8/2/2019 Subunidad Sigma

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 9 3 , p p . 8 8 5 8 - 8 8 6 2 , A u g u s t 1 9 9 6B i o c h e m i s t r y

The s i g m a s u b u n i t o f E s c h e r i c h i a c o l i RNA polymerase s e n s e spromoter s p a c i n g( t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n )

A L I C I A J . D o M B R O S K I * , BRADLEY D . J O H N S O N * , MICHAEL L O N E T T O t , A ND CAROL A . G R O S S t* D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y a n d M o l e c u l a r G e n e t i c s , T h e U n i v e r s i t y o f T e x a s H e a l t h S c i e n c e C e n t e r , 6 4 3 1 F a n n i n S t r e e t , H o u s t o n , TX 7 7 0 3 0 ; a n dt D e p a r t m e n t s o f M i c r o b i o l o g y a n d S t o m a t o l o g y , U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a , S a n F r a n c i s c o , 5 1 3 P a r n as su s A v e n u e , S a n F r a n c i s c o , C A 9 4 1 4 3 - 0 5 1 2C o n t r i b u t e d b y C a r o l A . G r o s s , A p r i l 2 5 , 1 9 9 6A B ST R A CT T h e p r o m o t e r s r e c o g n i z e d b y o r 7 r , t h e p r i -m a r y s i g m a o f E s c h e r i c h i a c o l i , c o n s i s t o f t w o h i g h l y c o n s e r v e dh e x a m e r s l o c a t e d a t - 1 0 a n d - 3 5 b p f r o m t h e s t a r t p o i n t o ft r a n s c r i p t i o n , s e p a r a t e d b y a p r e f e r r e d s p a c i n g o f 1 7 b p . a ,f a c t o r s h a v e t w o d i s t i n c t D NA b i n d i n g d o m a i n s t h a t r e c o g n i z et h e t w o h e x a m e r s e q u e n c e s . H o w e v e r , t h e c o m p o n e n t o f R NAp o l y m e r a s e r e c o g n i z i n g t h e l e n g t h o f t h e s p a c i n g b e t w e e nh e x a m e r s h a s n o t b e e n d e t e r m i n e d . U s i n g a n e q u i l i b r i u mD NA b i n d i n g c o m p e t i t i o n a s s a y , w e d e m o n s t r a t e t h a t ap o l y p e p t i d e o f c r 7 0 c a r r y i n g b o t h D NA b i n d i n g d o m a i n s i s v e r ys e n s i t i v e t o p r o m o t e r s p a c i n g , w h e r e a s a c r 7 0 p o l y p e p t i d e w i t ho n l y o n e DNA b i n d i n g d o m a i n i s n o t . F u r t h e r m o r e , a m u t a n tc r , s e l e c t e d f o r i n c r e a s i n g t r a n s c r i p t i o n o f t h e m i n i m a l l a cp r o m o t e r ( 1 8 - b p s p a c e r ) , h a s a n a l t e r e d r e s p o n s e t o p r o m o t e rs p a c i n g i n v i v o a n d i n v i t r o . Our d a t a s u p p o r t t h e i d e a t h a t a ,m a k e s s i m u l t a n e o u s , p r o d u c t i v e c o n t a c t s a t b o t h t h e -10 a n dt h e - 3 5 r e g i o n s o f t h e p r o m o t e r a n d d i s c e r n s t h e s p a c i n gb e t w e e n t h e s e c o n s e r v e d r e g i o n s .T h e s i g m a ( a - ) s u b u n i t s o f p r o k a r y o t i c RNA p o l y m e r a s ep r o v i d e s p e c i f i c i t y f o r t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n b y d i r e c t i n gRNA p o l y m e r a s e t o p r o m o t e r DNA s e q u e n c e s ( 1 , 2 ) . E v e r yc e l l c o n t a i n s a p r i m a r y a - f a c t o r , w h i c h i s e s s e n t i a l f o r e x p r e s -s i o n o f g e n e s r e q u i r e d f o r n o r m a l g r o w t h , a n d s e v e r a l a l t e r -n a t i v e a - f a c t o r s , w h i c h a r e u s e d t o r e s p o n d t o a l t e r e d e n v i -r o n m e n t a l c o n d i t i o n s a n d t o p r o g r a m d e v e l o p m e n ta l p a t h w a y s( 3 ) . T h e m a j o r i t y o f p r i m a r y a n d a l t e r n a t i v e o c f a c t o r s a r er e l a t e d i n a m i n o a c i d s e q u e n c e t o o . 7 0 , t h e E s c h e r i c h i a c o l ip r i m a r y c r , a n d e x h i b i t f o u r m a j o r r e g i o n s o f h o m o l o g y ( r e f . 3 ;F i g . 1 ) . M u t a t i o n a l a n a l y s i s h a s i m p l i c a t e d c o n s e r v e d r e g i o n2 . 4 o f a - i n r e c o g n i t i o n o f t h e - 10 h e x a m e r a n d c o n s e r v e dr e g i o n 4 . 2 o f a - i n r e c o g n i t i o n o f t h e - 3 5 h e x a m e r o f t h ep r o m o t e r ( F i g . 1 ; f o r r e v i e w , s e e r e f . 3 ) . B i o c h e m i c a l c h a r a c -t e r i z a t i o n s u p p o r t s t h e s e c o n c l u s i o n s . P a r t i a l p o l y p e p t i d e s o fo . 7 0 c o n t a i n i n g e i t h e r r e g i o n 2 o r r e g i o n 4 i n t e r a c t s p e c i f i c a l l yw i t h t h e - 1 0 o r - 3 5 p r o m o t e r e l e m e n t s , r e s p e c t i v e l y , p r o -v i d e d t h a t t h e N - t e r m i n a l i n h i b i t o r y d o m a i n o f r e g i o n 1 i sr e m o v e d . M o r e o v e r , a o r 7 0 f r a g m e n t c a r r y i n g b o t h DNA b i n d -i n g d o m a i n s i n t e r a c t s s p e c i f i c a l l y w i t h DNA t h a t r e t a i n s b o t hp r o m o t e r e l e m e n t s . DNA b i n d i n g b y a - 7 0 f r a g m e n t s a c c u r a t e l yr e f l e c t s h o l o e n z y m e i n t e r a c t i o n s a t t h e p r o m o t e r b e c a u s e ( i )a c f r a g m e n t s c a n d i s t i n g u i s h p r o m o t e r f r o m n o n p r o m o t e rDNA a n d ( i i ) o c m u t a t i o n s t h a t a l t e r t h e p r o m o t e r r e c o g n i t i o ns e l e c t i v i t y o f h o l o e n z y m e s i m i l a r l y a l t e r t h e b i n d i n g s e l e c t i v i t yo f a - f r a g m e n t s ( 4 ) .T h e p r o m o t e r s p a c e r s e p a r a t e s t h e - 1 0 a n d - 3 5 c o n s e n s u sh e x a m e r s a n d c o n t r i b u t e s t o p r o m o t e r f u n c t i o n . T h e l e n g t h o ft h e s p a c e r , b u t n o t i t s s e q u e n c e , i s a n i m p o r t a n t d e t e r m i n a n to f p r o m o t e r s t r e n g t h , w i t h t h e c o n s e n s u s 1 7 - b p s p a c i n g u s u a l l yc o n f e r r i n g o p t i m a l p r o m o t e r a c t i v i t y ( 5 - 9 ) . One e x c e p t i o n i st h e " e x t e n d e d - 1 0 " p r o m o t e r s w h e r e TG a t p o s i t i o n s - 1 5 a n d

