �� �� �� � � ������� � ���� �� �� �� ������" ������ � ������ ������ �� ������� �� $ �� � � ��� ���� � ��#������ �� �"� �11%�" 3� ��������� �,���������� �� � � ������� �� ���� ��� � ���� ���� ������"

�����

��-����# -��������# ��� �������'������ ������

� �<�.# ����� �� �� �# ,������� �����(��� �� � �$� ��� �� �� ������@AB�� $ �� ����� !��� � � ��� � �� ������"@� �� ��� �?��� ���� ���� 3; �� �,�,8�+����� � ���� � ���� � �� ��� $ �� � ���� ���� �������� ! 1����������� ����� ��� �������� � �� ���� � �1������ �2������� �� �"� �11%�"#� �� �� �� �(��� ��� � �� ����@AB �?��� ���� ���� 3; �� �)%%1%�� � �� ����� ���� ���� �� 1�����" 2�$��� ����@AB� � �# ,������� �� � � ����� �� ��� ���� �(��� � � ��� � $ �� ������ ��)* �� � �"�� �)%%1%� ������ �� � ���� �� �� ����� ���� ����� ��������� �� �� ��0 ���������� ���� �� ������������ ��"#� ��� � $���� �� � ���������� ! @AB

� �� �# ,������� ���� ��� �)%%1%�� ���� ������ ���� ���� $ ���� � �� �� �� �(������� ���� � ;=� � ��� ���� ��� � ���� ����0A� �� ���� � ��� �� �����0�� ����� ������� �=$ 5����� � ������� ���� �� ����� ���� �� �� �(��� �� ������ $ �� ���� �� ���# ,������� @AB" < - 1������ �� ����� ��� ��� �� � ����� � �,���� � ������ � �� =���� ��� ��� ���� �������� ���� �� �������� ���� � �� �� ������" ����� �� � ��� ���� �� � � ��� � �� �� ������ � ���� ��� �$� �� � ���� �� �� ���������� �� �� �� ����� � ������ �� ��� ������ �� ����� ������� ���� � $�� ��� ���� ����� $�� �� =��� ��� �� �� II�����JJ ��� � �� �,��������� �� �" 2�$��� �� �$� �(���� ����� �� �� ����� ������ �� �� �� $ �� �� ������ � ���� �� = ��� ��� �� ����� ������"#������ $ � �� ��� ����� �� ����� �

�� �� � ��� ��� ���� �� �� �� �� ���� ������ �� �� ����� ������ ����� �� � � ���� ���� �� � �� �� �����$ � C), �� �� ���� �# ,������� ;=�"?��� ���� �� $ �� ������ � ��;��� ���������

� ����� �3�#6� � �# ���� �<��D;5C ����� ���,���� ����� �� ����� ����� �� ����������� � $ �� �� ���� �������� ���� ���+C -;��� �� 4�� � �� �� �� � ������D��� ��� ��� �� ���������� �" #� � ���� ���������� � � ������ ���� � �� ��� ���������� �� ��� � ������ �� ���� �������� ���� �� $� ��� � ��� � ��� �� �������� �� 18 �0 ��� �& � ���� ���� ��� ���$��"?�� - 1����� �2������� �� �"� �11%�� �� � �,�������� � ���� �� �� ��� �� �� ���� $� �� ����� � ����� � �������� ��������� �� ������� �� ���� � � � � ����� ���� �������� ��� � �� ���� �" ���� �(��� �� �� ��� ���� � �� � ������ � ������ �� ������������� ����� �� ���� � $�� ������� �� �� ������������ �����" < ������ �,���� $�� ������ ������� �� �� ���� �� ���� �� ��� ����� � ������������� "< ��� �,���� $�� �� ����� ! ����

����� �� ������ ��2 1� � �� ���� �� ������� (�" 0� ��� � K��� ������ �� ��� $������� ��� �� ��� � �� ���� �� ��� ��� �$���� ����� � ��� �� �� �"%& �' �� �"� �' ������� ��� ����� �� " #� �������� $�� ���� �� ������ �� ���������� �������� �� ��� ����� � � ���� ��� �� �����"A���� � ������ ���� � �� ����� ! ����

��� �� �� �� ��� �+888 �� ,888/ �2 +�&� � ������ �� �� �� � ��� ���� ��� �� �������� �� �� ����������� � ���� � �" 7�� �������� �� $�� � �� �� ���� ���� �� �������� �� ����� ! ���� ����� �� ������ ��� �� �2" #�� �� ����� $� �� ��� $ �� �������� � $�� �� � ��� ���� � $�� ��� ���� ��� � ��� � ���"

������ ���-���� ���.��� ��� �������� �������� ��� �����

< - ������� �,���� � ������ �� �1���� �� �� �) �������� ���� �� ��� �����$� �$� �� ��� ��� �� ������� ���� ��$� �� �� ������ �� � ������ ���� ������������ � ���� ��" �B ��� �����" #� ������� ����� � �� � � � ����� � �� �������$� �� ����� $� �� �� ������ � � � ���� �� �� �� �$� ��� ������� �������� �� ������ �"2�� $ ����� �� �������� �� �� ������

� �������� ���� �� �,����" 2��� � � ��� ����� �� �� �������� �� � � ��� ���� �� ��������� ������ ���" .���� ��������� �� �� ����������� ������� ������� ��� �� ����� � ��� ������� ���� �� �� ������� ��������� ������� �� �� � ����� ���������� �� � $��-��;� ����� �� �� C���� L� ���� �� �"� �11)�"

������ �� ��� .����� ���������� �,����� ����� � ���� � ��������� ������" ��� ����������� ��$ ������ � �� � �� �����"6���� �� ���� $ �� �@<.0A3�#�>���� �� �11��� �@�.0A3�#�5������ �11)�� �� A����C;������ G ������� �1%%/ ��� � G����� � �11+�" ��� .������ � �� ���� �,���� ����� �� ��������� ���-��� ���������"

���� �� !� "#���$#$ ��� ��%

�� ����� �� �� �$� ��������� � <.L��=�>� $��� �11,� ����� � � ����� �� C�, 0�

����� $ �� � ����������(��� � �� �� ����� ���"% �' ��� ������ 0� ��� � �� ��� � 1"� �' �" @��� �� �� �� �� �� �� ��� �1* �� �� �����)* ������ �(��� �� � �" 3� � ��� �� ������� � � ������ �� �� $� $ ��� ���� � ��� ������� �� ���� �� � �������� � ����������������" � ������������ �� �(��� �� ������ �� �� �$� ���� �� � ����� � B ��� �"#� ������ �� �� �� ��� ��� �� �� ��� ���������� �� �$� ��� �� $ �� ��������� ������� ���� ��� �� �� �� � �������� ����� � �� � �"�������� �,���� �� ������ ��� �� ���

���� �� ��� � �� �� �� ���� �� �� ��� �� �������� �������� ������ ��� ��� ���� ���� � �� �� ���� � ����� �� �� ������ ����� � �� � �� �� (� � ����� �B ��� �����" #������� �� �,���� ���� �& ��� ���� � ���������� ���� �� ������� �� � �� � �� ���������� � ����� � B ��� C���" ���� ���� �� ��� � ����

� ��� ����� �� ���� � ������ � ������ ���� � ����� � �� �� ������ ����� � �� � ��B ��� C���� �� $�� �� ����� ������ � ������� � ������ ��� ��� ��� �� � ������"

����� ������������ ��� ��� ������������������ ��

�,���� ����� �� $�� ��� ���� �� �� ��������� $ �� ������� $� �� � � ������� " #���� ����� �� ��$��� �� ���� �� �� �������� � � �� ������ ����� � �� � � �� �,��������� � ��� ���� ��� ������ ����� � ���$� �����" 7�� �� ��� ����� � ��� ����� ������ � �� ������ ��$� ������� � �� �� ����� �� � ��� � �� C �� ��0+ ����� �� �� � ����� �� ������ ����� � ��� ��� � �������� �� 0�@ ������� ��� �������B ��� +�" #� ������ ���� ��� $���� �� ������� �� � �������� �� �� �� ��� ����� � ������ �� � �� ������� � ����� ���� �� ���� ����� � �� �� �$� ������� � ����� �� �4����

������ � .������������(��� �� ����� �� �,���� ��������" 3�� ��� �� �� ������ �� �� �� � �� �� �� ��� � !� �� �� �� � ��������� � �� � � �� ���- $ ���� ���� �- �M�"

������ � .����� ������ � �� �,����" 6���� �� ����� $ �� 6A�.� �= ������ �� �"� �11��" ��� 5��������� ������ �� ������ ����� �� �,���� �������� �������" ��� ���� �������� �� ��� � � ����� ��� � �� ���� ������ ��" ���� ������ ��� � ���$� � ���" ��� 2 ������ � ������ ����� �� ������ �� �,����" #� � ������� � ������ � � �� � �� ���� � ���-��� � $� �� �� ���� ������ ��� � ���"

�� �� �� .��������������� �������� ��$� ������� ���� �,����

.����� �������

0����� ����� � A� � ; ����� ��' ��

6����� ���+ C"+����C C"1#��,& C",�+"C#���C8 C")�+"C# ���8 +"8�+"+���,� +"&

6����� #��,& C"%�+"&���,, C"C��CC& C"%# ��,� C",�+"+#���C8 C",�C"1���,� C",�C"%

6���C� # ��,� C"��C"&��CC& C")�C"1#��C+& C"%�+"&

� A��� �� ������� � ������ ��$� �� �� �� �����"2 ���� ����� �� ��� ����"

��� ���� �� !� "#���$#$ ���

� ��� $ ������ ������ �� �� ��� ����������� �������� ��� ��� ��� � ����� �� ��� �� �� �� ��� �������� �� �� ���� ����� ������ ��� �� �" #� ����� �� ��������� ��� ��� �� � �9�98"1 ��� � ��� �� �� �� C������ �� " �������� �� � ��� � � ���� ���� ����$ �� �� �������� �� 18* ������� �� �� �8*������� $ ���� � �� � �� � �� ��� -� "B ���� � �� ������ �� � ��� �� ����� � ������� ���� �� � �� � ����� ���$� �� �D� �CC* ��,,* �� ���� �� �� ����� $� �� � � � ����� ��� �� ������ ����" =� ���� ����� ������ � �� � � � � �� �� ����� � ����������� �� � ��� � �� C" #�-� ������� ��� ��������� ��� ��� ���� �� ��� � ��� ����� � �� ��� ������ �� ������� �� ����� ���� �$� ������������ ������� �� ������ �������"#� ������ �� ������ ��� ���� ������� �� �� $ �� ���$�"3� �,����� �� ������ ��� � ���$ ��

��$� �$� �� �� �� ������ � � ���� ���� � �� � ���� �� �� #��C+&� # ��,�� #���C8� ��#��,& �B ��� &���� #��� ��� $� �� � � � ��� �� ����������� � ������" ����C� ���+� ����,8�# ���8� ��CC&� ���,,� �� ���,� �� �������� � �� �� � � �� � � �� ���� �� ������ � �������� $ �� �� � ���" � ��$��-

�� � ���� ���� ����� �� �� ������ ����� � � �� � ���� �� �� #��,&� #��,1� ���,%�����&1� 6����,� < ��,,� �� 6���%� �� �� ���� � �� �� �� ����C�@� �� # ��,��=�� ��

������ �� ��� � ��� ������ �� � ����� ���������� �� C"8� � �� ��� �� �� ���� ������� ��������" #� � ��� $�� �������� ���� �� � ���$�� � �� �� ���"

���� �� !� "#���$#$ ��� ��&

� � $��� ������� � ���$� � B ��� &��� ��#��� �".��� ���� � �� �� �� � � �� � �� �� ��

������ �� �,���� �������� �� �� ��� �������� ��� ����� �� �� ����� �� ������ �����

�� �� � 2 ���� ���� ��$� ������� ��� �,����� ��

2 ����

0����� ��� �� � ���� #�

6����� @�� �77

@�� �@� 6�

7@C <

6�@& 7@, 7

76����� @� 6�

6�@C 6�

7@, �

76���C� @� #�

�6�

@C #��7

@+ 77

@, # 7

� 3������������ � ���� ��� ��$� @C �� �� �� � �� ��

� � ��� ���� ���� ������� �� � �� ���,���� � � �� ���� ����� ����� ���� ��$� � $� �� � � �� �� ������ �B ��� &����" 3��� �,������������ �� ������� ��� ��� ������� ����� � ���� � ���� � ������ ��� $ ���� ���� �� $���� �� ���� ������� �� �������� � �� ������� �� ��-� ���� �� �$ ��������� $ �� �� ���� � � �� ������ ������"0����� $ �� ������� �� ������� � �� ���� ���,���� ���� ������ ��$�� �� ��� �� �� ����� �" #� ����� � ���� �� �� ����� �� < ��&�$� �� � ������ ����� �� ���� ������ ����������� �� ��� �� � ����� � ��� ����������� ��� ������ � ���� �� �� ����C ������,� ����� �� � � �,����" � � ���� ���� ����� � �������� �� �� ��C��1� ��������� � ����� �� � ������� ���� ��6���& ����� ����+ � �������� $� �� ����� ����� � ���� ��� $ �� ������ ���������� .���� � �������"

�������� �� ������ ��� ��������� ������� ������

=� � �� ����� ��� ���� �� ������� �� ����� ��� ���� � ���� �� �� �,���� $ �� �������� �& �0" �� � �������� ������ $�� � ���� $ ���� ��� ����� �� ������ ����� �� �� �& �0" ������� �� � ���� �� $�� ������ �� $ �� ������ ��� � �������� � � ��� �� ���� ��� ���� � �#������ �� �"� �11%�" # ���� �� �� �,����

������

���

; ����� ��' �

���C @ �"1,�"),�"1%

���C @ �")+��% @5� �",+

�",)��,, =N �",C���� @�� �",%

�"18�")&�")C

���� @C� �",%���, @5� �",���C� @�� �")+

�"%)���&1 =;� �"1)

C"��,& =5� C"8+��,% @;� �",+���� @C� �")+�,1 =5� �"1,��,% @;� �",C

�"1��")%�"%C

��,� = C"8,�")+

����� �� �� @� �� �� �4���� �� �"

������ �� �,���� ������ ����� � �� � �" #� ������� �� � ��� � ��$� � � �� $ �� �� ��� �� � �� �� ��� �� ��$���" ��� .��� �������� �� �� �� �,���� �� �� ���� ���� � ��� � � ������ � ������ ��� $ �� ��������� �� ����� � �� � � �� � �" ��� .��� �������� �� �� �� �,���� �� �� �� $��� ������� �������� ���� ���� �� ��$��- �� � ���� ���� ���� ��� � ��� $ �� ������ ����� � �� � � �� � �" ���.��� ���� �� �� ������� � �� �� �,���� ����� �� ������ ��� ������ ����� � �� � ��" ����$� �� �� �� ������ ���� ��� ������ � �� ��������� �� �� ���� � ����"

��� ���� �� !� "#���$#$ ���

$ �� ������� �� �� �& �0 $�� ������� ������ ��B ��� ,�� $� �� ����$ �� �� �� ��� �� ���������� ������ � �� ����� �� � � �� �� ��") � �8) ���� �+"1% -���D���� �� �C"& ���D��� >� ����� �� "

�������� ���������� �� ������������

�,���� � �� ���� ����� ����� ���� �" =�� �� ����� ����� � �� � ������ ���� �� �������� � ����� �� ��������� �� �� %& �0 �� �, � ���� � � ������� �O" B�� �� ;"5"�"������� �� �������" 3� ��������� ������ �������� ������ ���� ,& �0 �� � � � ���� � � ���

����� �6���� �� �"� �11)�" 3� ��� �� � ��� ������� ���� � � �� �,���� � � -� � �� ����� ��� �� �� �������� ���� �� �� ������� ��������� ��� �� ����� �� ���� � �� �� � - ��� � ���� �� �� ����� �� � ���� ���-��$��-� �� ����� � �� �� �� ����� ������ � �� �� � �� ��� �� �� ���� �".������ �� ��� �� ������ �� ��� � ���� ��

��� � ������ �� � ����������� � � � ���� �������! G A� �� �1)&/ 5����-� �11%�" ?� �� � ������ ����� �� C"1 �' � $ ��� ������� �� � �C����� �� �� �� �� � �,���� �� �� ����� �� ���� �� � ������" ?� �� 2��<?. ���;���� G#�������� �11+� $ �� �� ��� ����� ������� $

������ �� # ���� �� �� �,���� $ �� ������� �� �� �& �0" @� �� � ��� � �� ���$� ������ �2 ����� �����(����� ����� ��� ��� �� ����� ��� � �� ������� ����� $ �� �� ��� ���� ������ �� � � ����� � ���� ���� ����-� � ��" 3������ �2 ����� ��� � ���� �� �� �,���� $ �� ������ �� ���$� �� ��� �(����"

���� �� !� "#���$#$ ��� ��'

��� �� � �& � ���� ���� ��$� ������ �� ����� �� �� �� �,���� ������ ����� �� ���� � ���� ���� � ������" #�����,���� ����� �� ��� ��� ������� �� ����������" �� �������� �� �� �� ������� � ��� ���� �� � �� �,���� �������� � ����� �B ��� )"3� ��� �� ������ ���� �� ����� �� ���� �

�� �� � - ��� � ���� ���� �� ��� � �� � �� � ������� �� �� �� �� �� �� �� �� � �� ����������� ������ ��� ����� ����� �� ��������� �� � �� ���� �� ������$� �� �"� �1%)/ >��-� � �� �"��11%�" @�� �� �� ���� � �� �� �&")* �� ������������ � ��� � ������� ��� �� � ��� � �� �� ������ �� � � �� ���� �� �� = ��� � ������ ��" 3� � � ��� � ����� ���� ��+%��&+� ����� � ! � ���� � �� �� �� �� �� �� �� ���� �" 3� ��������� � � ��� �� �1 ���� � �� �� � �,���� �)",* �� ������ ������ � ��� ����� ��������� �� ���� �� �� ���� $ �� ���� � ������ ��� �� �$� ��� �� ���� �� �� � =��� � " #� ��+%��&1� ���� � �,���� � P��-� ���� � �� �� �� ��� � ��� �+, �� �,�� ������� �� ���� � �� ��� � ��� �+%� �+1� �� �&1"#�� ���� � �� �� ������� ��� ����������� �� ���� � ! �� ���� �� �� �� ���� �� �� � �� ����"3����� � ������� �� � ��� ���- �� �� � ���

���� � �� �� � �� ��� �� �� ���� � �� �������� �� ��4�� ��� ����� �� ������ ���� � � �;����� G 2����� �11%�" �,���� �� ����������� � C� �� �C 3� �� ��� ����� �� " 3�������� �� )1��,,�&1�1 ������ ����� � ����-������ ���� ��������" 3� �,����� �� ��� ������ � ��� �� �� �� ��������� C%��8�,+��,% �������" 3� � � ��� �� �,���� �������� ����� �� �$������� 3� �������� C8+�C���C�, �� �����C�� ��$�� �� �� ���� � ��$��- �� ����� � �� ���

�&%� �,,� �88� �&8� C,)� C&&� C,+� �18� C&� �� �,C�B ��� )�" � ����-��� � ������ � ����- $ �� �� �� �� �� ��� �� ��� ���� � !�� �� � ����� Q��)%� ��)C� #��,1� #��,&� �� ������ � �� ���� � ���� #���C8� ��� ��1� ��C�&� �� Q���++�B ��� %�"� ����� �� ���� �������� ���� �� ����������

����� ��� ��� ������ � ���� ��� ��� �� ����� ��� �� �� ������� �� �� �������� � �� ���� ������� � ��� ����� ��� � �� ����� �� ������ � !�� �� �� �,����" #� ��� � ������ ����������������� ��� �� �� �� �$� ���� �� ��� � ���" #� ������ ��� � ���� ��� �,���� ��� ������ �� �% �' C� $ �� �� ����� ����� �� ��� � �� �� ��� CC �' C" #� �$� ������ ��� � � ������� ��� ������ �� �& �� �, �' C� �� ���������� �� �� ��� � � � �� &+ �' C" �,���� ��� ������ �� &��&&C �' C �� � ������ ��� ���C�8++ �' �" #� �������� �� ����� ��� �������� +1�C�% �' C �� �C�C&� �' �� ����� �� " #� ����� �� �� �� � ���� ��� �� �� ���� � � ��� ��� ���$� ���� ��9 �,���� �� ������ ��� �� ������ �� 8"%% �� 8"18 � ���� ��� �� �� ������� �� " =� � �� ����� ����� � ����� � �� ��� ��� �� �� �� ����� � "����� � ���� �� ���� ����" =��� �� ����� �� �� �� �� �� �� ���� �� �� = ��� � �� ���� �� ���� �$� ���� ��� �,���� �� � �� ��� ���������" 0���(���� � $ � ��� �� � ������ � ���� �� ����� ���� � �� ������ �� �� ����� � � �� ��� ���� �" ���� 6��� ��� �� 0 � ���� ����� � �� �������� � ����� �� �� � ����� �� ����� ��� ��� �� ���� �� �� � ����������� �A����� �� �"� �11)�" .���� � ��� ��,���� ����� �� ������ �$ � �� ��� �� ����� �� �� �� ������ �,& �� C,� ����� �� �"������� �,���� ��� ���� ������� ����� $� ���� ����� ��� ������ �� �� � ��� � � �� � ��

������ �� .������ �� �� ��� �D ����� � �� ��$ �� � �� �,���� ��������" .������ �� �� ���$� ���� �� �� ����� �� ����� �� �� ��� � � �� ��� � � ���� 4� � � � ���� ���� �����" <�� � �� ����� � �� �� �� ���$� �� ��� ��� ���� �������"

������ �� � ���� ��� � ������ � ����- � ���,���� ��������" #� ���� � ��� � ���$� � ���"

��� ���� �� !� "#���$#$ ���

�������� �A�� ���� �� �"� �1%%/ A ������� G������� �1%+�� $���� ������ ��� ��� ��"#���� ��� � �� � ��� �� ���� �,���� ��� ����� ���� � ������ �� � � � ! �� ������� �������� � �� �� �� � �� ������� �������� � ����� ��"

$����

#� ������ ���� �� �,���� �� ������ ���� � � ���" #� ���� ������ ���� � � ���,���� � ���� � -� � �� � ���� ��� �� �� ��������� �� �� ��� �� � ������ � ������ �������� �� ����� � ������ ��� �� ����� ������� ������� ��� �� �� ����� �� ���� � �� �� � ��� - ��� � ���" #� � � ��� � �� ���� ������ ��$��� ����� � �� ��� ������ ����� � �� � ��" ���� ����� �� �� ������ ����� � �� � � � �� �� � � �������� �� ���� � ������� �� �� � � �� �� � ��� ����� � ����������� ����� �� ������ ����� � �� � � ���� ���� � ����� ����� �� ������� �� ����� ����������� �� ������ �� ����� ����� $�� ����� ��� �� �� �� ���� � �� ������ �� �� ��������"#�� �� �� ���� �$� ������� ��� ��� �� �

��������" @� ���� � � � � ���� �,���� ����! ��� � ������ � ���� ���� � �� ������ ������� ��� ������� ��" ������� �� � �,���� ��

��� ������ ��� ��������� �� � �� ������� ���� �� ����� ��� �� � ��� �� �� �� � �"#� � �� ����� �� ������� �������� ������ � ����� �" #� ��� �� �� �,���� ���� ���� ��� ������ $�� ������� �� �� �� ������� �� ;������� �30=� � ��������� ����" 0������ �� ������ � -��$� �� ����� � �����(���� � � �� ������� �� �� � ��� �� ��������� �" #� ���� ����� ����� �� ������ $ �� ���������������� $�� 1)* ���� ����� �� �� �������������" =�A �� �. ���������� ��$�� �� ���� ������������� ���� ��� ���$��� � ��� ���� �� � ����� �� ������ ����� � 8"& ���* �� ������� ��� ����� $ �� ��� � ��� �� ���������� �" =������ � ���� � ����� ����� �� �������� ����� � �� �� ����(���� ��� ��� $�� �� ������� � �� �� � ������ ����� ���

���� �� !� "#���$#$ ��� ���

����� �� ������ �� �� � ����� ��� ��� �� ��������� �� ���� �� ���� �� ��� ���� � �� � �� ����� ���� ��" 3� �� � ���� ��$��� � � ���������� �� ���� ����� ���� � �� �,���� ��� �������� �� ���� ��� ������ ����� � �� ������ ��� � �� �� ������� �� ���� ����� ��� ����� � ������ ������" ������ $�� �� � ��888��������� ���� �� �� ��� ��� �� ��� $�� ������� ����� ������� �� ����� �� � � ��� �� ����� ���� ���� �" 7 $��� � - �� ����� ! ���� � $�� ��� ������ �� � �� ������ ��� ���� ���� � � ��� �� �� ����� ! �� �������$� �� ������ ��������� �� �� �� ���� �� � ������� �� �,���� �� �� ��� �� ���� �� �� ������� � ������ �� ��� ���� �� �� �� �����(��� ��� ���� �� �� �� � � ����" @�� ����������� ��� � !������ �� ������������� ������ �� ���� $ ����� � ����� �� �,�������� $�� ���� ����� �� �� � ���"0��������� � �� � � �� �� ������� �� ��

�,���� ������ �� �� �� � � �� �� �� ���������� � �� ������" 3� ���� ����� �� ����� � ���$ �� ��$� �$� �� �� �� � ������� � �� �� �� � �� � ��� � �� � ������ �� � ���� ���� �B ��� &�" � ��� - �� ����� ����� ��$��� $�� �� ����� �� �� �,������������ �� ����� � ������$ �� ���� �� �� �������������� �� ������"#� ��� �� ������ ����� � �� �� �� �������� �� � ������ $ �� ������ ��������� ���� � � ������ ����� � �� �� �� �������� �� � �� �,���� ������� � $� �� ����� �� � �� � ��������� � �� ���� ���� �� � � �� � � ��$�� �� ��� �� �� ����� � �B ��� &�" #� � �������� �� �� ��� � ����� � �� ������ ����� �� �������� �� �� � � �� �����1� ����� ����� �� � �� �$�� ��� �� �� �� $��� ����� $� �� ��������� � ���� �� ������ � ���� ������� �� ���� �" �� � ������ ��� ��� � ����� � ��� �� ������� �� ���� � ���� �� ������� ��� $ �� �,����" 3� ��������� �� ��� ��������� ����� � �� �� ������� �� ��-� ����� �� �$ �������� $ �� ������� �� ��� � ������ �� K��� �������� �� �� �������L� ���� �� �"� �11)�"#� (� � �� �� � � �� �������� �� ��

�,������������ �� ������ ��") � �8) ���� � �8� �� ����� ���� ���� �� �� �������������� �������� ��"C � �8, ���� �#������ �� �"� �11%��$� �� � ��� ����� � �� � � ��� �� �� ��������$� ���" 3� � � -� ���� � ��� � � �� � ��(� ���� ��� � ����� � ����� � �� �� ���������� �� �� ��������� � � �# ,������� �� �� ��� ��� ��������" @� �� ���� ���� ������� �� ��� ������ ����� � �� � � �� �,���� ��� ����� ���� ������ �� �� ������� $���� ������� �� ����� � ��� ���� ��� �� �B ��� &�" #�� ������ ������ ���� �,���� ���� �� P� �� �� ������� �� �� ���� ���� �� (� �� �� �� ��$� �� ��� �� ���� ����� �� ������ � � �� �� ��$�� �� ���� ����" 3� �� �� ����� � � ������� ��� �� � �� ������

������ �� �� ����� ��� � ���� � �� � ������� �� � � �� �� � �� ��� � - � II���- ��- JJ ���� � ������ ���� �� ����� � ��������������� �� � $� �� �� ���� � ����� ����� ������ � ���" #� ��� P� � � � �� �,������ ����� ��� �� �� ��������� � � " 3� � ����$���� ��� �� �� ���� �,���� �������������� ����� � ����� �� ������� ��� ��� - �������� ���� ���� �� �� �� � ��� � � $� �� �� � � ������� ��� ��� �� ������ �6�� �� �� �"��11��"7� � �� � ������� �� $�� � ������� ��� $

���� ���� �� ���� � �������� �� �� ������ ����� - @AB � �# ,������� �?��� ����� ���� 3; �� �,�,8�+� ��� �� ������� �� ����� ! � ������ $ �� ������� � �� ����� �� 7������ 7�� �?� ��� � �� >�������!� 6���� �" �� ����� ����� ���(��� �� �� � ���� � � �� ��� $ �� 1�������� ����� $ $ �� �� �� ��� ����� �� �� ���� �� ��� ������ ��" �� ������ �� ���� ����� �� �� �� ���� ��� �� ��� ����$ �� ����$ ��� ������� ��� ���� �� ��������� � � 7�� �� ���$��-��" #� ��������� �� �� ���� � � �� � � ��� �� �� ��� �������� �� �,����� ��� ��� �� �� ���� ����� � �� ����� ������ � �� ��� � �� ���� ���� �� �� ��� � � ��� ������ ��������� �����" #� ������� � �� � � �� 1����������� ��������� �� ��������� � ����� ���������� �� ������� �7" 7�� �� �"� ������������� ��� ���" @�� ��� � ��� ����� ��� ���� � � ��� ���� �,���� �� ��� � � �������� �� �� �������� �� �� ���� � ������� ������� ���� � � �� �� ������� $��� ���� ������ ��� ���� ����������" ����� �����,���� �� 1����� �� ���� � �# ,�������� � � ��� ��� �� ����� ���� �� ������D������������ � �� �� ���������� �� �� ����� � ���� ��������� �� � ��� �� �������� � �� ������ ����� ���� ��� � �$� ������ � ���� � �� � ����� ��" #� ����� �� 1����� ��# ,������� �� � ���� � � � ������ ��������� ��� � ���� �� ���� � � �111�� $� �� ������� ����$ �� ��� � ��� �� ���� ��� ������ � ����� ��$�� ����� �� ��������� �"A���-��� � ������� �,����� �� 1����� ���

��� ���� ��� � ������ � ������ �� �� � �������� � ������ ���� �� ��� ����� ��� �� ������� � ��� ���� �� � ����� � �� � ��B ��� +��� �� ��� ��� ���$��" #��� ���� �� � ����� ��� ����� �� ��� �� ���� � �� �� � �� �� ��������" #� �� � �� ��� � ��������� ����� ������������ � ������ � � ���� �� ����� � ��� ������� ��� �� � ���� �� ���� ���������� ���� � ������ � ����� �� ��� ��� ����� �� ������ ���� ���� �� � ��� -� ��� � �� �� ��" ������ �� � ���� �� �� ����������� ���� � ������� ������� ! ���� �� ������� �� � �" 3� � ��� � ��� ���� �� ���� ��� �� ����� �� �� �� �� ����� ��� ��� � �� � �� �� �������� �� �� � ���� ��� ��� � � �� "�"�"

