sveučilište u zagrebu -...
TRANSCRIPT
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek
Zvonimir Šamija
RAZNOVRSNOST ALELA HLA MEĐU BOLESNICIMA U PROGRAMU
TRANSPLANTACIJE KRVOTVORNIH MATIČNIH STANICA
Diplomski rad
U Zagrebu, 2014.
Ovaj rad je izrađen u Kliničkoj jedinici za tipizaciju tkiva, Kliničkog zavoda za transfuzijsku
medicinu i transplantacijsku biologiju, Kliničkog bolničkog centra Zagreb, pod vodstvom prof.
dr. sc. Zorane Grubić. Rad je predan na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno –
matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistar eksperimentalne
biologije
Zahvaljujem se, prije svega, svojoj mentorici prof. dr. sc. Zorani Grubić na nesebičnoj pomoći
pri oblikovanju ideje ovog diplomskog rada, za izradu kojeg sam motivaciju dobio upravo
zahvaljujući njezinom znanstvenom i obrazovnom djelovanju. Posebno joj se zahvaljujem na
ukazanom povjerenju, velikom strpljenju i stručnim savjetima kojima me je vodila kroz izradu
ovog diplomskog rada. Također, želio bih se zahvaliti svim djelatnicima Kliničke jedinice za
tipizaciju tkiva KBC-a Zagreb na ugodnoj radnoj atmosferi, nesebičnoj pomoći i susretljivosti, a
posebno mag. biol. mol. Mariji Maskalan na strpljenju i pomoći u rješavanju svih problema i
zapreka s kojima sam se susreo tijekom istraživanja.
Posebno se zahvaljujem svojoj obitelj na bezuvjetnoj podršci tijekom proteklih godina i naravno,
veliko hvala svim prijateljima koji su bili uz mene tijekom moga studija, a zbog kojih će mi to
razdoblje ostati u nezaboravnom sjećanju.
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA
Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek Diplomski rad
RAZNOVRSNOST ALELA HLA MEĐU BOLESNICIMA U PROGRAMU
TRANSPLANTACIJE KRVOTVORNIH MATIČNIH STANICA
Zvonimir Šamija
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska
U ovom radu analizirana je raspodjela alela i haplotipova HLA kod bolesnika uključenih u
program nesrodne transplantacije krvotvornih matičnih stanica (TKMS) u Hrvatskoj, s ciljem
određivanja vjerojatnosti pronalaska HLA podudarnog nesrodnog darivatelja. Unutar skupine od
150 nesrodnih bolesnika, određena je raspodjelu alela HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1 te
haplotipova HLA-A-B-DRB1, odnosno HLA-A-B-C-DRB1-DQB1. Aleli HLA određeni su
metodama lančane reakcije polimerazom upotrebom specifičnih DNA početnica i
oligonukleotidnih proba za alele HLA (metode: PCR-SSP i PCR-SSO). Haplotipovi HLA
bolesnika određeni su segregacijskom analizom na temelju podataka o tipizaciji HLA članova
uže obitelji. Usporedbom učestalosti alela HLA između ispitivane skupine bolesnika i zdrave
kontrole nisu utvrđene statistički značajne razlike. Najčešći aleli bili su: HLA-A*02:01 (27,7%),
B*51:01 (13,0%), C*07:01 (20,3%), DRB1*03:01 (15,3%) i DQB1*03:01 (23,3%). Od 227
različitih haplotipova HLA-A-B-DRB1, njih 197 pojavilo se samo jednom, a najzastupljeniji je
bio: HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7,3%). Analiza haplotipova HLA koja je uključila 5
lokusa potvrdila je najveću učestalost haplotipa: HLA-A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-
DQB1*02:01 što je u skladu s prethodnim istraživanjima. Neuobičajene kombinacije alela HLA-
B-C uočene kod 15 bolesnika i neuobičajene kombinacije alela HLA-DRB1-DQB1 uočene kod 4
bolesnika te prisustvo rijetkih alela (A*29:01, B*80:01, C*07:18, DRB1*04:15, DRB1*11:15 i
DRB1*11:28) pokazali su se kao otežavajući čimbenici u pronalasku HLA podudarnog
nesrodnog darivatelja.
(43 stranice, 14 slika, 15 tablica, 22 literarna navoda, jezik izvornika: hrvatski)
Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici
Ključne riječi: HLA, transplantacija krvotvornih matičnih stanica, nesrodni darivatelj
Voditelj: Dr. sc. Zorana Grubić, izv. prof., KBC Zagreb
Ocjenitelji: Dr. sc. Nada Oršolić, prof., PMF Sveučilišta u Zagrebu
Dr. sc. Silvija Černi, doc., PMF Sveučilišta u Zagrebu
Dr. sc. Inga Marjanović, doc., PMF Sveučilišta u Zagrebu
Rad prihvaćen: 28.11.2014.
