suvremeni pristup u patohistoloŠkoj ... - … · (slika 1.), stanica, organela, različitih...

59Interdisciplinarnost u dijagnozi i terapiji premalignih i malignih lezija oralnih sluznica

SUVREMENI PRISTUP U PATOHISTOLOŠKOJ DIJAGNOSTICI MALIGNIH TUMORA

Svjetlana Radović, Edina Lazović Salčin

Katedra za patologiju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Sarajevu

Autor za korespondenciju:Svjetlana Radović

Medicinski fakultet Univerziteta u SarajevuKatedra za patologiju

Čekaluša 90, 71000 Sarajevo, [email protected]

Lektor za B/H/S: Zdenka PejićLektor za engleski jezik: Naida Kaltak

SažetakUvod: Cilj rada je prezentirati suvremene metode patohistološke dijagnostike (pre)ma-lignih lezija usne duplje. Patohistološka egzaminacija tkivnih uzoraka predstavlja stan-dardizovanu proceduru koja obuhvata makroskopski i mikroskopski pregled bioptata, što se odnosi i na lezije oralne sluznice. Za najveći broj neoplazija, fi nalna dijagnoza se po-stavlja na osnovu same morfologije lezije, na tkivnim rezovima obojenim standardnom, hematoksilin-eozin (HE) metodom. Morfološka egzaminacija biopsijskih uzoraka oboje-nih HE metodom i dalje je esencijalna za postavljanje patohistološke dijagnoze. Metode: U slučajevima kada postoji dvojba o prirodi tumora, konvencionalna morfološka analiza upotpunjava se i nekim drugim tehnikama – histohemijom, imunohistohemijom (IH), a zadnjih godina i metodama molekularne patologije. Molekularna dijagnostika sve više postaje sastavni dio kliničke prakse. IH i molekularno-genetske metode su samo dodatne metode koje predstavljaju integralni, ali ne ključni i neovisan dio procedure postavljanja fi nalne patohistološke dijagnoze. Rezultati: Količina informacija o tumoru, koje treba da sadrži patohistološki izvještaj, zadnjih godina eksponencijalno raste, te pored histološkog porijekla i proširenosti tumora, važni su podaci o njegovom metastatskom potencijalu, proliferacijskom kapacitetu i, za neke vrste malignoma, prediktivnim osobinama. Uloga patologa promijenila se u odnosu na onu koja je bila do prije dva desetljeća. Patolog postavlja preoperativnu dijagnozu (na osnovu biopsije, citologije), vrši intraoperativnu evaluaciju tumora (ex tempore analizu, status resekcionih margina, pojavu nodalnih i udaljenih metastaza) i postoperativno određuje tumorski stadij, parametre metastatskog potencijala i genetske karakteristike tumora (prognostičke i prediktivne parametre). Za-ključak: Konačna dijagnoza tumora postavlja se tek nakon mikroskopskog pregleda. Morfološka egzaminacija tkivnih uzoraka obojenih HE metodom je zlatni standard pa-tohistološke dijagnostike. IH i molekularne metode predstavljaju samo integralni, ali ne ključni i neovisan dio procedure postavljanja fi nalne patohistološke dijagnoze.

Ključne riječi: tumori, patohistološka dijagnostika, imunohistohemija, molekularna patologija.

Stručni članak

DOI: 10.5644/PI2016.165.06

60 Interdisciplinarnost u dijagnozi i terapiji premalignih i malignih lezija oralnih sluznica

UVODPatohistološka egzaminacija tkivnih uzoraka je standardizovana procedura koja podrazumijeva makroskopski i mikroskopski pregled bioptata, što se odnosi i na lezije koje su uzete sa područja oralne sluznice. Da bi tkivni uzorak bio kvalitete-no pripremljen za mikroskopski pregled, potrebno je da se tkivni uzorci stavljaju u 10% puferovani neutralni formalin kako bi se sačuvale proteinske komponente unutar tkiva, u slučaju potrebe dalje upotrebe sofi sticiranih metoda bojenja tipa imunohistohemije ili neke iz domena molekularne patologije, koje se danas sve više koriste u rutinskoj dijagnostici malignoma, a koje, pored dijagnostičke vri-jednosti, imaju kod nekih tumora prognostičku i prediktivnu vrijednost.

