BIOCHIMIE, 1976, 58, 1367-1380.

des Structures, teneurs et compositions

esters sulfuriques, sulfoniques, phosphoriques des glycosyldiglycdrides de trois fucacdes.

IOHAM QUANG LIEM ~ et Marie-H61bne LAUJR.

lnst i tut de Biologie V~g~tale Marine, Laboratoire de Biochimie des Lipides, BOtiment I B i s , Universit~ Pierre el Marie Curie,

4 Place Jussieu, 75230 Paris Cedex 05.

(17-10-1975).

Summary. - - The mono and polyester glycosyl sulfates or phosphate diglyeerides aeeount for a group of polar lipids ~vhich is found in large amounts in the three fueaeae that are studied : Peluetia canaliculata (L) Deen and Thur, Fucus vesiculosus (L), Fucus serratus (L).

These polar tipids have been sh(rwn to have complex structures, most of them are uuknown in the present nomenelature. Both quantity and composition of these polar lipids are species characteristics, forming the equipment of polar lipids for every species of algae.

Glyeosyl ester sulfate and phosphate diglyeerides are very unstable substances when pure, moreover photolabile and thermodegradable. This extreme fragility caused many difficulties in the determination of molecular structures 'whieh require a very high purity af isolated substances.

The determination of the structures, studies of quantities and composition, cytological localization of these polar lipids should allow to define clearly their physiological func- tion and importance from the biochemical and ecological point of vie'xv.

INTRODUCTION.

Ant6rieurement , nous avons d6jh signal6 chez Peloetia canaliculata, Fucus vesiculosus, Fucus serratus une abondance re la t ive des l ipides polai- res totaux. Diversement repr6sent6es sur le plan qualitatif , ces substances sont de s t ructure souvent complexe, et les 6tudes les concernan t sont encore trbs f ragmenta i res s inon superficiel les bien que, depuis quelques ann6es beaucoup de chercheurs se soient consacr6s ~ la d6terminat ion s t ructurale et au m6tabolisme d 'un cer ta in nombre de ces consti tuants.

Pelvetia caualicalata possbde 16 l ipides polaires individuels , tous repr6sent6s chez Fucus vesiculo- sus et Fucus serratus. Chez Fucus vesiculosus, les glycosyl-polyesters phosphate diglyc6rides sont pr6sents excep t ionne l lement dans les thalles jeu- nes, leur taux reste faible co lnpara t ivement aux autres lipides. Fucus serratus poss6de outre les 16 l ipides polaires isol6s d.e Pelvetia canaliculata, c inq h six autres qui ne se t rouvent que chez cette espbce. Ces derniers sont souvent pr6sents en fai- ble quantit6 mats non n6gligeables ; leurs 6tudes

<> A qui toute correspondance doit dtre adress6e.

s t ructurales et m6taboliques seront faites ult~- r ieurement . Les 16 l ipides polaires communs aux trois algues 6rant de const i tut ion ident ique h la composi t ion en acides gras pr6s, quelle que soil leur origine, nous les avons r6partis en quatre groupes distincts.

Les phospha t idy l diglyc6rides (X1-X ~) ne repr6- sentent qu 'une faible p ropor t ion quelle que soit l 'esp6ce, leur composi t ion 616mentaire et leur poids mol6culai re cor respondent h ceux de leurs homologues connus.

Les glycosyl esters sulfate, sulfonate et phos- phate diglyc6rides const i tuent la masse la plus i lnportante. Dans ces mol6cules les taux de soufre et phosphore sont souvent ~lev6s et les glucides pr6sents au hombre de une h quatre mol6cules sont en gdndral le glucose et le galactose.

Teneur et composi t ion sont deux caract6ris t i - ques sp6cifiques des 6quipements l ip id iques des diff6rentes esp~ces. Leur va r ia t ion d6pend 6troite- lnent des condi t ions 6cologiques de l 'habi ta t dont la r6par t i t ion au niveau de la m e r e s t bien connue

El, 2, 31. Certains des glycosyl esters diglyc6rides isol6s

des trois algues 6tudi6es sont des substances en-

1368 P h a m Quang L i e m et M.-H. Laur.

core inconnues actuellement, en par t icul ier , les polyesters sulfate et phosphate. Ils n 'on t 6t6 , isolds jusqu ' ic i ni chez les animaux, ni chez les vdgd- taux.

Au cours de cette 6rude, nous nous at tacherons la ddterminat ion des s t ructures moldculaires de ces const i tuants et ~ rd tude des var ia t ions des teneurs et composi t ions au niveau des espdces.

La connaissance de la rdpar t i t ion cytologique de ces substances permet t ra par la suite de d6finir le rdle plast ique ou catalyt ique que ces l ipides po- laires peuvent jouer au sein de la cellule et par extension dans la biologic des algues.

MATERIELS, METHODES ET TECHNIQUES D'I~TUDES.

Les trois algues 6tudides p rov i ennen t de la sta- t ion biologique de Roscoff od elles out dt6 rdcol- td.es dans les envi rons immddiats entre Ju in 1971 et Aofit 1972 grace aux bons soins de M 'me Cabioch. Lavds, sdchds et lyophylisds les matdriels sont con- servds sous forme de poudre h - - 4°C selon le pro- tocole ddcrit [4, 5]. Les l ipides totaux sont extraits extemporandment , isolds, purifids et analysds dans les heures qui suivent leur extract ion de la facon suivante :

1) Extraction.

Les glycosyl esters diglycdrides comme la plu- par t des l ipides polaires sont fortement lids aux s tructures organisdes des cellules, leur extract ion pose cer tains probldmes techniques surtout pour les obtenir intacts et en totalitd, car les moldcules sont trds fragiles, faci lement ddgradables. Nous avons adoptd le mode d 'ext ract ion en pal ter ddcrit ci-aprds, qui pernlet de rdaliser les condi t ions favorables de t ravai l et d 'ob ten i r la quasi-totalit~ des glycosyl esters diglycdrides (GED), tout en prdservant l ' intdgrit~ des moldcules.

Darts la premiere drape, les poudres d'algues convenab lement rdimbibdes d'eau, sont laiss~es & macdrer dans l 'ac6tone pendan t trois heures ~ la tempdrature ambiante et sous agitat ion magndti- que r6gulidre. Les l ipides polaires << libres >> sont ainsi extraits en totalitd tandis que les l ipides po- laires << lids >> sulfatds et phosphatds, en l 'occur- rence les GEl), ne sont pas extraits darts ces con- ditions.

Darts la deuxi~me ~tape, les l ipides neutres sont extraits h chaud sous reflux, par le chloroforme selon la mdthode pr~conis~e [6]. Dans cet extrai t les l ipides fa iblement polaires sont aussi extraits, mats en faible quantitd. On y trouve gdn6ralement des acides phosphat idiques, des lysophosphat idyl chol ine et d.thanolamine.

Dans la troisi~me ~tape, l 'ensemble des l ipides polaires totaux est extrai t par le m61ange chloro- fo rme/m6thano l (1/1) h 70°C pendan t 3 h selon la mdthode ddcrite [4, 5, 6]. Les G,E~D sont alors extraits dans leur quasi-totalit6, la d6natura t ion n 'a pas affect6 plus de 1 p. cent de leur taux dans la majorit6 des eas. Les polyesters sulfates et phos- phates notamment , peuvent parfois s ' isomdriser mais en gdndral, ]cur s t ructure est b ien respect6e, les produi ts d6natur6s sont toutefois quanti tat ive- ment peu abondants par rappor t h la masse totale de ces substances.

2) S~paration en classes individaelles.

La sdparat ion des li,pides polaires en classes in- dividuelles est faite par chromatographic sur colonne de Silice Mall inckrodt 200 Mesh avec gra- dient l indaire puts concave de polarit6 du solvant [4-7].

3) Purification des lipides polaires individuels isolds.