BASIC DOCUMENTATION CARD
University of Zagreb
Faculty of Science
Division of Biology Graduation Thesis
HLA ALLELE POLYMORPHISMS AMONG PATIENTS IN HEMATOPOIETIC STEM
CELL TRANSPLANTATION PROGRAM
Zvonimir Šamija
Rooseveltov trg, 10000 Zagreb, Croatia
The aim of the present study was to analyze the distribution of HLA alleles and haplotypes
among patients (N=150) in hematopoietic stem cell transplantation program (HSCT) in Croatia,
in order to determine the probability of finding an HLA matched unrelated donor. The
distribution of HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 alleles and HLA-A-B-DRB1/HLA-A-B-C-
DRB1-DQB1 haplotypes was investigated. HLA alleles were tested by Polymerase Chain
Reaction with specific primers or probes (PCR-SSP and PCR-SSO). HLA haplotypes were
determined by segregation analysis. Comparison of patients included in this study and healthy
controls regarding the HLA allele distribution did not reveal any statistically significant
difference. The most common alleles detected in our patient group were: HLA-A*02:01 (27.7%),
B*51:01 (13.0%), C*07:01 (20.3%), DRB1*03:01 (15.3%) and DQB1*03:01 (23.3%). Out of
227 different detected HLA-A-B-DRB1 haplotypes, 197 were observed only once and the most
frequent one was HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7.3%). Five loci haplotype analysis
confirmed the highest frequency of HLA-A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-
DQB1*02:01 haplotype, which is in concordance with the previous studies. Unusual HLA-B-C
combinations detected in 15 patients together with unusual HLA-DRB1-DQB1 combinations
detected in four patients and the presence of rare alleles (A*29:01, A*80:01, C*07:18,
DRB1*04:15, DRB1*11:15, DRB1*11:28) were shown to be limiting factors in finding an HLA
matched unrelated donor.
(43 pages, 14 figures, 15 tables, 22 references, original in: Croatian)
Thesis deposited in the Central Biological Library
Key words: HLA, hematopoietic stem cell transplatation, unrelated donor
Supervisor: Dr. Zorana Grubić, Assoc. Prof., University Hospital Centre Zagreb
Reviewers: Dr. Nada Oršolić, Prof., Faculty of Science, University of Zagreb
Dr. Silvija Černi, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb
Dr. Inga Marjanović, Asst. Prof., Faculty of Science, University of Zagreb
Thesis accepted: 28.11.2014.
Sadržaj
1.0. Uvod ............................................................................................................................................... 1
1.1. Glavni sustav tkivne podudarnosti ............................................................................................... 1
1.1.1. Organizacija sustava HLA ................................................................................................... 1
1.1.2. Obilježja sustava HLA ......................................................................................................... 3
1.1.3. Raspodjela alela HLA u svijetu ............................................................................................ 6
1.1.4. Građa i funkcija antigen-predočnih molekula HLA ............................................................ 9
1.1.4.1. Antigen-predočne molekule HLA razreda I ................................................................. 9
1.1.4.2. Antigen-predočne molekule HLA razreda II .............................................................. 10
1.2. Transplantacija krvotvornih matičnih stanica ............................................................................ 11
1.2.1 Registri dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica ..................................... 14
2.0. Ciljevi istraživanja ..................................................................................................................... 18
3.0. Materijali i metode ..................................................................................................................... 19
3.1. Ispitanici .................................................................................................................................... 19
3.2. Izolacija DNA ........................................................................................................................... 19
3.3. Metode određivanja alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 ..................................................... 19
3.4. Statistička analiza rezultata ....................................................................................................... 21
4.0. Rezultati ...................................................................................................................................... 22
4.1. Učestalost alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 među bolesnicima
u programu nesrodne TKMS .................................................................................................... 22
4.2. Raspodjela haplotipova HLA-A-B-DRB1 kod bolesnika
u programu nesrodne TKMS ................................................................................................... 27
4.3. Raspodjela haplotipova HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 kod bolesnika
u programu nesrodne TKMS .................................................................................................. 28
4.4. Broj mogućih nesrodnih darivatelja u nacionalnom i svjetskom registru za bolesnike
u programu nesrodne TKMS .................................................................................................. 30
5.0. Rasprava ..................................................................................................................................... 36
6.0. Zaključak .................................................................................................................................... 40
7.0. Literatura ........................................................................................................................ 41
1
1.0. Uvod
1.1. Glavni sustav tkivne podudarnosti
Geni glavnog sustava tkivne podudarnosti (engl. Mayor Histocompatibility Complex -
MHC) kod ljudi se nalaze na kratkom kraku kromosoma 6 u regiji 6p21.3 (Slika 1). Više od 200
dosad otkrivenih gena tog sustava obuhvaća kromosomsku regiju od približno 4000 kilobaza. Ta
je regija najistraživaniji dio ljudskog genoma zbog činjenice da se unutar nje nalaze geni HLA
(engl. Human Leukocyte Antigens) koji imaju značajnu ulogu u transplantaciji tkiva i organa, a
također se smatraju ključnima i u nastanku pojedinih bolesti autoimune etiologije. Ključna
funkcija gena HLA očituje se, kako u imunološkoj reakciji tako i u transplantacijskom kliničkom
procesu, kroz funkciju njihovih najvažnijih produkata – molekula HLA. One su glavni dio
antigen-predočnog kompleksa na površini stanica, predočuju vlastite i strane peptidne dijelove
citotoksičnim i pomoćničkim T-limfocitima. Upravo razlikovanje vlastitih od stranih peptida,
koji se predočuju u sklopu molekula HLA, ključan je čimbenik u ishodu postupka transplantacije
tkiva i organa [1].
