sử dụng kỹ thuật fish để kiểm tra sự hội nhập của gen il–6 phân lập

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

Nguyễn Tiến Lung

SỬ DỤNG KỸ THUẬT FISH ĐỂ KIỂM TRA

SỰ HỘI NHẬP CỦA GEN IL–6 PHÂN LẬP TỪ NGƯỜI

TRONG TẾ BÀO GỐC PHÔI GÀ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2013

BÌA



---------------------

Vũ Anh Tuấn

ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SODIUM BENZOATE,

PROPYL GALLATE, TARTRAZINE, AMARANTH,

MONOSODIUM GLUTAMATE VÀ FORMALDEHYDE

TRÊN MÔ HÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI CÁ NGỰA VẰN


Hà Nội – 2015



---------------------

Vũ Anh Tuấn

ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA SODIUM BENZOATE,

PROPYL GALLATE, TARTRAZINE, AMARANTH,

MONOSODIUM GLUTAMATE VÀ FORMALDEHYDE

TRÊN MÔ HÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI CÁ NGỰA VẰN

Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm

Mã số: 60.42.0114


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nguyễn Lai Thành

TS. Hoàng Thị Mỹ Hạnh

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS. TS. Nguyễn Lai

Thành, người thầy đã thu nhận, hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức và

kinh nghiệm trong suốt thời gian học tập nghiên cứu tại phòng thí nghiệm. Thầy đã

luôn theo sát, chỉ bảo cho tôi những góp ý quý báu để tôi có thể hoàn thành tốt công

việc.

Tôi cũng rất biết ơn TS. Hoàng Thị Mỹ Hạnh đã chỉ bảo, hướng dẫn tôi kiến

thức, kỹ năng mới để tôi hoàn thiện được luận văn tốt nghiệp này.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến NCS. Đinh Duy Thành, người đã chỉ dạy, hướng

dẫn cho tôi từ những ngày đầu tôi vào làm việc tại phòng, truyền đạt cho tôi những

kinh nghiệm trong công việc cũng như trong cuộc sống.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến các thầy cô công tác tại bộ môn Sinh

học Tế bào cũng như các thầy cô trong khoa Sinh học đã truyền đạt cho tôi những

kiến thức cơ sở, làm nền tảng cho việc thực hiện nghiên cứu.

Tôi xin cảm ơn tất cả các anh chị, các bạn và các em sinh viên đang học tập

và công tác tại phòng Công nghệ Tế bào Động vật - Trung tâm Nghiên cứu Khoa

học Sự sống, đặc biệt là học viên cao học Lưu Hàn Ly đã luôn bên cạnh giúp đỡ, hỗ

trợ tôi trong thời gian thực hiện nghiên cứu.

Tôi xin được chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân, đã luôn ở

bên, động viên cho tôi có thêm nghị lực để vượt qua được khó khăn trong suốt thời

gian qua.

Hà Nội, tháng 12 năm 2015

Học viên

Vũ Anh Tuấn

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 3

1.1. THỰC TRẠNG SỬ DỤNG HÓA CHẤT ........................................................... 3

1.2. PHỤ GIA THỰC PHẨM ....................................................................................... 4

1.2.1. Sơ lược về phụ gia thực phẩm .................................................................. 4

1.2.2. Các loại phụ gia thực phẩm được sử dụng trong nghiên cứu ............... 6

1.2.2.1. Chất bảo quản - Sodium benzoate ................................................... 6

1.2.2.2. Chất chống ô xy hóa - Propyl gallate .............................................. 7

1.2.2.3. Chất tạo màu vàng - Tartrazine ...................................................... 8

1.2.2.4. Chất tạo màu đỏ - Amaranth ........................................................... 9

1.2.2.5. Chất điều vị - Monosodium glutamate ............................................ 9

1.2.2.6. Chất bảo quản đã bị cấm sử dụng - Formaldehyde ...................... 10

1.3. CÁC MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH HÓA CHẤT ................................. 10

1.3.1. Sử dụng động vật thí nghiệm trong đánh giá độc tính hóa chất ........ 11

1.3.2. Mô hình thay thế động vật thí nghiệm trong đánh giá độc tính hóa

chất ............................................................................................................ 12

1.3.2.1. Mô hình đánh giá độc tính sử dụng tế bào nuôi cấy in vitro ......... 12

1.3.2.2. Mô hình phôi cá ngựa vằn trong đánh giá độc tính ...................... 12

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................... 18

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 18

2.2. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ................................................................. 18

2.2.1. Dụng cụ, thiết bị ....................................................................................... 18

2.2.2. Hóa chất .................................................................................................... 19

2.3. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM ............................................................................... 21

2.3.1. Quy trình nuôi cá bố mẹ và thu phôi ..................................................... 21

2.3.2. Phơi nhiễm với hóa chất ......................................................................... 21

2.3.3. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất phụ gia tới sự phát triển phôi

dựa trên hình thái và sức sống ............................................................... 23

2.3.4. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất đến nhịp tim phôi/ấu thể cá ngựa

vằn ............................................................................................................. 25

2.3.5. Phân tích thống kê ................................................................................... 25

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 27

3.1. SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SỨC SỐNG CỦA PHÔI CÁ NGỰA VẰN

KHI PHƠI NHIỄM VỚI CÁC CHẤT PHỤ GIA ............................................. 29

3.1.1. Hình thái phôi cá ngựa vằn đối chứng .................................................. 29

3.1.2. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất tạo màu ...................... 30

3.1.2.1. Phơi nhiễm với chất tạo màu vàng Tartrazine (E102) .................. 30

3.1.2.2. Phơi nhiễm với chất tạo màu đỏ Amaranth (E123) ....................... 34

3.1.3. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất bảo quản .................... 36

3.1.3.1. Phơi nhiễm với sodium benzoate (E211) ....................................... 36

3.1.3.2. Phơi nhiễm với propyl gallate (E310) ........................................... 39

3.1.4. Nhóm chất điều vị - Monosodium glutamate (E621) .......................... 41

3.1.5. Chất bảo quản đã bị cấm sử dụng – Formaldehyde (E240) ............... 43

3.1.6. Sự ảnh hưởng của hóa chất đến tỷ lệ phôi nở ...................................... 47

3.2. SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HÓA CHẤT THỬ NGHIỆM ĐẾN NHỊP

TIM PHÔI CÁ NGỰA VẰN ............................................................................... 49

3.3. ĐỘC TÍNH CỦA CÁC CHẤT PHỤ GIA TRONG NGHIÊN CỨU ............. 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Sự tương đồng về gen hoạt động giữa người, chuột, gà và cá ngựa vằn .. 13

Hình 1.2: So sánh kết quả từ thử nghiệm độc tính trên các loài cá và thử nghiệm

trên phôi cá ngựa vằn ............................................................................... 15

Hình 1.3. Các lĩnh vực nghiên cứu sử dụng phôi cá ngựa vằn và số lượng nghiên

cứu được công bố từ 1992 đến 2015 ....................................................... 17

Hình 2.1. Hình thái cá ngựa vằn trưởng thành .......................................................... 18

Hình 2.2. Phân bố nồng độ trên đĩa 24 giếng ............................................................ 22

Hình 2.3. Hình thái phôi cá ngựa vằn ở một số giai đoạn theo Kimmel .................. 24

Hình 3.1. Hình thái phôi và ấu thể cá ngựa vằn đối chứng ....................................... 29

Hình 3.2. Phôi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với Tartrazine nồng độ 8 g/l ................ 30

Hình 3.3. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở

thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau thụ tinh ................................................... 31

Hình 3.4. Phôi cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với Tartrazine ...................................... 32

Hình 3.5. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở

thời điểm 96 giờ sau thụ tinh ................................................................... 34

Hình 3.6. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Amaranth 35

Hình 3.7. Phôi cá ngựa vằn sau 96 giờ phơi nhiễm với Amaranth ........................... 36

Hình 3.8. Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Sodium benzoate ................................. 37

Hình 3.9. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Sodium benzoate

................................................................................................................. 38

Hình 3.10. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Propyl gallate

................................................................................................................. 39

Hình 3.11. Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Propyl gallate .................................... 40

Hình 3.12. Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Monosodium glutamate .................... 41

Hình 3.13. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với

Monosodium glutamate ........................................................................... 42

Hình 3.14. Phôi cá ngựa vằn phơi nhiễm với Formaldehyde ................................... 44

Hình 3.15. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Formaldehyde

................................................................................................................. 45

Hình 3.16. Tỷ lệ các loại dị dạng quan sát được ở 96 giờ sau thụ tinh ..................... 46

Hình 3.17. Tỷ lệ phôi nở ở thời điểm 72 giờ sau thụ tinh ......................................... 48

Hình 3.18. Nhịp tim/phút của ấu thể cá ngựa vằn khi phơi nhiễm với các phụ gia .. 50

Hình 3.19. Chỉ số LC50 thu được ở các thời điểm của các chất ............................... 53

Hình 3.20. Các chỉ số độc học của các chất ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh ........... 54

Hình 3.21. Chỉ số độc học TI của các chất ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh ............. 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Phân loại phụ gia thực phẩm ...................................................................... 4

Bảng 2.1. Dụng cụ, thiết bị được sử dụng trong luận văn ........................................ 18

Bảng 2.2. Các loại hóa chất được thử nghiệm .......................................................... 20

Bảng 2.3. Một số tiêu chí đánh giá sự phát triển phôi cá ngựa vằn .......................... 23

Bảng 3.1. Các dải nồng độ thí nghiệm của các chất ................................................. 28

Bảng 3.2. Liều lượng an toàn để sử dụng hàng ngày chấp nhận được ..................... 56

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt

ADI

EC50

LC50

LOEC

NOEC

OECD

TI

Viết đầy đủ

Acceptable Daily Intake - Lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận

được

Median effective concentration - Nồng độ gây ảnh hưởng 50% cá

thể thí nghiệm

Median lethal concentration - Nồng độ gây chết 50% cá thể thí

nghiệm

Lowest observed effect concentration - Nồng độ thấp nhất quan sát

thấy ảnh hưởng đáng kể so với đối chứng

No Observed Effect Concentration - Nồng độ cao nhất không quan

sát thấy sự ảnh hưởng đáng kể so với đối chứng

Organization for Economic Co-operation and Development – Tổ

chức hợp tác và phát triển Kinh tế

Teratogenic index – chỉ số gây quái thai

1

MỞ ĐẦU

Hóa chất được sản xuất ra trên toàn cầu đang tăng lên nhanh chóng cả về số

hợp chất và sản lượng tạo ra mỗi năm. Cùng với những lợi ích đối với nền kinh tế,

nhiều hóa chất cũng có thể là mối nguy hại tiềm tàng với sức khỏe con người và

môi trường. Việc sử dụng các chất chưa biết độc tính có thể gây ra những hậu quả

nghiêm trọng như việc sử dụng thalidomide dẫn đến hàng ngàn trường hợp chết non

hoặc khuyết tật bẩm sinh [39] hay việc sử dụng DDT đã đe dọa đến sức khỏe của rất

nhiều động vật hoang dã và cả con người [87]... Do đó, việc đánh giá ảnh hưởng

của các hóa chất là rất cần thiết, đòi hỏi phải có các phương pháp kiểm định toàn

diện ở nhiều mức độ.

Việc xác định độc tính hóa chất cho đến nay vẫn đang gặp phải nhiều thách

thức. Thứ nhất, số lượng lớn các hóa chất đã được đăng kí trên thị trường cùng với

những hóa chất mới được tổng hợp chưa được đánh giá độc tính một cách kĩ lưỡng,

chưa kể đến khả năng tương tác giữa các chất có thể gây ra những ảnh hưởng kết

hợp khó đoán trước, do đó đòi hỏi sự ra đời các phương pháp kiểm nghiệm nhanh

chóng và ít tốn kém. Thứ hai, cho đến nay vẫn chưa có một mô hình hoàn hảo để dự

đoán tác động của hóa chất đối với cơ thể người. Mô hình gần nhất với con người là

thử nghiệm trên động vật có vú thì không thể thực hiện trên quy mô lớn do các vấn

đề chi phí và các rào cản bảo vệ động vật. Mô hình thực hiện trên tế bào nuôi cấy lại

không mang tính đại diện cho toàn bộ cơ thể phức tạp, không đánh giá được ảnh

hưởng của các sản phẩm chuyển hóa trong cơ thể [12], thử nghiệm trên động vật

không xương sống thì lại có sự khác biệt rất lớn với con người về các mặt di truyền,

sinh lý, chuyển hóa.

Phôi cá ngựa vằn là mô hình thử độc tính đầy hứa hẹn có thể khắc phục được

những khó khăn trên. Phôi cá ngựa vằn 4-5 ngày sau thụ tinh vẫn chưa được coi là

động vật do đó không bị ràng buộc bởi các quy định nghiêm ngặt đối với động vật

thí nghiệm, phôi có thể được chủ động sản xuất với số lượng lớn, sự phát triển phôi

sớm và hình thành cơ quan ở cá ngựa vằn rất giống với các động vật có xương sống

2

khác nhưng tốc độ phát triển nhanh hơn nhiều: chỉ sau 3 ngày từ phôi đã phát triển

thành ấu thể; phôi cá trong suốt cho phép quan sát được sự ảnh hưởng của hóa chất

trong suốt quá trình phát triển phôi sớm [40], bộ gen cá ngựa vằn cũng có nhiều

điểm tương đồng với động vật có xương sống cao hơn, đặc biệt có trên 12 nghìn

gen tương đồng với con người [32]. Ngoài ra, mô hình phôi cá ngựa vằn không chỉ

có thể đưa ra dự đoán nguy cơ đối với sức khỏe con người mà còn cho phép đánh

giá các ảnh hưởng đến môi trường nói chung [79]. Vì thế mô hình này ngày càng

nhận được sự chú ý của các nhà khoa học trong thử nghiệm độc tính.

Một nhóm hóa chất được có vai trò rất quan trọng trong đời sống hàng ngày

của con người là nhóm các phụ gia thực phẩm. Không ai có thể phủ nhận những ưu

điểm của chúng trong việc cải thiện màu sắc, hương vị của thức ăn cũng như bảo

quản thức ăn trong thời gian dài. Tuy nhiên, mức độ an toàn cũng như độc tính của

chúng đối với sức khỏe con người vẫn là điều cần phải xem xét, những chất đang

được sử dụng hàng ngày có thể có những tác động không mong muốn. Trên cơ sở

đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá độc tính của sodium benzoate, propyl

gallate, Tartrazine, amaranth, monosodium glutamate và formaldehyde trên mô

hình phát triển phôi cá ngựa vằn” nhằm mục tiêu đánh giá được độc tính của các

phụ gia thực phẩm đang được sử dụng là Sodium benzoate, Propyl gallate,

Tartrazine, Amaranth, Monosodium glutamate cùng với một chất phụ gia đã bị cấm

sử dụng là Formaldehyde dựa trên các biến đổi về hình thái và một số hoạt động

chức năng của phôi và ấu thể cá ngựa vằn. Kết quả đề tài cũng góp phần bổ sung

thông tin cho nguồn dữ liệu độc tính của các chất này.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. THỰC TRẠNG SỬ DỤNG HÓA CHẤT

Cùng với sự phát triển của khoa học, kỹ thuật và nhu cầu ngày càng cao của

xã hội, việc sản xuất hóa chất đặc biệt là các hóa chất mới hàng năm đang tăng lên

một cách đáng kể. Theo thống kê của Nordbeck và cộng sự, từ năm 1930 đến 2001,

lượng hóa chất toàn cầu đã tăng từ 1 triệu tấn lên hơn 400 triệu tấn và riêng trên thị

trường liên minh châu Âu EU có khoảng 143 nghìn hợp chất đã được đăng ký,

trong số đó có 30 đến 70 nghìn chất được dùng hàng ngày [59]. Trước khi có quy

định mới trong EU – REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and

Restriction of Chemicals), tất cả các hóa chất trên thị trường trước năm 1981 đều

được sử dụng mà không có bất kì thử nghiệm nào theo quy định của luật để chứng

minh sự an toàn với con người [7]. Mặc dù những hóa chất được sản xuất với khối

lượng lớn trên 1000 tấn một năm đã được kiểm tra, đánh giá kỹ lưỡng hơn nhưng

khoảng 21% trong số này không có bất kì dữ liệu an toàn nào và 65% có rất ít thông

tin [59].

Theo cùng với những lợi ích đối với sự phát triển kinh tế, nhiều hóa chất còn

có thể trở thành mối nguy hại tiềm tàng với sức khỏe con người và môi trường. Việc

sử dụng các chất mà chưa được nghiên cứu đầy đủ mức độ độc tính có thể gây ra

những ảnh hưởng nghiêm trọng. Hai trường hợp được biết đến nhiều là sử dụng

thalidomide như một chất điều hòa miễn dịch, thuốc an thần dẫn đến hàng ngàn

trường hợp thai nhi chết non hoặc khuyết tật bẩm sinh [6, 45] và việc sử dụng

dichloro diphenyl trichlorothane (DDT) đã đe dọa đến sức khỏe của rất nhiều động

vật hoang dã và cả con người [87, 89]... Điều đáng nhắc đến ở đây là có rất nhiều

loại hóa chất mà độc tính của chúng còn chưa được tìm hiểu một cách đầy đủ vẫn

đang được sử dụng trong cuộc sống hàng ngày của con người, chưa kể đến tác động

đồng thời khi chúng kết hợp lại với nhau.

4

1.2. PHỤ GIA THỰC PHẨM

1.2.1. Sơ lược về phụ gia thực phẩm

Phụ gia thực phẩm là nhóm chất được sử dụng hàng ngày, hàng giờ trong

cuộc sống của con người. Theo Ủy ban Bảo vệ Thực phẩm Hoa Kỳ (Food

Protection Committee – FPC), phụ gia thực phẩm là một chất hoặc một hỗn hợp các

chất tuy không phải thành phần cơ bản của thực phẩm nhưng chúng được thêm vào

trong thực phẩm một cách có chủ đích trong các công đoạn của quá trình sản xuất

thực phẩm như chế biến, bảo quản và đóng gói sản phẩm [4].

