STTASTTA Ames mutagenitási vizsgálatAmes mutagenitási vizsgálat

In vivo mikronukleuszIn vivo mikronukleusz

Tarnóczai Tímeatarnoczai.timea@okbi.antsz.hu

2012. 11. 27.

MutációkMutációk Mindig genetikai eredetű (környezeti Mindig genetikai eredetű (környezeti

vagy endogén hatás)vagy endogén hatás) Minél több mutáció jön létre, annál Minél több mutáció jön létre, annál

nagyobb a rák kialakulásának nagyobb a rák kialakulásának valószínűségevalószínűsége

Sok vegyi anyag kis dózisban Sok vegyi anyag kis dózisban mutagén, nagy dózisban mutagén, nagy dózisban citotoxikuscitotoxikus→genotoxikus anyagok→genotoxikus anyagok

TautomerizációTautomerizáció

Fizikai tényezők: ionizáló és nem-ionizáló Fizikai tényezők: ionizáló és nem-ionizáló sugárzássugárzás

Ionizáló: rövid hullámhossz, atomokat ionokká Ionizáló: rövid hullámhossz, atomokat ionokká alakítjaalakítja→vízből szabadgyökök →vízből szabadgyökök keletkeznek→intenzív oxidációkeletkeznek→intenzív oxidáció

Determinisztikus (küszöbdózis) és Determinisztikus (küszöbdózis) és sztochasztikus hatás (vagy kialakul, vagy sztochasztikus hatás (vagy kialakul, vagy nem, dózissal nő a valószínűség)nem, dózissal nő a valószínűség)

Nem-ionizáló: hosszú hullámhossz (pl. UV, Nem-ionizáló: hosszú hullámhossz (pl. UV, timin dimerizáció)timin dimerizáció)

Mutagén tényezőkMutagén tényezők

kémiai tényezők: kémiai tényezők: hatásmechanizmusok alapján lehetnek:hatásmechanizmusok alapján lehetnek:

bázisanalógokbázisanalógokinterkaláló vegyületekinterkaláló vegyületek

(gyűrűs szerkezetű anyagok, beépülnek)(gyűrűs szerkezetű anyagok, beépülnek)alkiláló vegyületekalkiláló vegyületekdeamináló vegyületekdeamináló vegyületekszabadgyököt képező vegyületekszabadgyököt képező vegyületeknehézfémeknehézfémekDNS-szintézis inhibitorokDNS-szintézis inhibitorok

BázisanalógokBázisanalógok: A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, : A természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz beépíti a kettős spirálbaa DNS polimeráz beépíti a kettős spirálba

pl. 5-brómuracil (5BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is pl. 5-brómuracil (5BU) : timin analóg adeninnel és guaninnal is képes párosodni, tranzíciót okoz képes párosodni, tranzíciót okoz

Deamináló szerekDeamináló szerek: indukált deaminációt okoz: indukált deaminációt okoz

pl. salétromossavpl. salétromossav

citozincitozin→→uracil, mely a következő replikáció során uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodikadeninnel párosodik

és C-G > T-A tranzíciót okozés C-G > T-A tranzíciót okoz

Alkiláló szerekAlkiláló szerek: alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a : alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak nukleinsavak

bázisaira és azokat módosítjákbázisaira és azokat módosítják

pl.etil-metánszulfonápl.etil-metánszulfonát t (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítjatimint módosítja

a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményeza 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

Környezeti mutagén anyagokKörnyezeti mutagén anyagokéélelmiszeradalékoklelmiszeradalékok:: nitritek, nitritek, nitrátok nitrátok nátriumbisziulfitnátriumbisziulfitciklohexaminciklohexaminkozmetikumokkozmetikumok::hajfesték (nitrofenilén-diamin)hajfesték (nitrofenilén-diamin)H2O2H2O2femnilén-diaminfemnilén-diamindiaminotoluoldiaminotoluoldiaminoanizoldiaminoanizolgyógyszerekgyógyszerek::citosztatikumokcitosztatikumokaltató és nyugtató szer altató és nyugtató szer fertőtlenítőszerek (formaldehid, Hfertőtlenítőszerek (formaldehid, H22OO22))növényvédőszerek, herbicidek, növényvédőszerek, herbicidek, insecticidekinsecticidek::klórozott szénhidrogénekklórozott szénhidrogénekszerves-foszforsav észterekszerves-foszforsav észterekkarbamidok, karbamátok, karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületekftálamidok, szerves higanyvegyületek