I n h i b i t o r y

1H NlE21 11 1 3 0

- 1 0 R e c o g n i t i o n* *2 3 4I i I SICOOH

I F | 8 DN570 1i 3y 7 1 E K 5 7 5

- 3 5 R e c o g n i t i o n

F I G . 1 . L i n e a r d i a g r a m o f o . 7 0 . T h e f o u r m o s t h i g h l y c o n s e r v e ds e g m e n t s a r e d e s i g n a t e d a s r e g i o n s 1 , 2 , 3 , a n d 4 . S u b d i v i s i o n s w i t h i nt h e s e r e g i o n s a r e i n d i c a t e d b y c h a n g e s i n s h a d i n g a n d c o r r e s p o n d t or e g i o n s 1 . 1 , 1 . 2 , 2 . 1 , 2 . 2 , 2 . 3 , 2 . 4 , 4 . 1 , a n d 4 . 2 . R e g i o n 1 . 1 c o n t a i n s ad o m a i n t h a t i n h i b i t s DNA b i n d i n g b y t h e DNA b i n d i n g d o m a i n s o fr e g i o n s 2 a n d 4 . R e g i o n 2 . 4 i n t e r a c t s w i t h t h e - 1 0 p r o m o t e r e l e m e n t ,a n d r e g i o n 4 . 2 i n t e r a c t s w i t h t h e - 3 5 p r o m o t e r e l e m e n t , a s i n d i c a t e db y t h e a r r o w s . M u t a n t s t h a t w e r e s e l e c t e d f o r i n c r e a s e d e x p r e s s i o n o ft h e l a c o p e r o n i n t h e a b s e n c e o f cAMP a c t i v a t i n g p r o t e i n ( C A P ) -cAMP a r e s h o w n b e l o w t h e l i n e a r r e p r e s e n t a t i o n . T h e n o m e n c l a t u r ef o r t h e s e m u t a n t s c o n s i s t s o f t h e o r i g i n a l a m i n o a c i d f o l l o w e d b y t h es u b s t i t u t e d a m i n o a c i d , i n s i n g l e - l e t t e r a m i n o a c i d c o d e . T h e p o s i t i o nw i t h i n t h e p o l y p e p t i d e i s i n d i c a t e d b y t h e n u m b e r f o l l o w i n g t h e a m i n oa c i d s u b s t i t u t i o n s .- 1 6 i s r e q u i r e d i n t h e s p a c e r ( 1 0 , 1 1 ) . P r o t e c t i o n s t u d i e s o fp r o m o t e r s w i t h 1 6 - , 1 7 - , o r 1 8 - b p s p a c e r s h a v e s h o w n t h a t RNAp o l y m e r a s e f o r m s a s i m i l a r p a t t e r n o f c o n t a c t s a t a l l t h r e ep r o m o t e r s ( 1 2 , 1 3 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e e n z y m e c a n a c c o m -m o d a t e r o t a t i o n a l a n d l o n g i t u d i n a l v a r i a t i o n . One m o d e lp r o p o s e s t h a t RNA p o l y m e r a s e r o t a t e s t h e - 1 0 a n d - 3 5s e q u e n c e s w i t h r e s p e c t t o o n e a n o t h e r t o m a k e s u f f i c i e n tc o n t a c t s w i t h b o t h c o n c o m i t a n t l y , t h u s p u t t i n g t o r q u e o n t h es p a c e r DNA ( 6 ) . T h e " m o l e c u l a r r u l e r " i n RNA p o l y m e r a s et h a t m e a s u r e s p r o m o t e r s p a c e r l e n g t h i s n o t k n o w n . DNAb i n d i n g b y a o r f r a g m e n t c o n t a i n i n g b o t h DNA b i n d i n g d o -m a i n s c a n b e d i s r u p t e d b y a s i n g l e m u t a t i o n i n e i t h e r t h e -10o r t h e - 3 5 r e g i o n o f t h e p r o m o t e r ( 4 ) . T h i s o b s e r v a t i o ns u g g e s t e d t o u s t h a t a - i t s e l f may i n t e r a c t s i m u l t a n e o u s l y w i t ht h e - 1 0 a n d - 3 5 p r o m o t e r e l e m e n t s a n d , t h u s , d i r e c t l y s e n s et h e s p a c i n g b e t w e e n t h e s e e l e m e n t s . T h e e x p e r i m e n t s d e -s c r i b e d i n t h i s r e p o r t p r o v i d e s u p p o r t f o r t h i s i d e a .