Za najveći broj neoplazija dijagnoza se postavlja na standardno, hematoksilin-eo-zin (HE) metodom obojenim rezovima, a na osnovu same morfologije lezije. Morfološka egzaminacija biopsijskih uzoraka obojenih HE metodom, esencijal-na je za postavljanje patohistološke dijagnoze (1). U slučajevima kada postoji dvojba o prirodi tumora, konvencionalna morfološka analiza se upotpunjava i nekim drugim tehnikama: histohemijom, imunohistohemijom, a zadnjih godina i metodama iz domena molekularne patologije.

Svakodnevno se u rutinskoj patohistološkoj dijagnostici, kao dodatna metoda, koristi histohemija koja ima cilj mikroskopsku vizuelizaciju i identifi kaciju tkiva (Slika 1.), stanica, organela, različitih supstanci, minerala i mikroorganizama. U nekim slučajevima histohemijska bojenja su od velike vrijednosti u identifi kaciji stanica, mada većina služi za identifi kaciju tkivnih struktura, čime je potpomo-gnuta interpretacija morfološkog nalaza.

Slika 1. Masson trihromno bojenje pomaže razlikovanje kolagenih (plavo obojena) od mišićnih vlakana (crveno obojena). Hijalinizacija i atrofi ja poprečnoprugaste muskulature.

Posebna izdanja ANUBiH CLXV, OMN 47, str. 59 - 68


Histohemijska bojenja su od vrijednosti na nekim nivoima dijagnostičke analize, napr. kod demonstracije Perodic Acid Schiff (PAS) pozitivnog mucina u stanica-ma koje su sumnjive na adenokarcinomske (Slika 2.), Masson-Fontana (srebro) pozitivnog bojenja melanina u stanicama sumnjivim na melanomske (Slika 3.). Međutim, ove vrste bojenja gube svoju specifi čnost kada je potrebno precizno odrediti stanični tip i neoplazmu koja od njih vodi porijeklo, što je gotovo sva-kodnevni slučaj u patohistološkoj dijagnostici malignoma, odnosno u onkološkoj patohistološkoj dijagnostici.

Slika 2. PAS pozitivan materijal u stanicama mukoepidermoidnog karcinoma maksilarnog sinusa.

Slika 3. Fontana pozitivan melanin u stanicama atipičnog “blue” nevusa.

Svjetlana Radović et al.: Suvremena patološka dijagnostika malignih tumora


Zadnjih 20-tak godina razvile su se, u odnosu na standardna bojenja i histohemi-ju, više sofi sticirane tehnike kao što su to imunohistohistohemija (IH) i različite molekularne tehnike (polimeraza lančana reakcija - PCR, hibridizacija – FISH, CISH; sekvencioniranje, protočna citometrija) koje su našle široku primjenu u svakodnevnom radu patoloških laboratorija. Sve one i dalje ne mogu zamijeniti tradicionalnu morfološku analizu, ali mogu znatno doprinijeti pravilnom postav-ljaju konačne patohistološke dijagnoze (2, 3).

IH je dijagnostička metoda koja se danas široko primjenjuje u istraživačkoj i dijagnostičkoj patohistologiji, a omogućava vizuelizaciju specifi čnih staničnih, odnosno tkivnih makromolekula iz skupine globulina označenih kao imunoglo-bulini, antigeni ili imunogeni. Reakcija antigen (Ag) – antitijelo (At), koja je temelj imunologije, našla je široku primjenu u ovoj metodi koja se izvodi in situ u humanim stanicama, odnosno u tkivima. Ova metoda se zasniva na reakcijama između makromolekula antigena i antitijela koje imaju uzajamni afi nitet. Reakci-ja je reverzibilna, jer ne dolazi do stvaranja hemijskih veza.

Vizuelizacija veze Ag - At ostvaruje se preko boje tj. hromogena, koji ne mijenja biološku aktivnost antitijela. Kao hromogen najčešće se koriste 3,3-diaminoben-zidin (DAB) koji krajnji produkt reakcije boji smeđe (Slika 4.) ili 3-amino-9-eti-lkarbazol (AEC) koji krajnji produkt reakcije boji crveno.