Ước tính trên thị trường có hơn 2.500 chất phụ gia khác nhau đang được sử

dụng trong thực phẩm [4]. Tại Châu Âu và một số nước trên thế giới, tất cả các loại

phụ gia thực phẩm được quản lý theo hệ thống E, theo đó, mỗi chất được phê duyệt

sẽ được kí hiệu là “E cộng số”, ví dụ Propyl gallate là E310, sodium benzoate là

E211, Tartrazine là E102… Chúng có thể được chia thành sáu nhóm chính là chất

bảo quản, chất phụ gia bổ sung dinh dưỡng, chất tạo màu, chất điều vị, các chất hỗ

trợ chế biến và nhóm các chất khác (Bảng Error! No text of specified style in

document..1).

Bảng Error! No text of specified style in document..1. Phân loại phụ gia thực

phẩm [4, 30]

Phân loại Chức năng Ví dụ

Chất bảo

quản

Chất chống oxy

hóa

Ngăn chặn quá trình oxy hóa

lipid và vitamin

Butylated hydroxy

hydroxyanisole

(E320)

Chất kháng sinh Tránh sự ảnh hưởng của vi

sinh vật và nấm

Sodium acetate

(E262), sodium

benzoate (E211)

Chất chống các

phản ứng hóa

nâu

Chống lại sự hình thành màu

nâu, đen, xám, đỏ không mong

muốn

Sodium sulfite

(E221), Sodium

bisulfite (E222)

5

Chất bổ

sung

dinh

dưỡng

Bổ sung vitamin, các amino

axit, các axit béo và các

khoáng chất

Vitamin B12;

Glutamic acid

Manganese sulfate

Chất tạo

màu

Cải thiện màu sắc, tăng độ hấp

dẫn cho món ăn

Tartrazine (E102)

Amaranth (E123)

Chất điều

vị

Bổ sung vị ngọt, vị chua, và

làm cho món ăn ngon miệng

hơn

Monosodium

glutamate (E621)

Saccharin (E954)

Các chất

hỗ trợ

chế biến

Chất nhũ hóa Giúp các thành phần phân tán

đều trong thực phẩm

Polyoxyethene

(40) stearate

(E431)

Chất ổn định Tạo kết cấu mong muốn, giữ

hương vị lâu hơn

Oat gum (E411)

Chất giữ ẩm Sodium

silicoaluminate

Các loại

khác

Các enzyme,

chất tạo phức,

tạo bọt

Amylase (E1100)

Proteases (E1101)

Theo Cansın Güngörmüş và cộng sự, trung bình mỗi năm, tính cả các loại

đường, muối, tiêu, mật ong … một người tiêu thụ khoảng 139 lbs (khoảng 63kg);

nếu không tính những chất phổ biến đó thì khoảng 2,27 kg phụ gia được sử dụng

[24]. Mặc dù các chất phụ gia thực phẩm đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ qua do

các ưu điểm trong việc cải thiện màu sắc, mùi vị thực phẩm, giúp bảo quản, giảm

thiểu sự hư hỏng thực phẩm do tác động của vi khuẩn và nấm nhưng về cơ bản,

chúng cũng như tất cả các loại hóa chất khác đều tiềm ẩn nguy cơ gây hại cho sức

khỏe con người đặc biệt là khi sử dụng với liều lượng lớn. Ảnh hưởng này có thể

ngay lập tức hoặc tác động về lâu dài nếu sử dụng liên tục trong thời gian dài. Các

tác dụng ngay lập tức có thể bao gồm đau đầu, giảm sự tập trung, thay đổi hành vi

6

hoặc các phản ứng miễn dịch. Ảnh hưởng về lâu dài có thể làm tăng nguy cơ ung

thư, các bệnh tim mạch… [4, 22]. Nghiên cứu của McCann và cộng sự trên 297 trẻ

em cho thấy việc sử dụng hỗn hợp các chất phụ gia gồm hai nhóm là

E102/E110/E122/E124/E211 và E104/E110/E122/E129/E211 có liên quan đến

chứng tăng động ở những đứa trẻ này [49]. Sự tương tác của một số chất khi chúng

kết hợp với nhau cũng đã được Lau Karen và cộng sự nghiên cứu. Cụ thể, hai hỗn

hợp là E104/E951 và E133/L-glutamic axit được cho là ức chế sự biệt hóa dòng

nguyên bào thần kinh chuột NB2a thành các sợi thần kinh và làm tăng tỷ lệ tế bào

chết của dòng tế bào nuôi cấy [44]. Ngoài ra gần đây, một số phụ gia thực phẩm

chậm phân hủy có trong chất thải ra môi trường từ hoạt động của con người đã tích

tụ, gây ô nhiễm và ảnh hưởng đến môi trường nước như butylated hydroxyanisole

(E320) và butylated hydroxytoluene (E321) hay propyl gallate (E310) ảnh hưởng

đến hệ sinh thái trong nước [53, 93]. Vì vậy, việc kiểm tra đánh giá ảnh hưởng của

các phụ gia thực phẩm lên sức khỏe con người và tìm giới hạn an toàn của chúng

trong sản xuất và chế biến thực phẩm là điều rất cần thiết.

1.2.2. Các loại phụ gia thực phẩm được sử dụng trong nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá độc tính của năm loại phụ gia

đang được sử dụng thuộc ba nhóm là nhóm chất bảo quản với hai đại diện là

Sodium benzoate và Propyl gallate, nhóm chất tạo màu với hai đại diện là

Tartrazine và Amaranth và nhóm chất điều vị với đại diện là Monosodium

glutamate cùng với một phụ gia đã bị cấm sử dụng là Formaldehyde để kiểm chứng

lại độc tính của một phụ gia đã được xác định là độc tới mức không được phép đưa

vào trong thực phẩm.

1.2.2.1. Chất bảo quản - Sodium benzoate

Sodium benzoate có công thức phân tử là NaC6H5CO2, được tạo ra bằng

phản ứng giữa natri hydroxit và axit benzoic. Đây là một chất phụ gia thực phẩm

được kí hiệu là E211, có tác dụng bảo quản thực phẩm tránh khỏi bị hư hỏng bằng

cách kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và nấm trong môi trường có tính axit.

Trung bình mỗi năm, khoảng 100 nghìn tấn E211 có thể được sản xuất trên toàn thế

7

giới. Theo ủy ban chuyên về phụ gia thực phẩm (JECFA - Joint FAO/WHO Expert

Committee on Food Additives), liều lượng an toàn để sử dụng hàng ngày với

Sodium benzoate tối đa là 5mg/kg trọng lượng [82]. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng

Sodium benzoate có tiềm năng thấp gây ra chứng mề đay do sự hình thành axit

benzoate tiếp xúc trên da [57]. E211 cũng được cho là làm thay đổi nồng độ ion

kẽm trong não dẫn đến sự thay đổi hành vi ở chuột [3, 16]; ảnh hưởng đáng kể đến

sợi trục tế bào thần kinh và các nút thần kinh từ đó gây độc thần kinh ở ấu thể cá

ngựa vằn [8].

1.2.2.2. Chất chống ô xy hóa - Propyl gallate

Propyl gallate (E310) là propyl este của axit 3,4,5-trihydroxybenzoic có công

thức cấu tạo là C12H12O5, tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu kem, không

mùi. Propyl gallate còn có tên gọi khác là gallic acid propyl ester hay Progallin P,

được sử dụng với vai trò là chất chống oxy hóa trong các loại thực phẩm (chủ yếu

có trong thực phẩm chứa hàm lượng chất béo cao), dược phẩm và mỹ phẩm [71].

Vai trò của Propyl gallate trong việc bảo quản nhiều loại sản phẩm phục vụ đời

sống con người là không cần bàn cãi. Tuy nhiên, việc sử dụng như thế nào và liều

lượng là bao nhiêu thì cần phải có các nghiên cứu rất cẩn thận và chi tiết. Trong bản

báo cáo khoa học đánh giá về propyl gallate của ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu

năm 2014, lượng được phép sử dụng mỗi ngày trên 1 ki-lô-gam trọng lượng cơ thể

(Intake Acceptable Daily - ADI) chỉ ở mức 0,5 mg/kg/ngày [15]. Cùng với đó,

nhiều nghiên cứu về tác động của propyl gallate theo các cách khác nhau cũng đã

được công bố. Speijers và cộng sự năm 1993, sau 13 tuần thử nghiệm trên chuột đã

đưa ra nồng độ không quan sát thấy tác dụng phụ (NOAEL) của E310 là 135

mg/kg/ngày và nồng độ cao nhất trong thử nghiệm (527 mg/kg/ngày) đã gây ảnh

hưởng xấu tới hệ thống tạo máu. Khả năng gây đột biến, ung thư của phụ gia thực

phẩm này cũng đã được một số nhà khoa học phát hiên thấy khi có mặt của Cu(II)

và Fe(III) EDTA thông qua sản phẩm chuyển hóa là axit gallic [41]. Tuy nhiên, một

số thử nghiệm khác trên động vật lại không cho thấy propyl gallate có khả năng gây

8

ung thư [85]. Ngoài ra, trên lĩnh vực bảo vệ an toàn môi trường thì E310 đã được đề

nghị xếp vào nhóm gây độc cho sinh vật thủy sinh [93].

1.2.2.3. Chất tạo màu vàng - Tartrazine

Tartrazine có tên hóa học là 3-carboxy-5-hydroxy-1-(4'-sulphophenyl)-4-(4'-

sulphophenylazo) pyrazole trisodium với công thức phân tử C16H9N4Na3O9S2 và

khối lượng phân tử (mole) là 534,36 gam, được kí hiệu là E102 trong danh mục các

phụ gia thực phẩm. Đây là một trong những phẩm màu nhân tạo đươc sử dụng rộng

rãi, không chỉ được dùng để tạo màu vàng cho thực phẩm, đồ uống mà còn được

tìm thấy trong các loại thuốc và mỹ phẩm [51]. Tartazine được các nước thuộc Liên

minh Châu Âu (EU) công nhận là một phụ gia thực phẩm được cho phép và đã

được đánh giá bởi Ủy ban chuyên về phụ gia thực phẩm của FAO/WHO (JECFA)

năm 1996 và Ủy ban Khoa học về thực phẩm (SCF) năm 1984. Các tổ chức này đều

đưa ra lượng Tartrazine được phép đưa vào cơ thể trong một ngày trên 1 kg cân

năng cơ thể (ADI) là 7,5 mg [43]. Tuy nhiên, nhiều báo cáo đã được công bố về

việc Tartrazine có thể gây ra một số phản ứng tiêu cực khi sử dụng như gây ra bệnh

hen suyễn, đau nửa đầu hoặc lupus [66, 74, 84]. Nhiều nghiên cứu đã được thực

hiện trên cả in vitro và in vivo về khả năng gây đột biến hoặc gây ung thư của

Tartrazine cho những kết quả khác nhau. Nghiên cứu của Das năm 2004 sử dụng

thử nghiệm đột biến Ames và thử nghiệm trên tủy xương chuột cùng với nghiên cứu

của Poul năm 2009 sử dụng phương pháp kiểm tra vi nhân tế bào ruột (gut

micronucleus test) cho thấy rằng Tartrazine không gây ảnh hưởng đến genome [11,

67]. Trong khi đó, kết quả nghiên cứu của Sasaki và cộng sự năm 2002 và nghiên

cứu của Mpountoukas năm 2010 lại cho rằng Tartrazine gây ra một số ảnh hưởng

như tăng sai hỏng trong nhiễm sắc thể, ức chế phân bào và tổn thương DNA ở niêm

mạc ruột và bàng quang [52, 77]. Năm 2011, Gao và cộng sự công bố Tartrazine

còn ảnh hưởng tới khả năng học tập và ghi nhớ ở chuột [20]. Do còn nhiều ý kiến

trái ngược về tác động của Tartrazine nên rất cần thêm nhiều nghiên cứu chuyên

sâu, toàn diện về phụ gia thực phẩm này.

9

1.2.2.4. Chất tạo màu đỏ - Amaranth

Amaranth (E123) là chất tạo màu đỏ có công thức cấu tạo

C20H11N2Na3O10S3. Danh pháp theo IUPAC (International Union of Pure and

Applied Chemistry) là trisodium 2-hydroxy-1-(4-sulphonato-1-naphthylazo)

naphthalene-3,6-disulphonate. Amaranth đã được đánh giá bởi tổ chức SCF Châu

Âu năm 1976, 1979, 1883 và tổ chức JECFA vào các năm 1972, 1975, 1978 và

1984 trước khi được cho phép sử dụng như là phụ gia thực phẩm. Dựa trên nghiên

cứu trên chuột trong 90 ngày, SCF đưa ra chỉ số ADI cho Amaranth là từ 0-

0,8mg/kg/ngày còn theo nghiên cứu khác trên chuột về khả năng gây ung thư của

Amaranth nếu sử dụng trong thời gian dài, JECFA đưa ra chỉ số ADI thấp hơn từ 0-

0,5mg/kg/ngày [14]. Từ những năm 70 và 80, các nhà khoa học đã cho rằng

Amaranth có khả năng gây đột biến tuy nhiên nghiên cứu trên vi khuẩn và nấm

không phát hiện thấy khả năng này [2]. Gần đây hơn, Sasaki (2002) đưa ra kết luận

Amaranth gây tổn thương DNA khi phơi nhiễm với tế bào lympho người và ở chuột

[52] trong khi đó, nghiên cứu của Das và cộng sự năm 2004 lại cho thấy kết quả trái

ngược [11]. Nghiên cứu của Mohamed và cộng sự năm 2011 trên chuột mang thai

còn cho thấy rằng khi cho chuột cái uống Amaranth với liều 47 mg/kg vào ngày thứ

sáu đến ngày 15 của thai kỳ, phôi chuột có dấu hiệu chậm phát triển cùng với một

số bất thường về tim, phổi và xương [26].

1.2.2.5. Chất điều vị - Monosodium glutamate

Monosodium glutamate có công thức phân tử là C5H8NO4Na, tên hóa học là

Sodium 2-aminopentanedioate. Đây là một chất phụ gia thực phẩm (E621) có tác

dụng làm tăng cường vị ngọt đặc trưng (vị Umami) cho món ăn. Lượng tiêu thụ

glutamate trên toàn thế giới đã tăng lên đáng kể trong những thập kỉ gần đây [27].

Nghiên cứu của He và cộng sự năm 2008 chỉ ra rằng glutamate có thể làm tăng

nguy cơ thừa cân béo phì [27] nhưng đến năm 2009, Ebert đã phản đối ý kiến này

[13]. Nhiều nghiên cứu lại cho rằng E621 có liên quan đến chứng hen suyễn [19],

co thắt phế quản, nổi mề đay và viêm mũi [91] tuy nhiên những kết quả này kém

10

thuyết phục. Nghiên cứu của Narayanan và cộng sự năm 2010 cho rằng E621 gây ra

sự thay đổi đáng kể hành vi của chuột [56].

1.2.2.6. Chất bảo quản đã bị cấm sử dụng - Formaldehyde

Formaldehyde đã từng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, giúp bảo

quản thực phẩm khô, khử trùng hộp đựng, bảo quản cá và một số loại dầu, chất béo

[36], được ký hiệu là E240. Đây là aldehyde đơn giản nhất có công thức phân tử là

CH2O, thường được biết đến ở dạng dung dịch với nồng độ 37-40% bão hòa trong

nước hay còn được gọi là dung dịch foocmalin. Trong tự nhiên, Formaldehyde được

hình thành từ các chất hữu cơ bởi các quá trình quang hóa trong khí quyển. Nó còn

được hình thành do các chất hữu cơ cháy không hoàn toàn nên có thể được tìm thấy

trong các quá trình đốt khí như khói ô tô, lò hơi hoặc thuốc lá [73]. Formaldehyde

được sử dụng rất phổ biến, có vai trò rất quan trọng trong một loạt các ngành công

nghiệp nhựa, ô tô, hàng không, dệt và ngành công nghiệp xây dựng [63, 70]. Ngoài

ra, nó còn được sử dụng trong lĩnh vực y tế, nông nghiệp, thuộc da [63].... Trên toàn

thế giới năm 1992, lượng E240 được sản xuất ước tính là khoảng 12 triệu tấn [33].

Tuy nhiên, nó cũng gây ảnh hưởng không nhỏ đến môi trường và sức khỏe con

người. Phơi nhiễm với Formaldehyde có thể gây ung thư biểu mô vòm họng, bệnh

bạch cầu tủy [58, 81].

1.3. CÁC MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH HÓA CHẤT

Việc xác định độc tính các loại hóa chất nói chung và nhóm phụ gia thực

phẩm nói riêng cho đến nay vẫn đang gặp phải nhiều thách thức. Thứ nhất, theo ước

tính có 1060

phân tử nhỏ [37], trên 61 triệu hợp chất đã được xác định (theo cơ sở dữ

liệu PubChem Compound - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound). Ở các nước

thuộc liên minh châu Âu (EU), có khoảng 2700 chất mới được kiểm tra nguy cơ đối

với con người và môi trường theo đúng quy định [59]. Yêu cầu kiểm định chất mới

được tổng hợp cùng với việc tái kiểm định những hóa chất đang có mặt trên thị

trường, chưa kể đến việc phải xem xét sự ảnh hưởng kết hợp khó đoán trước khi

chúng tương tác với nhau đòi hỏi phải có một phương pháp xác định độc tính một

cách nhanh chóng chính xác. Thứ hai, chưa có một mô hình nào hoàn hảo để dự

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound

11

đoán tác động trên con người. Mô hình gần nhất với con người là thử nghiệm trên

động vật có vú thì không thể thực hiện trên quy mô lớn do chi phí và các rào cản

đạo đức. Các mô hình khác thì đều có các ưu nhược điểm riêng.