M A T E R I A L S AND METHODSM a t e r i a l s . E n z y m e s w e r e f r o m P r o m e g a , Ne w E n g l a n dB i o l a b s , o r B o e h r i n g e r M a n n h e i m ; n u c l e o t i d e s w e r e f r o mP h a r m a c i a ; a n d A m p l i t a q DNA p o l y m e r a s e w a s f r o m P e r k i n -E l m e r . [ y - 3 2 P ] A T P [ 3 0 0 0 C i / m m o l ( 1 C i = 3 7 G B q ) ] a n dS e q u e n a s e w e r e f r o m A m e r s h a m , n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r d i s k s( B A 8 5 ) w e r e f r o m S c h l e i c h e r & S c h u e l l , i s o p r o p y l , B - D - t h i o -g a l a c t o p y r a n o s i d e ( I P T G ) w a s f r o m F i s h e r , a n d n i t r o c e f i n w a sf r o m B B L M i c r o b i o l o g y S y s t e m s .O l i g o n u c l e o t i d e S i t e - D i r e c t e d M u t a g e n e s i s , P l a s m i d C o n-s t r u c t i o n s , a n d F u s i o n P r o t e i n s . S y n t h e t i c o l i g o n u c l e o t i d e sc a r r y i n g d e l e t i o n s o r i n s e r t i o n s i n t h e s p a c e r r e g i o n o f t h e t a cA b b r e v i a t i o n s : HTH, h e l i x - t u r n - h e l i x ; C A P , cA MP a c t i v a t i n g pro-t e i n .

8858

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t " i na c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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8 8 6 0 B i o c h e m i s t r y : D o m b r o s k i e t a l .

2 4 .03a0

2

o 10

Region 2

Qc o 6 -

z0 4 -k0- 46a

9 2 -0C

R e g i o n 4

1 2 3 4 6 6 7 8 9

F I G . 4 . E q u i l i b r i u m c o m p e t i t i o n DNA b i n d i n g f o r G S T o - [ 3 7 2 - 4 6 6 ] a n d G S T o j [ O 6 - 6 1 3 ] . ( L e f t ) G S T o , [ 3 7 2 - 4 6 6 ] c a r r y i n g o n l y t h e r e g i o n 2 DNAb i n d i n g d o m a i n . ( R i g h t ) G S T o [ 5 0 6 - 6 1 3 ] c a r r y i n g o n l y t h e r e g i o n 4 DNA b i n d i n g d o m a i n . T h e r a t i o o f u n l a b e l e d c o m p e t i t o r DNA r e l a t i v e t o l a b e l e dp t a c r e q u i r e d t o r e d u c e DNA f i l t e r r e t e n t i o n t o o n e - h a l f i t s o r i g i n a l l e v e l i s i n d i c a t e d b y t h e b a r s . AP i s a n o n s p e c i f i c c o m p e t i t o r c o n t a i n i n g n op r o m o t e r -l i k e s e q ue n ce s . T h e n u m b e r s a b o v e t h e b a r s i n d i c a t e t h e b a s e p a i r s a d d e d o r d e l e t e d f r o m t h e s p a c e r o f t h e t a c p r o m o t e r . T h e d a t a a r et h e a v e r a g e f r o m t h e r e s u l t s o f t w o o r m o r e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . T h e e r r o r i n t h e r a w DNA b i nd i ng d a t a w a s l e s s t h a n 2 0 % .r e c o g n i z e s t h e l e n g t h o f t h e s p a c e r , we c o n s t r u c t e d s p a c i n gv a r i a n t s o f p t a c a n d u s e d t h e m t o e x a m i n e DNA b i n d i n g b y a -i n v i t r o .W e p r e v i o u s l y u s e d e q u i l i b r i u m c o m p e t i t i o n b i n d i n g e x p e r -i m e n t s t o s h o w t h a t p a r t i a l p o l y p e p t i d e s o f o ( 7 0 , l a c k i n g t h eN - t e r m i n a l i n h i b i t o r y d o m a i n , i n t e r a c t p r e f e r e n t i a l l y w i t hp r o m o t e r DNA ( 4 ) . I n t h o s e e x p e r i m e n t s , a 5 ' - e n d - l a b e l e d1 0 0 - b p DNA f r a g m e n t c a r r y i n g t h e t a c p r o m o t e r w a s m i x e dw i t h i n c r e a s i n g a m o u n t s o f u n l a b e l e d c o m p e t i t o r DNA, a n d af i x e d a m o u n t o f o - p o l y p e p t i d e w a s a l l o w e d t o b i n d . R e t e n t i o no f o:DNA c o m p l e x e s o n n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r s w a s u s e d t om e a s u r e DNA b i n d i n g . A r e d u c t i o n i n f i l t e r r e t e n t i o n o f t h el a b e l e d p r o m o t e r f r a g m e n t t o 50% r e q u i r e d a d d i t i o n o f e i t h e ra n e q u i v a l e n t a m o u n t o f u n l a b e l e d p r o m o t e r DNA o r a b o u t a5 - f o l d m o l a r e x c e s s o f u n l a b e l e d n o n p r o m o t e r DNA. T h u s , o na p e r s i t e b a s i s , t h e s e o - f r a g m e n t s e x h i b i t e d a 5 0 0 - f o l d s e l e c -t i v i t y f o r p r o m o t e r o v e r n o n p r o m o t e r DNA.W e u s e d t h i s s a m e c o m p e t i t i o n b i n d i n g a s s a y t o e x a m i n e t h ea b i l i t y o f f u s i o n p r o t e i n G S T o - [ 3 6 0 - 6 1 3 ] , c a r r y i n g r e g i o n s 2 - 4o f o a , t o i n t e r a c t w i t h t h e p t a c p r o m o t e r s p a c i n g m u t a n t s . W em o n i t o r e d t h e r e d u c t i o n i n DNA b i n d i n g a s t h e a m o u n t o fc o m p e t i t o r DNA w a s i n c r e a s e d ( d a t a n o t s h o w n ) a n d d e t e r -m i n e d t h e r a t i o o f c o m p e t i t o r DNA t o l a b e l e d p t a c DNAr e q u i r e d t o r e d u c e b i n d i n g b y o n e - h a l f ( F i g . 3 ) . I n t h i s s e t o fe x p e r i m e n t s , s p e c i f i c c o m p e t i t o r ( u n l a b e l e d p t a c ) r e d u c e d