Slika 4. Citokeratin AE1/AE3 u stanicama karcinoma.



Dijagnostičke mogućnosti imunohistohemije veoma su velike i obuhvataju odre-đivanje:

• histološkog porijekla tumora (karcinom, limfom, sarkom, melanom, itd.)• proširenosti tumora (detekcija mikrometastaza u limfnim nodusima, košta-

noj srži)• metastatskog potencijala tumora• proliferacijskog kapaciteta tumora (ekspresija proliferacijskih nuklearnih

antigena Ki-67 i PCNA)• prognoze tumora• prediktivnih osobina tumora.

U svim ovim slučajevima, načini proteinske ekspresije defi nišu pojedine tumor-ske entitete. Analiza rezultata dobijenih IH bojenjem prvenstveno ovisi o stručno-sti i iskustvu patologa, a ne o vrsti upotrijebljenog At. IH nalaz se mora interpre-tirati u sklopu morfološkog nalaza koji je bazičan, dok svi ostali nalazi, dobijeni različitim vrstama bojenja i tehnikama, predstavljaju samo njegov integralni dio. IH nalaz se ne smije interpretirati neovisno o morfologiji analiziranog tkiva, jer u protivnom mogu nastati greške u interpretaciji i konačnoj dijagnozi.

IH izvještaj mora biti sastavni dio morfološke analize uzorka, odnosno mora biti inkorporiran u patohistološki izvještaj. Ovaj izvještaj mora sadržavati, pored opi-sa prirode biopsijskog uzorka, i rezultat nalaza za svako upotrijebljeno At, bilo da daje pozitivnu ili negativnu reakciju. Ukoliko je reakcija pozitivna mora se na-značiti intenzitet obojenosti, brojnost antigen-pozitivnih (obojenih) stanica, kao i precizna lokalizacija vizueliziranog Ag. Izvještaj mora na kraju imati dijagno-zu, odnosno diferencijalnu dijagnozu u slučajevima kada nije moguće postaviti decidnu dijagnozu. U tumorskoj patologiji, fi nalna dijagnostička klasifi kacija, ali i dalji klinički tretman pacijenta, sve više zahtijevaju analizu genetskog pro-fi la neoplazme, tj. nalaz promjena na molekularnom nivou koji podrazumijeva identifi kaciju: specifi čnih genskih mutacija, gubitaka gena, promjena gena i ek-spresije raznih vrsta gena, koji su uključeni u proces tumorogeneze. Na osnovu dobro defi nisanih molekularnih abnormalnosti izvršena je najnovija molekularna stratifi kacija nekih vrsta invazivnih karcinoma (npr. dojke). Molekularno selekci-oniranje karcinoma ima cilj identifi kaciju agresivnijih formi tumora, kod kojih je nakon operativnog tretmana potrebno primijeniti adjuvantnu terapiju, kao i iden-tifi kaciju pacijenata kod kojih se očekuje zadovoljavajući odgovor nakon primjene odgovarajuće terapije. To znači da rezultati dobijeni istraživanjem molekularnog profi la karcinoma mogu biti od pomoći u terapeutskom selekcioniranju pacijenata i primjeni nove terapeutske strategije, koja ima cilj i moduliranje procesa kancero-geneze, u smislu usporavanja ili potpunog zaustavljanja tumorskog rasta.

Promjene na genskom materijalu mogu se identifi kovati različitim molekular-nim tehnikama koje se danas koriste posebno u onkološkoj dijagnostici u cilju



postavljanja dijagnoze, prognoze, otkrivanja minimalne rezidualne bolesti i na-sljedne sklonosti kod malignoma. Integracija molekularnog profi la nekih vrsta karcinoma (dojke, kolorektuma, pluća) pokazuje se kao neophodna za dalji klinič-ki tretman oboljelih. Budućnost liječenja od karcinoma je upravo u individualno- određenoj (personalizovanoj) terapiji, gdje se ovisno o biološkim karakteristikama tumora, apliciraju molekularno-ciljani lijekovi. Na ovaj način molekularna dija-gnostika sve više postaje sastavni dio kliničke prakse. Budućnost liječenja nekih vrsta karcinoma (pluća) upravo je u personalizovano-određenoj terapiji, koja je dik-tirana biološkim karakteristikama tumora. Radi se o terapiji molekularno- ciljanim lijekovima. Molekularno-ciljna terapija, iako je još u samom začetku, pokazala je dobre rezultate kod oboljelih od karcinoma dojke. Molekularna dijagnostika nekih malignoma (prvenstveno leukemija i sarkoma) već je postala integralni dio kliničke prakse.