1.1.1. Organizacija sustava HLA
Sustav HLA dijeli se u 3 genske regije (regija HLA razreda I, razreda II i razreda III).
Regija HLA razreda I smještena je telomerno i sastoji se od dvije skupine gena – klasičnih i
neklasičnih. Skupinu klasičnih gena HLA razreda I čine geni HLA-A, -B i -C, čiji su produkti -
molekule HLA, izraženi na gotovo svim stanicama u tijelu, s pojedinim iznimkama. Geni HLA-
E, -F i -G dio su skupine neklasičnih gena HLA razreda I koja se od prve skupine u osnovi
razlikuje zbog znatno slabijeg polimorfizma, drugačije tkivne rasprostranjenosti njihovih
molekula i specifične funkcije. U ovu se skupinu ubrajaju i neki pseudogeni iako ih dio autora
izdvaja kao zasebnu podskupinu gena HLA razreda I [1].
Regija HLA razreda II smještena je bliže centromeri i podijeljena je u 6 genskih
podregija: HLA-DM, -DN, -DO, -DP, -DQ i -DR. Podregije HLA-DP, -DQ i -DR kodiraju
molekule HLA razreda II koje se izražavaju na membrani stanica (antigen-predočne molekule
HLA razreda II), dok preostale tri podregije (HLA-DM, -DN i -DO) kodiraju molekule koje nisu
prisutne na staničnoj membrani i posredno su uključene u proces funkcionalnog formiranja
antigen-predočnih molekula HLA razreda II. Molekule kodirane genskim podregijama HLA-
2
DM, -DN i -DO poglavito su važne u procesu vezanja peptidnih ulomaka s drugim molekulama
HLA i prisutne su uglavnom u citoplazmi stanica, ali ne i na njihovoj površini. Molekule HLA
razreda II (HLA-DP, HLA-DQ i HLA-DR) izražene su samo na membrani specijaliziranih
antigen-predočnih stanica (makrofagi, dendritičke stanice, B-limfociti), ali i na pojedinim
stanicama koje takvu funkciju mogu imati povremeno, poput nekih endotelnih stanica. Unutar
regije HLA razreda II nalaze se i geni koji su ključni za konačni ustroj molekula HLA razreda I
poput TAP1 i TAP2 (engl. Transporters Associated with antigen Processing) proteinskih pumpi
za prijenos antigenskih dijelova iz citosola u endoplazmatski retikulum, kao i skupina gena za
enzimske dijelove proteasoma koji cijepa velike proteinske antigene na manje peptidne dijelove
[2].
Unutar regije HLA razreda III (tzv. centralna regija), koja se nalazi između regije HLA
razreda I i II, smješteni su geni čiji produkti nisu direktno uključeni u procese imunološkog
prepoznavanja i aktivacije stanica specifične imunosti, ali su važni jer posredno sudjeluju u
imunološkoj reakciji. Geni unutar HLA razreda III kodiraju neke sastavnice komplementa (C2,
C4A, C4B), proteine toplinskog šoka (engl. Heat Shock Proteins - HSP), enzim 21-hidroksilazu
te neke važne citokine poput TNF-α i TNF-β (engl. Tumor Necrosis Factors) [3]. Unutar ove
regije nema niti jedan gen HLA.
Slika 1. Smještaj regije HLA na kraćem kraku kromosoma 6. (Preuzeto iz [4])
3
1.1.2. Obilježja sustava HLA
Nekoliko je osnovnih obilježja koja sustav HLA čine specifičnim i značajno određuju
njegovu osobitost. Kad je riječ o nasljeđivanju gena HLA treba naglasiti kako ono prati
Mendelove zakone nasljeđivanja, odnosno segregacije (Slika 2). Nasljeđivanje kombinacije alela
HLA, točnije haplotipova HLA, klasičan je primjer Mendelovskog načina nasljeđivanja. Po
jedan haplotip HLA nasljeđuje se od svakog roditelja pri čemu se oba izražavaju kodominantno
na staničnoj membrani, što je posljedica kodominacije na razini gena [2].