1.3.1. Sử dụng động vật thí nghiệm trong đánh giá độc tính hóa chất

Nói đến các động vật được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu thì cá là loài

chỉ đứng sau các động vật có vú trong việc đánh giá độc tính hóa chất và các mối

nguy hại cho môi trường (theo Ủy ban của cộng đồng châu Âu năm 1996). Chúng

nhận được sự quan tâm chú ý với vai trò là chỉ thị nhằm theo dõi hệ sinh thái thủy

sinh, bảo vệ môi trường nước khỏi các chất ô nhiễm [55]. Thử nghiệm độc cấp tính

trên cá đóng một vai trò rất quan trọng trong việc đánh giá các rủi ro cho môi

trường vì từ những kết quả này có thể ước tính mức độ độc tính của hóa chất cho

các động vật khác [90]. Hơn nữa, theo quy định thì đây là thử nghiệm bắt buộc với

những chất có khối lượng sản xuất từ 1 tấn/năm trở lên trước khi được cấp phép

[18].

Nhiều loài cá khác nhau được sử dụng như sinh vật mô hình trong đánh giá

độc tính sinh thái (ecotoxicology) được đề xuất trong các tài liệu hướng dẫn của tổ

chức OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) như cá

hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá tuế đầu bẹt (Pimephales promelas), bluegill

(Lepomis macrochirus), cá ngựa vằn (Danio rerio), medaka (Oryzias latipes), cá

bảy màu (Poecilia reticulata), và cá chép (Cyprinus carpio) [61, 62]. Thực tế,

không có thử nghiệm trên một loài duy nhất nào có thể áp dụng cho tất cả các chất

và nếu chỉ sử dụng giá trị LC50 từ một loài thì khó đảm bảo độ chính xác về mức

độ độc hại của hóa chất [5]. Vì vậy, cần tiến hành thí nghiệm trên nhiều loài trước

khi đưa ra kết luận. Tuy nhiên, xét cho cùng thì cá vẫn là động vật và vẫn được bảo

vệ theo quyền lợi động vật (theo Chỉ thị 2010/63/EU [17]). Trong hai thập kỷ qua,

nhiều nỗ lực đáng kể đã được các nhà khoa học thực hiện để phát triển phương pháp

thay thế động vật trong các thí nghiệm. Pháp lý quản lý hóa chất mới của châu Âu

(REACH) ủng hộ phương pháp thay thế các thử nghiệm trên động vật nếu có thể

[47].

12

1.3.2. Mô hình thay thế động vật thí nghiệm trong đánh giá độc tính hóa chất

1.3.2.1. Mô hình đánh giá độc tính sử dụng tế bào nuôi cấy in vitro

Một sự thay thế khá hiệu quả là sử dụng các dòng tế bào nuôi cấy. Nhiều

nghiên cứu đã cho thấy có mối tương quan cao giữa các dòng tế bào khác nhau và

giữa các phòng thí nghiệm [78]. Do sự tương tác ban đầu giữa các chất độc với cơ

thể là ở cấp độ phân tử và tế bào nên từ kết quả mô hình in vitro chúng ta có thể dự

đoán tác động trên cơ thể động vật [80]. Hơn nữa, phương pháp này cũng ít tốn kém

và cũng không mất nhiều thời gian tiến hành nên thường được dùng với mục đích

sàng lọc nhanh số lượng lớn các chất tiềm năng gây độc. Tuy nhiên, độ nhạy của

phương pháp này tương đối thấp có thể là do trong quá trình nuôi cấy thời gian dài

đã làm mất đi một số đặc tính cụ thể như các thụ thể, các enzyme hoặc việc sử dụng

huyết thanh trong môi trường nuôi cấy làm ảnh hưởng đến kết quả của thí nghiệm

[78]. Đồng thời, thực hiện trên tế bào nuôi cấy lại không mang tính đại diện cho

toàn bộ cơ thể phức tạp bao gồm sự tương tác và ảnh hưởng qua lại giữa các tế bào

cũng như không đánh giá được ảnh hưởng của các sản phẩm chuyển hóa diễn ra

trong cơ thể sinh vật.

1.3.2.2. Mô hình phôi cá ngựa vằn trong đánh giá độc tính

Phôi cá ngựa vằn là mô hình thay thế đầy hứa hẹn có thể khắc phục được

những khó khăn trên. McKim sau khi tham khảo 150 nghiên cứu độc học sử dụng

các giai đoạn sống khác nhau của cá, ông cho rằng sự ảnh hưởng ở các giai đoạn

đầu có thể được dùng để dự đoán cho ít nhất 80% kết quả độc tính ảnh hưởng lâu

dài [50]. Theo hướng dẫn OECD 236 năm 2013, thử nghiệm áp dụng trên phôi cá

chỉ kéo dài 4-5 ngày [62]. Trong thời gian này, ấu thể cá chưa có khả năng tự kiếm

ăn được nên chưa được coi là một cơ thể động vật [17]. Do đó việc sử dụng phôi

không bị ràng buộc bởi các quy định nghiêm ngặt đối với động vật thí nghiệm. Hơn

nữa, một cá cái có thể đẻ được từ 50-200 trứng mỗi lần ghép [40]. Vì vậy, trong

điều kiện phòng thí nghiệm, số lượng lớn phôi có thể được sinh ra một cách chủ

động nên có khả năng đánh giá của số lượng lớn các chất. Thời gian tiến hành thí

nghiệm cũng như lượng hóa chất sử dụng ít hơn nhiều so với việc đánh giá độc tính

13

trên cá do thực hiện trên đĩa nuôi cấy 24 giếng [62]. Quá trình phát triển phôi sớm

và hình thành cơ quan ở cá ngựa vằn khá giống với các động vật có xương sống

khác nhưng tốc độ phát triển nhanh hơn: sau 3 ngày từ phôi đã phát triển thành ấu

thể và nhiều các cơ quan đã hoàn thiện về chức năng, bên cạnh đó phôi cá trong

suốt cho phép quan sát được sự ảnh hưởng của hóa chất trong quá trình phát triển

phôi sớm [40].

Cá ngựa vằn là sinh vật mô hình phổ biến được sử dụng ở nhiều phòng thí

nghiệm trên thế giới từ khá lâu và trình tự hệ gen đã được giải mã đầy đủ. Các phân

tích trên hệ gen cá ngựa vằn cho thấy có trên 12 nghìn gen tương đồng với hệ gen

người và khoảng 70% gen của người có ít nhất một gen tương đồng trên cá ngựa

vằn (Hình Error! No text of specified style in document..1) [31].

Hình Error! No text of specified style in document..1. Sự tương đồng về gen hoạt

động giữa người, chuột, gà và cá ngựa vằn [31]

Có nhiều cấp độ, tiêu chí có thể được thực hiện trong các thử nghiệm trên mô

hình này. Cấp độ đánh giá đơn giản nhất là dựa trên các tác động của hóa chất đến

hình thái bên ngoài của phôi và ấu thể cá ngựa vằn. Mọi loại hóa chất đều có thể

gây độc tùy thuộc vào giá trị nồng độ sử dụng. Ở một ngưỡng nào đó, tác động của

chúng sẽ biểu hiện ra hình thái bên ngoài gây dị dạng, quái thai hoặc ảnh hưởng đến

14

sức sống của phôi/ấu thể thí nghiệm. Đích tác động và cũng là tiêu chí quan sát để

so sánh với đối chứng rất đa dạng: có thể là mắt, vùng tim, vùng noãn hoàng, hình

dạng trục cơ thể … Số liệu thu được sẽ được phân tích thống kê để xây dựng đường

cong thể hiện sự đáp ứng với các nồng độ thí nghiệm và tính một số chỉ số độc học

như giá trị LC50 (Median lethal concentration) là nồng độ của chất thử gây chết

50% tổng số phôi/ ấu thể trong lô thí nghiệm hoặc giá trị EC50 (Median effective

concentration) là nồng độ chất thử gây dị dạng 50% số phôi/ấu thể sống sót [62].

Nhiều sàng lọc di truyền quy mô lớn đã phát hiện nhiều đột biến gen cá ngựa

vằn tương đồng với những đột biến gen gây bệnh ở người, từ đó gây ra các dạng

kiểu hình giống nhau, ví dụ như bệnh lý tế bào của đột biến thoái hóa cơ cá ngựa

vằn biểu hiện tương tự chứng loạn dưỡng cơ ở người. Một trong những đột biến là

sapje - đột biến mang khiếm khuyết làm suy yếu gen dystrophin ở cá ngựa vằn, cái

mà tương đồng với gen người khi bị ảnh hưởng trong hội chứng loạn dưỡng cơ

Duchenne – một dạng thường gặp của hội chứng loạn dưỡng cơ ở người [46]. Khi

phơi nhiễm với cùng loại hóa chất, các đặc điểm hình thái quan sát được trên phôi

cá ngựa vằn cũng có nhiều điểm tương đồng với các bệnh trên con người. Ví dụ,

Ethanol gây hiện tượng cyclopia – hiện tượng hai mắt gần sát nhau trên ấu thể cá

ngựa vằn khi phơi nhiễm từ giai đoạn phôi vị cũng là một loại kiểu hình được quan

sát thấy ở các em bé tiếp xúc với nồng độ cồn cao trong thời gian ở trong bụng mẹ

[48]. Ethanol cũng gây ra các khiễm khuyết thị giác ở ấu thể cá ngựa vằn [25] và sự

ảnh hưởng tương tự cũng được ghi nhận ở người. Do đó, hình thái phôi/ ấu thể cá

ngựa vằn phơi nhiễm với hóa chất cũng có thể được sử dụng để dự đoán tác động

của hóa chất trên cơ thể người.

Năm 2009, với mục tiêu đưa ra một sự ủng hộ có tính khoa học cho việc thay

thế các thử nghiệm độc cấp tính trên cá trưởng thành (theo hướng dẫn OECD 203

[60]) bằng thử nghiệm trên phôi cá, Lammer và cộng sự đã tiến hành thu thập các

kết quả các nghiên cứu áp dụng mô hình thử nghiệm trên một số loài cá theo hướng

dẫn của OECD trong đó có cá ngựa vằn đã được công bố trên cơ sở dữ liệu US EPA

ECOTOX (US EPA, 2002: http://cfpub.epa.gov/ ecotox/) và cơ sở dữ liệu ECETOC

15

Aquatic Toxicity [83] để so sánh với kết quả từ các nghiên cứu trên mô hình phôi

các loài cá [42]. Phân tích kết quả cho thấy mô hình phôi cá ngựa vằn có sự tương

đồng cao với mô hình thí nghiệm trên cá ngựa vằn trưởng thành nói riêng (Hình

Error! No text of specified style in document..2A) cũng như với các loài cá do

OECD chỉ dẫn nói chung (Hình Error! No text of specified style in document..2B).

Điều này cũng chứng tỏ rằng phôi cá ngựa vằn là mô hình hiệu quả có thể thay thế

cho các phương pháp đánh giá sử dụng động vật thí nghiệm.

Hình Error! No text of specified style in document..2: So sánh kết quả từ thử

nghiệm độc tính trên các loài cá và thử nghiệm trên phôi cá ngựa vằn

Giá trị LC50 thu được của các thử nghiệm phôi cá ngựa vằn được so sánh với thử nghiệm

cá ngựa vằn trưởng thành sử dụng 21 hợp chất (hình A) và với các thử nghiệm trên nhiều

loài cá của OECD sử dụng 70 hợp chất (hình B)

Trong quá trình phát triển phôi sớm ở cá ngựa vằn, bắt đầu từ khoảng 30-36

giờ sau thụ tinh thì tim phôi bắt đầu đập những nhịp đầu tiên. Sau đó, tim đập

thường xuyên và đều đặn hơn [40]. Việc phơi nhiễm với hóa chất có thể ảnh hưởng

đến chức năng của cơ quan này và biểu hiện bởi số nhịp tim trong một phút, sự khử

cực và tái phân cực. Nhịp tim cũng là một trong các chỉ tiêu được sử dụng nhiều

trong các nghiên cứu sàng lọc thuốc cũng như đánh giá ảnh hưởng của các chất đến

chức năng tim [21, 23, 65].

16

Ngoài chức năng của tim, chức năng của một số cơ quan khác trong quá trình

phát triển phôi cá ngựa vằn cũng được dùng trong đánh giá như gan, thận, mắt…

[9]. Để nghiên cứu sự ảnh hưởng đến hệ vận động cũng như ảnh hưởng đến thần

kinh, biểu hiện hành vi của ấu thể cá khi phơi nhiễm với hóa chất là tiêu chí được

lựa chọn [68]. Các thử nghiệm chức năng cơ quan, hệ cơ quan có thể cho độ nhạy

cao hơn so với các đánh giá hình thái thông thường.

Những nghiên cứu chuyên sâu hơn được áp dụng trên mô hình này là đánh

giá mức độ biểu hiện của gen, protein bằng các phương pháp RT-PCR, lai tại chỗ.

Chuyển gen sử dụng các công cụ hướng đích mới như Zinc-finger [92], CRISPR

[34, 35] cũng có thể áp dụng trên mô hình phôi cá ngựa vằn để nghiên cứu sự thay

đổi di truyền và ung thư. Ngoài ra, việc nghiên cứu một số quá trình sinh học như

apoptosis, lưu thông máu trong mạch, sự hình thành xương trên phôi/ấu thể cá cũng

được nghiên cứu bằng cách nhuộm với các thuốc nhuộm đặc hiệu [29].

Mô hình phôi cá ngựa vằn còn được ứng dụng trong việc sàng lọc các phân

tử nhỏ có hoạt tính sinh học hoặc sàng lọc thuốc [64, 75]. Vì tất cả các lý do trên,

mô hình này nhận được sự quan tâm rất lớn từ các nhà khoa học trên thế giới từ rất

nhiều lĩnh vực như khoa học môi trường, dược học, hóa sinh học, y tế, nông nghiệp,

khoa học vật liệu….(Hình Error! No text of specified style in document..3A) Số

lượng bài báo khoa học đã công bố sử dụng phôi cá ngựa vằn tăng qua các năm

cũng minh chứng cho điều này (Hình 1.3B).

17

Hình Error! No text of specified style in document..3. Các lĩnh vực nghiên cứu sử

dụng phôi cá ngựa vằn (Hình A) và số lượng nghiên cứu được công bố từ 1992

đến 2015 (Hình B)

18

Số liệu được lấy từ cơ sở dữ liệu Scopus (Scopus.com) với kết quả là các bài báo đã được

công bố có chứa cụm từ:(rerio hoặc zebrafish hoặc "zebra fish") và (embryo* *toxic*)

xuất hiện trong tiêu đề/tóm tắt/từ khóa tính đến tháng 11 năm 2015

CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Từ một số cửa hàng cá cảnh tại Hà Nội, chúng tôi thu thập cá ngựa vằn

trưởng thành (Danio rerio) có chiều dài từ 3-5 cen-ti-mét, có các sọc vằn đặc trưng

chạy dọc theo chiều dài cơ thể, vây và đuôi như mô tả bởi Dahm năm 2006 (Hình

Error! No text of specified style in document..4). Sau đó, chúng được lựa chọn qua

2 - 3 thế hệ tại phòng Công nghệ Tế bào động vật – khoa Sinh học – Trường Đại

học Khoa học Tự Nhiên trước khi sử dụng cho nghiên cứu.

Hình Error! No text of specified style in document..4. Hình thái cá ngựa vằn

trưởng thành [10]

Thước đo có độ dài 1 cen-ti-mét

2.2. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

2.2.1. Dụng cụ, thiết bị

Dụng cụ, thiết bị dùng trong đề tài được liệt kê trong Bảng Error! No text of

specified style in document..2.

https://d.docs.live.net/cb91ce6af85fe4f9/Documents/Scopus.com

19

Bảng Error! No text of specified style in document..2. Dụng cụ, thiết bị được sử

dụng trong luận văn

STT Tên dụng cụ, dụng cụ Hãng sản xuất Nước sản xuất

1 Kính hiển vi soi nổi Zeiss Đức

2 Cân gam Sartorius Đức

3 Cân mi-li-gam Precisa Anh

4 Tủ hút khí độc ESCO Singapore

5 Máy lọc nước RO Kangaroo Đài Loan

6 Máy ảnh Canon Nhật Bản

7 Pipetman 200 µl Gilson Pháp

8 Pipetman 1000 µl Gilson Pháp

9 Đĩa 24 giếng Corning Mỹ

10 Đĩa 6 giếng Corning Mỹ

11 Đĩa petri Corning Mỹ

12 Ống Falcon 50ml Corning Mỹ

13 Bơm pipet Mỹ

14 Pipet 10ml Corning Mỹ

2.2.2. Hóa chất

Trong nghiên cứu này, năm loại phụ gia thực phẩm được sử dụng ở dạng bột

là Sodium benzoate, Propyl gallate, Tartrazine, Amaranth, Monosodium glutamate,

riêng Formaldehyde ở dạng dung dịch với nồng độ gốc là 36% (Bảng Error! No

text of specified style in document..3). Tất cả các loại phụ gia nêu trên đều được

20

hòa tan thành dung dịch gốc và pha loãng thành các dải nồng độ thí nghiệm bằng

môi trường nuôi phôi tiêu chuẩn E3 với thành phần: NaCl 5 mmol/L; KCl 0,17

mmol/L; CaCl2 0,4 mmol/L và MgSO4 0,16 mmol/L.

21

Bảng Error! No text of specified style in document..3. Các loại hóa chất được thử

nghiệm

Tên hóa chất Hãng

sản xuất Công thức cấu tạo

Khối

lượng

phân tử

Sodium benzoate

(E211)

Sigma

Aldrich

144,1

Propyl gallate

(E310) Fluka

212,2

Tartrazine (E102) Sigma

Aldrich

534.36

Amaranth (E123) Sigma

Aldrich

604.47

Monosodium

glutamate (E621)

Sigma

Aldrich

187,13

Formaldehyde

(E240) Merck

30,03

22

2.3. QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM

Dựa theo tài liệu hướng dẫn của tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế OECD

về việc thử độc trên phôi cá ngựa vằn năm 2013 [62] và hướng dẫn đánh giá chất

lượng nước thải của tổ chức tiêu chuẩn thế giới ISO, chúng tôi tiến hành thí nghiệm

theo các bước sau: nuôi và ghép cá bố mẹ, thu – rửa phôi, chọn phôi, phơi nhiễm

với hóa chất, thu và phân tích kết quả.