.-4

0

S

w

1. 0 -

0 . 8

0 . 6

0 . 4 -

0 . 2 -

0 . 0

F I G . 5 . A c t i v i t y o f promoter s p a c i n g mutants i n v i v o . P r o m o t e r sc l o n e d i n t o p J R I , u p s t r e a m o f t h e l a c Z gene, were t e s t e d f o r t r a n -s c r i p t i o n a l a c t i v i t y i n E . c o l i s t r a i n X L 1 - B l u e . Th e f 3 - g a l a c t o s i d a s ea c t i v i t y f r o m t h e i n d i c a t e d m u t a t e d p r o m o t e r s i s e x p r e s s e d r e l a t i v e t ot h e 3 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y f r o m t h e w i l d - t y p e ( w t ) p t a c p r o m o t e r . Th eM i l l e r u n i t s , c o r r e c t e d f o r p l a s m i d copy n u m b e r , f o r e a c h p o l y m e r a s ea t t h e w i l d - t y p e p t a c p r o m o t e r w e r e r p o D ( 5 6 0 3 6 ) , r p o D 9 0 1 ( 1 4 7 7 0 7 ) ,r p o D 9 0 4 ( 7 8 7 3 9 ) , r p o D 9 1 1 ( 5 3 0 7 0 ) , a n d r p o D 9 1 2 ( 3 8 9 1 3 ) . T h e d a t a aret h e average f r o m t h e r e s u l t s o f two o r more i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s .Th e error i n t h e r a w f 3 - g a l a c t o s i d a s e d a t a was 7 % o r l e s s .

b i n d i n g b y o n e - h a l f a t a 1 : 1 r a t i o , w h e r e a s t h e n o n s p e c i f i cc o m p e t i to r ( w h i c h c o n t a i n s n o p r o m o t e r s e q u e n c e s ) r e q u i r e da 7 - t o 8 - f o l d h i g h e r c o n c e n t r a t i o n t o a c h i e v e a n e q u i v a l e n tr e d u c t i o n i n b i n d i n g . L i k e t h e n o n s p e c i f i c c o m p e t i t o r , e a c h o ft h e p t a c s p a c i n g v a r i a n t s r e q u i r e s a 5 - t o 1 0 - f o l d m o l a r e x c e s so f f r a g m e n t t o a c h i e v e a 50 % r e d u c t i o n i n b i n d i n g . T h u s ,p e r t u r b i n g s p a c e r l e n g t h i n t e r f e r e s w i t h t h e a b i l i t y o f t h e o -f r a g m e n t t o b i n d t h i s p r o m o t e r e f f e c t i v e l y . T h e s e r e s u l t ss u g g e s t t h a t o - m u s t s p a n t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e -10 a n d- 3 5 s e q u e n c e s .E q u i l i b r i u m c o m p e t i t i o n e x p e r i m e n t s w e r e a l s o c o n d u c t e du s i n g G S T a [ 5 0 6 - 6 1 3 ] , c a r r y i n g r e gi o n 4 a l o n e , a n dG S T o [ 3 7 2 - 4 6 6 ] , c a r r y i n g r e g i o n 2 a l o n e ( 4 , 1 6 ) . I n b o t h c a s e s ,t h e p r o m o t e r s p a c i n g v a r i a n t s b e h a v e l i k e s p e c i f i c c o m p e t i t o r s ,r e q u i r i n g l e s s t h a n a 2 - f o l d e x c e s s o v e r t h e l a b e l e d p r o m o t e rDNA t o r e d u c e b i n d i n g b y o n e - h a l f ( F i g . 4 ) . T h u s , a l t e r a t i o n si n s p a c i n g h a v e n o e f f e c t o n t h e a b i l i t y o f t h e i n d i v i d u a l DNAb i n d i n g d o m a i n s t o b i n d t o t h e i r p r e f e r r e d s e g m e n t o f t h ep r o m o t e r . T h i s o b s e r va t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e ss h o w i n g t h a t e a c h DNA b i n d i n g d o m a i n c a n i n t e r a c t w i t h i t sp r e f e r r e d h a l f o f t he p r o m o t e r i n d e p e n d e n t l y ( 4 ) a n d p r o v i d e sf u r t h e r s u p p o r t f o r t h e i d e a t h a t t o s e n s e s p a c i n g , o a m u s t

C u. 4. 1 . 2

~ 1 . 01 4 0 . 8 o

0 . 60 . 4 - f WT

- - SF 3 8 90 . 2~~ Y C 5 7 1

- DN570. - 0 . 0 II - - I- 1 4 1 6 1 8 2 0 2 2

S p a c i n g ( b p )F I G . 6 . , B - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y f o r o c m u t a n t s a n d p t a c p r o m o t e rs p a c i n g v a r i a n t s . T h e f 3 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e r a t i oo f a c t i v i t y f o r a p a r t i c u l a r o - w i t h a n a l t e r e d p r o m o t e r , r e l a t i v e t oa c t i v i t y o f t h e same a w i t h t h e u n a l t e r e d t a c p r o m o t e r . Two o r morei n d e p e n d e n t d e t e r m i n a t i o n s w e r e a v e r a g e d f o r e a c h v a l u e s h o w n . T h e, B - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y r a n g e d f r o m 8 1 9 t o 5 8 , 6 9 6 u n i t s w i t h a na v e r a g e e r r o r o f 1 1 . 5 % . T h e a c t u a l v a l u e s f o r , B - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t yw e r e c o r r e c t e d f o r p l a s m i d c o p y n u m b e r b y d i v i d i n g b y t h e u n i t s o f, B - l a c t a m a s e p r o d u c e d f r o m t h e s a m e p l a s m i d .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 )

8/2/2019 Subunidad Sigma

4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 ) 8 8 6 1

1 2 3 4 5F I G . 7 . E q u i l i b ri u m c o m p e t i t i o n DNA b i n d i n g f o r G S T o r [ 3 6 0 -6 1 3 ] E K 5 7 5 a n d G S T o f 3 6 0 - 6 1 3 ] . T h e r a t i o o f u n l a b e l e d c o m p e t i t o rDNA r e l a t i v e t o l a b e l e d p t a c r e q u i r e d t o r e d u c e DNA f i l t e r r e t e n t i o n