Sljedeća osobitost sustava HLA odnosi se na mogućnost rekombinacije gena HLA i
stvaranja novih haplotipova. Riječ je o procesu križnog spajanja ili crossing over-a (c.o.).
Genetička zakonitost koja definira učestalost genetičke rekombinacije kroz proces c.o.-a temelji
se na međusobnoj udaljenosti pojedinih gena. Naime, vjerojatnost c.o.-a je veća što su geni
međusobno više udaljeni i obratno. Ista zakonitost uočena je i unutar regije HLA gdje
vjerojatnost c.o.-a nije stalna i ovisi o međusobnoj udaljenosti gena HLA. Primjerice, pojava
c.o.-a nikad nije uočena između gena HLA-DQB1 i -DRB1, dok je učestalost rekombinacije
najveća između gena HLA-B i -DRB1. U načelu, stopa rekombinacije između gena HLA iznosi
oko 1%, dakle vrlo je mala i ne pridonosi (barem ne u značajnijoj mjeri) genetičkoj varijabilnosti
ovog genskog sustava [1].
Slika 2. Prikaz nasljeđivanja gena/haplotipova HLA u obitelji.
4
Možda najznačajnije obilježje sustava HLA, koje se snažno odražava na ulogu molekula
HLA u imunološkoj reakciji, a izuzetno je važno u postupku kliničke transplantacije, svakako je
velika genska raznolikost. Naime, sustav HLA najpolimorfniji je genski sustav kod čovjeka što
je posljedica nekoliko genetskih mehanizama koji uključuju gensku konverziju, točkaste
mutacije i već spomenutu rekombinaciju [2]. Do danas je utvrđeno više od 12 000 alela HLA
razreda I i II. Značajno veću raznolikost pokazuju aleli HLA razreda I s najpolimorfnijim
lokusom HLA-B (Tablica 1). Razlike među alelima HLA većinom su prisutne u egzonima koji
kodiraju α1 i α2 podjedinice α-lanca molekule HLA razreda I (egzoni 2 i 3) i u egzonu koji
kodira α1 i β1 podjedinice molekule HLA razreda II (egzon 2). Spomenute podjedinice formiraju
pukotine molekula HLA unutar kojih se vežu prerađeni peptidni dijelovi [5].
Tablica 1. Broj do sada otkrivenih alela HLA
Lokus Broj alela
HLA-A 2946
HLA-B 3693
HLA-C 2466
HLA-DPB1 472
HLA-DQB1 712
HLA-DRB 1684
(Prilagođeno prema [18])
Potrebno je naglasiti da se svakim danom otkrivaju novi aleli HLA te da njihov broj
sigurno nije konačan (Slika 3). Kao što možemo vidjeti iz Slike 3, od travnja 2013. (ukupan broj
alela HLA razreda I i II bio je oko 9550) do svibnja 2014. godine, otkriveno je oko 2500 novih
alela.
Osim polimorfizma, poligenija je još jedno obilježje koje uvjetuje antigensku razliku
među jedinkama. To se svojstvo odnosi na činjenicu da se unutar jednog haplotipa HLA nalazi
više gena HLA slične strukture i funkcije što osigurava (uz velik polimorfizam) veći broj
različitih kombinacija molekula HLA unutar jedinke, a time i veću mogućnost predočavanja
5
različitih antigena izvršnim stanicama imunološkog sustava. Ovo se obilježje, kao i velik
polimorfizam, smatra evolucijskom prilagodbom koja osigurava uspješniju borbu protiv
mikroorganizama s velikim broj različitih antigena [2].
Slika 3. Broj novootkrivenih alela HLA razreda I i II od 1987. do 2013. godine.
(Prilagođeno prema [6]).
S obzirom na velik broja alela HLA u svijetu i veći broj gena HLA koji čine jedan
fenotip, potencijalan broj mogućih fenotipova na razini populacije reda je veličine 1013
.
Međutim, stvaran broj fenotipova HLA, kako u svijetu tako i na razini pojedine populacije,
znatno je manji, prvenstveno zbog još jednog važnog obilježja sustava HLA – neravnoteže
udruživanja (engl. linkage disequilibrium - LD) [7]. Riječ je o fenomenu učestalijeg povezivanja
pojedinih alela HLA u specifične kombinacije, odnosno češće pojave pojedinih alela HLA u
haplotipovima HLA, nego što je to za očekivati na temelju pojedinačnih frekvencija tih alela.
Nekoliko je mogućih objašnjenja ovog fenomena poput djelovanja selekcijskih sila ili genetički
uvjetovanih mehanizama koji potiču specifična udruživanja alela HLA u zajednički haplotip, a
6
koji su rezultat male udaljenosti među pojedinim lokusima HLA. Međutim, niti jedno od
objašnjenja do sada nije dalo potpuni odgovor [3]. Najsnažnija neravnoteža udruživanja uočena
je između bliskih lokusa HLA (npr. HLA-B-C, HLA-DRB1-DQB1 ili HLA-DQA1-DQB1).