La purif icat ion des l ipides polaires sdpards se fait par chromatographic sur couches minces de Silicagel/sHicate de Magndsium/tdtraborate de sodium. La puri f icat ion des l ipides polaires sou- frds se fait secondai rement par chromatographies sur couches minces de Flor is i l [7]. Les autres l ipi- des polaires phosphords sont relavds en prdsence d 'acOone con tenan t 1 p. cent d'eau. La chromato- graphic descendante sur papier Wha tman N ° 1 est utilisde en dern ie r l ieu pour obtenir des sub- stances trds pures pour les analyses de structure. Les divers l ipides polaires isolds doivent 6tre con- servds en pr6sence des pigments polaires h - - 4 ° C h l 'obscuri t6 et dans les flacons colords. L'dlimi- na t ion des pigments se fait ex temporan~ment avant analyses cbimique, spectrophotomdtrique, IR et spectromdtr ique de masse.

DETERMINATION DES STRUCTURES.

1) Analyses des constiluants. 1 ° Acides gras.

Les caractdrisat ions et dosages sont faits simul- tandment sur couches minces de Silicagel G impr~- gn6 au ni t rate d 'argent et par chromatographic en phase vapeur sur colonne apolaire (SE 30 ou Apie- zon L) et polaire (DEGS) h 280°C. Les acides gras sont t ransmdthylds au pr6alable en prdsence de HC1/MeOH 0,5 N h 70°C pendan t 3,6 h en tube scelld. Les ddterminat ions quali tat ives et quanti ta- rives sont faites par 6valuations des longueurs 6quivalentes de chaines (:LEpC) sur in tdgrateur Packard Hewlett modble 3370.B. La raise en 6vi- dence et la local isat ion des l iaisons 6thyldniques 6ventuel lement prdsentes dans les moldcules sont

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Les glycosyl esters diglycdrides de trois fucacdes. 1369

faites soit par hydrog6nat ion catalyt ique [5, 61 soit aprbs hydrolyse oxydative en pr6sence de l 'acide periodique, par spectrom6trie de masse I7~ des produi ts t r im6lhylsi lyl6s apr~s clivage. La ni6tho- de d 'ozonolyse oxydat ive ou r6duct ive est aussi employ6e. Les r6sultats obtenus par la m6thode d 'ozonolyse sont en g6n6ral plus faciles h inter- p rOer que ceux obtenus par la m6thode d'oxy- dat ion per iodique, cette derni~re est par contre plus facile ~ r6aliser.

2 ° Glyc~rol.

Les dosages et caract~risat ions sont fairs selon la m6thode classique de Deniges ~9~ adapt6e aux d6riv~s glycbridiques sulfates et phosphates lipi- diques. La m6thode au per iodate est aussi em- ploy6e h t i tre comparatif , elle permet d 'obteni r la conf i rmat ion des r~sultats obtenus par la m6thode pr6c6dente.

3 ° Choline.

Caract6risat ion et dosages de la choline sont faits su ivant la m~thode de Handler h pH 9 [10] et de Appleton [111 apr~s hydrolyse en pr6sence du m~thanol ch lorhydr ique 5N.

4 ° Ethanolamine-S&ine.

Apr~s rn6thanolyse en mil ieu chlorhydr iquc , s~rine et ~.thanolamine sont doses au dinitrofluo- robenz~ne et par autoanalyseur Technicon [7-9i.

5 ° Sphingosine.

Lib6r6e par hydrolyse acide prolong6e, la sphin- gosine est extraite par le chloroforme puts dosSe selon la m6thode de Mc Kibb in et Taylor [13!.

6 ° Aldehyde gras.

Trans fo rm& en ald6hydes d6riv6s du glyc6rol par hydrolyse basique, leur dosage aprbs colora- t ion par la fuschine i)isulfit6e est r6alis6 au spec- t rophotombtre [14, 151. L'6talon de r~f6rence est un h6iniac6tal ou un ald6hyde gras connu.

7 ° Inositol.

Aprbs hydrolyse en pr6sence de HC1 2 N h 100°C pendan t 48-56 h, l ' inosi lol est caract6ris6 et dos6 selon la nI6thode de Scherer modifi~e [6, 7, 16!.

8 ° Ester sulfate et sulfonale. La caract6.risation des esters sulfates intramol6-

eulaires est faite par spectrophotom6tr ie fi 327,5 nm aprbs hydrolyse douce et pr6cipi ta t ion diff6rentielle au chlorani la te de ba ryum [7-8].

La spectrophotom6tr ie IR permet ensuite de caract6riser et diff~rencier les sulfates esters des sulfonates. La spectrom6trie de masse aprbs tri- ni6thyls i l lylat ion et oxydat ion per iodique permet

enfin de localiser les sulfates ou sulfonates esters dans la mol6cule [2, 71.

9 ° Esters phosphates.

Analyses et dosages des esters phosphates sont men6s suivant la technique de Mc Ardlle ct Zilkha [18].

10 ° NH~ et N-Acglation. Ces const i tuants sont analys~s qual i ta t ivement et

quant i ta t ivement selon la m~thode de Raghavan [18].

11 ° Glueides. Apr~s hydrolyse acide en presence de SO4H. _,

0,1 N, 100°C, 1 h et en tube scell~, l 'hydrolysa t est pass~ sur eolonne de Dowex 1X 200-400 Mesh, cou- pl~e h une deuxi~me colonne de Dowex 50, 200- 400 Mesh. Les sucres neutres sont alors analys~s et doses soit par les techniques classiques [19-211, soil par les m6thodes pr~conis~es E221, apr6s frac- t ionnen len t par chromatographies ascendantes ou descendantes sur papier What inan N ° 3. Pour cela les sucres isol6s sont tr im~thylsi l lyl~s au pr~ala- ble. Les d6riv6s (TMS) volatils permet tent en ou- tre la s~paration chromatographique en phase va- peur qui donne de tr~s bons r~sultats [23]. Les CGM un i et b id imens ionne l l es des glucides m ~ thyl~s en pr6sence du dim~thylsulfonyl iodom~- thane et hydro lys i s permet tent de s~parer les sucres isol6s. La r~v~lation se f a i t h l ' an throne- acide sulfur ique et au phtalate d 'ani l ine. Toutes les CCM sont faites en presence des t~moins (tri- mOhyl 2, 3, 4 glucose, t r imOhyl 2, 3, 4 galactose, et tOram6thyl 2, 3, 4, 6 glucose) employ6s comme ~talons internes.

La local isat ion des l iaisons entre deux oses d 'une part, et des oses avec les esters sulfates ou phosphates d 'autre part, peut 8tre dOerinin~e par spectrom~trie de masse des d~riv6s TMS apr6s oxydat ion per iodique au pr~alable, en presence du ni6taperiodate de sodium en solut ion fi 0,01-0,08 M dans le tampon ac6tate 0,0.5 M/pH 4,5 [24~.

TECHNIQUES EMPLOYt~ES.

1 ° Chromatographie en phase vapeur. La chromatographie en phase vapeur est faite

sur eolonne de SE30 g 10 p. cent sur chromosorb Q et DEGS pour les acides gras. Pour les aldehydes et ald6hydes esters d6riv~s des glucides TMS nous employons de preference des colonnes moins polaires (OV1 ~ 3 p. cent) apr~s clivage pr6alable.

2 ° Spectrom~trie de masse. Les spectres de masse sont r~alis~s avec l 'appa-

reil MS 902 AEI Ltd fi 70eV-6KV-100 ~A. Les toni-

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1370 P h a m Qzzang L i e m et M.-H. Laur .

sations potentiel les h haut voltage sont seules uti- lis~es au eours de cette ~tude.

3 ° Spectrophotom~trie IR.

Les spectres IR sont r~alis6s sur lanaelles de chlorure de sodium avec l ' appare i l Becknaann.

4 ° Preparation des ddriods trimdthglsillglds.

Les d6riv6s TMS sont pr~par6s par r~aetion avec l 'h exan)~tb:ylc~isilazan e / t r ina~thylchloros i lane /py - r id ine , 1/0,35/5 (v /v /v) , pendan t 10 nan h la tena- p~rature ambiante. La pr6para t ion doit se faire extenaporan&nent.

RESU,LTATS ET DJSCUSSIONS.

La chromatographic sur colonne de Silice Mal- l inckrodt 200 Mesh a pernais d ' isoler 10 fractions. Ces derni6res donnen t par CCM 13 bandes nette- ment s~par6es eor respondant aux 13 l ipides sou- fr6s et phosphor~s des fract ions f a e t f4 (cf par t ie technique exp6rimentale) .