t o o n e - h a l f i t s o r i g i n a l l e v e l i s i n d i c a t e d b y t h e b a r s . A P i s a n o n s p e c i f i cc o m p e t i to r c o nt a i n i n g n o p r o m o t e r - l i k e sequences. T h e n u m b e r sa b o v e t h e b a r s i n d i c a t e t h e b a s e p a i r s a d d e d o r d e l e t e d f r o m t h e spacero f t h e t a c p r o m o t e r . T h e d a t a a re t h e average f r o m t h e r e s u l t s o f twoo r more i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s . The error i n t h e r a w DNA b i n d i n gd a t a wa s l e s s t h a n 2 0 % .i n t e r a c t s i m u l t a n e o u s l y w i t h t h e -10 a n d - 35 r e g i o n s o f t h ep r o m o t e r .A c t i v i t y o f P r o m o t e r S p a c i n g V a r i a n t s i n V i v o . Th e a c t i v i t yo f s e v e r a l t a c p r o m o t e r s w i t h a l t e r e d s p a c i n g was a s s a y e d i nv i v o b y m e a s u r i n g , B - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y . Th e h i g h e s t a c t i v i t ywas a t t a i n e d f o r t h e w i l d - t y p e t a c p r o ' h o t e r . I n c r e a s i n g o rd e c r e a s i n g t h e spacer b y 1 b p h a d a m i n i m a l e f f e c t on p r o m o t e rs t r e n g t h ; h o w e v e r , more d r a s t i c a l t e r a t i o n s o f t h e spacer l e n g t hd e c r e a s e d a c t i v i t y more s e v e r e l y ( T a b l e 1 ; F i g . 5 ) . We n o t e t h a ts p a c i n g a l t e r a t i o n s a f f e c t b i n d i n g o f a- f r a g m e n t s i n v i t r o mores e v e r e l y t h a n h o l o e n z y m e t r a n s c r i p t i o n i n v i v o . We r e t u r n t ot h i s p o i n t i n t h e D i s c u s s i o n .A M u t a t i o n i n r p o D Can S u p p r e s s t h e T r a n s c r i p t i o n a lD e f e c t s o f P r o m o t e r S p a c i n g V a r i a n t s i n V i v o . S i e g e l e a n dc o w o r k e r s ( 2 0 ) i s o l a t e d s e v e r a l m u t a t i o n s i n a - 7 0 t h a t i n c r e a s e de x p r e s s i o n o f t h e l a c o p e r o n 5 - t o 7 - f o l d i n t h e a b s e n c e o fC AP -c A MP ( T a b l e 1 ) . O ne o f t h e r e a s o n s t h a t p l a c i s a weakp r o m o t e r i n t h e a b s e n c e o f a c t i v a t o r s i s t h a t i t h a s a n 1 8 - b pspacer ( 2 1 ) . T h u s , one w a y f o r t h e m u t a n t s t o i n c r e a s ee x p r e s s i o n o f t h e l a c p r o m o t e r i s t o p e r m i t b e t t e r u t i l i z a t i o n o fp r o m o t e r s w i t h n o n o p t i m a l spacer l e n g t h s . To d e t e r m i n ew h e t h e r a n y o f t h e s e mutant a- f a c t o r s e x h i b i t e d t h i s p h e n o -t y p e , we t e s t e d w h e t h e r t h e y a l t e r e d e x p r e s s i o n o f t h e s p a c i n gv a r i a n t s o f p t a c . One o f t h e m u t a n t s , E K 5 7 5 , i n c r e a s e d t r a n -s c r i p t i o n o f p t a c v a r i a n t s h a v i n g a 1 9 - b p s p a c i n g ( F i g . 6 ) .P r i m e r e x t e n s i o n a n a l y s i s o f t h e 5 ' e n d s o f RNA f r o m t h ew i l d - t y p e a n d EK575 s t r a i n s s h o w e d no d i f f e r e n c e i n t h e s t a r ts i t e f o r t h e l a c Z t r a n s c r i p t ( d a t a n o t s h o w n ) . We argue i n t h eD i s c u s s i o n t h a t t h i s p h e n o t y p e most l i k e l y r e s u l t s f r o m ac h a n g e i n t h e wa y t h a t a- senses s p a c i n g .T h e EK575 M u t a n t B i n d s t o a 1 9 - b p S p a c i n g P r o m o t e r i nV i t r o . E q u i l i b r i u m c o m p e t i t i o n b i n d i n g e x p e r i m e n t s u s i n gG S T a ( r 3 6 0 - 6 1 3 ] E K 5 7 5 s h o w e d t h a t b o t h p t a c + 1 a n d p t a c + 3p r o m o t e r v a r i a n t s c o m p e t e d w i t h p t a c f o r b i n d i n g a t n e a r l ye q u i m o l a r amoun t s ( F i g . 7 ) . I n c o n t r a s t , f o r w i l d - t y p eG S T a - [ 3 6 0 - 6 1 3 ] , n e i t h e r s p a c i n g v a r i a n t was a n e f f e c t i v eb i n d i n g c o m p e t i t o r f o r t h e p t a c c o m p e t i t o r ( F i g . 3 ) . T h u s , a se x p e c t e d f r o m i t s b e h a v i o r i n v i v o , E K 5 7 5 i s b e tt e r a b l e t h a tw i l d - t y p e a- t o b i n d t o p r o m o t e r s w i t h l o n g e r s p a c i n g .

D I S C U S S I O NNumerous s t u d i e s i n d i c a t e t h a t RNA p o l y m e r a s e h o l o e n z y m ei s s e n s i t i v e t o t h e s p a c i n g b e t w e e n t h e -1 0 a n d - 35 recog-