Međutim, postoje i cijeli haplotipovi koji pokazuju jaku neravnotežu udruživanja. Jedan od
najboljih primjera za to je haplotip: HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 odnosno HLA-
A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01, s vrlo visokom učestalošću u brojnim
populacijama u svijetu [8].
1.1.3. Raspodjela alela HLA u svijetu
Populacijska istraživanja, čiji je cilj utvrditi i analizirati učestalost odnosno raspodjelu
alela HLA među različitim populacijama u svijetu, provode se kontinuirano još od početka 1990-
ih godina. Na temelju rezultata niza istraživanja na području populacijske genetike, a koja
uključuju analizu raspodjele alela HLA, napravljena je sljedeća podjela alela HLA:
a) aleli HLA s relativno visokom učestalošću u svim populacijama
b) aleli HLA uočeni u većini populacija, ali ih u nekima uopće nema ili su rijetko prisutni
c) aleli HLA specifični samo za pojedine populacije
Prema istraživanju provedenom 2014. godine najčešći alel HLA-A među europskom
populacijom je HLA-A*02:01, inače vrlo čest i u ostalim svjetskim populacijama, primjerice u
SAD-u ili Južnoj Americi (Slika 4). Ostali aleli HLA-A česti među europskom populacijom su:
HLA-A*01:01, A*03:01, A*24:02. Raspodjela alela HLA-A*01:01 i A*03:01 pokazuje
regionalne razlike s obzirom da su češći među nekim populacijama sjeverne Europe nego među
populacijama na području jugoistočne Europe. Obrnuti je slučaj s alelom HLA-A*24:02 koji je
češći na području jugoistočne Europe u odnosu na ostale europske regije. Prema istom
istraživanju najčešće skupine alela na lokusu HLA-B bile su B*35 (najčešći alel B*35:01) i B*51
(najčešći alel B*51:01), inače relativno česti i u većini populacija u svijetu (Slika 5). Raspodjela
alela B*35:01 i B*51:01 također pokazuje regionalne razlike. Naime, uočena je veća učestalost
tih alela na području jugoistočne Europe, nego u populacijama zapadne i sjeverne Europe. Alel
HLA-C*07 najčešći je alel lokusa HLA-C u Europi, ali i u mnogim svjetskim populacijama, s
7
manjom učestalošću na jugoistoku Europe u odnosu na ostale europske regije. Na lokusu HLA-
DRB1 u Europi je najčešća skupina alela DRB1*11, odnosno aleli DRB1*11:01 i DRB1*11:04
koji također pokazuju razlike u učestalosti od sjevera do juga Europe, odnosno pad učestalosti od
istoka prema zapadu Europe (Slika 6). Najčešća skupina alela lokusa HLA-DQB1, DQB1*03
prisutna je u većini populacija u svijetu s vrlo visokom učestalošću i za razliku od nekih
navedenih primjera ne pokazuje izraženije regionalne razlike u učestalosti na području Europe
[8].
Slika 4. Raspodjela alela HLA-A*02:01 u svijetu. (Preuzeto s [19]).
8
Slika 5. Raspodjela alela HLA-B*51:01 u svijetu. (Preuzeto s [19]).
Slika 6. Raspodjela alela HLA-DRB1*11:01 u svijetu. (Preuzeto s [19]).
9
1.1.4. Građa i funkcija antigen-predočnih molekula HLA
Kao što je već navedeno, dvije su skupine, odnosno dva razreda molekula HLA čija je
glavna funkcija predočavanje vlastitih i stranih peptidnih dijelova izvršnim molekulama
imunološkog sustava te pokretanje imunološke reakcije s ciljem eliminacije stranog antigena.
Osnovne razlike između molekula HLA razreda I i II sadržane su u tipu antigena kojeg
predočuju, tipu stanica kojima predočuju antigen i njihovoj tkivnoj zastupljenosti.