Ces l ipides sont s tructuralenaent proches mats diff~rents les uns des autres, nous les d~signons par X1....X~3. Les X~-X 5 sont des phosphat ides clas- siques [2, 6, 71. Ils const i tuent une masse relative- ment faible par rappor t h celle des glycosyl esters diglyc~rides repr6sentg, s par les Xc-Xla. Ces der- niers forment deux fanailles de substances dis- tinctes. Les X6-Xlo que nous avons ranges dans ]e groupe 2 de notre classification sont des esters phosphates tandis que les X1vX13 du groupe 3 sont des esters sulfates ou sulfonates. Tous ces glycosyl esters sulfate, sulfonate ou phosphate diglyc~rides (Gt~D) donnen t des r~actions posit ives avec Pan- throne, le phtalate d 'ani l ine .

Nous n 'avons pas }dentifi~ de groupenaents anti- n~s dans aucun de ces l ipides et les l iaisons N-acyl glucosanaine n ' on t pas ~t~ raises en ~vidence. Les X6, XT, X s p rov iennen t tous de la sixi~nae f ract ion s~par~e par GC avec le syst~me de solvant h gra- dient concave de po]arit& En mi l ieu de solvant basique, les X s rnigrent plus rapidenaent que les X 6 et les XT, ]eur Rf respectif est 0,38-0,36-0,35.

TABLEAU ~I.

Teneurs en Soufre, Phosphore, Azote, Carbone, HgdrogOne, Oxygbne des diff~rents lipides polaires (Xe-Xlo) des trois Fucaedes btudi~es.

Lipides

X 6 X7 Xs Xo Xlfp Xt~ X]l' Xt2

El6ments : Poids par 100 grammes de lipides polaires

S P

0,00-0,001 0,00-0,01 0,01-0,05 0,02-0,03

4,32-4,38 4,08-4,12 4,72-4,80 12,2-12,5

0,01-0,02 0,00-0,01 5,12-5,41 7,31-7,32

0,01-0,02 0,00-0,00 0,01-0,00 0,00-0,00

0,08-0,10 0,05-0,08 0,01-0,02 0,03-0,03

0,01-0,02 0,01-0,02 0,00-0,00 0,00-0,00

77-78 63,2-64 54,1-56 42,1-43

63,2-64 64,1-65 60,9-62

44-44,57

9,00-9,20 9,1-9,20 8,1-8,20 6,7-6,90

9,1-9,21 8,9-9,12 8,2-8,30 7,5-7,70

20,2-20,60 25,5-25,60 29,2-29,50 39,2-39,40

23,5-24,60 22,6-24,30 23,2-23,50 23,2-24,10

TABLEAU II.

Compositions et teneurs en diff~rents constituanls des lipides (Xo-Xls) des trois Fucacdes dtudi~es.

Constituants : Poids par 100 grammes de lipides polaires Lipides

C16: o Cls: ~ Glycerol Sulfates

X 6 X~ Xs X!,

Nil Xlt,

3,1- 3,15 3,1- 4,22

20,1-25,2 10,2-15,3

23,1-24,2 24,2-25,3 26,3-28,4 20,1-21,4

4,2- 4,23 5,1- 6,20 0,1- 0,20 0,2- 0,31

23,2-25 22,3-23,4 20,5-22,3 20,5-22,4

C18:3 !

45,5 -50,45 42,1 -45,21 25,21-26,4 17,42-18,2

1,73- 4,272 I 3,12- 4,253[ 2,54- 3,6511 2,5 - 3,9861

Sucres I Phosphates

9,12-11,25 20,12-22,5 i 7,1 - 7,75 9,14-10,30 28,2 -32,451 6,1 8,30 9,20- 9,521 30,1 -35,421 9,1 9,5 5,11- 6,241 40,1 -42,40120,2 -22,5

/

8,52- 9,971 20,2 -21,401 0,00- 0,00 9,12-11,54 20,4 -22,50 i 0,00- 0,01 9,23-10,40 20,2 -22,40 0,00- 0,00 8,15- 9,890i 28,2 -29,411 0,00- 0,00

0,00- 0,001 ! 0,00- 0,00

0,00- 0,000 0,00~0,000

9,00-10,21 10,12-12,3

9,15-11 ,50 /22,1 -23,45

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Les glyeosyl esters diglycdrides de trois fucacdes. 1371

l .e t ab leau III r 6 s u m e les c a r a c t d r i s t i q u e s de ces d ive r s l i p ides p o l a i r e s soufr6s et phospho r6s .

ETUDES DES X 6.

Les X 6 son t des subs t ances t e r n a i r e s conlpos6es de C, H, O ( tab leau I). Les ana lyses 616mentai res

on t c o n d u i t h la f o r n m l e C48,75H71.sOlo.32. La c h r o - m a t o g r a p h i e en phase v a p e u r sur c o l o n n e de DEGS a pernf i s d ' i so l e r une s u b s t a n c e m a j o r i l a i r e f lanqu6e de deux cons t i t uan t s m i n o r i t a i r e s . Les p ics qu i les r e p r 6 s e n t e n t son t local i s6s dans la r6g ion C 48,30 de ]a LEC des satur~s et C 40,52

TABLEAU III .

Formules brutes et semi d~velopp~es des lipides polaires des groupes 2 el 3 des lrois Fucacdes ~tudi~es.

Lipides

X~

X6,

X6,,

PM ddtermind par

spectromdtrie de masse

774

776

752

Formules brutes

proposdes

C,.r,H;~Ojo

C45H7601o

C43H7601o

Formules semi-d6veloppdes

ClS: 3--O--CH=, I

CH--O--Cls : 3 CH._~--O--Glc, (3H~O)

Cxs: ~--O--CH~, t

CH--O--Cls : a I

CH~--O--Gle, (3HuO)

C1~ : 0--O--CH.: I

CH--O--Cls : 3 I

CH~--O--G|c, (3H~O)

X 6 : dil inoldnate-l-2, 3-O-glucosyl diglycdrides Idenli[ication : X6, : linol6ate-1, linoldnate-2, 3-O-glucosyl diglyc6rides

X6,, : palmitate-1, linol~nate-2, 3-O-glucosyl diglyc6rides

X 7 954 C51Hs60t6

X 7 ,

XT,

Identification :

956

934

C.~tHss016

C49H9oO16

CIs: a--O--CH~ I

CH--O--C18: a f

CH~--O--Glc- -O--Gal , (6H.zO)

Cls: 2 - -O- -CH 2 I

CH--O--Cls : I

CH:~--O--GIc--O--Gal, (6H~O)

Cle: o--O--CH~ I

CH--O--Cls : 3 I

CH~--O--GIc- -O--Gal , (6H~O)

X 7 : dilinoldnate-l-2, 3-0-glucosyl , galaetosyl diglycdride XT, : linoldate-1, linoldnate-2, 3-0-glucosyl, galactosyl

diglycdride XT,, : palmitate-1, linoldnate-2, 3-0-glucosyl, galactosyl

diglycdride

X, [ 984 I C4,,H9~0 wP

l ! Identification : X~: palmitate-1, linoldnate-2, 3-0~6P glueosyl, galaetosyl

diglyc~ride

C16 :o--O--CH~ I

CH-- O--CIs : 3 1

CH~--O--6P, Glc--O--Gal, (6H.20)

BIOCHIM1E, 1976, 58, n ° 11-12.