Tehnike molekularne patologije predstavljaju samo integralni, ali ne neovisan i ključni dio procedure postavljanja fi nalne patohistološke dijagnoze. Brojne mole-kularne tehnike (napr. lančana reakcija polimerazom - PCR, fl uorescentna in situ hibridizacija - FISH) nisu sasvim primjenjive u rutinskoj patohistološkoj dijagno-stici, jer ne daju jasnu morfološku sliku, zbog čega kod ovih tehnika obrade tkiv-nih uzoraka nije jasna korelacija između dobijenog nalaza i morfologije ispitivane promjene. Nejasna morfologija neoplazme u tkivnom preparatu predstavlja glavni nedostatak pomenutih molekularnih tehnika (Slika 5.). Najnovija metoda istraživa-nja genetskih promjena je sitnopostrojbena analiza DNA (engl. DNA micro-array) koja predstavlja zlatni standard u izučavanju molekularnih osobina karcinoma doj-ke, ali zbog visoke cijene koštanja (neophodne opreme, hemikalija, obuke stručnog osoblja), dugotrajnosti izvođenja i mogućnosti izvedbe isključivo na svježem tkivu, nije primjenjiva u rutinskoj kliničkoj praksi.

Nedostatak ove metode je i u tome što nivoi mRNA nisu uvijek asocirani sa pro-mjenama u proteinskoj ekspresiji. Surogat ove metode je IH metoda, gdje se upo-trebom IH markera mogu analizirati molekularni profi li tumora upotrebom razli-čitih markerskih panela koji pokazuju 100% senzitivnost i 76% specifi čnost. IH markeri služe kao surogat genskog profi la, na osnovu kojeg je moguća klasifi kacija karcinoma dojke u podgrupe koje pokazuju biološku različitost i diferentno pona-šanje. Prediktivna snaga IH kriterija je slična genskoj ekspresionoj analizi, te time primjenjiva u svakodnevnom kliničkom radu.



Slika 5. FISH metoda: tumorske stanice karcinoma dojke s prekomjernom amplifi kacijom gena HER2 kao posljedica mutacije gena (crveni signali).

U patohistološkoj dijagnostici oralnih lezija, primjena IH najčešća je u sluča-jevima identifi kacije tumorskih stanica slabo diferenciranih i nediferenciranih tumora, u slučajevima indentifi kacije tumorskih mikrometastatskih depozita u sentinel-limfnom čvoru, a koji su neuočljivi kod standardnog HE bojenja, kao i u diferencijalnoj dijagnostici metastatskih tumora nepoznatog primarnog porijekla. U primjeni IH metode vodimo se metodom primjene dijagnostičkih algoritama, u kojima se koriste paneli antitijela u cilju brzog i tačnog rješavanja problema tj. postavljanja dijagnoze uz upotrebu što manjeg broja dijagnostički vrijednih antitijela. Brojni različiti dijagnostički algoritmi dostupni su u relevantnim knji-gama i stručnim časopisima. Za određivanje histogenetskog porijekla tumora (karcinom, limfom, sarkom i melanom) koristi se primarni panel antitijela. Po-tom slijede dijagnostički algoritmi sa selektivnim markerima u cilju određivanja tumorskog podtipa svakog tkivnog sistema i organa ponaosob, što se odnosi i na područje usne duplje (1-3).

Patohistološki nalaz važan je medicinski dokument koji treba da sadrži, što je moguće konciznije, relevantne makroskopske i mikroskopske karakteristike bi-optata, kao i njihovo kliničko značenje. Nalaz treba da bude brzo izdan, tačan i kratak. Patohistološki izvještaj se sastoji iz nekoliko dijelova: prvi dio sadrži demografske i osnovne kliničke podatke. Drugi dio sadrži makroskopski opis bioptata, treći dio sadrži mikroskopski opis uzorka, četvrti dio je dijagnoza, a eventualni peti dio sadrži dodatni komentar patologa.