Vegyiparban használt köztes és Vegyiparban használt köztes és végtermékek:végtermékek:epoxidokepoxidoketilén-imineketilén-iminekacetaldehidacetaldehidAkrilaldehidAkrilaldehidpropán szulfonpropán szulfonDimetil-szulfát Dimetil-szulfát Dietil-szulfátDietil-szulfátdimetil-nitrózamindimetil-nitrózaminhidrazinokhidrazinokuretánuretánEtilén-kloridEtilén-kloridVinil-kloridVinil-klorid

Levegőszennyezés:Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogénekpoliciklikus aromás szénhidrogének

Szervetlen mikroszennyezőkSzervetlen mikroszennyezők::nehézfémeknehézfémekazbesztazbeszt

Szerves mikroszennyezőkSzerves mikroszennyezők::gomba és baktériumok által termelt toxinokgomba és baktériumok által termelt toxinok

STTA (STTA (stablestable transfected transfected transcriptional activation transcriptional activation

assay)assay) Endokrin diszruptorok azonosításáraEndokrin diszruptorok azonosítására OECD 455 guidelineOECD 455 guideline Hormonreceptorok citoplazmábanHormonreceptorok citoplazmában Szubsztrát kötődésSzubsztrát kötődés Dimerizáció és aktiválódásDimerizáció és aktiválódás Receptor-ligand komplex DNS promóterhez Receptor-ligand komplex DNS promóterhez

kötődikkötődik→transzkripció aktiválása→transzkripció aktiválása

STTA assay-ben:STTA assay-ben: hERhERαα-HeLa-9903 sejtvonal-HeLa-9903 sejtvonal Legrégebbi humán sejtvonalLegrégebbi humán sejtvonal Méhnyakrákból származik (Henrietta Lacks)Méhnyakrákból származik (Henrietta Lacks) HeLa genetikailag módosított változata→ HeLa genetikailag módosított változata→

ösztrogén reszponzív elemek, ösztrogén receptorösztrogén reszponzív elemek, ösztrogén receptor

DNS-ben szintetikus promóter kötőhellyelDNS-ben szintetikus promóter kötőhellyel Promóter után luciferáz génPromóter után luciferáz gén→hormon hatású anyag kötődése →hormon hatású anyag kötődése

esetén átíródikesetén átíródik Szubsztrát (luciferin) hozzáadásaSzubsztrát (luciferin) hozzáadása Fény szabadul fel, amit mérni lehet (luminométer)Fény szabadul fel, amit mérni lehet (luminométer) Minél nagyobb a fény aktivitása, annál nagyobb a hormonreceptor Minél nagyobb a fény aktivitása, annál nagyobb a hormonreceptor

hatás (1 hatás (1 μμM határig)M határig) Pozitív és negatív referencia anyagok (határokon belül!)Pozitív és negatív referencia anyagok (határokon belül!) Pozitív és negatív kontroll Pozitív és negatív kontroll

HR: Hormon Receptor

hER: humán ösztrogén receptor

ERE:Estrogen-Responsive Element

ligandum

HR

5’ 3’

luciferáz

fény

5’ 3’

sejtmag

citoplazma

Lu

cife

ráz

akti

vitá

s0 10-12 10-11 10-10 10-9 M

dimerizáció

ERE

luciferázERE

Full length of hER

hER Luciferin-luciferáz

reakcóvegyület

Bruce Ames 1970-es évek elejénBruce Ames 1970-es évek elején Pontmutációt okozó kémiai anyagok Pontmutációt okozó kémiai anyagok