1.1.4.1. Antigen-predočne molekule HLA razreda I
Molekule HLA razreda I građene su od dva polipeptidna lanca od kojih je teški α-lanac
kodiran genima HLA razreda I (HLA-A, -B, -C), a drugi lanac, tzv. β2-mikroglobulin kodiran je
genom na kromosomu 15. Molekula HLA razreda I građena je od četiri osnovna dijela: vanjski
dio koji veže peptidne ulomke, dio sličan imunoglobulinu te transmembranski i citoplazmatski
dio (Slika 7). Stabilnu strukturu na membrani stanice molekula HLA razreda I ima u obliku
heterotrimera sastavljenog od dva spomenuta lanca i vezanog peptidnog ulomka. Molekule HLA
razreda I u pukotinu mogu vezati peptide veličine 8-11 aminokiselina. Pukotina je najvažniji dio
molekule izgrađen od 180 aminokiselina stereokemijski podijeljenih u dva dijela: α1 i α2 . Upravo
je polimorfizam gena HLA, odnosno brojni alelni oblici, odgovoran za različitost stereokemijske
površine vezne pukotine, čime se osigurava vezanje velikog broja potencijalnih antigena. Dio
oko vezne pukotine, zajedno sa stranim antigenom, prepoznaje receptor T-limfocita. Treći dio α-
lanca visoko je očuvan i služi kao vezno mjesto za molekulu CD8 citotoksičnih T-limfocita. Iz
navedenog je jasno da molekule HLA razreda I (HLA-A, -B i –C) predočuju antigene CD8+
citotoksičnim T-limfocitima i to mehanizmom tzv. spregnutog prepoznavanja gdje se receptori
T-limfocita moraju određenim afinitetom vezati kako za antigenski ulomak, tako i za dijelove
molekule HLA. Molekule HLA razreda I nalaze se na gotovo svim stanicama s jezgrom i
predočuju prerađene citosolne ili endogene antigene poput virusnih peptida, peptidnih dijelova
drugih unutarstaničnih patogena, razgradnih dijelova mutiranih tumorskih proteina i sl. [2].
10
1.1.4.2. Antigen-predočne molekule HLA razreda II
Molekule HLA razreda II građene su od dva polipeptidna lanca α i β od kojih su oba
kodirana genima HLA. Teški α-lanac kodiraju A geni HLA razreda II (npr. α-lanac molekule
HLA-DP kodira gen DPA1), dok laki β-lanac kodiraju B geni (npr. β-lanac molekule HLA-DP
kodira gen HLA-DPB1). Polimorfizmu molekula HLA razreda II znatno više pridonose geni koji
kodiraju β-lanac zbog većeg broja alela, poglavito najpolimorfniji gen HLA razreda II - HLA-
DRB1. Molekule ovog razreda također se sastoje od četiri osnovna dijela: vanjski dio koji veže
peptidne ulomke, dio sličan imunoglobulinu te transmembranski i citoplazmatski dio (Slika 7).
Kao i u slučaju molekula HLA razreda I, molekule HLA razreda II stabilnu strukturu na
membrani stanice imaju u obliku heterotrimera sastavljenog od dva spomenuta lanca i vezanog
peptidnog ulomka. Veznu pukotinu čine dijelovi lanaca α1 i β1, s naglaskom da su u slučaju ovih
molekula krajevi pukotine otvoreni (za razliku od molekula HLA razreda I) pa se vezani peptidni
dijelovi mogu nalaziti i dijelom izvan pukotine, što u konačnici omogućuje vezanje većih peptida
građenih od 10-30 aminokiselina. Dio β-lanca, točnije β2 domenu molekule HLA razreda II
prepoznaje molekula CD4 pomagačkih T-limfocita. Dakle, u slučaju molekula HLA razreda II
antigeni se predočuju CD4+ pomagačkim T-limfocitima jednakim mehanizmom spregnutog
prepoznavanja. Molekule HLA razreda II predočuju vezikularne ili egzogene antigene mnogih
izvanstaničnih patogena i to nakon procesa fagocitoze. Nalaze se isključivo na fagocitnim
odnosno antigen-predočnim stanicama poput makrofaga, dendritičkih stanica, B-limfocita te
nekih endotelnih i epitelnih stanica [2].
11
Slika 7. Shematski prikaz građe molekula HLA razreda I i razreda II. (Prilagođeno prema [3]).
1.2. Transplantacija krvotvornih matičnih stanica
Postupak transplantacije krvotvornih matičnih stanica (TKMS) uobičajena je metoda
liječenja mnogih malignih bolesti, ali i niza genetskih poremećaja koji rezultiraju patofiziološkim
promjenama u funkciji krvotvornog tkiva. Kod bolesnika sa zloćudnim tumorima krvotvornog
sustava (leukemije i limfomi), TKMS je metoda liječenja koja bolesnicima pruža dobre
mogućnosti za izlječenje i u konačnici preživljenje [9]. Tri su oblika TKMS obzirom na
genetički odnos primatelja i darivatelja: autologna, singenična i alogenična transplantacija.
Autolognom transplantacijom bolesnik prima vlastite matične stanice koje su se
prikupile prije postupka liječenja maligne bolesti te su time ostale neoštećene uslijed primjene
agresivnih metoda liječenja poput kemoterapije. Također, ovaj oblik transplantacije
podrazumijeva i korištenje matičnih stanica iz umbilikalne krvi, ukoliko je pacijentu ista i
pohranjena.