Makroskopski opis obuhvata utvrđivanje vrste uzorka – bioptat ili resektat, njego-ve dimenzije (dužina, širina i debljina), a ovisno o uzorku i težine, treba naglasiti ako uzorak nije primljen u formalinu, ako je svjež, intaktan ili zarezan (otvoren).



Ukoliko se u tkivnom uzorku nalazi lezija/tumor, opisuju se njegove dimenzije (izražavaju se u centimetrima), izgled (npr. nodularna, ulcerirana), boja, izgled rezne plohe, udaljenost rubova lezije/tumora od resekcionih margina koje se tu-širaju u cilju obilježavanja lateralnih i bazalne margine. Kroz tkivni uzorak se prave okomiti, uporedni rezovi debljine 2 – 3 mm, dok se manji tkivni uzorci (promjera do 5 mm) u cjelosti uklapaju u parafi n. Problem nastaje u slučajevima kada je tkivni uzorak isuviše malih dimenzija (jer kliničar nije u prilici, zbog mogućnosti narušavanja okolnih struktura, da uzme dovoljno velik komadić tki-va), kada bioptat predstavlja samo dio promjene, kada je fragmentiran, u kojim slučajevima nije moguće uraditi adekvatnu morfološku analizu.

Mikroskopski opis treba da bude kratak i precizan, bez nepotrebnih podataka koji su neinteresantni i beznačajni za kliničara (npr. da li je jedarce acidofi lno ili bazofi lno).

a) Histološki tip/podtip tumora Patohistološka dijagnoza temelji se na utvrđivanju porijekla tumorskih stani-

ca. U slučajevima kada se radi o benignim tumorima i dobro diferenciranim malignomima, dijagnoza se postavlja već na standardno obojenim preparati-ma, dok je u slučajevima slabe diferenciranosti tumora potrebno primijeniti histohemijske i/ili imunohistohemijske metode.

b) Stepen diferenciranosti tumora (gradus) – utvrđuje nivo agresivnosti (nivo maligniteta), koji se utvrđuje na osnovu citološke diferenciranosti tumorskih stanica i broja mitoza u tumorima; mogu biti gradusa I - IV, prema opadanju sličnosti sa normalnim tkivom; kriteriji diferenciranosti različiti su za poje-dine vrste tumora;

c) Prisustva intravaskularne intra - i /ili peritumorske invazijed) Perineuralna invazijae) Limfocitarnog odgovora domaćinaf) Prisustva tumorske nekrozeg) Broj patoloških mitoza na jedinici površine, odnosno proliferacijski indeks

tumorah) Način perifernog širenja tumorai) Prisustva metastaza u regionalnim limfnim čvorovima (ako su dostavljeni za

mikroskopski pregled)j) Stadija (engl. staging) malignoma – trenutno se koriste dvije metode za

prikazivanje tumorskog stadija, TNM i AJCC (American Joint Comitee on Cancer); analiziraju se svi parametri koji određuju njegov pTNM stadij, a što je u skladu sa aktuelnom TNM klasifi kacijom (T-tumor, N-zahvaćenost regionalnih limfnih čvorova, M-metastaze); kod AJCC metode karcinomi se dijele u stadije 0 - 4, uzimajući identične parametre kao i prethodni sistem.

Količina informacija koje treba da sadrži patohistološki izvještaj, posebno u slučajevima tumora, eksponencijalno raste zadnjih godina te pored histološ-kog porijekla tumora i proširenosti tumora, zahvaljujući IH sadrži i podatke o:



metastatskom potencijalu, proliferacijskom kapacitetu i, za neke vrste maligno-ma, prediktivnim osobinama tumora.