észlelésére alkalmas (genetikai betegségek)észlelésére alkalmas (genetikai betegségek) Prokarióta sejtekProkarióta sejtek Aminosav szintetizáló képesség károsodottAminosav szintetizáló képesség károsodott Öröklött génmutáció reverziójaÖröklött génmutáció reverziója A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a A kémiai anyag által okozott mutáció ezt a

képességet állítja vissza (back mutáció)képességet állítja vissza (back mutáció) Minél több mutációt okoz egy anyag, annál Minél több mutációt okoz egy anyag, annál

valószínűbb, hogy pont az a triplet mutálódikvalószínűbb, hogy pont az a triplet mutálódik

Bakteriális reverz Bakteriális reverz mutagenitási vizsgálatmutagenitási vizsgálat

Különbözik az emlőssejtektől Különbözik az emlőssejtektől (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, (metabolizmus, kémiai anyagok felvétele, kromoszómaszerkezet)kromoszómaszerkezet)Metabolikus aktivizálás kívülrőlMetabolikus aktivizálás kívülrőlCitokróm P450 oxidációs rendszer (májban)Citokróm P450 oxidációs rendszer (májban) S9 mikroszóma frakció + NADP + S9 mikroszóma frakció + NADP + kofaktorokkofaktorokEnzim termelődésének növelése→inducerEnzim termelődésének növelése→inducerNem mindig alkalmazható (baktericid Nem mindig alkalmazható (baktericid vegyületek)vegyületek)Spontán módon is visszafordulhat a Spontán módon is visszafordulhat a mutáció (spontán revertánsok-negatív mutáció (spontán revertánsok-negatív kontroll)kontroll)

TeszttörzsekTeszttörzsek

Escherichia coliEscherichia coli és és Salmonella typhimuriumSalmonella typhimurium E. coli E. coli triptofán mutáns (WP2 uvrA), triptofán mutáns (WP2 uvrA),

S. typhimuriumS. typhimurium hisztidin mutáns (TA98, hisztidin mutáns (TA98, TA100, TA1535, TA1537)TA100, TA1535, TA1537)

Mutációk a hisztidin és triptofán operon Mutációk a hisztidin és triptofán operon különböző részén (más-más törzsek)különböző részén (más-más törzsek)

Back mutáció hatására aminosav hiányában Back mutáció hatására aminosav hiányában is nőnekis nőnek

Negatív és pozitív kontroll kellNegatív és pozitív kontroll kell

Egyéb genetikai módosításokEgyéb genetikai módosítások

Cél az érzékenység növeléseCél az érzékenység növelése Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok Rfa mutáció: nagy molekulasúlyú anyagok

bejutása bejutása uvrA/uvrB mutáció: DNS javító uvrA/uvrB mutáció: DNS javító

mechanizmus mutációjamechanizmus mutációja pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás pKM101 plazmid: Kémiai és UV-besugárzás

szembeni érzékenység növelése, ampicillin szembeni érzékenység növelése, ampicillin rezisztenciarezisztencia

Törzsek ellenőrzése szükségesTörzsek ellenőrzése szükséges

Előinkubációs és lemezöntéses módszerElőinkubációs és lemezöntéses módszer Speciális anyagoknál módosításokSpeciális anyagoknál módosítások

10 órás szuszpenziós tenyészet készítése10 órás szuszpenziós tenyészet készítése Másnap kémcsőben tenyészet + puffer + Másnap kémcsőben tenyészet + puffer +

kontroll vegyület/teszt anyag + top agarkontroll vegyület/teszt anyag + top agar Minimál agaros Petri-csészére önteniMinimál agaros Petri-csészére önteni Top agar megszilárdulásaTop agar megszilárdulása Inkubálás 48-72 óráig 37°C-onInkubálás 48-72 óráig 37°C-on Előinkubáció esetén top agar nélküli Előinkubáció esetén top agar nélküli

keverék inkubálása (előinkubáció ideje 20-keverék inkubálása (előinkubáció ideje 20-40 perc)40 perc)

Telepszámolás, mikroszkópos értékelésTelepszámolás, mikroszkópos értékelés Eredmények értékelése (szignifikáns Eredmények értékelése (szignifikáns

emelkedés/statisztikai értékelés)emelkedés/statisztikai értékelés)

A vizsgálat meneteA vizsgálat menete

Aminosav igény ellenőrzése(minimál agar)

Ampicillin rezisztencia,kristályibolya- és UV-érzékenység

(tápagar)