1372 P h a m O, u a n g L i e m et M.-H. Laur .

Lipides

X0

PM d6termim! Formules par : brutes

spectr°mdtric i propos6es de masse

]

1562 Call I toO:;:P~

Formules semi-d6velopp6es

C~: o--O--CH~ I

CH--O--C~s:

CH~--O--Gal~--O--3P.GI%--O--3,

6P.Gl%-- O--6P.Gal 4 (6H~O)

Identification : X 9 : palmitate-1, linol6nate-2, 3-O~galactosyl--O--3P glucosyl --O - 3,6P glucosyl--O--6P galactosyl diglyc~ride

X~o : Lipide non encore identifl6

X~ ~ 837 C~3Hs~O~aS

Xl~,

Xl.l,~

837

837

C43Hs~O~aS

C~Hs~O~3S

C~6 : 0-- O--CH2 [

CH--O--C~s: I

CH~--O--6 su]fate.Glc, (5H~O)

C~o: 0 - -O- -CH~ I

CH--o--C~s:

CH~--O--3 sulfate.Glc, (5H,_,O) C~: o--O -- CH~

I CH--O--C~s: 1

CH~- 0 - -6 sulfate.Gal, (5H,O)

Xll: palmitate-1, linol6ate-2,3-O-3 sulfateglucosyl diglyceride Identificalion : Xll,: palmitate-1, linol6ate-2,3-O-6sulfateglucosyl diglyc~ride

X~l,, : palmitate-1, linolfiate-2,3-O-6sulfategalactosyl diglyc6ride

X~3 [ 1146 1 I

C4:*H~'40~:~S i CI~:0--O--CH~ I

CH--O--C18: I

CH~--O--6 sulfonate.Gal-- O--3,

~ 6.disulfates Glc, (6H.20)

Identification : X13 : palmitate-l, linol~ate-2, 3-0-6 sulfonate ga]actosyl-O-3,6 di- sulfate glucosyl diglyc6ride.

de celle des monoinsatur6s , Apr6s hydrolyse acide et basique puis ~SSp~rati0n des const i tuants , nous avons isol6 des extraits 6th6rosolubles , des acides palmii ique, l inol6ique, l inol~2ique. Ces 3 acides gras consti tutifs sont pr6sents s imul tan6ment dans l 'extrait , p rovenan t vra i semblablement des trois isom6res (X~, X6, , X6,,) qui forment le m&lange et qui different par leur composi t ion en acides gras constitutifs. Les X~ sont majori taires, ils forment la masse des di l inol6nate- l ,2 diglyc6rides, tandis que les m ino r i t a i r e s (X w- X6,, ) sont compos6s de palmitate ou linol6ate-1, l inolinate-2, diglyc6- r ide (tableau II). Dans la fract ion hydrosoluble nous avons identifi6 le glyc6rol et les glueides en

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.

quantit~ 6quimol6culaire, dans les propor t ions de une mol6cule de glycerol et une mol6cule de sucre par mol6cule de X 6. Les glucides isol6s et chro- matographi~s sur papie r donnen t un spot un ique tr6s sensible h l ' an throne . Avec le phtalate d 'ani- l ine la colorat ion est moins in tense et se d6ve- loppe tr6s lentement. ,Le rSactif d 'Elson-Morgan ne r6agit pas, les amines et amino-sucres ne sont pas pr6sents dans les X 6. Par ailleurs, ]es d6riv6s TMS cochromatographi6s en phase vapeur avec les TMS, tr i et t6trasubstitu6s, glucosyl et galactosyl employ6s comme t6moins et 5talons in ternes , ont 6t6 identifibs couune 6tant des t r im6thyls i l lyls t6trasubstitu6s 1, 2, 3, 6 glucosyl. Ces r6sultats sont

Les glycosyl esters diglycdrides de trois fucacdes. 1373

v@ifi~s par la m6thode d 'oxydat ion periodique. Par ail leurs les posi t ions des OH lihres en C1, C2, C3, C6 ont 6t6 d6,montr6es par ces diff6rentes m6- rhodes analytiques, tandis que la l iaison osidique avee le glyc6rol a lieu en C4 dans la p tupar t des cas. Les 6tudes par spectrom6trie de masse per- mettent d '6tablir la s t ructure de ces l ipides et de confirmer la pr6sence simultan6e des trois iso- m6res dans le rn61ange.

Dans le spectre de masse des X~ const i tuants ma- jor i ta ires du m61ange, nous avons not6 ] e p i c m / e

774 cor respondant h la masse M de cette mol6- eule. Le PM lhborique des homologues de s t ructure de X~ est 6valu6 h 760 tandis que le PM calcu]6 par t i r de la formule brute 6tablie est de l 'o rdre de 840. La diff6rence observ6e entre ]es r6sultats de l 'analyse 616mentaire et les ions mol6culaires me- sur6s en spectrom6trie de masse provien t de la pr6sence d'eau li6e h la s t ructure qui ne peut 6tre 61imin~e par le s@hage. Nous avons aussi not6 les pics m /e = 49~ (.M-C~TH~CO) ÷, 221 (M-2 × Ca~H3~CO) +, 481 (M-CaTHa~OCOH) ÷, et 20'4 (M-2 X C17HaiOCOH )+.

Ces derniers p rov iennen t des ions acyliums ~ ]a suite de la perte de CH.~OH de la mol6cule et mi- gration de l 'hydrog6ne. En outre la pr6sence des fragments 79 el 159 cor respondant h - - C H = C H - - CH=CH~CH=GH.~ , et 2 X ~ C H = C H - - , C H = C H - .CH=CH 2 permet de confirmer la nature di l ino-

16nique des restes acyls de la mol6cule. Les frag- ments qui cor respondent ~ la scission des acides l inol6ique (m/e -- 47) et pahni t ique (m/e -- 67) n 'on t pas 6t6 trouv6s dans le spectre de masse de X~. Enfin les pics m / e = 611 (M-C~HI~Os) +, 595 (M-OC~Ha~Os) ~ et 160 (M-C3~Hr~Oz) + confirment la s t ructure glycosyldiglyc6ridique de X6, ce l ipide 6taut le di l inol6nate-l ,2, glycosyl-3 d ig ly@ride (tableau l iD.

Le, ~. spectres des X~, et X~,. sont comparables 'h celui des X 6 no tamment en ee qui concerne le nombre et l ' impor tance relative des pies pr6sents. Les X~, accusent une masse M = 776 et X~., 752. Dans le spectre de masse de X~, les pies m / e = 481 (M-C17H30OCOH) +, 478 (M-C~vH3=,OCOH) +, 184 (M-C~TH30OCOH + .C~7Hz._,OCOH) +, 597 (M-Ct~HuO ~) et 164 (M-C3~H750~) + s o n t aussi pr6sents, caract6- r isant la pr6sence des linol6ate et l inol6nate corn- me restes aeyls d 'une par t et glucose, glycerol d 'autre part, dans la mol6eule de X6,. Cette der- ni6re est le linol6ate-1, linol6nate-2, glycosyl-3 diglye6ride (tableau III).

De m6me dans le spectre de X~,, la pr6sence des pie3 m/e = 505~481 eonfirme la nature pahni t ique el l inol6nique des restes aeyls de cette mol6cule.

Les pics cor respondant h M-C6HnO ~ et M-C39H7~O~ sont aussi pr6sents. Les X6,, sont des palmitate-1, linol6nate-2, glucosyl-3 diglyc6rides (tableau HI).

Les diff6rents acides gras consti tutifs des X 6, X 6, et X6,, mis en 6vidence par les 6tudes spectrom6- tr iques de masse confirment enfin le rappor t mo- 16culaire d6.termin6 ant6r ieurement par la chroma- tographic en phase vapeur que est de 12,6/25,30 /14,5 (palmitique/linol6ique/linol6nique). Ce rap- port mol6culaire a 6t6 trouv6 dans le m+lange des X 6 isol~s des trois algues.

Les X 6, X 6, et X~,, sont en fait des homologues de s t ructure des monogalactosyl diglyc6rides connus (MGDG), h la nature et composi t ion en glucides et acides gras consti tut ifs pr6s.

Chez les algues brunes consid6r6es, il y a l ieu de noter aussi que les acides gras des X(; sont poten- t ie l lement plus insatur6's chez les Fucas serratus que chez les Pelvetia canaliculata et Fucus vesi- cuIosus. En outre cette insa tura t ion potentiel le augmente en m6me temps que d iminue la lumino- sit6 locale et saisonni6re. I1 en r6sulte que les pro- por t ions des X 6 augmentent d'6t6 en h i r e r chez les trois algues tandis que les X G, et X6,, ont dimi- nu6 quant i ta t ivement pendan t la m6me 6poque de l 'ann6e. I1 est int6ressant de noter aussi que, au niveau des esp6ces, les X 6 sont plus abondants chez les algues de p rofondeur que chez les algues de surface, el le conira i re a 6t6 observ6 pour les const i tuants minor i ta i res . L ' indice de sa tura t ion potentiel le ( rapport des propor t ions molaires des acides gras satur~s/acides gras insatur6s consti tu- tifs) des X~r et d 'une facon plus g6n6rale des di- vers l ipides polaires 6tudi6s au cours de ce travail , varie de facon significative avec ]es qualit6s et quantit6s de la lumi~re locale, les 6tudes exp6ri- mentales de ces observat ions feront l 'objet d 'une note s6par~e.