2.3.1. Quy trình nuôi cá bố mẹ và thu phôi

Cá ngựa vằn bố mẹ được nuôi duy trì ở điều kiện nhiệt độ 260C ± 1

0C và chu

kì sáng/tối là 14/10 giờ. Nước bể nuôi được lọc liên tục để đảm bảo độ sạch. Cá

được cho ăn bằng sản phẩm thương mại bán sẵn cho cá cảnh 1-2 lần/ngày và được

bổ sung bằng thức ăn tươi là ấu trùng muỗi lắc Chironomus.

Vào cuối chu kì sáng trước ngày thu phôi, cá bố mẹ sẽ được bắt vào bể ghép

với tỉ lệ 1:1. Cá đực và cái sẽ được ngăn cách nhau bằng một tấm lưới với mục đích

ngăn cản sự giao phối trong đêm. Chúng tôi tiến hành ghép cá vào đầu chu kì sáng

ngày hôm sau bằng việc rút tấm lưới ngăn cách để chúng giao phối đồng thời đặt

tấm lưới phía dưới đáy để ngăn cản cá bố mẹ ăn trứng. Thời điểm này sẽ được tính

là 0 giờ sau thụ tinh (hour post fertilization).

Sau 30 phút giao phối và đẻ trứng, cá bố mẹ được đưa trở lại bể nuôi. Phôi cá

sẽ được thu và đặt vào đĩa petri rồi được được rửa nhiều lần bằng môi trường E3 để

loại bỏ các chất bẩn cùng những phôi không được thụ tinh. Việc ghép cá thường

được thực hiện với ít nhất 3 bể và chỉ phôi ở những bể có tỉ lệ thụ tinh trên 90% mới

được sử dụng cho thí nghiệm.

2.3.2. Phơi nhiễm với hóa chất

Thí nghiệm của chúng tôi được xây dựng dựa theo hướng dẫn thử nghiệm

độc tính hóa chất trên phôi cá ngựa vằn của Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế

(OECD 236 công bố ngày 26/7/2013) và hướng dẫn đánh giá chất lượng nước thải

theo ISO 15088:2007. Theo đó, việc phơi nhiễm phôi nên được thực hiện sớm nhất

có thể và muộn nhất là không quá 3 giờ sau thụ tinh (giai đoạn 128 tế bào) [62].

23

Sau khi được rửa sạch, phôi thụ tinh giai đoạn 4 đến 32 tế bào được chuyển

vào đĩa 6 giếng đã có sẵn hóa chất thí nghiệm (trên 25 phôi/một nồng độ/giếng).

Những phôi khỏe mạnh, phát triển bình thường sẽ được chọn dưới kính hiển vi soi

nổi với độ phóng đại tối thiểu là 20x. Giai đoạn phân cắt từ 4 tế bào trở đi, phôi chất

lượng tốt có thể dễ dàng phân biệt với phôi không thụ tinh hoặc bất thường dựa vào

sự trong suốt, đĩa phôi được phân cắt đồng đều, đối xứng, màng phôi và khối noãn

hoàng nguyên vẹn. Những phôi tốt được chuyển ngẫu nhiên mỗi phôi vào một

giếng của đĩa nuôi cấy 24 giếng đã có sẵn 1ml hóa chất ở mỗi giếng theo sơ đồ bố

trí nồng độ thí nghiệm như Hình Error! No text of specified style in document..5.

Hóa chất thí nghiệm được pha theo một dải từ sáu đến tám nồng độ sử dụng

môi trường E3. Dải này thu được sau nhiều thí nghiệm kiểm tra giới hạn tác động

(limit test) với mục đích tìm ra khoảng nhỏ nhất có chứa nồng độ gây chết toàn bộ

phôi và nồng độ không quan sát thấy ảnh hưởng sau khi kết thúc thí nghiệm. Mỗi

nồng độ được tra vào 20 giếng của đĩa nuôi cấy 24 giếng, 4 giếng còn lại là đối

chứng nội là dung môi hòa tan các chất thử (trong thí nghiệm này là môi trường E3)

(Hình Error! No text of specified style in document..5).

Hình Error! No text of specified style in document..5. Phân bố nồng độ trên đĩa

24 giếng

T: các giếng có cùng nồng độ hóa chất thí nghiệm, C: đối chứng

Cứ sau 24 giờ, mỗi giếng trong các đĩa thí nghiệm lại được thay khoảng

700µl/giếng bằng dung dịch mới có nồng độ hóa chất tương ứng. Quy trình được

24

tiến hành tương tự với đĩa đối chứng (môi trường E3) để so sánh đối chiếu. Toàn bộ

thí nghiệm được giữ ở nhiệt độ 260C ± 1

0C. Mỗi thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3

lần.

2.3.3. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất phụ gia tới sự phát triển phôi dựa

trên hình thái và sức sống

Tại các thời điểm 24, 48, 72, 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi sẽ quan sát phôi

dưới kính hiển vi soi nổi và đánh giá theo các tiêu chí như Bảng Error! No text of

specified style in document..4. Việc đánh giá hình thái phôi sẽ dựa vào các đặc

điểm phôi cá ngựa vằn theo mô tả của Kimmel và cộng sự (Hình Error! No text of

specified style in document..6) [40]. Kết quả của thí nghiệm chỉ được chấp nhận khi

tỷ lệ phôi còn sống của đối chứng ở thời điểm kết thúc thí nghiệm đạt trên 90%.

Bảng Error! No text of specified style in document..4. Một số tiêu chí đánh giá sự

phát triển phôi cá ngựa vằn

Tiêu chí Miêu tả

Thời gian (giờ sau

thụ tinh)

24 48 72 96

Tiêu chí gây chết

Đông tụ Phôi màu trắng đục và không nhận rõ cấu

trúc

x x x x

Tim không đập Không quan sát thấy tim đập x x

Tiêu chí dị dạng

Cong vẹo trục cơ

thể

Trục cơ thể bị uốn cong ở một vài điểm

Dị tật đuôi Đuôi ngắn hoặc cong so với bình thường x x

Sắc tố Giảm sắc tố mắt và thân x x

Phù màng bao tim Màng bao ngoài tim bị phù x x

Phù túi noãn

hoàng

Màng bao noãn hoàng xuất hiện túi chứa

dịch

x x x

25

Noãn hoàng xù xì Bề mặt khối noãn hoàng xù xì x

Phù đầu

Hoại tử

Phần đầu xuất hiện túi chứa dịch

Đầu hoặc thân xuất hiện khối tế bào chết

x x x

x x

Nghẽn mạch máu

Chưa nở

Xuất hiện các điểm máu tụ trên cơ thể

Phôi còn sống nhưng chưa thoát khỏi lớp

màng phôi

x x x

x

Tiêu chí đánh giá trên được xây dựng dựa theo tiêu chí được mô tả bởi Nagel

và cộng sự năm 2002 [54].

Hình Error! No text of specified style in document..6. Hình thái phôi cá ngựa vằn

ở một số giai đoạn theo Kimmel [40]

Nhiệt độ môi trường khi quan sát 28oC. Thanh kích thước chuẩn có độ dài 250 µm,

26

hpf: giờ sau thụ tinh; tb: tế bào

27

2.3.4. Đánh giá sự ảnh hưởng của các chất đến nhịp tim phôi/ấu thể cá ngựa

vằn

Phôi cá ngựa vằn giai đoạn 4 đến 32 tế bào sẽ được phơi nhiễm với các nồng

độ hóa chất và đối chứng E3 trên đĩa 6 giếng; 10 phôi mỗi nồng độ/giếng. Nhịp tim

của ít nhất 5 trên 10 phôi này (chọn ngẫu nhiên) sẽ được ghi lại bằng máy quay

phim dưới dạng các video có độ dài một phút và thí nghiệm sẽ được tiến hành hai

lần. Số nhịp tim của phôi/ấu thể cá khi phơi nhiễm với hóa chất sẽ được đếm và so

sánh thống kê với phôi/ấu thể đối chứng của chính lô thí nghiệm đó theo tỷ lệ phần

trăm sử dụng phần mềm GraphPad Prism 6.07.

2.3.5. Phân tích thống kê

Các phép tính toán cơ bản được tính bằng công cụ Microsoft Excel 2013.

Phần mềm GraphPad Prism 6.07 thực hiện tất cả các phân tích thống kê bao gồm

các phép hồi quy và các so sánh giữa các lô thí nghiệm với lô đối chứng.

Kết quả của thí nghiệm về tỷ lệ phôi còn sống cũng như tỷ lệ phôi dị dạng sẽ

xử lý hồi quy với dạng bốn tham số của phương trình Sigmoidal:

Trong đó: Top và Bottom là giá trị cao nhất và thấp nhất của Y

Y là tỷ lệ phôi chết/sống hoặc dị dạng

X là log của nồng độ thí nghiệm

XC50 có thể là giá trị LC50 hoặc EC50

HillSlope thể hiện độ dốc của đường cong

Từ đó, phần mềm cho phép đưa ra biểu thức và đồ thị thể hiện mối quan hệ

giữa nồng độ thí nghiệm và sự ảnh hưởng của hóa chất đối với sự phát triển phôi cá

ngựa vằn đồng thời tính các chỉ số độc tính LC50 – nồng độ gây chết 50% phôi thí

nghiệm và EC50 – nồng độ gây ảnh hưởng đến 50% phôi hoặc ấu thể. Dựa trên kết

quả thu được, chỉ số gây quái thai TI (Teratogenic index) sẽ được xác định bằng tỷ

28

số LC50/EC50. Một chất được cho là gây quái thai khi TI >1 và được cho là gây

chết phôi khi TI < 1 [69].

Phương pháp Mann Whitney test được sử dụng để so sánh sự khác biệt giữa

lô đối chứng và các nồng độ thí nghiệm về tỷ lệ phôi nở ở 72 giờ cũng như số nhịp

tim/phút. Sự khác biệt được cho là có ý nghĩa khi p < 0,05.

Chỉ số NOEC (No Observed Effect Concentration) cho biết nồng độ hóa chất

thí nghiệm cao nhất không có ảnh hưởng đáng kể đến phôi thí nghiệm và chỉ số

LOEC (Lowest observed effect concentration) cho biết nồng độ thấp nhất tác động

đáng kể đến phôi thí nghiệm theo các tiêu chí đã nêu ở trên được xác định bằng

Dunnett’s test với độ tin cậy 95%.

29

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Tổ chức hợp tác và phát triển kinh tế OECD và tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

ISO đã đưa ra các tài liệu hướng dẫn thử nghiệm độc tính hóa chất sử dụng phôi cá

ngựa vằn (OECD 236 và ISO 15088:2007). Dựa vào đó, nhóm nghiên cứu của

chúng tôi đã xây dựng quy trình thí nghiệm áp dụng trong điều kiện sẵn có của

phòng thí nghiệm và ứng dụng trong đánh giá độc tính của ba dung môi là ethanol,

dimethyl sulfoxide và acetone [1]. Kết quả thu được có độ tương đồng cao với kết

quả được đưa ra bởi OECD. Phương pháp sử dụng trong luận văn này giống với

phương pháp trong nghiên cứu trên chứng tỏ kết quả đưa ra có thể được chấp nhận

và có độ tin cậy cao.

Để xác định dải nồng độ cho thí nghiệm đánh giá độc tính của các chất,

chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với nhiều nồng độ để tìm ra một khoảng nồng độ

hẹp nhất mà vẫn đảm bảo giá trị dưới không gây bất kì ảnh hưởng nào đến phôi, ấu

thể thí nghiệm và giá trị trên gây chết toàn bộ phôi sau khi thí nghiệm kết thúc (96

giờ sau thụ tinh). Dung dịch gốc của các chất thử nghiệm được chuẩn bị bằng cách

hòa tan từ dạng bột (với Sodium benzoate, Propyl gallate, Amaranth, Tartrazine,

Monosodium glutamate) và từ dạng dung dịch Formaldehyde 36% trong môi trường

E3 sau đó cũng được pha loãng thành các dải nồng độ bằng môi trường E3. Ở một

vài thử nghiệm đầu, hóa chất sẽ được đánh giá ở những dải nồng độ rộng rồi thu

hẹp dần dựa trên kết quả thu được của thí nghiệm trước đó. Sự tác động của các hóa

chất đến sinh vật thường tuân theo phương trình Sigmoidal với giá trị nồng độ biểu

diễn theo thang logarit. Do đó, chúng tôi chia khoảng nồng độ đã xác định thành

một dải gồm sáu đến tám nồng độ dựa theo một cấp số nhân với giá trị công bội tùy

thuộc vào từng chất thí nghiệm. Cuối cùng, chúng tôi thu được các dải nồng độ

đánh giá cho từng chất như Bảng 3.1.

30

Bảng Error! No text of specified style in document..5. Các dải nồng độ thí nghiệm của các chất

Tên hóa chất Kí

hiệu

Độ tan trong

100 ml nước

Đơn vị

pha loãng Dải nồng độ thí nghiệm

Sodium

benzoate E211 62,87 g mg 25 45 80 145 260 350 500 650

Propyl gallate E310 350 mg mg 15 20 26 35 45 60 75

Amaranth E123 5 g g 0,1 0,2 0,5 1 2 4 8

Tartrazine E102 14 g g 0,25 0,5 1 2 4 8 16

Monosodium

glutamate E621 10 g g 2 5 10 15 25 40 60

Formaldehyde E240 37-40 g ppm 140 170 200 240 290 350 420

31

3.1. SỰ BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI VÀ SỨC SỐNG CỦA PHÔI CÁ NGỰA

VẰN KHI PHƠI NHIỄM VỚI CÁC CHẤT PHỤ GIA

3.1.1. Hình thái phôi cá ngựa vằn đối chứng

Hình thái của phôi, ấu thể cá ngựa vằn ở lô đối chứng cũng được ghi nhận và

được sử dụng như một tiêu chuẩn để xác định sự dị dạng khi phơi nhiễm với hóa

chất. Ở 24 giờ sau thụ tinh, bên trong phôi đã xuất hiện những chuyển động tự phát.

Mắt, đá tai đã hình thành, đồng thời đuôi đã phát triển dài và tách khỏi khối noãn

hoàng. Phần mở rộng của noãn hoàng cũng đã thấy rõ ràng (Hình Error! No text of

specified style in document..7).

Ở 48 giờ sau thụ tinh, chúng ta có thể dễ dàng quan sát thấy rõ nhịp đập đều

đặn của tim cùng với dòng vận chuyển máu dọc theo trục cơ thể và trên noãn hoàng.

Sắc tố cũng hình thành đầy đủ ở mắt và dọc theo cơ thể đến tận cuối của đuôi. Các

chất trong noãn hoàng được sử dụng làm chất dinh dưỡng nuôi cơ thể nên kích

thước của noãn hoàng giảm đi rõ rệt so với thời điểm 24 giờ sau thụ tinh. Đến thời

điểm 96 giờ sau thụ tinh, ấu thể đã thoát ra khỏi lớp màng phôi và có thể bơi tự do.

Lúc này, trục cơ thể đã trở nên thẳng, vây bơi hình thành, khối hoãn hoàng thon

gọn, sắc tố trên thân tập trung nhiều quanh khu vực hình thành bóng bơi nên vùng

này sậm màu hơn các vùng khác. Ngoài ra, miệng ấu thể cũng đã nhô về phía trước

(Hình Error! No text of specified style in document..7).

32

Hình Error! No text of specified style in document..7. Hình thái phôi và ấu thể cá ngựa

vằn đối chứng

A: 24 giờ sau thụ tinh; B: 48 giờ sau thụ tinh; C: 96 giờ sau thụ tinh

3.1.2. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất tạo màu

3.1.2.1. Phơi nhiễm với chất tạo màu vàng Tartrazine (E102)

Khi phơi nhiễm với Tartrazine, chỉ sau hai giờ phơi nhiễm với các nồng độ

từ 8 g/l trở lên, sự phát triển phôi cá ngựa vằn đi theo hai hướng rõ ràng. Hướng thứ

nhất, phôi có hình thái và sự phát triển không có nhiều khác biệt so với đối chứng.

Những phôi này vẫn sẽ tiếp tục phát triển bình thường qua thời điểm 24 giờ sau thụ

tinh. Chiều hướng thứ hai là phôi cá sẽ hình thành nhiều bất thường như đĩa phôi xù

xì, các phôi bào có thể tách nhau ra, không còn liên kết thành một khối trên cực

động vật, hoặc cả đĩa phôi sau đó khối noãng hoàng sẽ bị tan ra dẫn đến việc chúng

không thể sống đến thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (Hình Error! No text of specified

style in document..8).

Hình Error! No text of specified style in document..8. Phôi cá ngựa vằn khi phơi

nhiễm với Tartrazine nồng độ 8 g/l

Sau 2 giờ phơi nhiễm, một số phôi xù xì mất đi sự liên kết giữa các phôi bào (A) và sẽ tan

ra khi quan sát ở thời điểm 24 giờ sau thụ tinh (B)

Tại thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, sức sống của phôi thí nghiệm chỉ bị ảnh

hưởng khi phơi nhiễm với nồng độ 8g/l trở lên. Tỷ lệ phôi bị chết do tác động của

33

hai nồng độ 8g/l và 16 g/l lần lượt là khoảng 10% và 90%. Tiếp tục phơi nhiễm đến

72 giờ sau thụ tinh, số lượng phôi chết gần như không tăng thêm. Các đường đồ thị

tương quan giữa nồng độ E102 và sức sống phôi ở ba thời điểm đầu quan sát trong

Hình Error! No text of specified style in document..9 (đường màu đỏ) gần như

trùng khít lên nhau cũng thể hiện điều này. Hiện tượng này có thể giải thích do đích

tác động gây chết của Tartrazine tập trung chủ yếu ở thời điểm phát triển phôi sớm

trước thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, vì thế ở các giai đoạn tiếp sau, khi mà các cơ

quan đã tương đối hoàn thiện thì chất này không gây chết thêm phôi.