Singenična transplantacija podrazumijeva TKMS od genetički identične jedinke,
dakle jednojajčanog blizanca. Ovim se oblikom transplantacije u potpunosti mogu izbjeći
neželjeni učinci transplantacije koji su posljedica razlika u genetičkoj strukturi primatelja i
darivatelja.
12
Treći oblik TKMS je alogena ili alogenična transplantacija gdje bolesnik prima
krvotvorne matične stanice (KMS) od HLA podudarnog darivatelja. Podudarnost HLA između
primatelja i potencijalnog darivatelja jedan je od ključnih čimbenika za uspješan ishod
transplantacije. Približno 30% bolesnika pronalazi genotipski ili fenotipski HLA podudarnog
darivatelja unutar obitelji (Slika 8a i 8b). U ostalih 70% slučajeva, kada unutar obitelji nema
genotipski HLA, odnosno fenotipski HLA identičnog darivatelja, pristupa se pronalaženju
fenotipski HLA podudarnog nesrodnog darivatelja kroz postupak pretraživanja nacionalnog ili
svjetskog registra dobrovoljnih darivatelja KMS [7]. Prva alogenična TKMS u Hrvatskoj
izvedena je 1983. godine (od srodnog darivatelja), a prva alogenična TKMS od HLA
podudarnog nesrodnog darivatelja izvedena je 1991. godine u KBC-u Zagreb.
OTAC MAJKA
.
BOLESNICA BRAT SESTRA
Slika 8a. Obitelj u kojoj bolesnica ima genotipski HLA identičnog brata.
A*29
B*44
DRB1*10
A*30
B*53
DRB1*13
A*03
B*35
DRB1*04
A*24
B*57
DRB1*11
A*29
B*44
DRB1*10
A*29
B*44
DRB1*10
A*03
B*35
DRB1*04
A*03
B*35
DRB1*04
A*30
B*53
DRB1*13
A*03
B*35
DRB1*04
13
OTAC MAJKA
.
BOLESNIK SESTRA SESTRA
Slika 8b. Obitelj u kojoj bolesnik ima fenotipski HLA identičnog darivatelja (majka).
U postupku određivanja podudarnosti HLA između bolesnika i darivatelja, kriteriji
Europske skupine za TKMS (engl. European Bone Marrow Transplantation – EMBT) i
Američkog nacionalnog programa darivatelja KMS (engl. National Marrow Donor Program –
NMDP) zahtijevaju tipizaciju gena HLA-A, -B, -C i -DRB1 (podudarnost 8/8) odnosno gena
HLA-A, -B, -C, -DRB1 i DQB1 (podudarnost 10/10) na visokoj rezoluciji [9]. Naime, pojam
”visoka rezolucija” podrazumijeva tipizaciju HLA na razini 4 znamenke (npr. HLA-A*02:01,
B*07:02). S druge strane, pojam ”niska rezolucija” podrazumijeva tipizaciju HLA na razini 2
znamenke čime se određuje samo skupina alela (npr. HLA-A*02, B*07).
Alogenična TKMS se kao terapijska metoda primjenjuje zbog djelovanja
transplantata protiv tumora (engl. Graft versus Leukemia Effect - GvL) gdje imunokompetentne
stanice presatka prepoznaju tumorske antigene zloćudnih stanica u sklopu molekula HLA
razreda I čime se aktivira imunološka reakcija citolize zloćudnih stanica posredovana
A*01
B*08
DRB1*03
A*24
B*35
DRB1*04
A*23
B*44
DRB1*07
A*23
B*44
DRB1*07
A*01
B*08
DRB1*03
A*23
B*44
DRB1*07
A*24
B*35
DRB1*04
A*24
B*35
DRB1*04
A*23
B*44
DRB1*07
A*01
B*08
DRB1*03
14
citotoksičnim T-limfocitima. Djelotvorni učinak TKMS na bolest značajno je umanjen
neželjenim učincima, prvenstveno reakcijom presatka protiv primatelja (engl. Graft versus Host
Disease - GvHD) gdje imunokompetentne stanice iz presatka prepoznaju antigene primatelja,
slično kao u efektu GvL. Međutim, u ovom slučaju reakcija nije ograničena isključivo na
zloćudne stanice. Pojava GvDH znatno je manja u slučaju transplantacije od srodnog darivatelja.
Značajno je manja i u slučaju HLA podudarnosti 10/10 između primatelja i darivatelja.
Terapijski uspjeh dugog preživljenja nakon TKMS može se postići u približno 40% bolesnika
koji se liječe ovom terapijskom metodom. Važno je spomenuti da se uspješnost TKMS u
liječenju malignih i drugih bolesti znatno povećala unaprjeđenjem postupka određivanja
podudarnosti HLA (tipizacija na visokoj rezoluciji), ali i povećanjem broja darivatelja u
nacionalnom i svjetskom registru što značajno povećava vjerojatnost pronalaska HLA
podudarnog nesrodnog darivatelja [9].