ETUDES DES X 7,

Les X 7 sont aussi des substances ternaires com- pos6s de C, H, 0 dont la formule brute calcul~e

est C~s.40Hs2,~s017,1, " (Tableau 1).

La chromatographic sur couches minces avec les solvants basiques permet de s6parer net tement les X 7 des autres l ipides de la m6me s6rie. La chro- matographie en phase vapeur permet d ' isoler une substance major i ta i re et deux substances minor i - taires du m6!ange. Ces trois const i tuants ont des polarit6s proches et les pics cor respondants sont localis6s dans la r6gion comprise entre C51,2 et C51,6 de la LEC des satur6s et C48,12-C48,6 de eelle des insatur6s. L 'analyse des const i tuants mo- 16culaires apr6s hydr-31yse pr6alable et extract ion

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.

1374 Pham Quang Liem et M.-H. Laur.

par l '6ther de p6trole (65-70°C), permet les carac- t6risat ions et ident if icat ions des acides palmit ique, l inol6ique, l inol6nique d 'une part , du glyc6rol, des glucides d 'autre part . Ces derniers sont le glucose et le galactose. L, oxydat ion per iodique des d6riv6s t r im6thylsi l lyl~s ou ac~tyl6s de ces glucides a per- mis de mettre en 6vidence les OH libres qui sont en C1, C2, C3, C6 pour les galaetosyl TMS et C2, C3, C6 pour les glucosyl TMS. Par ailleurs, l 'hy-

Concernant les X 7, et X7,, les masses d6termin6es sont respect ivement 9'56 93.4. Dans le spectre de X~,, nous avons not6 les pics m / e = 680 (lVI-C~s:,,), 682 (M-C ~s:~), 780 (,M-OGlc) et 634 (M-2 × OGlc). Tous ces pics caract6risent la s t ructure du lino- 16ate-l, lino16nate-2, glucosyl galactosyl-3 diglyc6- r ide de X7,{tableau III). De m6me les X~,, sont des palmitate-1, linol6nate-2, glucosyl, galactosyl-3 di- glyc6rides.

°°l 173 8O 20~

~o~ i'~ 1~ '

0 100 200 300 ADO S00 600 700 a00 900 100"3 li00 120.~ iJoo 1400

Fro. 1. - - S p e c t r e d e m a s s e de X~.

drolyse acide douce des X 7 major i ta i res et minor i - taires en pr6.sence du ttC1/,MeOH h 3 p. cent pen- dant 3 h e t sous reflux, a permis de mettre en 6vi- dence la l iaison par pont osidique entre le C1 du glucose et le C4 du gatactose d 'une par t et le C4 du glucose et C3 du glyc6rol d 'autre part. Les d6ri- v6s m6thyl6s ou tr im6thylsi lyl6s sont toujours des 1, 2, 3, 6 m6thyl ou TMS t6trasubstitu4s galactosyl et des 2, 3, 6 m6thyl ou TMS trisubstu6s glucosyl, identifi6s par chromatographie en phase vapeur (tableau II).

Le spectre de masse de X 7 (fig. 1) est caract6ris6 par le pic m / e : 954 qui correspond ~ la masse M de la mol6cule. Cette masse est inf6r ieure de 110 unit6s par rappor t ~ celle d6duite de la fornmle brute 6tablie, la diff6rence observ6e est due corn- me dans le eas des X 6 ~ la pr6sence d'eau li6,e h la structure. Par rappor t au PM th6orique des diga- lactosyl diglyc6rides (DGDG) dont les X 7 sont des homologues de structure, la masse M d6termin6e par spectrom6trie de masse est sup6rieure de 8 unit6s environ, ceci est dO vra i semblablement au r6ar rangement de la s t ructure au cours des scissions mol6culaires. Nous avons aussi not6 les pics m / e : 680 (M~Cls:~) +, 403 (M-2 X C~s:~) +, ca- ract6r isant la pr6sence s imultan6e de deux mol6- cules d 'acide octad6catr i6noique dans la mol6cule de X 7. Enfin les pics m / e : 778 (M-OGlc) ÷, 599 ¢M-2 X OGle) ÷, 362 (M-l,2 diglye6rines) ont permis de confirmer la nature glycosyl diglyc6ridique tie X 7. Ce dernier est le dil ino]6nate-l ,2 glycosyl, galaetosyl-3 diglyc6ride.

B I O C H I M 1 E , 1976, 58, n ° 11-12.

Notons que les X 7 dans leur ensemble sont potent ie l lement tr~s polaires, i ' ind ice de leur insa- tura t ion potentiel le varie en relat ion 6troite avec les 6tats physiologiques des thalles et d6pend des condi t ions 6'cologiques locales. Les X 7, et les XT.. sont en outre toujours fa iblement repr4sent6s chez les 3 algues consid6r6es, leur taux ne d6passe pas 10 p. cent du m6/ange des X 7 totaux.

]~TUDES DE'S~ X 8.

Les X s sont des l ipides tr~s polaires. En mil ieu basique leur migra t ion est beaucoup plus rapide que celle des X 6 et X 7. Substances quaternai res compos6es de C, H, O, P (tableau I), les X~ r6pon- dent h la formule brute (~47,21H86.89017,86P0,97 . La chromatographie en phase vapeur a permis d'iso- ler un seul pic net tement d61imit6 et s6par6 , des autres l ipides de la m~me s6rie, localis6 dans ]a r6gion C47,41 de la I.t~C des satur~s. Les X s sont aussi des glycosylesters diglyc6rides, les acides gras consti tutifs sont des C16:0 , et Cls:a. Les sucres isol6s des X s sont le glucose et le ga]actose. Les d6riv6s tr im6thylsi lyl6s ou ac6tyl6s cochromato- graphi6s en pr6sence du TMS ou CH3-1, 2, 3 tr isub- stitu6s et TMS ou CHa-1 , 2, 3, 6 t6trasubstitu6s glu- cosyl et galactosyl comme t6moins et 6talons in- ternes sont identifi6s comme 6tant : des TMS-1, 2, 3, 6 t6trasubstilu6s ga]actosyl et des TMS-1, 2 di- substitu6s glucosyl (tableau II, fig. 2). Apr~s m6- thyla t ion et hydrolyse oxydative en pr6sence de l ' iodure de m6thyle /oxyde d 'argent, les produi ts

L e s g l g c o s g l e s t e r s d i g l g c d r i d e s de t ro i s [ u c a c d e s . 1375

m6thyl6s sont chromatographi6s en phase vapeur. La posi t ion des esters phosphates mis en 6vidence anl6r ieurement par analyses chimiques est locali- s6e en C6. La l iaison entre le glucose et galactose dans la mol6cule a l ieu entre C1 el C4 respective- ment et le galactose est en posi t ion terminale . Le glucose est en outre lib en C4 au C3 du glyc6rol par pont osidique. L'6tude des spectres IR de ce

(TM5 gluco~,) I-

FI6. 2. - - Chromatographie en phase vapeur des dd- rivds 2, 3 TMS glucosyl et 1, 2, 3, 6 TMS galactosyl, constituants des Xs en prdsenee des tdmoins.

lipide, permet en outre de conf i rmer la pr6sence des phosphates in t ramol6culai res de X s. Dans ce spectre (,figure 3) nous avons not6 la pr6sence des bandes d 'absorpt ion ~ 1200 cm-1 caract6rist iques des PO], 820 (C-O-C), 930 (C-O), 3600 (OH stretch.) et 3400 (CH3CH,).