Các dị dạng trên phôi cá ngựa vằn quan sát được ở thời điểm 48 giờ sau thụ

tinh là phù túi noãn hoàng, tụ máu và chỉ xuất hiện khi phơi nhiễm với Tartrazine ở

nồng độ từ 8 g/l trở lên. Vị trí tụ máu thường quan sát được sự tụ máu là phía trên

phần phình noãn hoàng, trên đầu hay cả ở đuôi sát với phần kéo dài của noãn hoàng

(Hình Error! No text of specified style in document..10 A, B, C).

Hình Error! No text of specified style in document..9. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ

phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở thời điểm 24, 48 và 72 giờ sau

thụ tinh

Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống; đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên

tổng số phôi còn sống; thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm

34

Hình Error! No text of specified style in document..10. Phôi cá ngựa vằn khi phơi

nhiễm với Tartrazine

A, B, C: nồng độ 8 g/l ở 48 giờ sau thụ tinh; D, E, F, G nồng độ 1g/l ở 96 giờ sau thụ tinh

e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử

Ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi nhận thấy vài điểm đặc biệt khi

phơi nhiễm với Tartrazine. Thứ nhất là mức độ dị dạng của phôi cá khi phơi nhiễm

với E102 ở nồng độ thấp hơn lại nặng nề hơn nhiều so với phơi nhiễm nồng độ cao

trong dải nồng độ thí nghiệm. Cụ thể ở đây là nồng độ 1-2 g/l và nồng độ 8 g/l trở

lên. Hình Error! No text of specified style in document..10D-G cho thấy rằng nồng

độ 1 g/l gây ra hiện tượng phần phình của khối noãn hoàng của ấu thể không còn

giữ được hình dạng elip mà có thể bị tách ra thành nhiều phần nhỏ, hoặc phù nề

nghiêm trọng kèm theo việc xuất hiện một khối hoại tử bên trong. Do bị phù, màng

noãn hoàng lúc này rất yếu và rất dễ vỡ làm các thành phần bên trong, kể cả khối

hoại tử tràn ra ngoài. Noãn hoàng phình to, dị dạng kéo theo hiện tượng trục cơ thể

của ấu thể cũng bị cong, gập tại vị trí đó. Hiện tượng phù nề không chỉ bắt gặp ở

khối noãn hoàng mà cả ở phần thân cạnh noãn hoàng, trên đầu, dưới mắt và cả vây

ngực. Ngoài ra, ấu thể còn bị dị tật phần cuối đuôi, hoại tử trên cơ thể cũng như bị

tụ máu. Trong khi đó, phôi được phơi nhiễm với nồng độ 8g/l chỉ phù màng bao

h

h, e

h

h

h

h

e

e

e n

35

tim, hoại tử và phù nhẹ màng bao noãn hoàng, tụ máu, một vài trường hợp bị cong

đuôi. Hiện tượng nêu trên có thể là một bằng chứng của hiệu ứng liều thấp (low

dose effect) – mức độ ảnh hưởng ở nồng độ thấp nghiêm trọng hơn nồng độ cao.

Một vài lý do được đưa ra để giải thích cho hiện tượng này là chất thử nghiệm có

cấu trúc tương tự một loại hormone nào đó nên cũng tương tác với các thụ thể hoặc

ảnh hưởng đến quá trình tạo hormone, đến các con đường di chuyển hormone [88].

Thứ hai, hiện tượng tụ máu là kiểu dị dạng phổ biến nhất khi phơi nhiễm với

Tartrazine (Hình Error! No text of specified style in document..22C). Từ thời điểm

48 giờ sau thụ tinh, chúng tôi thấy việc tăng đáng kể tế bào máu đỏ xuất hiện quanh

khối noãn hoàng. Có thể vì thế nên dẫn tới sự tắc nghẽn mạch máu trên vài phôi ở

thời điểm này và hầu hết ấu thể ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh. Ấu thể có thể bị

một hoặc một vài điểm, ở nhiều vị trí và hình thức khác nhau. Điểm tụ máu quan sát

được có thể ngay dưới miệng, ở noãn hoàng gần sát vùng tim hoặc bên trong noãn

hoàng gần phần cơ, trên đầu hoặc dưới đuôi. Hình thức có thể là một khối nhỏ màu

đỏ hoặc tăng mạnh lượng tế bào máu đỏ tại một vị trí nào đó cũng có thể khiến cả

phần phù nề ở noãn hoàng có màu hồng hơn bình thường (Hình Error! No text of

specified style in document..10 E). Hiện tượng tụ máu bắt gặp nhiều có thể do

Tartrazine đã tác động đến các gen liên quan đến quá trình đông máu hoặc làm tăng

sự hình thành, phát triển mạch máu. Tuy nhiên vẫn cần thực hiện các nghiên cứu

chuyên sâu để khẳng định giả thuyết này.

Thứ ba, bên cạnh những phôi bị dị dạng, ở hầu hết các nồng độ trong dải

nồng độ thí nghiệm đều tồn tại một vài phôi không quan sát thấy bất kì sự ảnh

hưởng nào đến hình thái phôi sau 96 giờ phơi nhiễm. Hiện tượng này được thể hiện

trong Hình Error! No text of specified style in document..11 với tỷ lệ phôi dị dạng

khi phơi nhiễm với Tartrazine không đạt tới 100% hay tỷ lệ các loại dị dạng kể cả dị

dạng hay gặp nhất là tụ máu cũng không đạt được 100% phôi còn sống (Hình

Error! No text of specified style in document..22C). Vậy cơ chế nào bảo vệ những

phôi này chống lại tác động của E102?

36

Thứ tư, tỷ lệ phôi dị dạng cũng như tỷ lệ phôi chết khi phơi nhiễm với

Tartrazine dường như không tuân theo quy luật thông thường (Hình Error! No text

of specified style in document..11, Phụ lục 1). Hai tỷ lệ này không tăng liên tục theo

chiều tăng nồng độ mà chững lại ở khoảng nồng độ 4 đến 8 g/l. Do nồng độ 1 g/l và

2 g/l ảnh hưởng nghiêm trọng đến hình thái phôi ngay sau khi phôi nở ở 72 giờ sau

thụ tinh nên đến thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, hai nồng độ này làm chết nhiều phôi

hơn nồng độ 4 và 8 g/l. Nồng độ 12 và 16 g/l đã gây tác động lớn ngay từ thời điểm

hai giờ sau phơi nhiễm nên tỷ lệ chết tính tới thời điểm 96 giờ sau thụ tinh vẫn cao

hơn các nồng độ còn lại. Tỷ lệ ấu thể dị dạng ở nồng độ 2 g/l là cao nhất (khoảng

93%) trong khi ở nồng độ 12 g/l chỉ khoảng 72%.

Hình Error! No text of specified style in document..11. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ

lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Tartrazine ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh



3.1.2.2. Phơi nhiễm với chất tạo màu đỏ Amaranth (E123)

Sự tác động của Amaranth đến sự phát triển phôi cá ngựa vằn khá giống với

Tartrazine nhưng sự ảnh hưởng xuất hiện khi phơi nhiễm với nồng độ thấp hơn. Sau

2 giờ phơi nhiễm, phôi cá phơi nhiễm với Amaranth nồng độ từ 4 trở lên cũng quan

sát thấy hiện tượng làm tan đĩa phôi và noãn hoàng cùng với hệ quả gây chết sau 24

37

giờ sau thụ tinh (Phụ lục 2). Sở dĩ Amaranth và Tartrazine gây ra tác động nhanh

chóng như vậy là vì chúng không bị hoặc rất ít bị ngăn cản bởi màng phôi. Tính

thấm qua màng phôi bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố; một trong số đó là đặc tính ưa

lipit (Lipophilicity) của chất được thử nghiệm. Những chất này có thể dễ dàng đi

qua lớp màng phôi để ảnh hưởng trực tiếp đến phôi [28] và hai phụ gia E102 và

E123 đều có đặc tính này.

Sức sống của phôi thí nghiệm ở thời điểm 24 giờ sau thụ tinh chỉ bị ảnh

hưởng khi phơi nhiễm với nồng độ 4 và 8 g/l. Tỷ lệ phôi bị chết do tác động của hai

nồng độ này lần lượt là 55% và 100%. Ở 48 giờ sau thụ tinh, Amaranth không gây

chết thêm phôi so với 24 giờ sau thụ tinh (Hình Error! No text of specified style in

document..12, Phụ lục 3). Cùng với đó, E123 rất ít gây ảnh hưởng đến hình thái

phôi thí nghiệm ở hai thời điểm này.

Hình Error! No text of specified style in document..12. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ lệ

phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Amaranth



Sau khi phôi cá ngựa vằn nở, Amaranth lại tác động rất lớn đến cả hình thái

cũng như sức sống của ấu thể. Tại thời điểm 72 giờ sau thụ tinh, nồng độ 0,5 g/l và

38

1 g/l đã làm chết lần lượt khoảng 17% và 35% ấu thể còn nồng độ 4g/l gây chết đến

82%. Ở 96 giờ sau thụ tinh, mức độ ảnh hưởng của ba nồng độ này tương ứng là

31,7%; 60,1% và 93% (Hình Error! No text of specified style in document..12). Hình

thái phôi cũng bị biến đổi rất nhiều ở thời điểm này. Hiện tượng phơi nhiễm ở nồng

độ thấp hơn lại ảnh hưởng đến hình thái ấu thể nhiều hơn khi phơi nhiễm với nồng

độ cao hơn trong dải thí nghiệm cũng được ghi nhận ở các nồng độ 0,5 g/l; 1 g/l và

4 g/l. Kiểu dị dạng quan sát được cũng tương tự như ảnh hưởng của Tartrazine:

noãn hoàng biến dạng, trục cơ thể bị cong, phù đầu và tụ máu (Hình Error! No text

of specified style in document..13). Sự biến dạng noãn hoàng do Amaranth gây ra

có hơi khác với Tartrazine: khối noãn thường bị hoại tử nhiều và có thể bị chia

thành nhiều phần, sự phù túi noãn hoàng cũng ít gặp hơn và hiếm thấy có khối hoại

tử bên trong và Amaranth không gây ra hiện tượng tụ máu nhiều như Tartrazine. Tỷ

lệ phôi chết và dị dạng ghi nhận được do tác động của E123 vẫn tăng khi nồng độ

tăng.

Hình Error! No text of specified style in document..13. Phôi cá ngựa vằn sau 96

giờ phơi nhiễm với Amaranth

A, B, C, D: phôi bị dị dạng khi phơi nhiễm với E123 nồng độ 0,5 và 1 g/l;

E, F: phôi phơi nhiễm với nồng độ 4 g/l

c: cong vẹo trục cơ thể; e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử

e h c

e

c

c n

e, n h n

39

3.1.3. Hình thái phôi khi phơi nhiễm với nhóm chất bảo quản

3.1.3.1. Phơi nhiễm với sodium benzoate (E211)

Sau 24 giờ phơi nhiễm với dải gồm tám nồng độ thí nghiệm là 25; 45; 80;

145; 260; 350; 500 và 650 mg/l, Sodium benzoate không ảnh hưởng lớn đến hình

thái cũng như sức sống của phôi cá ngựa vằn. Ở thời điểm 48 giờ sau thụ tinh, E211

không gây chết thêm phôi thí nghiệm nhưng tác động nhiều đến hình thái của phôi.

Kiểu dị dạng phổ biến nhất quan sát được là hoại tử noãn hoàng khi phơi nhiễm với

nồng độ từ 80 mg/l trở lên. Từ nồng độ 260 mg/l, phôi bị phù túi noãn hoàng cùng

với tụ máu. Hiện tượng phù màng bao tim chỉ bắt gặp từ nồng độ 650 mg/l trở lên

(Hình Error! No text of specified style in document..14 A, B).

Hình Error! No text of specified style in document..14. Phôi cá ngựa vằn phơi

nhiễm với Sodium benzoate

A, B: phôi phơi nhiễm với nồng độ 650mg/l ở 48 giờ sau thụ tinh;

C, D: phôi phơi nhiễm với nồng độ 145mg/l ở 96 giờ sau thụ tinh

c: cong đuôi; e: phù nề; h: tụ máu; n: hoại tử

e

c

n

n

e

h

40

Tại thời điểm 72 giờ sau thụ tinh, nồng độ 350 mg/l đã cho thấy sự tác động

đến sức sống của phôi/ấu thể, cụ thể là làm chết 10%. Đến nồng độ 650 mg/l, 23%

phôi còn sống và 3% khi phơi nhiễm 850 mg/l.

Ở 96 giờ sau thụ tinh, chúng tôi quan sát thấy có thêm hai kiểu dị dạng là

hoại tử phần đầu và cong vẹo hoặc dị tật đuôi (Hình Error! No text of specified

style in document..14 C, D). Hoại tử phần noãn hoàng vẫn là kiểu phổ biến nhất khi

phơi nhiễm với E211và được quan sát từ nồng độ 45 mg/l trên 16,7% ấu thể. Hiện

tượng phù màng bao tim, phù noãn hoàng và hoại tử cũng được bắt gặp từ nồng độ

145 mg/l. Ngoài ra, phần kéo dài của noãn hoàng có thể không có hoặc bị gián

đoạn. Mặc dù sự dị dạng đã xảy ra từ nồng độ 45 mg/l nhưng phải đến nồng độ 145

mg/l, chúng tôi mới quan sát thấy tác động gây chết phôi đáng kể (khoảng 15%).

Nồng độ 650 mg/l làm chết gần như toàn bộ ấu thể (Hình Error! No text of

specified style in document..15, Phụ lục 4).

Hình Error! No text of specified style in document..15. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ

phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Sodium benzoate



41

Sau 96 giờ phơi nhiễm với Sodium benzoate ở nồng độ cao thì số loại và tỷ

lệ các dị dạng có xu hướng tăng. Như đã đề cập ở trên, hoại tử noãn hoàng là kiểu

phổ biến nhất, chiếm 100% ở nồng độ 350 và 500 mg/l. Có một điều khá thú vị,

hoại tử phần đầu và tụ máu là hai loại dị dạng đều bắt đầu hình thành ở nồng độ 145

mg/l và tỷ lệ của hai loại này luôn bằng nhau ở các nồng độ thí nghiệm (Hình

Error! No text of specified style in document..22A). Có thể, Sodium benzoate đã tác

động đến một gen/protein nào đó mà hệ quả là gây ra cả hai loại dị dạng cùng lúc.

Tuy nhiên, cần thực hiện nhiều thí nghiệm chuyên sâu hơn để chứng minh cho giả

thuyết này

42

3.1.3.2. Phơi nhiễm với propyl gallate (E310)

Khác với Sodium benzoate, Propyl gallate lại ảnh hưởng khá nhiều ở giai

đoạn sớm. Ở 24 giờ sau thụ tinh, nồng độ 26 mg/l đã gây chết 3% còn nồng độ 75

mg/l làm chết 99% tổng số phôi thí nghiệm. Tác động gây dị dạng đã quan sát thấy

từ nồng độ 35 mg/l trên 15% phôi; con số này ở nồng độ 60 mg/l lên tới 88% (Hình

Error! No text of specified style in document..16, Phụ lục 5). Ở thời điểm này, phôi

thường có dấu hiệu hoại tử cả phần đầu và thân ngoại trừ khối noãn hoàng cùng với

đuôi bị ngắn và xù xì (Hình Error! No text of specified style in document..17 B).

Một số phôi quan sát thấy hiện tượng phù màng noãn hoàng.

Hình Error! No text of specified style in document..16. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi

dị dạng khi phơi nhiễm với Propyl gallate



Tiếp tục phơi nhiễm với Propyl gallate, tỷ lệ phôi sống chỉ giảm nhẹ và giảm

khá đều nhau ở các thời điểm quan sát tiếp theo. Tỷ lệ này chỉ giảm từ 5,3% đến

14% và giảm nhiều nhất ở nồng độ 45 mg/l. Các đường cong nồng độ - tỷ lệ phôi

sống (màu đỏ) của E310 ở Hình Error! No text of specified style in document..16

43

phân bố khá sát nhau cũng thể hiện tác động gây chết của E310 diễn ra liên tục,

đồng đều qua các khoảng thời gian thí nghiệm. Hiện tượng này có thể do tác động

gây chết của Propyl gallate không đặc trưng cho một giai đoạn phát triển cụ thể nào

mà là độc tính chung.


nhiễm với Propyl gallate

Phôi cá sau 24 giờ (A), sau 48 giờ (B) và sau 96 giờ (D) phơi nhiễm với nồng độ 60 mg/l

Hình C: phơi nhiễm nồng độ 35 mg/l ở 96 giờ sau thụ tinh

e: phù nề; n: hoại tử; t: dị tật đuôi

Sau 96 giờ phơi nhiễm với Propyl gallate, chúng tôi ghi nhận được sự ảnh

hưởng đến hình thái ấu thể từ nồng độ 20 mg/l cho 15% tổng số phôi. Tỷ lệ phôi dị

dạng đạt 100% thấy được khi phơi nhiễm với nồng độ 60 mg/l. Tỷ lệ phôi bất

thường tăng đáng kể theo nồng độ E310 trong môi trường. Hình Error! No text of

specified style in document..22B cho thấy rằng, tỷ lệ tất cả các loại dị dạng quan sát

được đều tăng khi tăng nồng độ. Các kiểu tác động quan sát được cũng khá giống

với Sodium benzoate: hoại tử, đuôi cong vẹo, ngắn; phù màng tim, phù noãn hoàng.

Kiểu dị dạng quan sát được nhiều nhất và xuất hiện từ những nồng độ nhỏ của hai

phụ gia này là hoại tử. Có thể, hai chất này ảnh hưởng nhiều đến những gen liên

44

quan đến sự hoại tử đặc biệt là hoại tử noãn hoàng. Tuy nhiên, Propyl gallate gây ra

hiện tượng hoại tử nhiều ở phần đầu nhưng ít gây ra hiện tượng phù màng noãn

hoàng hơn và tụ máu.