n i t i o n s i t e s o f t h e p r o k a r y o t i c p r o m o t e r , w i t h a 1 7 - b p s p a c i n gc o n s i d e r e d o p t i m a l f o r a c t i v i t y ( 5 - 9 ) . I n t h i s r e p o r t , we p r e s e n tt w o l i n e s o f e v i d e n c e c o n s i s t e n t w i t h t h e i d e a t h a t o a i t s e l fd i s c r i m i n a t e s t h e s p a c e r l e n g t h o f p r o m o t e r s .I n t e r a c t i o n s B e t w e e n d 7 0 a n d S p a c i n g V a r i a n t s o f t h e t a cP r o m o t e r . When t h e a 7 0 f r a g m e n t c a r r i e s b o t h DNA b i n d i n gd o m a i n s , s p a c i n g b e t w e e n t h e -10 a n d - 3 5 h e x a m e r s i s ac r i t i c a l p a r a m e t e r i n t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e c r 7 0 f r a g m e n ta n d t h e p r o m o t e r . I n t h e t a c p r o m o t e r , a 1 6 - b p s p a c i n g i so p t i m a l . A c h a n g e o f a s l i t t l e a s 1 b p i n e i t h e r d i r e c t i o na b o l i s h e s t h e a b i l i t y o f t h e c r f r a g m e n t t o d i s c r i m i n a t e p r o -m o t e r f r o m n o n p r o m o t e r DNA. I n c o n t r a s t , s p a c i n g i s n o t c r i t i c a lf o r t h e D N A - p r o t e i n i n t e r a c t i o n t h a t o c c u r s f o r o . 7 0 f r a g m e n t sw i t h o n l y a s i n g l e DNA b i n d i n g d o m a i n . T h e s e r e s u l t s s u g g e s tt h a t t h e f u n c t i o n a l i n t e r d e p e n d e n c e o f t h e t w o DNA b i n d i n gd o m a i n s o f o 7 0 u n d e r l i e s i t s a b i l i t y t o s e n s e s p a c i n g b e t w e e n t h e- 1 0 a n d - 3 5 r e c o g n i t i o n e l e m e n t s o f t h e p r o m o t e r .T h e f a c t t h a t i s o l a t e d o . 7 0 s e n s e s s p a c i n g s u g g e s t s t h a t i t a l s op e r f o r m s t h i s f u n c t i o n i n t h e c o n t e x t o f RNA p o l y m e r a s eh o l o e n z y m e . H o w e v e r , a l t h o u g h q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r , t h e r ea r e d i s t i n c t d i f f e r e n c e s i n t h e r e s p o n s e o f o . 7 0 a n d h o l o e n z y m et o a l t e r e d p r o m o t e r s p a c i n g . W h e r e a s c h a n g e s o f 1 b p i ns p a c i n g a b o l i s h t h e a b i l i t y o f o 7 0 f r a g m e n t s t o d i s c r i m i n a t ep r o m o t e r f r o m n o n p r o m o t e r DNA, s p a c i n g c h a n g e s o f 3 b p o rmore a r e r e q u i r e d f o r l a r g e e f f e c t s on h o l o e n z y m e a t t h e t a cp r o m o t e r ( F i g . 5 ) . W h e r e a s h o l o e n z y m e may c o m p e n s a t e f o rn o n o p t i m a l p r o m o t e r s p a c i n g b y b e n d i n g , t w i s t i n g , o r o t h e rDNA d e f o r m a t i o n s b e f o r e s t r a n d o p e n i n g , t h e r e i s no e v i -d e n c e t h a t o - a l o n e c a n p e r f o r m t h e s e m a n i p u l a t i o n s . B ya l i g n i n g t h e p r o m o t e r r e c o g n i t i o n e l e m e n t s , t h e DNA t r a n s -a c t i o n s o f h o l o e n z y m e may i n c r e a s e t h e r a n g e o f p r o m o t e rs p a c i n g v a r i a n t s s u c c e s s f u l l y r e c o g n i z e d b y a .A o - 7 0 M u t a n t A f f e c t i n g S p a c i n g . T h e E K 5 7 5 m u t a n t s u p -p r e s s e s t h e l o w t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y o f t h e p t a c v a r i a n t w i t ha 1 9 - b p p r o m o t e r s p a c e r . R e s i d u e 5 7 5 o f a 7 0 i s l o c a t e d i n t h eu p s t r e a m h e l i x o f t h e h e l i x - t u r n - h e l i x ( H T H ) m o t i f , w h i c hr e c o g n i z e s t h e - 3 5 r e g i o n o f t h e p r o m o t e r . A l t h o u g h a n EKs u b s t i t u t i o n a t t h i s p o s i t i o n - c o u l d s i m p l y c o m p e n s a t e f o rn o n o p t i m a l s p a c i n g b y s t r e n g t h e n i n g t h e o u - D N A i n t e r a c t i o n ,s e v e r a l c o n s i d e r a t i o n s s u g g e s t t h a t EK575 i s m o r e l i k e l y t od i r e c t l y a l t e r t h e m e c h a n i s m b y w h i c h c r s e n s e s s p a c i n g . ( i )F o u r m u t a n t s e x h i b i t a c o m p a r a b l e i n c r e a s e i n p l a c t r a n s c r i p -t i o n , b u t o n l y EK575 s u p p r e s s e s l o n g s p a c i n g ( F i g . 6 ) . I t i sp a r t i c u l a r l y s i g n i f i c a n t t h a t DN570 a n d Y C 5 7 1 , l o c a t e d a t t h eN - t e r m i n a l s i d e o f t h e u p s t r e a m h e l i x o f t h e HTH m o t i f i np o s i t i o n s known t o c o n t a c t DNA i n o t h e r H T H - t y p e p r o t e i n s ,d o n o t a l t e r r e s p o n s e t o s p a c i n g . ( i i ) E K 5 7 5 m a n i f e s t s ap h e n o t y p e o n l y i n t h e c o n t e x t o f p r o m o t e r s w i t h l o n g e rs p a c i n g . I t s p e c i f i c a l l y i n c r e a s e s t r a n s c r i p t i o n o f t h e 1 9 - b pp r o m o t e r v a r i a n t f r o m t h e c o r r e c t s t a r t s i t e b u t d o e s n o ti n c r e a s e t r a n s c r i p t i o n o f p t a c i t s e l f . ( i i i ) R e g i o n s 2 - 4 o f E K 5 7 5b i n d b e t t e r t h a n r e g i o n s 2 - 4 o f w i l d - t y p e . 7 0 t o p r o m o t e r s w i t hi n c r e a s e d s p a c i n g , a r g u i n g s t r o n g l y t h a t EK575 d i r e c t l y a f f e c t st h e a b i l i t y o f a - t o d e t e c t s p a c i n g c h a n g e s . T h e a m i n o a c i ds u b s t i t u t i o n i n EK575 may p r o v i d e a - w i t h i n c r e a s e d f l e x i b i l i t y ,w h i c h w o u l d f a c i l i t a t e s i m u l t a n e o u s r e c o g n i t i o n o f -10 a n d- 3 5 b i n d i n g s i t e s a t l o n g e r s p a c i n g .H o w a r Can B e a M o l e c u l a r R u l e r ? T h e s i m p l e s t m o d e l t oa c c o u n t f o r t h e a b i l i t y o f a r t o r e c o g n i z e s p a c i n g w o u l d s u g g e s tt h a t a - s p a n s t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e - 1 0 a n d - 3 5 s e q u e n c e sw h i l e s i m u l t a n e o u s l y m a k i n g p r o d u c t i v e c o n t a c t s a t b o t h . I ft h e s p a c i n g i s t o o l a r g e , a - c a n n o t r e a c h a c r o s s t h e g a p . I f t h es p a c i n g i s t o o s m a l l , a - may n o t b e a b l e t o p h y s i c a l l y c o m p r e s si t s s t r u c t u r e e n o u g h t o a c c o m m o d a t e t h e r e d u c e d s p a c i n g . I nt h e s e c a s e s , a - may n o t b e a b l e t o p o s i t i o n t h e - 1 0 a n d - 3 5s e q u e n c e s p r o p e r l y . W e c o n s i d e r two a l t e r n a t i v e c o n f i g u r a -t i o n s o f a - t h a t w o u l d a l l o w i t t o measure d i s t a n c e . I n t h e f i r s t ,we i m a g i n e t h a t t h e t w o DNA b i n d i n g d o m a i n s , r e g i o n 2 . 4 a n dr e g i o n 4 . 2 , a r e s e p a r a t e d b y a r e l a t i v e l y r i g i d s t r u c t u r e com-p o s e d p r i m a r i l y o f r e g i o n 3 . T h e l e n g t h o f t h e s t r u c t u r e