��� ���� �� !� "#���$#$ ���

3����� ��� � �� ��� ���� ������ ������� � ������ ��� 1������� � ����� �1� ����� �� � ��������� �� � �� ����� ��� � ������ �� � ��� �� ���� �� ������ �7������� �� �"��888�� ������ �� ���� ��� � � ����� �� ������������ � � ��� � ��$� 1� ��� �������� ���� ��$� 1� ��� �� �,���� ��1�����" #� � � �� �� ���� ������ �� �������� �� �� ������ �� 1� ��� � ������ � ������� �� � �� �� ��� � � ����� �������#������ �� �#� �11%/ 7������� �� �#� �888�" 3���������� �� ������ ������ ���� �������� �� � � �� �� ������ �� �,���� �� ����� ���������� �B ��� , �� ��� ��� ���$��� $������ � � �� �� ������� �� $�� � � ������� �" ���� � � �� �� � � �� ����� � ���� ������ � ���� �� � ���� ������ ���� �� ����� ���� � ��" � ���� ������� �� �� �� ����� ��� ���� �,����������� ��� ������ ��� �(� �� �� ����� ��� � $� �� $ �� � ��� � ��$��"7 �� ������ �� �� ���� � � �������� �� ��� ������ ���� �� �,���� � ��� �� ���� ! ����������� ���� ������ ���� �������� � ���� � ��"

������� ��� ������

/����� ����������

#� ��������� �>�%88� �� @AB ��� �� �� ����� ��,���� �?��� �� ���� 3; �� �)%%1%�� $�� ���� ����� ���� � ;=� � �0A $ �� �� ��� �5�+)��&��00#000�#�#6����#06��6��66����6##6##�###660�#60��#6�C�� �� �5�+)C �&��0�600#66�#00�##�#00##60�#6##6##��66�###0##6�C��" #� �0A ������ $�� ��� $ �� � �23 �����3� �� ��� � ��� $ �� �� � �23D���3 ����� ���-���� �� �����0�� �=$ 5����� � ������ ���� � ���"#� ������ �(��� �� �� ���� $�� �� ���� ������ "

������ ��-����

�>�%88 $�� ������ ��� �# ���� 0#�+ ����� $� ��� ��� ����� �� ������� ��� �.���P� �� �"��11+�" #� ���� ���� ����� � �;01&� �0����� �� �"��11,�� � ����� ���� ����� ��� �� ��������� �������� �A=� ��� �6� �� �66 ����� � �*�" 0������� � � ��� ������ ����� ����� $� ���$� �� �������� �� � <� ����� �� ���� �1)�� �������� $ ���88 ��D�� ��� � �� � �� C8 ��D�� ���������� ��� ��C) �0" #� ������� ������ $�� ��� ,,���� � ����� � �� �� ���$� � ���-�P��-� �� � �������� �+,88 8"&�8")�� �� $� �� � � 3�#6 $�� � �� ����� ��������� �� �� � ��" ���� ��� �� ���� �������� ���� $� ����� � ���� ����� �� �� ���!� ���%8 �0"

������ -��������

������ ���� �8 � �� $� ��� ���� $�� ������ � �88 �� �� �8 �� #� ��20� ��2 )"+�� �88 �� =�0�"O��� �� �� �� � � �� ��� � ��� �������� � P��� ���.B�� 5;#�� �� ��!�� � $� � �� �� ���� �"& ��� ����� �� " #� ���� $� � � � ��� ���� �� �.�� �� �� ���� ��� Q ������� �D�II .�8%1,

����� � &8 �� �� (���� ��� +& ����� �� � ��$� ��� ��,&*" #� ��� ��� �� $�� ���� ��� � �� $ �� �$ ��� �� �� �� ����� � � ���� ��-� � �� ��$��� ������ -� � ���" ��� �� �� � � �. ���� �C�+C� $����� � �� 8"�*� �� �� � ��� $�� ������ �� ���� � @�-� � ���� �=����� C��+�88&8� �� ���� ��� � �� .��,88 ����� �� C)�888 � ��� �� � ����" .�� ����� �� ������ $�� � �� �� ���������� ���� �� � �� C&* ������� ��" @�� �� ���� �� �������� ����� $�� ���� � � ���� ����� �� ��� �� ������" =��� ��� ����� �� ������ $�� � �� ������������ �� �� �� � �� )&* ������� ��" ���� �& � ����� �� �� �� ��� � ��� $�� ����� � ���� ������ ��� �� ����� �� ������ � �88 �� �� �8 ��#� � ��2 )"+�� �88 �� =�0�" #� ����� �� $�� ���� ���� � � ���� ����� �� �� ��� ���� ������� � 8"+&�� ���� �� �� �� ������������� "

#� ����� $�� ��� ���� �� �� �� ��� �������& �� � �� ��� �� ����=5�� K>�&8� ������� ���$��� $ �� � � �� �8 �� #� ��20� ��2 )",�� �88 ��=�0�� � �� 5;#�� �� ��� $ �� �8 �� �������30= � ���� ����� � ��������� ����" B����� ��� ����� �� �� �� � �������� ���� �� �,���� $�� �������� �� � � ������ � ������ �� ������������� ".�� ����� �� ������ $�� � �� �"8 �� �� ����� ����� $�� ���� ���� ���� �� � �� � ��� ��.������ ������ ��", �� � �8 ��� ������� ��" #� ������� $�� $��� $ �� ��� ������ �� �"8 ������ �� ������� C8 �� �� �� �������� ��2 ,"��"�,���� $�� ��� ���� �� ������ $ �� 8"% ������ �� ������� C8 �� �� �� �������� ��2 ,"��"

#� ����� � ������ �,����� ���� �� ��� ���� � ������������� ������ �� ���� � $�� �� ! ��8 �� �� �� ����� ��2 &"��� �� ��� ��� ���� �� �� �� �� ���� �$� �� � � ���� ���� ������������ �� ���� ���� ���� � �� ����� � $�� ��� ������ ���� &"& �" ; �� ���� ��� �;##� $�� ��� � ��� �� �� ����� �� $�� ��� �� ���� ����������� ��� � �" ;������� �� $�� ������ � �� �������� ��� ��� �� ��� $��� �� ���� �������� � ������ ������ ������� �� �� �� ���� �" #� ���� ��$�� ��� ��������� � ����������� �� � � �� �� ������ ���� �� ���� � �"& �� �� (���� �� � ����- ����� ���� �� ������� �6��&.B .����� &��� 2 ����;���� ��� ������� �� �� �� � ���� �� ����� �� �8 ���� �� ����� ��2 &"+�� &"& � ���� � �� �� �� ������ � P�$���� �� � ��D� ��� �� ���� ��������" #����� � ��- $�� ������ ��� ��� ���� ����� ���� ��� ���� ��"

���� � ���� �� $�� ���� ��� �� � ��� ����- $ ���� � ��� �������� �� &8 �0" #� ����� �� ���������� �� �� ���� � $�� �"& ��D��" � �"& �� �� (��� �� ������ � ����� �� $�� � �� � ���� �, �� � ��& ������� ��� �� ������ �� &8 �0 ��� �� � ����" ; ��� !� ���� $��� $�� (� � ���� �� �� � ����������� �� ���� �8 � ���� ���� ��" #� � � �� ���� ���& �� �� &8 �0 $��� $�� ���$� � �� �� ������������� �� $ �� � ������ �� �� ��" #� ��� ���� � ������ �� $�� ������ ��� �8��& � ���� �� &8 �0 ���������� % �� �� &8 �0 $��� $�� � �� �� ��� $������$ �� ���� ���$� �� ���� ��������" #����� ���� � $�� ��������� �� 8"& ��D�� �� ��� ! ��� ��� $��� �� ���� �������� �� ���� �� �� ��� �� �� ����" A����� �� �� � ��� $�� ������� � ����� ��� � ��� ���� �� � ������ �� ���� ���� � �� �� ��� �� �"

#� ���� �,���� $�� �4��� �� �& �� #� ��20� ��2 )"+�� �& �� =�0�� �� ������ ���� � ��

���� �� !� "#���$#$ ��� ���

��� ��������� �� � ������ � � ������� �� ���$�� � �� ��� �� ����������� ���� �������� �� ��� ����" ���� C8 � ���� �� ���� ���������� �� � ���� �� $�� ���� �� � ����L ��������", �� � ,8 ��� ������� �� �� � � ��� ��� �� �����& �� �� )&8 �� =�0� � �8 �� #� � ��2 )"+� $������ " #� ��- ����� ��� $� ��� �4��� �� �"& ������ �� ������ �� ���� �� �� % �� ������ ��.���� 3.@ 230 �� � ��", �� � + ��� 2A�,D&� �������� ��" ?� �� �� ��� ����� �� ����� ��� � ���� ����� ��� � ������ ��� � ��� �� �� �"8 � �� 8"& ������ �� ������ ��2 ,"�� C8 �� �� �� ���������$�� ��� � �C ������ ������� �����$ � �� ������������ �� 8"& � ����� �� ������ �� ��� ���,����" #� ���� � ���� � � �� � $� �� �� ������� ���� ��� ����� � ��������� �.� $ �� � ������ �� �� ��������" �� �� �� ������ � �� ���� � � ��� ���� �� �� �� �� � ��� !�� ��"

0������'����

.���� ��-�� � ��2 %�1�� � ������� ��"8��"+ ������ �� ������� �� ����� !�� �� ��� � ��� $����� ��� ������ �� �,���� $ �� ������� �� ���������� �� �� � ���������� � �������� �O����� - G> �� �11��" �� ���� � �� $ ������� �� � ����� �� �� � � $�� ����� � ������� �� �� �� ���� �$�� �� ��� � � � ����� �� ����� � �� �8 �� �������" 2�$��� ���� �� �������� $�� ���� �� ����� ���� ���� �� � ��� $�� ������� ������� ���$ ����� �� ���� �� � � �� �� ������ $�� ��������� ��� �� ����� !�� ��" 3� ��� ����� �� �� �����$� ���������� � �� ���� $� �� ����� $ �� ��$� �� ���� � �" ; ������ ���(��� � �� ����� $����� � � ���� ������ (� � ���� �� �� , ��D������ �������� ��� ������ � � $ �� �� (�������� �� ����� � ����� �� ��� ��� �"+ � ����� ��������� 8"� � � � � ��2 1"8�� 8"�* ��D�� ����������������" 0� ����� ����� $ �� � �$� �� ���� � ��� ���� �� ����� � ! ��8"& �� � 8"C �� � 8"C �� � �$� $-�"

3� ��������� �� ������ ������ ������ ���� ��� ����� ! � �� ���� �� �� �� � ��� ���� C8*�$D�� �56 +888 ��2 &"8� �� ���� � � �� �� ����������2 +"8�" 3� �� � �������� ���� � $�� ������ $ ��& �� ������� ��� ��� �� ����� �� �� ������ ���� ����� � ��� �� ��� ��� � ��� �� ���� � ������� �� �������� ���� �"

�� �� � .��� �� �� �� ��� ������ �� �� �������� ����� ��

=�� �

���� ��' � ��1"8)� ,%"&)� ,�"�,A����� �� ��' � �88��"%&0�������� �*� 1�"%%S�� �*� %8A����� +"&?� (� ����� ��� +��1%C�D�� �8"8% ��� �*� &"C � ��� �D��� � �*� �=���� �� � �� ����� �� ��$� �B ��� �� �� � 8"+C�

� ���� � ��� �� �� C"8 �' ������ ��� ���� �� � �� ���� ��"

$��� ���������# �������� ��� �������� ������

� � ��� �� ���� �� �� �,���� ������� ����� ��8"C �� � 8"� �� � 8"� ��� $�� ���� � ��������= � �� ����� � � ���������� ����� �� P�������!� � � �� ��� � � ����� ����� �@���� 0� ������� ���88 >" K��� ������ �� $�� ���� �� �� � ��A�C+& ��� ���� ����� �� � A ��-� K��� �������" #��� ���� ����� �� ���� ����� �������" � �� ������������� ����� �� �88 �� �� �� ������ � � �� ,8� ����D�� $� �� �� ������ ��� ��� 18 � �8"�& � ��� ���� ���" #� ��� $� ��� �� ������ �� 2>< ����$�� �@�$ ��$�- G � ���� �11)� ��#��� C ��� �� �� �� ��� ������ �� �� ������ ���"

�� ������ �� ���� �� �������� � �������� ���������� �� �� ���� �� ���������� �� ������������� �� ������� $�� �����������" #������ ��� ����� � ��� �� $� ����� � ���- �� �� �,������ ����� � ��� �� �� ����� � (��� ����� � �� �"� ������ �� ������� �88 �� � � � ��2 1"8�� �� � ���� �� ��� ����� �����" #$� � ��� �� $� ��9�2�@�� ����- ��� +8 � ����� �� >+��3, ����-��� �& � �����" ;� ��� � ��� ������ �� �������$� �� ��� �� ��� �� ��� � �� ����/ � ������ �� �� � #��� C"

#� ��� ������ $� ����� � ���������� ����������� �������� ����� �������� $ �� �� �������0=. ����R��� �� �"� �11%�� �� �� � �� �� �� �������� .@<Q5 �#�$ �� �� G ���!�� �111�" #$��� ��� � ����������D��������� ���� �� �� ����� � ����� �� C"8 �' $�� ������ $ �� 0=.�#��� C� �� $�� �����$ � �� � �� ���� ���� �� �� ��� �������" �� �� � �� ��� ���� ����� ������� �� � $�� ����� ��� �� ���� � ������ �������� ��������� ����� $� ����� � � �� � �������� �� � ���"

����� ������ ��� ���������

#� ���� ��� �� �� ���� � $�� ������� �� �� ����� ������ �� � �� �� �� ������� @ �O��� �� �"��11��" .���� � ��� �� � ����� ����� �� $������� $ �� 0=.� ���� $� �� ��� ������ ������$�� ������ �� �� .����1) �6" �" .��� �- ��11)�?� ��� � �� 6���� ���/ .��� �- G .��� �� �11)�"� ����� �� C%8 �� �� �� �� �� $� �� �� �� ������ 0���� ��� �� � � �� � $�� ��� ����� � ���� � � ���� � -� � �� �����"

�2�@�� >+��3,

��%"��� ,1"+C� ,�"�� �C8"C8� ,%"�8� ,�"�C�88��"� �88��"�1�"& 1,"8%& %CC"% +"�

�,��11 �)�+8)�)"% �8",1"� �8"��1"C ��"�

� ������ � � $�- � ������ � � $�-8"&, 8"1C8"� 8"C

�� ���� �� !� "#���$#$ ���

#� ������ �� � � �� ������� � �� � � ����� $ �� ������ � ������ � ���� ��� � ����� �� ���� � �� � B ��� +" �� �� � �� ��� �$�� ������� ���� ��� ;������� ����� � ��� $������ �� �� � �" #�� ������ ����� �� �� $��� �� ��� �� �� � � �� �� ���� ���� ���� 2 ��?��>� $�� G O���� �11%�� �� $� ��� ������� " #� ����� � �� �� ���� �� � �� � $�� �� �� �� ���� ��$� � �� � ��������� ���� � �� ������� �� � $�� ����� ��� ����" ; ���� ����� ��� �� ��������� $� ��� $ �� �� ��� �� �� ��������� � ����� � �� �� � " 0����� ��� � ��� ��� C $� �� �� �� � ������" 0 �� � CC �� ������� ������� �� ���� �� � ��������������� ���0 ��.�.�02��02��@2" �� ������� �� �� � $�� �� �� ��� �� �� � �� �� ���� ���� ���� 2 ��?��>� $�� G O���� �11%�" �� �� ���� ���� �� �� �������� C%, ������ ������� $� � �� �� ����������� �� ����� �� � �� ������ ���� � � �� �� �"� ������ �� ������ �� �� � � �� � #��� +"