L'~tude des spectres de masse des X s (figure 4), complete les 6tudes de s t ructure de ce lipide. Dans ces spectres, nous avons not6 les pics h 944 (M), 729 (M-C16:0), 707 (M-Cls:a), 684 (M-O, 6P Glc), 856 (M-POoH), 534 (M.(]12H,2601~P). (]es pics permet- tent de conf i rmer la presence des acides pa]mi- tique, l inol6nique comme restes acyls d 'une part, glucose phosphate et galactose d 'autre part. Les X s sont des palmitate-1, linol6ate-2,3-O-6P glycosyl- galactosyl, diglyc6rides. Chez ces lipides, les acides gras consti tutifs sont potent ie l lement moins insatur6s que ceux des X 6 et X 7. L ' ind ice de satu- ra t ion potentiel le varie d'O6 en hiver. Pendan t les mauvaises saisons, de Novembre h F+vrier, l ' insa- tu ra t ion augmente, par contre entre Mars el Sep- tembre, la t endance h la baisse est souvent accu- s6e, surtout pendan t les p6riodes off la luminosi t6 locale est in tense qual i ta t ivement et quanti tat ive- m e n t Notons enfin que les esters phosphates en C6 sont re la t ivement stables h la temp@ature inf6- r ieure h 50°C, mais h par t i r de 70°C, ils devien- nent labiles. Au del'h de 100°C, les l iaisons des

a b s o r p t i o n * / . ]

4000 3O O0 21000 1500 1300q 1200 1000 900 BOO 700 t600 J I , ' , '

20"1.--

60"1.-

80"

C 0 S 2 s y m ~ i r l q ~ t PG'"

FI(~. 3. - - Spech'e IR des Xs.

i00 IQ .... 3 .... 2f14 L c . . . . . . . . . . . . . 10 36, / - - - ' ~ ~ 1 60 7 6~

217 4O

20-- ' ~ 3, 45/. 6,0 79B / 8 ..... [I

0 IC~ 200 300 ~00 50O 6~0 705 8~0 ~0 1000 ~0 1200 :360 l~OO

m/,

F I G . 4 . - - Spectre de masse des Xs.

BIOCHIMIE, 1976, 58, n" 11-12.

1376 Pham Quang Liem et M.-H. Laur.

esters phosphates avec le glucose en C6 sonl iota- lement rompues. Cons6cutivement le taux des X s d imiuue consid6rablement , tandis que les X~ et X 7 dev iennent p ropor t ionne l l ement plus abondants , dans ces condi t ions part icul ibres. Par ailleurs la relat ive mobili t6 des esters phosphates en C6 par t i r de 50°C ent ra ine la format ion en grande quanti t6 des C:~ esters phosphates h cette lemp6- rature re la t ivement douce, les in te rconvers ions des 6P en 3,P glucose deviennent syst6matiques entre 50-60°C. Ainsi les 3P esters phosphates glu- cosides apparaissent major i ta i res h 65°C dans les extraits alors que dans les condi t ions normales leur pr6sence est en faible quantit6, souvent h l '6tat de trace, ne d~passant en aucun cas 1 p. cent des X s totaux isol6s.

E T U D E S DES X 9.

Les X9, derniers glycosyl ester phosphate digly- c6rides du groupe 2, sont des l ipides polaires phosphates trouv~s en quantit6 plus ou moins im- por tante selon les esp~ces. Leur taux varie 6troite- ment avec les condi t ions ~cologiques li~s h l 'habi- tat de l 'algue consid~r6e. Chez les esp~ces de pro- fondeur, les X:) sont pr~pond~rants alors que les X s sont quant i ta t ivement les plus abondants chez les algues de << surface >>. Pour ces substances 6galement quaternaires , le taux de phosphore par mol6cule de l ipide est ~lev6. Les analyses ~16men- taires ont condui t "h la formule C61.57H~ze.r,O~z.2 s Pa~2(tableau I). La chromatographie sur couches minces permet d ' isoler une substance re la t ivement pure, mats la fragHit6 des X 9 h l '~tat pu r g6ne con- s id~rablement ]curs 6tudes de structure. L 'hydro- lyse acide douce de la molecule en pr6sence de IffC1/~MeOH 2,5 p. cent h 2.0°C pendan t 3 h a permis d ' isoler : les acides gras dont les Ca~:0 et C~s:s, le glycerol, les esters phosphates et les glucides. Sous forme de d~riv6s ac~tyl~s ou tr im~thylsi lyl~s et chromatographi~s en phase vapeur sur colonne de SE 30 h 10 p. cent, les produi ts identif ies sont :

- - des TMS ou acOyl-l,2,3 et 2,3,6 tr isubsti tu6s galactosyls ;

- - des TMS ou ac6tyl-2 monosubst i tu6 et TMS ou ac~tyl-2,6 disubsti tu6s glucosyls. I1 en r6sulte que les sucres consti tutifs de X 9 sont des glucose et galactose, ces derniers sont presents en quan- tit~ 6quimol~culaire. L 'analyse s~quentielle des divers sucres apr~s hydrolyse graduelle en pr6- sence de HC1/MeOH (0,5 N) h la temperature am- b iante a permis d 'about i r aux conclusions sui- vantes :

1) Le T~S-1,2,3 tr isubsti tu6 galactosyl est en posi t ion te rminale de la s6quen~e. I1 est est~rifi~ en C6 par un acide phosphorique. Les OH en C1, C2, C3 sont libres et le C4 est reli6 au C1 du glu-

BIOCHIMIE, 1976 , 58, n ° 11 -12 .

cose 3 (Glc3) par pont osidique. Le G lc3 est en troisibme posi t ion dans la s6quence.

2) Le glucosyl TM'S monosubstitu6, en C2 (Glc 3) est est6rifi6 en C3 et en C6 par deux acides phos- phoriques. Le C1 de ce sucre est li6 au C4 du galactose 4 (gal 4) et son C4 au glucose 2 (Glc 2) par pont osidique.

3) Le glucosyl TMS disubstitu~ en C2 et C6 (Glc 2) est li6 en C4 au C1 dugalactose 1 (Gal 1) et en C1 au G4 du glucose 3 (Glc 3). Son O,H en C3 est est6rifi6 par un acide phosphorique.

4) Le galactosyl TMS trisubsti tu6 en C2, C3, C4 (Gal 1) est en posi t ion 1 de la s~quence. Les OH libres sont en C2, ~3, C4 tandis que le C.1 est It6 par pont osidique au glucose 2 (Glc 2) et ]e C4 est reli6 au C3 du glycgrol.

Le spectre IR de X 9 permet de conf i rmer la pr6- sence des esters phosphates intramol6.culaires. Ces spectres sont comparables h ceux des X s. Les bandes d 'absorpt ion et leur abondance relative permet tent de conf i rmer les r6sultats analyt iques obtenus pr6c6demment. Les spectres de masse de X~ ont permis de noter les pics m / e : 15.5.2 (M), 1162, 1309, 971, 520. Ces derniers caract6risent la pr6sence des esters phosphates glucosides dans la mol6cule de X s. Par ail leurs les pics m / e : 1297, 1275 ind iquen t la pr6sence des acides pa lmi t ique et l inol6ique const i tuant les X~, ce qui a 6t6 ant6- r i eurement d6montr6, par les 6tudes chromatogra- phiques en phase vapeur des acides gras isol6s de ce lipide. L 'eau li6e h la s t ructure est aussi pr6sente dans le cas des X 9 h ra ison de 6,I-120 par mol6cule de lipide. Des diff6rents r6sultats analy- t iques obtenus il r6sulte que les X 9 sont des palmi- tare-l, linol6nate-2,3-O-galactosyl-O-3P.glucosy]-O- 3,6,P.glucosyl-O-6,P.galactosyl diglyc6rides. Les dif- f6rentes caract6rist iques sont r6.sum6es clans le tableau III. La complexit6 et l 'extr6me fragilit6. des X;j r enden t difficiles les 6tudes de leur struc- ture. Une var ia t ion de temp6rature et du pH h titre exp6r imental en t ra lne indub i t ab lemen t la d6sorganisat ion progressive mats rapide de !'6all- rice mol6culaire. En outre la grande mobili t6 des esters phosphates en C3 est souvent h l 'or ig ine des in te rconvers ions isom6riques tr~s fr6quentes ",i haute temp6rature. En outre les X a sont vuln6ra- bles aux attaques nucl6ophiles, la s t ructure secon- daire de la nlol6cule est de ce fait pr6caire, sujette h des d6naturat ions voire des destruct ions com- plbtes en cas de var ia t ions brutales des condi t ions analytiques.