45

3.1.4. Nhóm chất điều vị - Monosodium glutamate (E621)

Trong số các chất được thử nghiệm trong nghiên cứu này, Monosodium

glutamate là chất duy nhất làm chậm sự phát triển của phôi ở nồng độ cao nhất là 40

g/l. Tại thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, phôi phơi nhiễm với nồng độ này chưa hình

thành mắt, đuôi mới tách khỏi khối noãn hoàng, ngắn và xù xì (Hình Error! No text

of specified style in document..18). Hình thái này chiếm tỷ lệ khoảng 50% tổng số

phôi. Những phôi này ở thời điểm 48 giờ sau thụ tinh thường có ít sắc tố hơn so với

đối chứng, thường bị phù noãn, đuôi ngắn và cong vẹo, xù xì và đa số bị chết sau 96

giờ phơi nhiễm.


nhiễm với Monosodium glutamate

A: nồng độ 40g/l ở 24 giờ sau thụ tinh; B: nồng độ 40 g/l ở 48 giờ sau thụ tinh; F, G: nồng

độ 15 g/l ở 96 giờ sau thụ tinh

c: cong vẹo trục cơ thể; e: phù nề; h:tụ máu; n: hoại tử; t: dị tật đuôi

Nồng độ 40 g/l cũng gây chết 12% tổng số phôi ở 24 giờ sau thụ tinh. Tỷ lệ

phôi bị chết tăng lên rất ít ở thời điểm 48 và 72 giờ sau thụ tinh. Tuy nhiên, đến thời

điểm 96 giờ sau thụ tinh, số lượng phôi chết do tác động bởi nồng độ 40 g/l tăng lên

t

e

h

n

c

46

nhiều và đạt 95%. So với thời điểm 48 giờ sau thụ tinh, tỷ lệ phôi bị dị dạng tăng

lên đáng kể. Nồng độ 10 g/l, 15 g/l và 25g/l lần lượt gây dị dạng cho khoảng 12%;

42% và 86% phôi còn sống (Hình Error! No text of specified style in document..19,

Phụ lục 6). Các dị dạng quan sát được là phù màng tim, phù, cong vẹo, dị tật đuôi

và hoại tử. Ngoài ra, một số phôi còn bị phù màng bao noãn hoàng và tụ máu ở

nồng độ 25 g/l.

Tại thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, tỷ lệ ấu thể bị dị tật đuôi (thường là cong)

và hoại tử noãn hoàn tăng lên theo chiều tăng nồng độ. Hiện tượng hoại tử đầu chỉ

bắt gặp khi phơi nhiễm với nồng độ 15 g/l trở lên. Tỷ lệ dị tật này tăng từ khoảng

8% ở nồng độ 15 g/l lên 53% ở nồng độ 25 g/l sau đó lại giảm ở nồng độ 40 g/l có

thể do mức độ ảnh hưởng lớn đến sức sống của Monosodium glutamate ở nồng độ

này. Các kiểu phù màng bao tim hay tụ máu không quan sát thấy ở nồng độ 40 g/l

(Hình Error! No text of specified style in document..22E).

Hình Error! No text of specified style in document..19. Tỷ lệ phôi còn sống và tỷ

lệ phôi dị dạng khi phơi nhiễm với Monosodium glutamate

Đường màu đỏ thể hiện tỷ lệ phôi sống, đường màu đen thể hiện tỷ lệ phôi dị dạng trên

tổng số phôi còn sống, thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn giữa kết quả các lần thí nghiệm

48

3.1.5. Chất bảo quản đã bị cấm sử dụng – Formaldehyde (E240)

Formaldehyde đã được xác định là chất gây độc, gây ung thư do đó nó đã bị

cấm sử dụng trong bảo quản thực phẩm. Việc đánh giá độc tính của chất này trên

mô hình phôi cá ngựa vằn nhằm kiểm chứng khả năng gây độc của nó lên quá trình

phát triển phôi. Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy sự tác động khá đặc

biệt của chất này lên phôi cá ngựa vằn. Khi phơi nhiễm với Formaldehyde từ nồng

độ 200 ppm trở lên, phôi cá ngựa vằn đã hình thành một lớp màng bám sát với phôi,

nằm phía bên trong màng phôi. Cấu trúc màng này khiến cho phôi chỉ vận động rất

hạn chế, một vài trường hợp đuôi của phôi chỉ cử động tại chỗ (Hình Error! No text

of specified style in document..20B). Nồng độ càng cao thì số lượng phôi bị ảnh

hưởng theo cách này càng tăng lên và đạt 100% ở nồng độ 420 ppm. Có hai giả

thiết được đặt ra, thứ nhất là lớp màng trong cùng của phôi tách ra khỏi các lớp

màng khác và co lại do ảnh hưởng làm kết tủa của Formaldehyde. Thứ hai, dựa vào

kết quả của Henn và cộng sự năm 2011 thì màng phôi cá ngựa vằn gồm ba lớp trong

đó lớp trong cùng có độ dày chiếm tới 80%, đây là lớp gây cản trở sự xâm nhập của

các chất bất lợi vào phôi [28]. Do chính khả năng cố định làm kết dính các phân tử

protein lại với nhau của Formaldehyde [86], ở nồng độ có lượng phân tử đủ lớn thì

Formaldehyde đã nhanh chóng cố định các protein màng để tạo thành lớp màng

protein kết tủa có liên kết khá chặt chẽ làm cho các phân tử khác kể cả

Formaldehyde cũng khó xâm nhập được vào bên trong nên phôi vẫn phát triển được

ở mức độ nhất định. Tác động này được xem như một tiêu chí đánh giá dị dạng

riêng của Formaldehyde.

49


nhiễm với Formaldehyde

Phôi phơi nhiễm với nồng độ 290 ppm ở 24 giờ sau thụ tinh (A) và 48 giờ sau thụ tinh (B)

C, D: Phôi phơi nhiễm với nồng độ 200 ppm ở 96 giờ sau thụ tinh

y: noãn hoàng xù xì; n: hoại tử

Sau 24 giờ phơi nhiễm, chỉ những nồng độ cao nhất trong dải nồng độ thí

nghiệm mới có tác động đến sức sống của phôi. Nồng độ 350 ppm và 420 ppm lần

lượt gây chết khoảng 5% và 35% tổng số phôi thí nghiệm. Đến thời điểm 48 giờ sau

thụ tinh, do sự vận động của phôi nên lớp màng mới được hình thành bị vỡ ra hình

thành một vùng mờ bên trong khi quan sát dưới kính hiển vi (Hình Error! No text

of specified style in document..20 D). Tỷ lệ phôi chết do sự ảnh hưởng bởi hai nồng

độ 350 ppm và 420 ppm ở thời điểm này tăng lên đến khoảng tương ứng là 17% và

57%. Tỷ lệ dị dạng ghi nhận được cũng tăng đáng kể: nồng độ 240 ppm và 350 ppm

gây dị dạng cho khoảng 60 và 80% tổng số phôi (Hình Error! No text of specified

style in document..21, Phụ lục 7).

Kể từ thời điểm bắt đầu nở, vì không còn được sự bảo vệ của lớp màng ở giai

đoạn trước nữa nên phôi và ấu thể dễ bị tác động bởi Formaldehyde làm cho phôi bị

hoại tử và chết nhanh chóng sau đó. Tỷ lệ phôi chết tăng lên rất nhanh từ thời điểm

50

48 giờ đến 72 giờ sau thụ tinh. Nồng độ 290 ppm làm chết thêm 25% tổng số phôi

còn nồng độ 350 ppm làm chết thêm khoảng 77%. Tỷ lệ này tiếp tục tăng khi quan

sát ở 96 giờ sau thụ tinh. Nồng độ 240 ppm đã làm chết khoảng 35 % còn nồng độ

350 ppm gây chết toàn bộ phôi thí nghiệm (Hình Error! No text of specified style in

document..21, Phụ lục 7). Như vậy, tỷ lệ phôi chết tăng theo thời gian phơi nhiễm.

Hình Error! No text of specified style in document..21. Tỷ lệ phôi sống và tỷ lệ phôi

dị dạng khi phơi nhiễm với Formaldehyde



Formaldehyde là chất gây ít kiểu dị dạng nhất. Chúng tôi chỉ ghi nhận được

hai kiểu ảnh hưởng là noãn hoàng xù xì và hoại tử ở 96 giờ sau thụ tinh. Một lý do

để giải thích cho hiện tượng này là một khi phôi, ấu thể đã bị hoại tử ở một vị trí

nào đó thì sẽ rất nhanh chóng bị hoại tử toàn bộ cơ thể và dẫn đến hiện tượng phôi

chết. Tỷ lệ hoại tử ghi nhận được cao nhất ở nồng độ 240 ppm có thể do nồng độ

cao hơn đã làm chết những phôi hoại tử tại thời điểm quan sát. Trái lại, hiện tượng

noãn hoàng bị xù xì có thể không ảnh hưởng ngay đến sức sống ấu thể do đó tỷ lệ

phôi bị dị tật này quan sát được tăng dần theo chiều tăng nồng độ (Hình Error! No

text of specified style in document..22F).

51

Hình Error! No text of specified style in document..22. Tỷ lệ các loại dị dạng

quan sát được ở 96 giờ sau thụ tinh

52

Độ cao cột thể hiện giá trị trung bình của ba lần thí nghiệm. Tỷ lệ dị dạng được tính bằng

tỷ số giữa số phôi dị dạng trên số phôi còn sống tại thời điểm 96 giờ sau thụ tinh.

3.1.6. Sự ảnh hưởng của hóa chất đến tỷ lệ phôi nở

Sự nở của phôi phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ, ánh sáng, sự vận

động của phôi và hoạt động của hai enzyme nở là ZHE1 và ZHE2 [76]. Ở nhiệt độ

26 ± 10C, sau 72 giờ tính từ thời điểm thụ tinh, khoảng 75-85% phôi đối chứng

thoát khỏi lớp màng phôi. Hình Error! No text of specified style in document..23

cho thấy các chất đều có xu hướng làm giảm tỷ lệ phôi nở ở thời điểm 72 giờ sau

thụ tinh so với đối chứng và giảm nhiều nhất ở những nồng độ cao. Tuy nhiên, ảnh

hưởng của Monosodium glutamate và Tartrazine lại có chút khác biệt. Monosodium

glutamate làm tăng tỷ lệ phôi nở khi phơi nhiễm với nồng độ 2-10 g/l sau đó làm

giảm dần tỷ lệ này ở các nồng độ cao hơn. Ở thời điểm 72 giờ sau thụ tinh,

Monosodium glutamate nồng độ từ 2-10 g/l chưa gây ảnh hưởng nhiều đến hình

thái phôi, nhưng từ nồng độ 15 g/l trở lên, mức độ dị dạng đã nghiêm trọng hơn

nhiều nên có thể những tác động đó cũng tác động đến quá trình nở của phôi. Trái

lại, Tartrazine lại làm tăng tỷ lệ phôi nở ở những nồng độ gây ảnh hưởng lớn nhất

đến hình thái phôi/ấu thể cá đặc biệt là tăng cao nhất ở nồng độ 2 g/l.

53

Hình Error! No text of specified style in document..23. Tỷ lệ phôi nở ở thời điểm

72 giờ sau thụ tinh

54

Kết quả được biểu diễn bởi giá trị trung bình (chấm tròn). Thanh sai số thể hiện độ lệch

chuẩn. Sự khác biệt giữa lô thí nghiệm và đối chứng có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (*);

p<0,01 (**)

3.2. SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC HÓA CHẤT THỬ NGHIỆM ĐẾN NHỊP

TIM PHÔI CÁ NGỰA VẰN

Để đánh giá sự ảnh hưởng của các phụ gia đến chức năng tim, cụ thể là số

nhịp tim/phút, chúng tôi tiến hành thí nghiệm như mô tả ở mục 2.3.4. Kết quả được

thể hiện dưới dạng biểu đồ như Hình Error! No text of specified style in

document..24.

Nhìn chung, tất cả các chất đều có sự tác động nhất định đến số nhịp tim của

phôi/ấu thể cá ngựa vằn so với đối chứng. Sự ảnh hưởng này có thể là làm giảm

nhịp tim phôi do các chất Sodium benzoate, Propyl gallate, Amaranth, Monosodium

glutamate hoặc làm tăng nhịp tim phôi khi phơi nhiễm với Tartrazine,

Formaldehyde.

Đối với nhóm thứ nhất, xu hướng chung là đến nồng độ cao nhất thì tim đập

chậm hơn so với đối chứng. Tuy nhiên, khi xét dải từng nồng độ thì lại có sự biến

đổi khác biệt giữa các chất. Phôi khi phơi nhiễm với Sodium benzoate (E211) và

Propyl gallate (E310) đều có hiện tượng tim đập nhanh hơn sau đó nhịp tim mới

giảm dần. E211 làm cho nhịp tim tăng ngay từ những nồng độ đầu tiên trong dải thí

nghiệm (25 mg/l đến nồng độ 80 mg/l) sau đó nhịp tim bắt đầu giảm và giảm đáng

kể so với đối chứng ở nồng độ 500 mg/l. Trong khi đó, ở lô phơi nhiễm với E310,

chúng tôi chỉ quan sát hiện tượng đập nhanh hơn đáng kể ở khoảng giữa của dải

nồng độ (35 mg/l) rồi giảm dần và giảm rõ ràng so với đối chứng ở 60mg/l.

Monosodium glutamate và Amaranth chỉ có tác động làm giảm đáng kể ở nồng độ

cao trong dải nồng độ thí nghiệm và hiện tượng giảm này là do sự ảnh hưởng lớn

của các nồng độ này đến hình thái của phôi/ấu thể cá ngựa vằn.

55

Hình Error! No text of specified style in document..24. Nhịp tim/phút của ấu thể cá

ngựa vằn khi phơi nhiễm với các phụ gia

Kết quả được thể hiện dưới dạng tỷ lệ phần trăm giữa nhịp tim/phút của phôi/ấu thể cá

ngựa vằn khi phơi nhiễm với các nồng độ của phụ gia thực phẩm và đối chứng ở cùng lô

56

thí nghiệm. Thanh sai số thể hiện độ lệch chuẩn. Sự khác biệt giữa lô thí nghiệm và đối

chứng có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (*); p<0,01 (**); p < 0,001 (***)

Với nhóm thứ hai, Tartrazine và Formaldehyde là hai chất có tác động làm

tăng nhịp tim. Kết quả ở Hình 3-18 cho thấy, nhịp tim của phôi/ấu thể tăng theo

chiều tăng nồng độ của các chất thử. Đồng thời, tuy chưa thực hiện được việc đo

kích thước và xử lý thống kê, nhưng chúng tôi cũng nhận thấy biểu hiện khá rõ ràng

với hiện tượng kích thước tim phôi, ấu thể cá ngựa vằn nhỏ hơn đối chứng khi phơi

nhiễm với Tartrazine. Từ những đặc điểm này, chúng tôi đưa ra giả thiết rằng: để bù

đắp thiếu sót về hình thái, tim phải đập nhanh hơn để đáp ứng nhu cầu của cơ thể.

Tuy nhiên, giả thiết này còn cần những thí nghiệm chuyên sâu hơn để kiểm chứng.

Một điều đáng lưu ý là Sodium benzoate nồng độ 25 mg/l đã làm tăng đáng

kể nhịp tim ấu thể trong khi không gây ra bất kì sự biến đổi rõ rệt nào về hình thái

của ấu thể. Rõ ràng là Sodium benzoate đã có ảnh hưởng nhất định đến hoạt động

chức năng của tim. Điều này chứng tỏ phương pháp đánh giá dựa trên chức năng

các cơ quan có khả năng cho độ nhạy cao hơn so với phương pháp chỉ đánh giá dựa

trên hình thái.

3.3. ĐỘC TÍNH CỦA CÁC CHẤT PHỤ GIA TRONG NGHIÊN CỨU

Khi xử lý số liệu bằng phần mềm phân tích thống kê GraphPad Prism, ngoài

đồ thị thể hiện mối tương quan giữa nồng độ thí nghiệm với tỷ lệ phôi còn sống

cũng như tỷ lệ phôi bị dị dạng, chúng tôi còn xác định được các giá trị nồng độ gây

chết 50% tổng số phôi thí nghiệm - LC50 và nồng độ gây dị dạng 50% tổng số phôi

còn sống - EC50 ở các thời điểm quan sát. Từ đó, chỉ số gây quái thai TI cũng được

tính từ hai giá trị trên. Ngoài ra, giá trị nồng độ lớn nhất không quan sát thấy sự ảnh

hưởng khác biệt so với đối chứng (NOEC) và nồng độ nhỏ nhất gây ra sự ảnh

hưởng đáng kể (LOEC) cũng đã được xác định.

Chúng ta có thể dễ dàng nhận ra rằng các chỉ số LC50 và EC50 của tất cả các

chất đều giảm qua các thời điểm tiến hành quan sát 24, 48, 72, 96 giờ sau thụ tinh,

thể hiện rằng với cùng một nồng độ thí nghiệm, nếu tăng phơi nhiễm thì mức độ tác

động của nó sẽ tăng lên. Tuy nhiên, mức độ giảm các giá trị LC50 và EC50 qua thời

57

gian không giống nhau ở các chất. So với thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, ở 96 giờ

sau thụ tinh, giá trị LC50 của Amaranth giảm nhiều nhất (4,4 lần), tiếp đến là

Sodium benzoate (khoảng 3,4 lần). Hai chất có mức độ giảm ít nhất là Tartrazine

(khoảng 1,18 lần) và Propyl gallate (1,1 lần) (Hình Error! No text of specified style

in document..25). Hơn nữa, thời gian ghi nhận được sự giảm giá trị này cũng khác

nhau. Nồng độ LC50 của Monosodium glutamate và Tartrazine hầu như không

giảm sau 72 giờ phơi nhiễm và chỉ giảm ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh. Có hai giả

thuyết để giải thích cho hiện tượng trên. Một là hai chất này gặp phải rào cản là lớp

màng phôi, sau khi phôi nở thì mới bắt đầu gây chết nhiều, hai là đích tác động của

chúng chỉ xuất hiện sau thời điểm 72 giờ sau thụ tinh. Tuy nhiên, giả thiết thứ nhất

có thể cũng không giải thích được cho tất cả các chất, cụ thể là khi xét đến

Amaranth thì kích thước của Amaranth cồng kềnh hơn nhưng khả năng tác động

của nó cũng xảy ra ở giai đoạn rất sớm khi màng phôi vẫn còn nguyên vẹn. Sodium

benzoate và Amaranth là hai chất lại có giá trị LC50 giảm đột ngột từ khoảng 48-72

giờ sau thụ tinh, sau đó tiếp tục giảm ở 96 giờ sau thụ tinh chứng tỏ rằng Amaranth

đã vượt qua được màng để tác động đến sức sống phôi, ấu thể ngay trước và khi

phôi nở. Propyl gallate và Formaldehyde là hai chất giảm giá trị LC50 đồng đều qua

các thời điểm quan sát gợi ý rằng đích tác động của hai chất này không cụ thể ở thời

điểm nào mà tác động từ từ, đều đặn sau thời gian phơi nhiễm.

Ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh, Monosodium glutamate là chất có giá trị

LC50 cao nhất (27,45 g/l) tiếp đó là Tartrazine (9,13 g/l) và thấp nhất là Propyl

gallate (53,43 mg/l). Điều này thể hiện Propyl gallate là chất có độc tính lớn nhất,

lớn hơn cả Formaldehyde.

58

Hình Error! No text of specified style in document..25. Chỉ số LC50 thu được ở

các thời điểm của các chất

Giá trị trên trục tung được biểu diễn theo thang logarit cơ số 10

Chúng tôi cũng ghi nhận được sự thay đổi của chỉ số EC50 qua các thời điểm

thí nghiệm. Amaranth không gây dị dạng ở thời điểm 24 và 48 giờ sau thụ tinh nên

với chất này chúng tôi chỉ tính được ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh (0,83 g/l). Xu

hướng chung chúng tôi quan sát được là giá trị EC50 của các chất đều giảm sau thời

gian phơi nhiễm. Riêng Formaldehyde có sự tăng giá trị này ở thời điểm 96 giờ sau

thụ tinh so với 48 giờ sau thụ tinh có thể do tiêu chí đánh giá dị dạng ở thời điểm 48

giờ sau thụ tinh liên quan đến lớp màng phôi không được dùng để đánh giá tại 96

giờ sau thụ tinh do phôi đã nở cùng với việc Formaldehyde rất ít gây dị dạng.

Propyl gallate là chất có giá trị EC50 thấp nhất, tiếp sau là Sodium benzoate,

Tartrazine có chỉ số EC50 cao nhất (Hình Error! No text of specified style in

document..26).

59

Hình Error! No text of specified style in document..26. Các chỉ số độc học của các

chất ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh

Giá trị các chỉ số được thể hiện dưới dạng logarit cơ số 10 của nồng độ thu được (đơn vị

mg/l)

Chỉ số gây quái thai TI của các chất đều được tính bằng tỷ số giữa giá trị

LC50 và EC50 thu được (nếu có ảnh hưởng xảy ra). Kết quả thu được cho thấy ở

thời điểm 24 giờ sau thụ tinh, Propyl gallate và Formaldehyde thể hiện là chất gây

quái thai yếu với (1<TI<2)) còn Monosodium glutamate có thể coi là chất không

gây quái thai (TI~1). Ở 48 giờ sau thụ tinh, Tartrazine được cho là chất chủ yếu gây

chết với TI < 1 (TI = 0,77) còn các chất khác gây quái thai. Đặc biệt, Sodium

60

benzoate là chất gây dị dạng nhiều nhất. Trái lại, tại thời điểm 96 giờ sau thụ tinh,

Tartrazine lại thể hiện là chất gây quái thai mạnh nhất với TI = 8,89, tiếp sau là

Sodium benzoate (TI = 6,36) và thứ ba là Amaranth (TI = 2,24). Propyl gallate và

Monosodium glutamate là chất gây quái thai yếu còn Formaldehyde lại là chất có

ảnh hưởng chủ yếu là gây chết (TI < 1) (Hình Error! No text of specified style in

document..27).

Hình Error! No text of specified style in document..27. Chỉ số độc học TI của các

chất ở thời điểm 96 giờ sau thụ tinh

Trục tung được thể hiện theo thang logarit cơ số 10

Từ những nghiên cứu về mức độ độc tính của các chất trên mô hình động vật

có thể quy chiếu tương đối để tìm ra nồng độ an toàn khi phơi nhiễm với người. Do

đó, chỉ số ADI - mức độ liều lượng đủ để các chất phụ gia gây hại đến sức khỏe con

người có ý nghĩa quan trọng. Mức độ cao nhất mà không quan sát thấy có sự ảnh

hưởng xấu đến sức khỏe động vật thí nghiệm được gọi là NOAEL (No-Observed-

Adverse-Effect-Level) hoặc NOEC (No-Observed-Effect-Concentration). Chỉ số

ADI có thể tính bằng cách chia NOEC thu được từ những thí nghiệm trên động vật

cho một số phù hợp để giảm rủi ro có thể xảy ra cho con người. thông thường, số đó

là 100 (giả thuyết rằng con người nhạy cảm hơn động vật thí nghiệm 10 lần và sự

chênh lệch mức độ nhạy cảm với hóa chất trong quần thể người là 10 lần) [38, 72].

61

Giá trị ADI rút ra từ nghiên cứu của chúng tôi được thể hiện trong Bảng Error! No

text of specified style in document..6.

Khi so sánh với giá trị ADI của các chất đã được Ủy ban chuyên về các phụ

gia thực phẩm (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) công bố

tháng 11 năm 2013, đối với ba chất là Sodium benzoate, Propyl gallate, Tartrazine

kết quả thu được của chúng tôi nhỏ hơn. Với Amaranth thì kết quả của chúng tôi lại

lớn hơn nhiều (Bảng Error! No text of specified style in document..6). Sự khác

nhau đó có thể do đối tượng thí nghiệm, tiêu chí cũng như thời gian thí nghiệm là

khác nhau.

Bảng Error! No text of specified style in document..6. Liều lượng an toàn để sử

dụng hàng ngày chấp nhận được

E211 E310 E102 E123 E621 E240

NOEC

(mg/l) 25 15 500 100 2000 140

ADI

(mg/kg/d) 0,25 0,15 5 1 20 1,4

ADI đã

công bố* 5 1,4 7,5 0,5 - -

* Số liệu được lấy từ trang web: http://apps.who.int/food-additives-contaminants-

jecfa-database/search.aspx?fl=p

http://apps.who.int/food-additives-contaminants-jecfa-database/search.aspx?fl=p

http://apps.who.int/food-additives-contaminants-jecfa-database/search.aspx?fl=p

62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận

Từ các kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:

Các phụ gia thử nghiệm đều ảnh hưởng đến hình thái phôi. Các dị dạng quan sát

được là phù màng bao tim, phù màng noãn hoàng, phù đầu, hoại tử đầu, hoại tử

noãn hoàng, tụ máu và cong vẹo trục cơ thể.

Tartrazine và Formaldehyde làm tăng nhịp tim ở các nồng độ thí nghiệm,

Amaranth và Monosodium glutamate làm giảm nhịp tim ở nồng độ cao còn

Sodium benzoate Propyl gallate vừa làm tăng, vừa làm giảm nhịp tim.

Độc tính của các chất theo thứ tự giảm dần lần lượt là Propyl gallate >

Formaldehyde > Sodium benzoate > Amaranth > Tartrazine > Monosodium

glutamate.

Giá trị ADI thu được của Sodium benzoate, Propyl gallate, Tartrazine, Amaranth

và Monosodium glutamate lần lượt là 0,25; 0,15; 5; 1 và 20 mg/kg/ngày.

63

Kiến nghị

Từ những kết quả trên, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau:

Cần có quy định nghiêm ngặt về liều lượng sử dụng Propyl gallate trong thực

phẩm.

Với những chất có tiềm năng độc tính thì thực hiện ở mức độ chuyên sâu hơn

như sự tác động đến hành vi ấu thể hay sự biểu hiện gen, protein. Với những chất

có mức độ độc tính không cao thì tiến hành đánh giá tác động phối hợp với các

chất khác vì trong thực phẩm thường chứa nhiều loại phụ gia.

Nghiên cứu chuyên sâu hơn về cơ chế ảnh hưởng của các chất đặc biệt là

Tartrazine.

Tiến hành thử nghiệm trên phôi đã được loại bỏ lớp màng phôi để việc đánh giá

chính xác hơn.

64

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Vũ Anh Tuấn, Đinh Duy Thành, Nguyễn Lai Thành (2014), “Đánh giá ảnh

hưởng của ethanol, acetone và dimethyl sulfoxide lên quá trình phát triển

phôi cá ngựa vằn, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, 30 (3S), tr.

295-302.

Tài liệu Tiếng Anh

2. Al-Mossawi, M.J. (1983), “The mutagenic effect of amaranth (FD and C red

no. 2) in bacteria and yeast”, Environment International, 9 (2), pp. 145-

148.

3. Arnold, L.E. and Disilvestro R.A. (2005), “Zinc in attention-

deficit/hyperactivity disorder”, Journal of Child & Adolescent

Psychopharmacology, 15 (4), pp. 619-627.

4. Brannen, A.L. and Haggerty R.J. (2002), “Introduction to food additives”, in

Food additives, pp. 1-11.

5. Braunbeck, T., Böttcher M., et al. (2005), “Towards an alternative for the

acute fish LC (50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity

test goes multi-species—an update”, Altex, 22 (2), pp. 87-102.

6. Bren, L. (2001), “Frances Oldham Kelsey. FDA medical reviewer leaves her

mark on history”, FDA Consum, 35 (2), pp. 24-29.

7. Brown, V.J. (2003), “REACHing for chemical safety”, Environmental Health

Perspectives, 111 (14), pp. A766-A769.

8. Chen, Q., Huang N.-N., et al. (2009), “Sodium benzoate exposure

downregulates the expression of tyrosine hydroxylase and dopamine

transporter in dopaminergic neuronsin developing zebrafish”, Birth

Defects Research Part B: Developmental and Reproductive Toxicology,

86 (2), pp. 85-91.

9. D'amico, L., Li C., Glaze E., Davis M., and Seng W.L. (2011), “Zebrafish: A

Predictive Model for Assessing Cancer Drug-Induced Organ Toxicity”, in

Zebrafish, John Wiley & Sons, Inc., pp. 135-149.

10. Dahm, R., Geisler R., and Nüsslein-Volhard C. (2006), “Zebrafish (Danio

rerio) Genome and Genetics”, in Reviews in Cell Biology and Molecular

Medicine, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA.

65

11. Das, A. and Mukherjee A. (2004), “Genotoxicity testing of the food colours

amaranth and tartrazine”, International Journal of Human Genetics, 4 (4),

pp. 277.

12. De Jong, E., Barenys M., et al. (2011), “Comparison of the mouse Embryonic

Stem cell Test, the rat Whole Embryo Culture and the Zebrafish

Embryotoxicity Test as alternative methods for developmental toxicity

testing of six 1,2,4-triazoles”, Toxicology and Applied Pharmacology, 253

(2), pp. 103-111.

13. Ebert, A.G. (2009), “Evidence that MSG does not induce obesity”, Obesity

(Silver Spring), 17 (4), pp. 629-630; author reply 630-621.

14. EFSA (2010), “Scientific Opinion on the re-evaluation of Amaranth (E 123) as

a food additive on request from the European Commission”, EFSA

Journal, 8(7):1649 (41pp).

15. Efsa (2014), “Scientific Opinion on the re-evaluation of propyl gallate (E 310)

as a food additive”, EFSA Journal, 12(4):3642 (46 pp).

16. El-Nouby, K.A., Hamouda H.E., Abd El Azeem M.A., and El-Ebiary A.A.

(2009), “Food additives and Hymenolepis nana infection: an experimental

study”, Journal of the Egyptian Society of Parasitology, 39 (3), pp. 1015-

1032.

17. EU (2010), “Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the

Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for

scientific purposes”, Official Journal EU, L 276 (33-79s).

18. EU (2012), “2012/707/EU: Commission Implementing Decision of 14

November 2012 establishing a common format for the submission of the

information pursuant to Directive 2010/63/EU of the European Parliament

and of the Council on the protection of animals used for scientific

purposes”, Official Journal of the European Union, 028 P (163 - 180).

19. Freeman, M. (2006), “Reconsidering the effects of monosodium glutamate: a

literature review”, Journal of the American Academy of Nurse

Practitioners, 18 (10), pp. 482-486.

20. Gao, Y., Li C., Shen J., Yin H., An X., and Jin H. (2011), “Effect of Food Azo

Dye Tartrazine on Learning and Memory Functions in Mice and Rats, and

the Possible Mechanisms Involved”, Journal of Food Science, 76 (6), pp.

T125-T129.

66

21. Gerger, C., Thomas J., Janz D., and Weber L. (2015), “Acute effects of β-

naphthoflavone on cardiorespiratory function and metabolism in adult

zebrafish (Danio rerio)”, Fish Physiology and Biochemistry, 41 (1), pp.

289-298.

22. Groten, J., Butler W., Feron V., Kozianowski G., Renwick A., and Walker R.

(2000), “An analysis of the possibility for health implications of joint

actions and interactions between food additives”, Regulatory Toxicology

and Pharmacology, 31 (1), pp. 77-91.

23. Grunow, B., Mohamet L., and Shiels H.A. (2015), “Generating an in vitro 3D

cell culture model from zebrafish larvae for heart research”, Journal of

Experimental Biology, 218 (8), pp. 1116-1121.

24. Güngörmüş, C. and Kılıç A. (2012), “The safety assessment of food additives

by reproductive and developmental toxicity studies”, Food Additive,

InTech., pp 31-48

25. Guo, N., Lin J., et al. “Influences of acute ethanol exposure on locomotor

activities of zebrafish larvae under different illumination”, Alcohol, 49 (7),

pp. 727-737.

26. Hashem, M.M., Atta A.H., Arbid M.S., Nada S.A., Mouneir S.M., and Asaad

G.F. (2011), “Toxicological impact of amaranth, sunset yellow and

curcumin as food coloring agents in albino rats”, Journal of Pioneering

Medical Sciences, 1 (2), pp. 43.

27. He, K., Zhao L., et al. (2008), “Association of monosodium glutamate intake

with overweight in Chinese adults: the INTERMAP Study”, Obesity

(Silver Spring), 16 (8), pp. 1875-1880.

28. Henn, K. (2011), Limits of the fish embryo toxicity test with Danio rerio as an

alternative to the acute fish toxicity test, University of Heidelberg,

Germany.

29. Hill, A., Mesens N., Steemans M., Xu J.J., and Aleo M.D. (2012),

“Comparisons between in vitro whole cell imaging and in vivo zebrafish-

based approaches for identifying potential human hepatotoxicants earlier

in pharmaceutical development”, Drug metabolism reviews, 44 (1), pp.

127-140.

30. Hodgson, E. (2004), "Food Additives and Contaminants", in A textbook of

modern toxicology, 4ed, pp 65-66.

67

31. Howe, K., Clark M.D., et al. (2013), “The zebrafish reference genome

sequence and its relationship to the human genome”, Nature, 496 (7446),

pp. 498-503.

32. Howe, K., Clark M.D., et al. (2013), “The zebrafish reference genome

sequence and its relationship to the human genome”, Nature, 496 (7446),

pp. 498-503.

33. Humans, I.W.G.O.T.E.O.C.R.T. and Cancer I.a.F.R.O. (1995), Wood dust and

formaldehyde, World Health Organization, International Agency for

Research on Cancer.

34. Hwang, W.Y., Fu Y., Reyon D., Gonzales A.P., Joung J.K., and Yeh J.-R.J.

(2015), “Targeted Mutagenesis in Zebrafish Using CRISPR RNA-Guided

Nucleases”, CRISPR: Methods and Protocols, pp. 317-334.

35. Hwang, W.Y., Fu Y., et al. (2013), “Efficient genome editing in zebrafish

using a CRISPR-Cas system”, Nature biotechnology, 31 (3), pp. 227-229.

36. IPCS (1989), “Environmental health criteria 89:Formaldehyde ”, World

Health Organization, (219pp).

37. Jacoby, E. and Mozzarelli A. (2009), “Chemogenomic strategies to expand the

bioactive chemical space”, Current medicinal chemistry, 16 (33), pp.

4374-4381.

38. Joint, F., Organization W.H., and Additives W.E.C.O.F. (1987), “Principles

for the safety assessment of food additives and contaminants in food”

Geneva : World Health Organization.

39. Kim, J.H. and Scialli A.R. (2011), “Thalidomide: the tragedy of birth defects

and the effective treatment of disease”, Toxicological Sciences, 122 (1),

pp. 1-6.

40. Kimmel, C.B., Ballard W.W., Kimmel S.R., Ullmann B., and Schilling T.F.

(1995), “Stages of embryonic development of the zebrafish”,

Developmental Dynamics, 203 (3), pp. 253-310.

41. Kobayashi, H., Oikawa S., Hirakawa K., and Kawanishi S. (2004), “Metal-

mediated oxidative damage to cellular and isolated DNA by gallic acid, a

metabolite of antioxidant propyl gallate”, Mutation Research/Genetic

Toxicology and Environmental Mutagenesis, 558 (1–2), pp. 111-120.

42. Lammer, E., Carr G.J., Wendler K., Rawlings J.M., Belanger S.E., and

Braunbeck T. (2009), “Is the fish embryo toxicity test (FET) with the

68

zebrafish (Danio rerio) a potential alternative for the fish acute toxicity

test?”, Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &

Pharmacology, 149 (2), pp. 196-209.

43. Larsen, J.C., Mortensen A., and Hallas-Møller T., Scientific Opinion on the re-

evaluation Tartrazine (E 102) on request from the European Commission:

Question No EFSA-Q-2008-222. 2009, European Food Safety Authority.

44. Lau, K., Mclean W.G., Williams D.P., and Howard C.V. (2006), “Synergistic

interactions between commonly used food additives in a developmental

neurotoxicity test”, Toxicological Sciences, 90 (1), pp. 178-187.

45. Lenz, W. (1977), “Thalidomide and Congenital Abnormalities”, in Problems

of Birth Defects, Springer, pp. 199-199.

46. Lieschke, G.J. and Currie P.D. (2007), “Animal models of human disease:

zebrafish swim into view”, Nature Reviews Genetics, 8 (5), pp. 353-367.