Spontán mutáció (negatív kontroll) Indukált mutáció (pozitív kontroll)

Negatív kontroll, normál baktériumpázsit

25μg/lemez glutáraldehid toxikus hatása

Ames II.Ames II. módosított Ames vizsgálatmódosított Ames vizsgálat 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez 96 v. 384 lyukú mikrotiter lemez TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár TA 98 (frameshift) és TAMix (6 törzs, bázispár

szubsz.) szubsz.) baktériumok és teszt anyag + hisztidin = savas baktériumok és teszt anyag + hisztidin = savas

közeg, melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából közeg, melyet a pH indikátor festék érzékel (lilából sárgába vált)sárgába vált)

automatizált, kisebb mennyiség is elégautomatizált, kisebb mennyiség is elég

In vivo mikronukleuszIn vivo mikronukleusz

Genotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákonGenotoxikus károsodás vizsgálata eritrocitákon Kromoszómakárosodás következtében kialakuló Kromoszómakárosodás következtében kialakuló

mikronukleusz meglétemikronukleusz megléte Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr. Mikronukleusz: membránnal határolt teljes kr.

vagy kr. darab vagy kr. darab

Emlős csontvelőben vagy perifériális vérbenEmlős csontvelőben vagy perifériális vérben OECD Guideline 474OECD Guideline 474

(a) a mikronukleusz acentrikus kromoszóma fragmensből származik

(b) a mikronukleusz egész kromoszómát tartalmaz

A csontvelőben történik az A csontvelőben történik az vörösvérsejtek érésevörösvérsejtek érése

NormocitaNormocita→polikromáziás →polikromáziás eritrocita eritrocita fejlődés során a mag kipréselődik a fejlődés során a mag kipréselődik a sejtbőlsejtből

Ha keletkezett mikronukleusz, azt az Ha keletkezett mikronukleusz, azt az polikromáziás eritrocitában láthatjukpolikromáziás eritrocitában láthatjuk

A mikronukleusszal rendelkező A mikronukleusszal rendelkező eritrocitaszám emelkedés eritrocitaszám emelkedés megemelkedett kromoszómális megemelkedett kromoszómális károsodásra utalkárosodásra utal

Állatok kezelése subcutan (bőr alatt) vagy Állatok kezelése subcutan (bőr alatt) vagy per os (szájon át)per os (szájon át)

Kontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoportKontroll (negatív és pozitív) és kezelt csoport Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen Megfelelő oldószer kiválasztása: ne legyen

toxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggaltoxikus, ne lépjen reakcióba a tesztanyaggal Kezelés egyszerKezelés egyszer→leölés és csontvelő kivétele →leölés és csontvelő kivétele

(24 és 48 órával a kezelés után)(24 és 48 órával a kezelés után) Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer Perifériális vérminta esetén vérvétel kétszer

(36 és 72 órával a kezelés után)(36 és 72 órával a kezelés után) Femur preparálás→csontvelő fötális Femur preparálás→csontvelő fötális

borjúsavóba→centrifugálás→kenetkészítésborjúsavóba→centrifugálás→kenetkészítés

Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Kenetkészítés után festés (May-Grünwald és Giemsa)Giemsa)

Normocita Polikromáziás eritrocita mikronukleusszal és anélkül

Egy polikromáziás eritrocita az érett eritrociták között

Értékelés mikroszkóppalÉrtékelés mikroszkóppal Először polikromáziás eritrocita Először polikromáziás eritrocita

(PCE)/normocita(NCE) arány (PCE)/normocita(NCE) arány meghatározása (100 db PCE meghatározása (100 db PCE leszámolás)leszámolás)

2000 PCE közül mennyiben van 2000 PCE közül mennyiben van mikronukleusz mikronukleusz

PCE/NCE arány 0,1 felett kell legyenPCE/NCE arány 0,1 felett kell legyen A vizsgálat végén az alább adatokra A vizsgálat végén az alább adatokra

lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ lesz szükség: MPCE/2000 PCE, NCE/ 100 PCE, PCE/NCE arány100 PCE, PCE/NCE arány

Statisztikai értékelés Statisztikai értékelés