Outre ces quatre l ipides polaires phosphat6s nous avons aussi isol6 un c inquibme l ip ide phos- phor6 en l 'occur rence les Xlo. Ces l ipides sont pr6- sents en trbs faible quantit6, leurs 6tudes sont par-

L e s g l y c o s y l es ters d ig lycdr ides de trois fucacdes . 1377

t icul i~rement difficiles, nous nous borne rons h s ignaler ici leur presence, la d~terminat ion de leur s t ructure sera faite ul t~rieurement .

ETUDES DES LIPIDES DU GROUPE 3.

Les l ipides polaires qui composent le groupe 3 sont tous des glycosyl esters sulfate diglyc~rides.

/ Fro. 5. - - Chromaloyraphie en phase oapeur des dd-

riots 1, 2, 3 TMS galactosyl extraits des X,e en presence des t~moins.

De polarit6 trbs proche les uns des autres leur const i tu t ion comporte n6anmoins des diff6rences nettes.

Les trois premiers Xll, Xll, et XI~ - sont en fair des isom~res de structure. Alors que les Xll sont des 3, sulfate glucosyl diglyc6rides, et les Xll, des 6, sulfate glucosyl diglyc~rides, les Xt~ " sont des 6, sulfate galactosyl diglyc~rides (fig. 5, 6, 7, tableaux 1, II, IH).

Les acides gras consti tutifs isol~s de ces trois l ipides sont des C1~:0 et Cls:2. La sa turat ion poten- tielle est en g~n~ra], re la t ivement ~lev~e par rap- port aux l ipides polaires pr6c6dents. Toutefois l ' ind ice de saturat ion potentiel le varie consid~ra- b lement selon les esp~ces et su ivant les saisons. Pendan t les mauvaises saisons, de Novembre h F6vrier, l ' ind ice d ' insa tura t ion potentiel le aug- mente, elle d iminue au contra i re entre Mars et Septembre. Chez les Fucus sereatus, la var ia t ion est plus marqu6e que chez les Peloetia canalicn- lata et ]es Fucus oesicnlosus.

Par rappor t aux l ipides polaires phosphat6s du groupe 2, les X n , Xll, et XI~ sont net tement moins satur6s dans le cas des trois algues. Les spectres IR de ces trois l ipides pr6sentent des bandes h 810-815 cm -1 (SO 4 en posi t ion 6quatoriale), 800-860 (O-S stretching), 12:00-1240 (C-O-S), 3400 (OH stretching) 2900-2880-1465 (CHzCH2), 1380-1365 (doublet), 1100-1010 (CO), 1235 (S-O) et enfin 815 (O-S) (figure 6).

Ces bandes sont routes pr6sentes dans les spec- tres IR de ces trois substances, seule leur abon- dance relative diff6re. Les spectres de masse de ces l ipides sont aussi comparables quant aux pics pr6sents et h leur impor tance relative (fig. 7).

3-0 ~k0_

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BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.

54) MICRONS 6"0 7"0 ~-0 9-0 ] i 0 12 I/, 16 . t . . . . . . . . ~ . . . . . • _ _ 1 _ l . . . . . . . . . . 1 - I 0 0

J

-80

60

-&0

- - 2 0

2~o 0

I . . . . . . t l I I ! O0 1600 I~00 1200 1000 800 ~25

( C M - 1 )

FIe.. 6. Spectre IR des X1~.

1378 P h a m Q u a n g L i e m et M.-H. L a u r .

Nous avons not6 dans ces spectres de masse Ies pics m / e = 837 (M), 741 (M-SO~), 563 (M-6 Sulfate, Glc), 579 (M-Glc), 582 (M-CI~:0), 5.5.8 (M-Cls:e). Tous ces pics permet ten t de conf i rmer les struc- tures de ces trois l ipides 6tablies an t6r ieurement Ces derniers sont tous des monoglycosyl esters sulfate diglyc6rides. En~m les X13, derniers l ipides soufr6s du groupe 3, sont tr6s abondants chez les Fucus serratus. Chez les Fucus vesiculosus et PeI- vatia canaIiculata ils sont aussi pr6.sents mats en quantit6 net tement plus faible. Les analyses 616-

disubstitu6s glucosyl, et TMS-2,3 disubstitu6s gatactosyl (figure 8). L 'analyse s6quentielle par hydrolyse douce graduelle des X13 t r im6thyls i ly- 16s condui t aux conclusions suivantes :

1) Le glucose est en posi t ion te rminale de la s6quence. II est li6 en C4 par pont osidique au C1 du galactose. Les C3 et C6 sont t o u s l e s deux est6- rifi6s par SO~H 2.

2) Le galactose est felt6 en C1 au C4 du glu- cose par pont osidique. Le C4 est li6 au C3 du gly-

100 . . . . . . .

ttO

6o--

i,C-

20-

0

36~

" [ . . . . ' . . . . I ' ' " . . . . I . . . . ' . . . . I . . . . ' . . . . E . . . . ' . . . . U ~ q " ~ ' 7 . . . . I . . . .

I00 20o 300 400 5O0 600 700 g o 0 90O

m ] ¢

Fie. 7 . - Spectre de masse des Xn.

'""-I ' " " : " l ; : ~ " " " l ~''~ ... . i ' ~ ' " ] 0 ~ ]lO0 1200 1300 1400

mentaires ont condui t h la formule C~1,32H90,21 O23,60S2,96 (tableau D. L 'hydrolyse en pr6sence de ttC1/MeOH 2 p. cent h 20°G pendan t 5 h permet d ' isoler les const i tuants mol6culaires des X13. Dans les extraits 6th6rosolubles nous avons isol6 des

c6rol et le Ci6 est est6rifi6 par une mol6cule d 'acide sulfonique. Ce dern ie r a 6t6 mis en 6vi- dence par diff6rentes nl6thodes de caract6r isat ion physico-chimiques et plus par t icu l ibrement par spectrom6trie de masse et IR (figures 9 et 10).

T M S ( d l m c t h y t l u¢ose~

Fro. 8. - - Chromatographic en phase vapeur des d~rivds 1, 2 TMS glucosgl et 2, 3 TMS galactosgl constituants des X1s, plus t~moins.

acides hexad6canoique et octad6canoique, ces deux acides sont pr6sents en quanti t6 6quimol6.- culaire. ,La f rac t ion hydrosoluble cont ient du gly- c6rol, des glucides, des esters sulfates et sulfo- nates. Aprbs t r im6thyls i ly la t ion au pr6alable, les glycosyl esters TMS d6riv6s sont analys6s par la chronlatographie en phase vapeur en pr6sence des t6moins. Les produi ts identif i6s sont des TMS-1,2

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.

Les spectres IR des X13 donnen t en effet des pics caract6rist iques h 860-9'0.0 (O-S stretching), 810-815 (SO 4 6quatorial), 1220-1240 (S-O), 1350 (SO,,), 900 (S-O) 1160 (SO 2 stretching), 3400 (OH stretching), 2930-28.80 (CH3CH2) , 1235 (S-O-C), 815 (O-S).

Les spectres de masse des X13 sont caract6ris6s par tes pics m / e = 114.6 (M), 1050 (M-SO4), 954

Les g lycosy l es ters diglycdrides de trois fucacdes . 1379

(M-2)<. SO~), 807 (M-OGlc disulfate), ces derniers conf i rment la presence du 3,6 sulfate ester glu- cosyl dans la mol6cule. De m6me, les pics m / e 597 (M-C1~H26Ol~S~), 581 (M-6, monosul fonaie Gal

Concernant les taux relatifs des ]ipides polaires soufr~s et phosphor~s des groupes 2 et 3, il faut surtout s ignaler que les Fucus serratus sont plus r iches en polyesters sulfates et phosphates et plus

V cH 3 CH 2

I

OH Slretc

160C 14oo 12oo iooo ~co ~o

_o t ~o

FIG. 9. - - Spectre IR des X~.