EK575 W i l d t y p e

S

0 4Q

e )

* l

1 2 3 4 5

B i o c h e m i s t r y : D o m b r o s k i e t a l .

8/2/2019 Subunidad Sigma

5/5

8 8 6 2 B i o c h e m i s t r y : D o m b r o s k i e t a l .s e p a r a t i n g t h e two DNA b i n d i n g d o m a i n s w o u l d m e a s u r es p a c i n g . A n a l t e r n a t i v e m o d e l e n v i s i o n s r e g i o n s 2 . 4 a n d 4 . 2f o l d i n g i n d e p e n d e n t l y b u t t h e n i n t e r a c t i n g w i t h e a c h o t h e r ,p o s s i b l y l o o p i n g o u t r e g i o n 3 . T h i s i n t e r a c t i o n w o u l d f i x t h ed i s t a n c e b e t w e e n r e g i o n s 2 . 4 a n d 4 . 2 , t h u s s e t t i n g t h e o p t i m a lspacer l e n g t h .Our e x p e r i m e n t s d o n o t p e r m i t u s t o d i s t i n g u i s h b e t w e e nt h e s e m o d e l s . H o w e v e r , t h e i d e a t h a t r e g i o n s 2 . 4 a n d 4 . 2i n t e r a c t i s q u i t e a p p e a l i n g . o a f r a g m e n t s c o n t a i n i n g b o t h DNAb i n d i n g d o m a i n s a r e s e n s i t i v e t o t h e sequ e nce a n d s p a c i ng o fb o t h p r o m o t e r e l e m e n t s , w h e r e a s s i n g l e - d o m a i n f r a g m e n t s a ren o t . I n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e s e two DNA b i n d i n g d o m a i n sw o u l d e x p l a i n w h y t h e s e a i f r a g m e n t s b e h a v e q u a l i t a t i v e l yd i f f e r e n t l y f r o m t h o s e c o n t a i n i n g o n l y o n e d o m a i n . W e n o t et h a t h o m o l o g y arguments s u g g e s t t h a t E 5 7 5 m i g h t b e w e l l -p o s i t i o n e d t o carry o u t t h i s i n t e r a c t i o n . P r o f i l e a n a l y s i s i n d i -c a t e s t h a t t h e HTH o f o . 7 0 i s most s i m i l a r t o t h a t o f 4 3 4 c r o . I nt h a t s t r u c t u r e , a r e s i d u e i n t h e m i d d l e o f t h e u p s t r e a m s t r u c -t u r a l h e l i x w o u l d b e a w a y f r o m t h e DNA a n d t h u s i n a p o s i t i o nt o i n t e r a c t w i t h o t h e r r e g i o n s o f t h e p r o t e i n .T h e i d e a t h a t a n i n t e r a c t i o n b e t w e e n regions 2 . 4 a n d 4 . 2m e a s u r e s spacing h a s i m p l i c a t i o n s f o r how promoter a c t i v i t y i sc o n t r o l l e d . T h i s i n t e r a c t i o n c o u l d b e a p o i n t o f r e g u l a t i o n .E f f e c t o r s c o u l d a l t e r t h i s i n t e r a c t i o n a n d , h e n c e , c h a n g eo p t i m a l s p a c i n g a t a p a r t i c u l a r p r o m o t e r . T h e l e n g t h a n ds t r e n g t h o f t h e h o m o l o g y r e g i o n s a t - 1 0 a n d - 3 5 c o u l d b ea l l o s t e r i c e f f e c t o r s o f t h i s i n t e r a c t i o n , t h u s p e r m i t t i n g o p t i m a ls p a c i n g t o v a r y a c c o r d i n g t o promoter sequence. I n a d d i t i o n ,s e v e r a l r e g u l a t e d p r o m o t e r s h a v e n o n o p t i m a l s p a c i n g s . T h eP T P C A D p r o m o t e r o f t h e me rcu ric io n r e s i s t a n c e o p e r o n h a s a1 9 - b p spacer. I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e a c t i v a t o r H g ( I I ) -M er R d i s t o r t s t h e spacer DNA t o a l l o w RNA p o l y m e r a s e t oc o n t a c t t h e - 10 r e g i o n o f t h e p r o m o t e r ( 2 2 ) . I n B a c i l l u ss u b t i l i s , t h e s p o I I G a n d s p o I I E genes a re t r a n s c r i b e d b y t h e o . 7 0a n a l o g , o A . T h e s e p r o m o t e r s h a v e 2 2 - a n d 2 1 - b p spacers,r e s p e c t i v e l y . One m o d e l f o r a c t i v a t i o n o f t h e s e p r o m o t e r s i st h a t p h o p h o r y l a t e d SpoOA m o d i fi e s t h e RNA p o l y m e r a s e -promoter c o m p l e x e s t o s t i m u l a t e i n i t i a t i o n a n d overcome t h eo v e r l o n g s p a c i n g ( 2 3 ) . A c t i v a t o r p r o t e i n s may a l s o f u n c t i o n t oa l t e r t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e two DNA b i n d i n g d o m a i n s o fa , a l l o w i n g t h e n o n c o n s e n s u s s p a c i n g a t a p a r t i c u l a r p r o m o t e rt o b e o p t i m a l f o r o i f u n c t i o n .We t h a n k R . G o u r s e f o r p r o v i d i n g p J R 1 , D . S i e g e l e f o r p r o v i d i n g