U eri personalizovane medicine došlo je do promjene uloge patologa u tretmanu pacijenata sa nekim oblicima malignoma. Tradicionalni morfolog postaje klinički konsultant za neke medicinske struke (gastroenterologa, kolorektalnog hirurga, onkologa i medicinskog genetičara). Patolog određuje patohistološku dijagno-zu, patološki status tumora, analizira hirurške margine, traga za prognostičkim parametrima koji nisu uključeni u stadiranje tipa limfovaskularne i perineuralne invazije, te na osnovu molekularnog statusa tumora procjenjuje terapeutsku efek-tivnost neoadjuvantne terapije. Uloga patologa u multidisciplinarnom timu koji prati pacijenta oboljelog od karcinoma uvećana je uvođenjem novih hirurških tehnika i ciljane terapije, sa izgledima za daljim uvećanjem značaja, zbog sve veće potrebe za inkorporiranje informacija iz domene molekularne patologije u dalji tretman ovih pacijenata.

ZAKLJUČAKKonačna dijagnoza tumora postavlja se tek nakon mikroskopskog pregleda tumo-ra. Morfološka egzaminacija tkivnih uzoraka obojenih hematoksilin-eozin (HE) metodom predstavlja zlatni standard patohistološke dijagnostike. IH i molekular-no-genetske metode su samo dodatne metode koje predstavljaju integralni, ali ne ključni i neovisan dio procedure postavljanja fi nalne patohistološke dijagnoze. Standardizacija postupka u patohistološkoj dijagnosici utječe na tačnost i brzinu postavljanja dijagnoze. Uloga patologa u dijagnostičkom lancu tumora promije-nila se u odnosu na onu koju je imao prije dva desetljeća. Patolog postavlja pre-operativnu dijagnozu (na osnovu biopsije, citologije), vrši intraoperativnu evalu-aciju tumora (status resekcionih margina, pojava nodalnih i udaljenih metastaza) i postoperativno određuje tumorski stadij, parametre metastatskog potencijala i genetske promjene tumora (prognostičkih i prediktivnih parametara).

Reference1. Damm N, Bouguot A. Oral & Maxillofacial Pathology. 2th ed. Philadelphia, London,

New York, St. Louis, Sydney, Tokio: W. B. Saunders Company; 2002.2. Derek CA. Histopathology reporting. 2th ed. London: Springer; 2006.3. Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry. Theranostic and Genomic Applicati-

ons. 4th ed. Philadelphia: Saunders Elsevier; 2014.



MODERN APPROACH IN DIAGNOSTIC PATHOLOGY OF MALIGNANT TUMORS

AbstractObjective: To present modern methodology of histopathological diagnosis of pre-malignant and malignant lesions of the oral cavity. Histopathological screening of tissue samples is a standardized procedure that includes macroscopic and mi-croscopic examination of biopsy specimens and applies to oral mucosal lesions. Final diagnosis, for the largest number of neoplasias is based on the morphology of tissue samples stained by standard hematoxylin-eosin (HE), a method still es-sential for pathohistological diagnosis. Methods: In cases where the nature of the tumor is unclear, conventional morphological analysis is supplemented by other techniques such as histochemistry and immunohistochemistry (IHC) and more recently with molecular methods. Molecular diagnostics are increasingly beco-ming an integral part of clinical practice. IHC and molecular-genetic methods are additional methods which are an integral and independent, but not crucial part of the procedure of providing a fi nal histopathological diagnosis. Results: In recent years, details about cancer in histopathological reports increased exponentially. In addition to the histological origin and spread of the tumor, other important information reported includes metastasis, proliferation and, for some types of malignancies, predictive features. The role of the pathologist has changed in the past two decades. Modern day pathologists set pre-operative diagnoses (based on biopsy, cytology), perform intraoperative evaluation of tumors (ex tempore biop-sy, status of resection margins, the appearance of nodal and distant metastases) and determine the postoperative tumor stage, parameters of metastatic potential and genetic characteristics of the tumor (prognostic and predictive parameters). Conclusion: The fi nal diagnosis of a tumor is given after extensive microscopic examination of biopsy specimens. Morphological examination of tissue samples, prepared by a standard HE method is still the golden standard for histopathologi-cal diagnosis. IHC and molecular methods have become an integral part of fi nal histopathological diagnosis.

Key words: Tumors, Diagnostic pathology, Immunohistochemistry, Molecular pathology.


suvremeni pristup u patohistoloŠkoj ... - … · (slika 1.), stanica, organela, različitih...

Documents