+ 3,6 disulfate Glc) permet tent d '6tablir la pr6- sence simultan6e des 6, sulfonate galactosyl et 3,6, disulfate glucosyl dans ]a mol6cule des X1~. Nous avons aussi not6 les pics 891 (M-C16:u), 867 (M-Cls:,,). Ces deux acides gras sont des consti-

pauvres en monoesters sulfates et phosphates que les Peh, etia canaliculata et Fucus vesiculosus. Les 6tudes comparat ives feront l 'objet d 'une discus- sion d6taill6e dans une note s~par6e. Ajoutons en outre que les algues de << profondeur >) sont en

!! .i,!! 0 +oo 2 O0

. . . . . . . . . / +,s +5~ S . . . . . .

972 M i ++ , l, t 7 + ± I +42 +

+PI'P+ ' + L ' I ' " + ' ; ' " : ' I ' ' " ' + ' ' I . . . . + . . . . i . . . . ' . . . . I . . . . ' . . . . l . . . . ' . . . . I . . . . ' . . . . I . . . . ' . . . . I . . . . ' . . . . I ' ' ' + ' . . . . ] . . . . ' . . . . I

300 ~00 sO0 ~00 700 ~00 9 O0 lo00 t 19o ~ 20 0 1300 ~4~0

Fro. 1 0 . - Spectre de masse des XI+~.

tuants des X13, ce qui d 'ai l leurs a 6t6 d~montr~ ant~rieurement .

Signalons pour t e rminer que la sa turat ion potentiel le des acides gras consti tutifs des Xla est re la t ivement basse. Chez les Fueus serratus l ' ind ice de sa turat ion potentiel le est net tement peu &lev~ par rapor t h celui des Pelvetia canalicl+lata et Fucus vesiculosus.

BIOCHIMIE, 1976, 58, n ° 11-12.

g~n~ral plus r iches en l ipides phosphor~s que les algues de << surface >>. Ces derniers sont r iches en l ipides polaires sulfates en par t icu l ie r les mono- esters sulfates.

CONCLUSIONS.

Les glycosyl esters sulfates, sulfonates, phos- phates diglyc~rides sont des l ipides polaires tr~s

94

1 3 8 0 P h a m Q u a n g L i e m e t M . - H . L a u r .

i o n i q u e s . T e n e u r , c o m p o s i t i o n et s a t u r a t i o n p o t e n - t i e l l e s o n t t r o i s c a r a c t 6 r i s t i q u e s sp&ci f iques d6f i - n i s s a n t l ' 6 q u i p e m e n t en l i p i d e s p o l a i r e s de cha - e u n e des t r o i s e s p6ces 6 tud i6es . L a p r 6 s e n e e de ces m o l 6 e u l e s d a n s les c h l o r o p l a s t e s et m i t o c h o n - d r i e s e n p a r t i c u l i e r [251 et la d i f f i cu l t6 d e l e u r e x t r a c t i o n p e r m e t t e n t de p e n s e r q u ' i l s ' a g i t v r a i - s e m b l a b l e m e n t de l i p i d e s p o l a i r e s l i6s ~ u n e i n f r a - s t r u c t u r e o r g a n i s 6 e des ce l lu les . Les e h a n g e m e n t s des 6 ta ts m 6 t a b o l i q u e s des t h a l l e s n ' o n t p a s af fec t6 s i g n i f i e a t i v e m e n t le t a u x et la c o m p o s i t i o n de ces t i p i d e s , l a n d i s q u e les c o n d i t i o n s 6 c o l o g i q u e s e n p a r t i c u l i e r la l u m i 6 r e p e u v e n t d 6 t e r m i n e r ces v a r i a t i o n s d a n s de t r6s l a r g e s l im i t e s . I1 f a u t t ou t e - fo is t e n i r c o m p t e d a n s la d 6 l e r m i n a t i o n q u a n t i t a - t i v e des g lycosy l e s t e r s su l fa t e s , s u l f o n a t e s , p h o s - p h a t e s d i g l y e 6 r i d e s des d i f f i cu l t6s d ' e x t r a c t i o n de ces s u b s t a n c e s . Les t h a l l e s s o n t en effet p r o t 6 g 6 s p a r u n e p a r o i m u c i l a g i n e u s e t r6s 6pa i s se de n a t u r e m u c o p o l y s a c c h a r i d i q u e s u l f a t e et p h o s p h a t 6 . Ces m u c i l a g e s s o n t s o u v e n l a s soc i6s h des p r o t 6 i n e s p l u s ou m o i n s b a s i q u e s p a r des l i a i s o n s h y d r o - g6ne ou de c o v a l e n c e t r6s so l ides . I l s j o u e n t u n r61e p r o t e c t e u r e f f i eace c o n t r e la d e s s i c c a t i o n des t h a l l e s lo r s de l ' 6 m e r s i o n p r o l o n g 6 e . L a f o r t e po la - r i t 6 de ees m u c i l a g e s r e n d l ' e x t r a e t i o n des su l fo et p h o s p h o l i p i d e s t r 6 s i o n i q u e s p a r t i c u l i 6 r e m e n t d i f f i c i l e , la p l u p a r t des m 6 t h o d e s e l a s s i q u e s se r6- v~ len t i n e f f i e a c e s . P a r a i l l eu r s , les ¢ f a u x - c o m - p l e x e s >> l i p o g l y c o p r o t 6 i n e s p r 6 s e n t s d a n s ]es di- v e r s e s m e m b r a n e s e e l l u l a i r e s r e t i e n n e n t f o r t e m e n t les GED, les d 6 n a t u r a t i o n s l o r s des e x t r a c t i o n s p e u v e n t 8 t re i m p o r t a n t e s . L ' e n s e m b l e des GED j o u e n 6 a n m o i n s u n r61e i m p o r t a n t en t a n t que g r o u p e s de s u b s t a n c e s m e m b r a n a i r e s . L e u r i n t e r - v e n t i o n ou l e u r i n t e r f e r e n c e d a n s l ' a d a p t a t i o n des s y s t 6 m e s p h o t o s y n t h 6 t i q u e s et 6ne rg f i t i ques a v e c les d i v e r s e s c o n d i t i o n s 6 e o l o g i q u e s de l ' h a b i t a t des a lgues a p p a r a i t d o n e 6 v i d e n t e . On sa i l d6jh que les l i p i d e s p o l a i r e s p a r l e u r e a r a e t b r e axnphi - p h i l e et i o n i q u e j o u e n t u n r61e de p r e m i e r p l a n d a n s le t r a n s f e r t 6 1 e c t r o n i q u e i n t r a et i n t e r m o l 6 - eu l a i r e . I ls p o u r r a i e n t auss i a v o i r u n r61e p r 6 p o n - d ~ r a n t d a n s la d i s p e n s e 6 n e r g 6 t i q u e des e n z y m e s m i t o c h o n d r i a l e s ou c y t o p l a s m i q n e s .

R~SUM~.

Le glycosyl mono et polyesters sulfate, su l fonate et phospha te diglyc~rides cons t i tuen t les groupes de l i- p.ides polaires pond~ra lement les plus i m p o r t a n t s chez les t ro is fucacdcs 6tudi~es : Pelve t ia canaliculata (L) Deen et Thur, Fucus vesieulosus (L), Fucus serratus (L).

De s t ructure complexe, la p lupa r t de ces substances est inconnue dans la nomenc la tu re actuelle. Leur taux et composi t ion caractdr isent chaque esp6ce d'algue. IIs d~ te rminent l ' dqu ipemeat l ip id iqne de chacune d'c]les.

Tous ces glycosyl esters sulfate, su l fonate et phos- pha te diglyc~rides sont des substances trfis fragiles, the rmolab i les et photod6gradables h ]Y~tat pur. Cette fragil i t~ rend difficiles les ~tudes de ]cur s t ruc ture moldculaire, lesquelles ndcessi tent leur i so lement et purif icat ion tr6s soignge au pr6alable.

Les df i terminat ions de stru,cture, t eneur et composi- t ion a ins i qne la ]ocal isa t ion cytologique de ces ]ipides doivent permet t re d 'glucider leur rSle physiologique in t raee l lu la i re et de dfitermir~er leur impor tance au point de rue b ioch imique et deologique.

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