t h e r p o D s t r a i n s , a n d W . M a r g o l i n f o r s t r a i n M H 7 2 9 5 . T h i s s t u d y w a ss u p p o r t e d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h P u b l i c S e r v i c e G r a n tA 1 1 9 6 3 5 t o C . A . G . , a n d A m e r i c a n C a n c e r S o c i e t y G r a n t P F - 3 4 0 8 a n dG r a n t 9 4 G- 2 6 3 f r o m t h e T e x a s A f f i l i a t e o f t h e A m e r i c a n H e a r tA s s o c i a t i o n t o A . J . D .1 . B u r g e s s , R . R . , T r a v e r s , A . A . , D u n n , J . J . & B a u t z , E . K . F .( 1 9 6 9 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 2 2 1 , 4 3 - 4 4 .2 . B u r g e s s , R . R . & T r a v e r s , A . A . ( 1 9 7 0 ) F e d . P r o c . 2 9 , 1 1 6 4 - 1 1 6 9 .3 . G r o s s , C . A . , L o n e t t o , M . & L o s i c k , R . ( 1 9 9 2 ) i n T r a n s c r i p t i o n a l

R e g u l a t i o n , e d s . M c K n i g h t , S . L . & Y a m a m o t o , K . R . ( C o l dS p r i n g H a r b o r L a b . P r e s s , P l a i n v i e w , N Y ) , p p . 1 2 9 - 1 7 6 .4 . D o m b r o s k i , A . J . , W a l t e r , W. A . , R e c o r d , M . T . , J r . , S i e g e l e ,D . A . & G r o s s , C . A . ( 1 9 9 2 ) C e l l 7 0 , 5 0 1 - 5 1 2 .5 . H a r l e y , C . B . & R e y n o l d s, R . P . ( 1 9 8 7 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 5 ,2 3 4 3 - 2 3 6 1 .6 . W a r n e , S . E . & d e H a s e t h , P . L . ( 1 9 9 3 ) B i o c h e m i s t r y 3 2 , 6 1 3 4 -6 1 4 0 .7 . H a w l e y , D . K & M c C l u r e , W. R . ( 1 9 8 3 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 1 1 ,2 2 3 7 - 2 2 5 5 .8 . S t e f a n o , J . E . & G r a l l a , J . D . ( 1 9 8 2 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA7 9 , 1 0 6 9 - 1 0 7 2 .9 . M u l l i g a n , M . E . , B r o s i u s , J . & M c C l u r e , W. R . ( 1 9 8 5 ) J . B i o l .C h e m . 2 6 0 , 3 5 2 9 - 3 5 3 8 .1 0 . K e i l t y , S . & R o s e n b e r g , M . ( 1 9 8 7 ) J . B i o . C h e m . 2 6 2 , 6 3 8 9 - 6 3 9 5 .1 1 . C h a n , B . & B u s b y , S . ( 1 9 8 9 ) G e n e 8 4 , 2 2 7 - 2 3 6 .1 2 . S i e b e n l i s t , U . , S i m p s o n , R . B . & G i l b e r t , W. ( 1 9 8 0 ) C e l l 2 0 ,2 6 9 - 2 8 1 .1 3 . K i r k e g a a r d , K . , B u c , H . , S p a s s k y , A . & W a n g , J . C . ( 1 9 8 3 ) P r o c .N a t l . A c a d . S c i . USA 8 0 , 2 5 4 4 - 2 5 4 8 .1 4 . K u n k e l , T . A . , R o b e r t s , J . D . & Z a k o u r , R . A . ( 1 9 8 7 ) M e t h o d sE n z y m o l . 1 5 4 , 3 6 7 - 3 8 2 .1 5 . S i m o n s , R . W . , H o u m a n , F . & K l e c k n e r , N . ( 1 9 8 7 ) G e n e 5 3 ,8 5 - 9 6 .1 6 . D o m b r o s k i , A . J . , W a l t e r , W. A . & G r o s s , C . A . ( 1 9 9 3 ) G e n e sD e v . 7 , 2 4 4 6 - 2 4 5 5 .1 7 . M i l l e r , J . H . ( 1 9 9 2 ) i n A S h o r t C o u r s e i n B a c t e r i a l G e n e t i c s ( C o l dS p r i n g H a r b o r L a b . P r e s s , P l a i n v i e w , N Y ) , p p . 7 1 - 7 4 .1 8 . T o m i z a w a , J . - I . ( 1 9 8 5 ) C e l l 4 0 , 5 2 7 - 5 3 5 .1 9 . T s u i , H . - O . , P e a s e , A . J . , K o e h l e r , T . M . & W i n k l e r , M . E . ( 1 9 9 4 )i n M e t h o d s i n M o l e c u l a r G e n e t i c s ( A c a d e m i c , S a n D i e g o ) , V o l . 3 ,p p . 1 7 9 - 2 0 4 .2 0 . S i e g e l e , D . A . , H u , J . C . & G r o s s , C . A . ( 1 9 8 8 ) J . M o l . B i o l . 2 0 3 ,2 9 - 3 7 .

2 1 . A m a n n , E . , B r o s i u s , J . & P t a s h n e , M . ( 1 9 8 3 ) G e n e 2 5 , 1 6 7 - 1 7 8 .2 2 . O ' H a l l o r a n , T . V . , F r a n t z , B . , S h i n , M . K . , R a l s t o n , D . M . &W r i g h t , J . G . ( 1 9 8 9 ) C e l l 5 6 , 1 1 9 - 1 2 9 .2 3 . B i r d , T . H . , G r i m s l e y , J . K . , H o c h , J . A . & S p i e g e l m a n , G . B .( 1 9 9 6 ) J . M o l . B i o l . 2 5 6 , 4 3 6 - 4 4 8 .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 9 3 ( 1 9 9 6 )