47. Lilienblum, W., Dekant W., et al. (2008), “Alternative methods to safety

studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals

under the new European Chemicals Legislation (REACH)”, Archives of

toxicology, 82 (4), pp. 211-236.

48. Loucks, E. and Ahlgren S. (2012), “Assessing Teratogenic Changes in a

Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure”, Journal of Visualized

Experiments : JoVE, (61), pp. 3704.

49. Mccann, D., Barrett A., et al. (2007), “Food additives and hyperactive

behaviour in 3-year-old and 8/9-year-old children in the community: a

randomised, double-blinded, placebo-controlled trial”, The Lancet, 370

(9598), pp. 1560-1567.

50. Mckim, J.M. (1977), “Evaluation of tests with early life stages of fish for

predicting long-term toxicity”, Journal of the Fisheries Board of Canada,

34 (8), pp. 1148-1154.

51. Moutinho, I., Bertges L., and Assis R. (2007), “Prolonged use of the food dye

tartrazine (FD&C yellow n° 5) and its effects on the gastric mucosa of

Wistar rats”, Brazilian journal of biology, 67 (1), pp. 141-145.

52. Mpountoukas, P., Pantazaki A., et al. (2010), “Cytogenetic evaluation and

DNA interaction studies of the food colorants amaranth, erythrosine and

tartrazine”, Food and Chemical Toxicology, 48 (10), pp. 2934-2944.

69

53. Murray, K.E., Thomas S.M., and Bodour A.A. (2010), “Prioritizing research

for trace pollutants and emerging contaminants in the freshwater

environment”, Environmental Pollution, 158 (12), pp. 3462-3471.

54. Nagel, R. (2002), “DarT: The embryo test with the Zebrafish Danio rerio--a

general model in ecotoxicology and toxicology”, ALTEX, 19 Suppl 1, pp.

38-48.

55. Nagel, R. and Isberner K. (1998), “Testing of chemicals with fish — a critical

evaluation of tests with special regard to zebrafish”, in Fish

Ecotoxicology, T. Braunbeck, D. Hinton, and B. Streit, Editors, Birkhäuser

Basel, pp. 337-352.

56. Narayanan, S.N., Kumar R.S., Paval J., and Nayak S. (2010), “Effect of

ascorbic acid on the monosodium glutamate-induced neurobehavioral

changes in periadolescent rats”, Bratislavske lekarske listy, 111 (5), pp.

247-252.

57. Nethercott, J.R., Lawrence M.J., Roy A.M., and Gibson B.L. (1984),

“Airborne contact urticaria due to sodium benzoate in a pharmaceutical

manufacturing plant”, Journal of Occupational Medicine and Toxicology,

26 (10), pp. 734-736.

58. Nielsen, G.D. and Wolkoff P. (2010), “Cancer effects of formaldehyde: a

proposal for an indoor air guideline value”, Archives of toxicology, 84 (6),

pp. 423-446.

59. Nordbeck, R. and Faust M. (2003), “European chemicals regulation and its

effect on innovation: an assessment of the Eu's White Paper on the

strategy for a future chemicals policy”, European Environment, 13 (2), pp.

79-99.

60. OECD Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test, OECD Publishing.

61. OECD (2005), “Guidance Document on the Validation and International

Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment ”,

OECD Series on Testing and Assessment No. 34, OECD Publishing.

62. OECD (2013), “Test No. 236: Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test”,

OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2, OECD

Publishing.

70

63. Organization, W.H. (2002), “Concise international chemical assessment

document 40: Formaldehyde”, Geneva, Switzerland: World Health

Organization.

64. Peterson, R.T. and Fishman M.C. (2011), “Designing zebrafish chemical

screens”, Methods in Cell Biology, 105, pp. 525-541.

65. Peterson, R.T. and Macrae C.A. (2012), “Systematic Approaches to

Toxicology in the Zebrafish”, Annual Review of Pharmacology and

Toxicology, 52 (1), pp. 433-453.

66. Pohl, R., Balon R., Berchou R., and Yeragani V.K. (1987), “Allergy to

tartrazine in antidepressants”, The American Journal of Psychiatry, 144

(2), pp. 237-238.

67. Poul, M., Jarry G., Elhkim M.O., and Poul J.-M. (2009), “Lack of genotoxic

effect of food dyes amaranth, sunset yellow and tartrazine and their

metabolites in the gut micronucleus assay in mice”, Food and chemical

toxicology, 47 (2), pp. 443-448.

68. Pruvot, B., Quiroz Y., et al. (2012), “Zebrafish (Danio rerio) behavioral

analysis: A new tool in toxicological assays”, Toxicology Letters, 211, pp.

S153.

69. Pruvot, B., Quiroz Y., et al. (2012), “A panel of biological tests reveals

developmental effects of pharmaceutical pollutants on late stage zebrafish

embryos”, Reproductive Toxicology, 34 (4), pp. 568-583.

70. Qiao-Jia, L., Gui-Di Y., and Jing-Hong L. (2005), “Application and

mechanism principium research on nano-SiO_2/urea formaldehyde resin

[J]”, Journal of Fujian College of Forestry, 2, pp. 000.

71. Raghavan, S. and Hultin H.O. (2005), “Model system for testing the efficacy

of antioxidants in muscle foods”, Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 53 (11), pp. 4572-4577.

72. Renwick, A.G. (1996), “Needs and methods for priority setting for estimating

the intake of food additives”, Food Additives & Contaminants, 13 (4), pp.

467-475.

73. Reuss, G., Disteldorf W., Gamer A.O., and Hilt A. (2000), “Formaldehyde”, in

Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH Verlag

GmbH & Co. KGaA.

71

74. Rowe, K.S. and Rowe K.J. (1994), “Synthetic food coloring and behavior: a

dose response effect in a double-blind, placebo-controlled, repeated-

measures study”, Journal of Pediatrics, 125 (5 Pt 1), pp. 691-698.

75. Rubinstein, A.L. (2006), “Zebrafish assays for drug toxicity screening”.

Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology, 2(2) ppp 231-40.

76. Sano, K., Inohaya K., Kawaguchi M., Yoshizaki N., Iuchi I., and Yasumasu S.

(2008), “Purification and characterization of zebrafish hatching enzyme -

an evolutionary aspect of the mechanism of egg envelope digestion”,

FEBS J, 275 (23), pp. 5934-5946.

77. Sasaki, Y.F., Kawaguchi S., et al. (2002), “The comet assay with 8 mouse

organs: results with 39 currently used food additives”, Mutation

Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 519 (1–2),

pp. 103-119.

78. Schirmer, K. (2006), “Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish

them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents

using fish”, Toxicology, 224 (3), pp. 163-183.

79. Scholz, S., Fischer S., Gündel U., Küster E., Luckenbach T., and Voelker D.

(2008), “The zebrafish embryo model in environmental risk assessment—

applications beyond acute toxicity testing”, Environmental Science and

Pollution Research, 15 (5), pp. 394-404.

80. Segner, H. (2004), “Cytotoxicity assays with fish cells as an alternative to the

acute lethality test with fish”, Alternatives to laboratory animals: ATLA,

32 (4), pp. 375-382.

81. Siew, S.S., Kauppinen T., Kyyrönen P., Heikkilä P., and Pukkala E. (2012),

“Occupational exposure to wood dust and formaldehyde and risk of nasal,

nasopharyngeal, and lung cancer among Finnish men”, Cancer

management and research, 4, pp. 223.

82. Sijm, D. (2001), “Benzoates” SIDS Initial Assessment Report For 13th SIAM,

The Netherlands.

83. Solbé, J., Mark U., et al. (1998), “Analysis of the ECETOC Aquatic Toxicity

(EAT) database I—general introduction”, Chemosphere, 36 (1), pp. 99-

113.

72

84. Stevenson, D.D., Simon R.A., Lumry W.R., and Mathison D.A. (1986),

“Adverse reactions to tartrazine”, Journal of Allergy and Clinical

Immunology, 78 (1), pp. 182-191.

85. Tayama, S. and Nakagawa Y. (2001), “Cytogenetic effects of propyl gallate in

CHO-K1 cells”, Mutation Research/Genetic Toxicology and

Environmental Mutagenesis, 498 (1–2), pp. 117-127.

86. Thavarajah, R., Mudimbaimannar V.K., Elizabeth J., Rao U.K., and

Ranganathan K. (2012), “Chemical and physical basics of routine

formaldehyde fixation”, Journal of Oral and Maxillofacial Pathology :

JOMFP, 16 (3), pp. 400-405.

87. Turusov, V., Rakitsky V., and Tomatis L. (2002),

“Dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT): ubiquity, persistence, and

risks”, Environ Health Perspect, 110 (2), pp. 125-128.

88. Vandenberg, L.N., Colborn T., et al. (2012), “Hormones and Endocrine-

Disrupting Chemicals: Low-Dose Effects and Nonmonotonic Dose

Responses”, Endocrine Reviews, 33 (3), pp. 378-455.

89. Vos, J.G., Dybing E., et al. (2000), “Health effects of endocrine-disrupting

chemicals on wildlife, with special reference to the European situation”,

CRC Critical Reviews in Toxicology, 30 (1), pp. 71-133.

90. Wedekind, C., Von Siebenthal B., and Gingold R. (2007), “The weaker points

of fish acute toxicity tests and how tests on embryos can solve some

issues”, Environmental Pollution, 148 (2), pp. 385-389.

91. Williams, A. and Woessner K. (2009), “Monosodium glutamate ‘allergy’:

menace or myth?”, Clinical & Experimental Allergy, 39 (5), pp. 640-646.

92. Zhu, C., Smith T., et al. (2011), “Evaluation and application of modularly

assembled zinc-finger nucleases in zebrafish”, Development, 138 (20), pp.

4555-4564.

93. Zurita, J.L., Jos Á., Del Peso A., Salguero M., López-Artíguez M., and

Repetto G. (2007), “Ecotoxicological effects of the antioxidant additive

propyl gallate in five aquatic systems”, Water Research, 41 (12), pp.

2599-2611.

PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết quả thí nghiệm với Tartrazine

nồng độ (g/l) Đối chứng 0,25 0,5 1 2 4 8 12 16

R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3

sống

24h 24 24 24 20 20 20 19 20 20 20 20 20 20 19 20 18 20 19 16 16 15 10 8 7 4 0 2

48h 24 24 24 20 20 20 19 20 20 20 20 20 20 19 20 18 20 19 16 15 15 10 8 7 4 0 2

72h 24 24 24 20 20 20 19 20 20 20 20 20 20 19 20 17 20 19 16 15 15 10 8 7 4 0 2

96h 24 24 24 20 20 20 19 20 20 20 18 20 15 13 17 14 17 17 14 15 13 10 7 6 3 0 2

phù tim

48h

96h

1

4

1

phù đầu

48

96

1 4 2 6 7 2 7 5 4 1 1

phù noãn

48h

1 6

3

96h

9 7 7 7 11 12 12 12 12 6 5 3 1

1

dị tật đuôi

24h

1

48 h

1

1 1

96 h

1

3

1 1

1 2 3

1 1 3 2

hoại tử noãn

24h

48 h

1

96 h

1 2 3

10 5 3 9 5 1 1 1 3 4

3

Tụ máu

48

2

2 1

96

1 9 10 9 11 13 15 12 13 14 12 12 6 4 1 2 1

1

Nở 72h 20 20 19 - - - 14 11 16 19 16 17 20 18 18 16 18 15 16 15 12 5 4 6 2

2

R: lần thí nghiệm

Phụ lục 2: Phôi cá ngựa vằn sau 2 giờ phơi nhiễm với Amaranth nồng độ 4 g/l

Phụ lục 3: Kết quả thu được khi phơi nhiễm với Amaranth

Nồng độ (g/l) Đối chứng 0,1 0,2 0,5 1 2 4 8

R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3

Sống

24h 20 20 20 20 20 20 20 19 20 20 20 20 20 20 19 20 19 18 18 4 5 0 0 0

48h 20 20 20 20 20 20 20 18 20 20 20 20 20 20 19 20 19 18 18 4 4 0 0 0

72h 20 20 20 20 20 20 20 18 20 15 18 17 11 15 13 13 15 14 6 3 2 0 0 0

96h 20 20 20 20 20 20 20 18 20 12 16 13 8 8 7 4 7 7 3 1 0 0 0 0

Phù tim 48h

96h

1 3

1

1

Phù đầu 48

96

4 7 5 3 2 2 2 1 2

Phù noãn

24h

48h

96h

7 12 9 5 3 2 3 3 3 1

Dị tật đuôi

24h

48 h

96 h

4

2 1

2

Hoại tử noãn 48 h

96 h

5 8 6 3 2 2 2 3 1 1

Tụ máu 48

96

6 7

4 5 4 4 6 4 3 1

Nở 72h 21 18 19 16 17 16 14 13 14 5 10 9 6 5 6 2 3 1 1


Phụ lục 4: Kết quả thí nghiệm với Sodium benzoate

Nồng độ (mg/l) Đối chứng 25 45 80 145 260 350 500 650

R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3 R1 R2 R3

Sống

24h 24 24 24 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 19 19 20 20 20 20 20 20 19

48h 24 24 24 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 19 19 20 20 20 19 20 20 18

72h 24 24 24 20 20 20 20 20 20 20 20 20 19 20 20 20 20 20 19 19 16 17 19 16 3 5 6

96h 24 24 24 20 20 20 20 20 18 18 20 20 12 19 20 5 16 17 9 10 7 2 7 3 0 0 1

Phù tim 48h

6

3 2

96h

3 2

8 2 15 14 9 10 7 2 6 2

1

Phù noãn

24h

48h

3 2 1 4 2 6 17 17

96h

1

4

10 6

7 3

1

Dị tật đuôi

24h

48 h

96 h

1

3

3 2 4 9 6 1 6 3

Hoại tử

noãn

24h

2

48 h

3 1 5 9 7

19 18 19 19 20 20 20 19 20

96 h

1 2 2 6 8 11 12 12 19 18 4 15 17 9 10 7 2 7 3

1

Hoại tử

đầu 96 h

5

4

4 3

2 1 2

Tụ máu 48

3 2

1

6 16 12

20

96

1 3

10

7 3

1

Nở 72h 24 19 24 20 18 19 20 15 17 20 10 15 19 10 12 20 5 14 17 4 8 1 0 0 0 0 0


Phụ lục 5: kết quả thí nghiệm với Propyl gallate

Nồng độ (mg/l) Đối chứng 15 20 26 35 45 60 75


Sống

24h 24 24 23 20 20 20 20 20 20 18 20 20 18 20 19 16 19 17 8 5 17 0 0 1

48h 24 24 23 20 20 20 20 20 20 18 20 20 17 20 18 15 18 17 6 5 16 0 0 0

72h 24 24 23 20 20 20 20 20 20 18 20 20 17 20 18 14 18 16 6 4 16 0 0 0

96h 24 24 23 20 20 20 20 20 20 18 20 20 16 20 17 11 18 15 5 4 15 0 0 0

Phù tim 48h

96h

7

1 10 12 6 5 4 5

Phù noãn

24h

1 1

1

48h

6 1

8 12

4 4 13

96h

1 2 1

6 3

2 2

Dị tật đuôi

24h

5

1 1

6 5 8

48 h

6 1

10 8

6 5 12

96 h

8 3 1 10 14 7 4 4 13

Hoại tử noãn

24h

6

12 11

7 5 11

48 h

6 4

14 11

6 5 10

96 h

5 4

3 2 0 15 18 8 11 18 10 5 4 15

Hoại tử đầu

24h

2 1

12 11

8 5 11

48 h

2 1

10 10

6 4 11

96 h

5 10 0 9 13 2 4 4 7

Tụ máu 96

1

1

Nở 72h 21 19 22 19 19 15 19 20 17 18 19 17 6 10 12 2 3 9 0 0 1


Phụ lục 6: Kết quả thí nghiệm với Monosodium glutamate

Nồng độ (g/l) Đối chứng 2 5 10 15 25 40 60


Sống

24h 24 24 24 19 20 19 20 20 19 20 20 20 20 20 20 19 20 20 15 20 13 0 0 0

48h 24 24 24 19 20 19 20 20 19 20 20 20 20 20 20 19 20 20 15 20 12 0 0 0

72h 24 24 24 19 20 19 20 20 19 19 20 20 20 20 20 19 20 20 12 18 7 0 0 0

96h 24 24 24 19 20 19 20 20 19 17 20 20 15 20 20 5 19 16 0 3 0 0 0 0

Phù tim 48h

1

1

96h

2 2

6 2 2 1 1 2

Phù noãn

24h

48h

1

2 1

2 1

4 14 3

96h

1

Dị tật đuôi

24h

1

14

48 h

1

13 17 8

96 h

4

1 13 5

3

Hoại tử người

24h

48 h

1

22

96 h

1 1

2 4 4 2 15 7

3

Hoại tử đầu

48 h

1

96 h

3

1 4 12 3

1

48

0

Tụ máu 96

2

2

1 1

2

Nở 72h 21 18 19 17 18 16 17 19 19 19 18 20 20 17 10 18 16 10 5 4 0


Phụ lục 7: Kết quả thí nghiệm với Formaldehyde

Nồng độ (ppm) Đối chứng 140 170 200 240 290 350 420


Sống

24h 23 24 24 20 20 20 20 19 20 20 20 20 20 19 18 20 18 18 20 20 17 14 13 12

48h 23 24 24 20 20 20 20 19 20 20 20 20 20 19 18 20 18 18 15 20 15 12 10 10

72h 23 24 24 20 20 20 20 19 20 20 20 20 18 19 18 12 16 18 0 4 14 0 0 0

96h 23 24 24 20 20 20 20 19 20 20 19 20 7 19 8 0 6 3 0 0 0 0 0 0

Hình

thành lớp

màng kín

24h - - - 3 - 9 - 2 10 - 10 17 - 13 12

48h 1 8 3 7 10 17 5 16 16 7 19 15 12 10 10

Noãn

hoàng xù

xì

96h

3

2

1

3

Hoại tử

thân 96h

1 1

1 1 1 1 2 1

5 1

Nở

23 20 21 20 8 17 20 9 17 18 15 19 14 11 9 10 13 5 0 2 5