5��������� � �� � ������ � � ����� $� ������� �� �� ������� 6A�.� �= ������ �� �"� �11��" #���� �� �� ��� � � ������ �� ��������� �� � $��������� $�� �����-� �� �� Q@3;@@ �>� $�� GO���� �11+� $ �� ����� ��� ���" 3� ���� ����� ��� ��� $�� ���� � �� �������� ���" #� ����� ��� ���� ���� $�� �������� �� �� 2��<?.���;���� G #�������� �11+�" @�� ���� ������ �� ���� ��� �� $�� ���� �"

)�������� ������� ����������

< ������ ������ �,���� $�� �� ! ��� ������ ������ �� �88 ������ �� �& �� #� ��20���2 )"&�� C8 �� =�0�" #� ���� � ��������� �� $���4��� �� 8"8& ��� �� �� ��� � �� �� ��� �� ���������� �� �%8 ��� ����� �� � (���� ��� � �� �� �� ���� � �" �� �� (��� �� �� � ����� �� $�� ���� ����� ��� �� �"+1�& �� ������ �� � � ���0�� Q��3#0����� ��� �� ����$ �� (� � ���� �� �& �0" #� ����� � $�� � ���� ��& �4�� ��� �� �8 ��� $ �� �� �������� ����� � �� 8"C& �� ������ ���" #� ���� ���� ��� $� ������ �� +8 �0 �� �� )& �0 ���� ������$�� �� ������ ���� � � �� �� ������ �� �,����$�� ��� ���- � �� ���� ���� �� �2 ������ �� ����� �� !�� �� �� ���� ����� ��������" #� �������� ������� �� �� � �� � ���� �� �� ��� �. �������� � ��� ���� $� �� ���� � ��� (��� � ���� �������� ���� $�� �� ��� ���� � ������������� � ������ � =�A �� ���� ������������� ���� ������$��" � � ����� � � � �� ��� � �� @� � � Q3����$�� ���-�� �� ���0�� 3��"� $�� �� �� ���� �

�� �� �� .��� �� �� �� �� ������

��� �*� �1", S+� �*� �%"+ �� �*�� ��"1;���D������� +"�A���������� ����� �*� 1+A���������� ����$ �*� ,��� ��� ������ ��' � 8"8)��� ��� ����� ��"� �"�

� AP�� ��� ��� �� $� � ������ ���� &* ���&C� ���� $��- �� �����"

����� ��� � �������� ���� �� ��� �����������"

������ $��� ��� ������ ������

#� ���� ���� �� �������� ������� $� ��� �$ �� �� A0.� ���� � ;��� ���- ������ �� �"� �888���� ����� �� �� �5<O "

�� ��.��������

�"5" �������� ��-��$��� � 0���� A�����#�� � �� �$�� ���� =32" 7 ����- ;� O��� �; A�� �� � �?� ��� � �� ��� ���� ��� �� - � � �� ���# ,������� ���� � ;=�� ;� .�� #������ ��� ���$ �� �� 3#0 ��� ����� ;� #� 6��!�! ��- ������� � �(��� �� �� �� �� �� ���� � �� ��������� ��� ���� ��� �� ��� ������ �� ��� �������� � �� ������������� 0� ����������� <�������� ���� ��� ;� ������ 7���$�� ��� �� � ��������� ���������� ������� �� �� ������� ��"�?. 6�������

���������

������ ;" G ������� 7" B" ��1%%�" � ���� ����� ������ ��� �� �������� �� ������ � �����" 3# ���#4� ��# �� ��1���8"

������ 2" �"� 7������-� O"� B��� N"� 6 �� ���� 6"������ #" ="� 7 �� �� 2"� .� � ����� 3" =" G������ �" 5" ��888�" #� ���� � ;��� ���-" ����#+���� ��# �� �C&��+�"

���R���� �" #"� ����� �" ;"� 0���� 6" �"� ;<����7" <"� 6���� �"� 6�����>������� A" 7"� O ���� O" ."�>��!$�- � O"� = ���� �"� ������ =" ."� A�� A" O"�A �� <" �"� . ������� #" G 7����� 6" <" ��11%�"0� ����������� �� =�A � ���9 � �$ ����$���� � ��� ������������� �������� ��� ��� ��"+�� ����� ���# ����# !� ��� 18&�1��"

0������ #" <"� .����� A" ;" G @��� #" ��11,�" 2 ������ � � ��������� �� �� � � � ��� ��� � � ���6� ����� � � ��� �� ���� � ����� ����������� ����" 3# ���# ����� �� +8)�+��"

0����� O" �" ��11%�" 5����� ���� ���� ���� �� �������0 �����������" ������� ��5����# �� �8����,"

;������ �" O" G 2����� ;" 7" ��11%�" .�������� ������ �� �� ���� � � �� �! �� ���� �� ������"1����� ���������# �� C8)�C�+"

5������� �"� 5���� A"� 2������� 5"� ����� 7" G.�������� �" ��11%�" #� ��0 ������ ����������"���# ���������# �� ,%&�,1+"

5����-� �" 2" ��11%�" #� ���� � � �� ���� �� �� �� � �����������9 ��� ��� ��� ��� � ��������� � ����� ��" 3# ���# ����# ��� +%1�&8�"

5������ A" �" ��11)�" �� ���� �� �� � ��� �� �����.�� �� ���� ����� ����� ����� ����� ������� � � �" 3# ���# 4� ��# ��� �C���C+"

6����� 0"� .���� �" ="� .$�� ������� 0" �"� .���� �� �"G Q������4��� A" ��11)�" #���� ��� � ��������� !�� �� �� �� ���� ��� �$������ ����� ���� ������ � � �� ���� �� � ���� �$����� ����� �" ������������� �� &8�8�&8�%"

6����� >" 2"� N����� K"� 6�� ��� >" G >� � <" ��11%�".���� �� =�A ��� � �� � +��-;� ���������� ���������� � � �� ���� �D��� ������ � ������9

���� �� !� "#���$#$ ��� ��%

��� ��� �� �� ��� ������ �� ���� � �" 3# +�#����# ��� ��� ��)C%���)+%"

6�� ��� >"� 7 �� ���� �" 6"� ������ O" 6"� ��� ����� 2"G 7���� ;" 5" ��11��" #� � �� =�A ����������� �� � ��� � � �� �� �������� � ������ �" ������������� �� &&�+�&&C�"

2���� O" �"� 6�� ��� >" G = -� �� 2" ��11)��" #$���� �� � ��� � � �� � �������� � �� ���� ��� ���������� ����" 0������ �� $ �� �� �������� ��� ���� �� �� �������� �� � � �� ���� �" 3# ����#����# �� �),8&��),81"

2���� O" �"� #���� ������ #" 5"� < �� O"� .� �� T"�>" G= -� �� 2" ��11)��" #$� ��� �� � ��� � � �� � �������� � �� ���� � �� ���������� ����"5������ ��������� � ������� ��� �� � ���� ��� ������ ��������� ���� ������ � � �� ��� �� � ���� ��" 3# ����# ����# �� �),�8��),�+"

2���� O" �"� 6������ �" >"� 0��� O" G = -� �� 2"��11)��" #$� ��� �� � ��� � � �� � �������� � �� ���� � �� ���������� ����" B���� ���� � ��� ����� � ��� � ���������" 3# ����# ����# ���),�&��),��"

2 �� ��� 0" B" ��11��" ��0 �����������9 ���� � ��������� ��� �� ���" +���# �"# ���� ����# �� ,)���C"

2�������� A"� K�� �� >" �"� .������ 2"� ; A��� ��� O"�>�������� �" G ����� 7" ��11%�" ������� � � ������ ������ ��0 ����������9 �������� ��� ���� ��� ���� � � �� �� �������D������ ���������� � ��� �� �� � ��������� � � �������1����������� ����� ���" 3# � �������# ���� ,%8�,%1"

O����� -� O" G > �� ." 2" ��11��" .���� ���� � ����� ��9� ���� �� ���� ��� �� ����� !�� �� �� ���� ��"3# +���# ����� ���# �� +81�+��"

O���� #" �"� N��� O" T"� 0�$��� ." 7" G >4������ �"��11��" 3����� ����� ��� �� � �� ���� ����� � ������ �� � ���� �� �� ����� �� ������� � ��� ����" +�� ����� ���# ����# +� �����8���1"

>� $��� 6" O" ��11,�" ?� �� ������ ����������� �� ���� � ���� � �������� ������" +�� ����� ���# ����# !� �� %+��%&)"

>� $��� 6" O" G O���� #" �" ��11+�" ;��� ��� � ���� ��� �������� �� ���� �� ��� � � � �������������� ���������" +�� ����� ���# ����# !� ����)%��%&"

>� $��� 6" O" G O���� #" �" ��11%�" ;������� � ����� � �� ����������� " +�� ����� ���# ����# !� ������1���C�"

>��-� �� T"� >����6 ������ �" O"� ���!� �"� ��� �� @"������ �� T" G B����$� B" ��11%�" =�;����������� �� ������� � �������9 �� ���� ������������������� � �� �� �������� ��� �� � �� ���;2� �� ����������� ���6�������� �� 1����� � ����� ���� �������" 3# ���# ����# ��� 1,)�1%�"

>���� �� �" O" ��11��" �@<.0A3�#9 � ������� �� ��������� �� � �� ������ � ����� �� ���� � ����������" 3# +���# ����� ���# �� 1+,�1&8"

���� ���� �"� .��� �� 7"� 2������� �"� .���� ��� O" 0"G L� ����� B" �" ��118�" ������� � �� �� ����� �� �� ������ �� � �� �� �� �� ����� ������� � � �� ���� � ���� �# ����" ���������� ��C1)�+8�"

�����$�� �" 7"� = �������� 2" G ��-��� 7" O" ��1%)�"5����� ���� � ��������� � � ���� � �� �������� ��� ���� ���� �� ����� �� ����� ��"����# � �� +� �# ��# *+� ��� ,,,C�,,,)"

��;����� 3" >" G #�������� O" �" ��11+�" .�� �� ��� ���� ��� �� ����� �� � ���� ��" 3# ���# ����#�� )))�)1C"

��� �� 5" �" G ����� � �" 5" �" ��11+�" A����C; ���� �� �"89 � ������� ��� �������� �� � ������������� ��" +�� ����� ���# ����# !� ��� %,1�%)C"

� ���� O" 2" ��1)��" �%��������� �� ������� � 4��������0�� .�� �� 2����� <�������� ����� 0�� .�� ��2������ =T"

= ������� �"� .����� >" �" G 2�� �� �" ��11��" ���� ���� �� �� ����� �� ��9 �� ���� ���� �� ������ ���� ����� ��� � ������ � �� � ���������"��������/ �����# �����# 4����# ��� �%���1,"

=���-���� � Q" G 3������ >" ��11)�" #���� ��� ���� ������ � � �� ���� � ����� ��" ������� ��# ���+���+,"

@�$ ��$�- � N" G � ���� 7" ��11)�" ������ �� �� K��� ������ �� ��� ������ � ��� ���� �� ��"������� ��5����# ���� C8)�C�,"

��� � � 5" ��111�" 3� � � � �� ������ �� �� �� � �H������� ��� �C8&��C8)"

����!� �" B" G A� �� 2" ��1)&�" .������ ��� ��� � ����� ���� � � � ����� �� ����� �� �� � ��������� � ��" � ����� ��� �&,��&1"

L� ����� B" �"� .���� ��� O" 0" G A����� <" 5" ��11)�"5���� � ������ �� � ��� �� ��������� � � ������ � � ��������� �� ��������� �� �� ��������� � ���������D��������� ������" ����������� 11)��8�&"

A �������� O" G ������� B" ��1%+�" ��� ���� �� � ��� ��� ��� �� ���������� � ���� ������ �������� ������ � ��� ���� � �� �� �� �������������� � �� ������" +� �# �������# ��� ++��++%"

A�� ����� ;" A"� 7����� =" A" G 0������ ;" 2" ��1%%�"2�� ������ �� ����� ����� #+ �� �C ������������ �$� ��� � ��� ���� �� � ���� ���� ��" 3# 7����# �� �)�C��)�1"

A������ A" O" �"� B������� O" �" 0"� 2����� ;" 7"�;������ �" O" G #� ���� 6" <" ��11)�" #� �� ������������ �� � ���� � ����� ���� �� � ���������� � � ������� ���������� ,������� �� �"1 �' ������� ��" ������������� �� 11%C�111+"

.���P�� O" 5"� 7����� ;" ."� �-� � 5"� > ��� ." 5"�<�.���� O" 5"� =� � �"� �� �!�� >" �"� #���� >"�<"�7��! ��- � �"� 5������ ." ;" G B� � ;" 0" ��11+�"0������� !�� �� �� � )%��� � ������� �� ��A�������� ����� �� � � � ��� � � �� ��� � ��� �� ������ �� $ �� A���6#�" 3# ����# ����# ��� ��C+8���C+,"

.������ �" O"� A����� <" 5"� .���� ��� O" 0" G L� �����B" �" ��11��" 0� ����������� � � �� �� � ����� ���� ��� � ����$ �� ��� �� ��$� �� �$���� �� �� �� �������� � � � �� ���� � ����� � ��� � ��������� �� ������� �"������������� �� �8,&)��8,,C"

.������ �" O"� A����� <" 5" G L� ����� B" �" ��11C�"A�� �"%��' �������� ����� �� �� �� � � ���� ����� ������ � �� �� �������� � � � ������ �" ������������� � �8&&C��8&&1"

.��� �-� 6" �" G .��� �� #" A" ��11)�" .25<K<9� �� ������ �� ������" ������� ��5����# ���C�1�C+C"

.���� ��� O" 0"� <�� 6" T" G L� ����� B" �" ��11��"#� �"C��' ������ �� �������� �� �� ������� ���������� ��� � �� ���� �� � �� ��� ������ ������� �� ��� � ��������� �� ������� �" 3# ����#����# ��� &�8��&��1"

��� ���� �� !� "#���$#$ ���

#������� A" <"� >��� �� 5" Q" G < ����� ;" O" ��11)�" ����� � ������ � �� ���� � ��� � �" ���������� ,C��,C)"

#�$ �� ��� #" 0" G ���!�� O" ��111�" ��������������� ����� �� ��� �3A �� ��;" +�� ����� ����# ����# !� ��� %+1�%,�"

#������� O"� < �� T"� .��������� O" �" G L� ����� B" �"��11%�" � ����� ��� � ��� �� �� � � �� ��� ��� �� � �� � �� ��������� � �� �� ��������� ��� � �� ���� � �� ���������� ����" �������#����# ��� �8���8%"

7�������� ;"� < ��� 7" G O�� �-� A" ��888�"�������� � �� ���� � ���� �� � ���������� � � ����� �� 1������� � ����� 9 ���� � � ��� � �� ������ �" 3# ���# ����# ��� �)1��%%"

7�� 2" 0" ��11,�" � �� ���� � �� � ������ ��" 3� 5����� �� � ��� �� .��������9 ������ � �� ������� ������� �= ����� B" 0"� 0��� ��� A"� 333� 3��������O" <"� < �� 5" 0" 0"� <�$� >" �"� ������� -� �"�A!� -���� 7" ."� A � � �"� .�������� �" G?������� 5"� ��� ��" �88&��8�+� ��� ��� .�� � ��� � ���� ���� � 7��� ������ ;0"

������ �� ����

8 ����"�� &9 3��� &))): �����"�� �� ��"���� ,��� &; �������� &))): ������� <) �������� &)))=