1.2.1. Registri dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica
Hrvatski registar dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica (engl.
Croatian Bone Marrow Donor Registry – CBMDR) nacionalni je hrvatski registar za liječenje
alogeničnom transplantacijom od nesrodnih darivatelja KMS. Njegova je osnovna zadaća
organizacija i provođenje procesa pretraživanja i pronalaženja HLA podudarnog nesrodnog
darivatelja kako u našem registru tako i u međunarodnim registrima dobrovoljnih darivatelja
KMS [10]. Hrvatski registar osnovan je 1994. godine i sve do 2007. imao je vrlo skroman broj
upisanih dobrovoljnih darivatelja. Naglo širenje započelo je 2008. godine podizanjem javne
svijesti o važnosti postojanja registra s dovoljno velikim brojem darivatelja. Registar je 2008.
godine brojao približno 9000 dobrovoljnih darivatelja KMS, a danas ima gotovo 37000 upisanih
darivatelja (Slika 9) kojima su određeni geni HLA-A, -B i -DRB1. Naš registar je dio Svjetskog
registra dobrovoljnih darivatelja (engl. Bone Marrow Donors Worldwide – BMDW).
15
Slika 9. Rast broja dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica
u hrvatskom registru.
Svjetski registar dobrovoljnih darivatelja KMS (BMDW) osnovan je 1989. godine u
nizozemskom gradu Leidenu. U početku je uključivao osam nacionalnih registara s oko 150000
dobrovoljnih darivatelja. Broj nacionalnih registara i banaka krvi iz pupkovine uključenih u
BMDW rastao je iz godine u godinu (Slika 10). Danas BMDW broji preko 24 milijuna
dobrovoljnih darivatelja s uključena 74 registra iz 53 zemlje te 49 banaka krvi iz pupkovine iz 33
zemlje. Najveći udio u broju dobrovoljnih darivatelja u BMDW-u imaju europske zemlje i SAD
(Slika 11). S druge strane, udio dobrovoljnih darivatelja iz azijskih zemalja, unatoč velikom
broju stanovnika, iznosi samo 14%. Broj dobrovoljnih darivatelja KMS u nacionalnim registrima
europskih zemalja uključenim u rad BMDW-a prikazan je na Slici 12. Treba spomenuti da se
Njemačka ističe kao zemlja s najvećim brojem dobrovoljnih darivatelja u Europi, odnosno ona je
jedina europska zemlja koja ima više od milijun dobrovoljnih darivatelja [20].
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
2008 2009 2010 2011 2012 2013
16
Slika 10. Broj nacionalnih registara dobrovoljnih darivatelja uključenih u rad BMDW-a (engl.
Bone Marrow Donors Worldwide). (Preuzeto s [20]).
Slika 11. Udio broja dobrovoljnih darivatelja u BMDW-u (engl. Bone Marrow Donors
Worldwide) po kontinentima. (Preuzeto s [20]).
17
Slika 12. Broj darivatelja u europskim zemljama čiji su nacionalni registri uključeni u BMDW
(engl. Bone Marrow Donors Worldwide). (Preuzeto s [20]).
18
2.0. Ciljevi istraživanja
1. Analizirati raspodjelu alela HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1 među bolesnicima u
programu TKMS s nesrodnog darivatelja u Hrvatskoj.
2. Istražiti raspodjelu haplotipova HLA-A, -B, -DRB1 među bolesnicima u programu
TKMS s nesrodnog darivatelja.
3. Istražiti raspodjelu haplotipova HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 među bolesnicima u
programu TKMS s nesrodnog darivatelja.
4. Utvrditi prisutnost neuobičajenih haplotipova HLA među bolesnicima
5. Odrediti broj mogućih darivatelja za svakog bolesnika u CBMDR-u.
6. Odrediti broj mogućih darivatelja za svakog bolesnika u BMDW-u.
7. Za bolesnike u programu TKMS iz Hrvatske odrediti „rizične“ alele HLA za
pronalaženje HLA podudarnog darivatelja 10/10.
19
3.0. Materijali i metode
3.1. Ispitanici
Ovo istraživanje obuhvatilo je 150 bolesnika koji su se liječili na Zavodu za
hematologiju, Klinike za internu medicinu, Kliničkog bolničkog centra Zagreb. Svim
ispitanicima je iz uzorka periferne krvi izolirana DNA te se odgovarajućim metodama pristupilo
postupku tipizacije tkiva, odnosno određivanju alela HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1.
3.2. Izolacija DNA
Izolacija DNA iz uzorka periferne krvi izvedena je upotrebom komercijalnog seta za
izolaciju (MagNA Pure LC DNA; Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Germany) prema
uputama koje je naveo proizvođač.
3.3. Metode određivanja alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1
Aleli navedenih lokusa HLA određivali su se metodama PCR-SSO (engl. Polymerase
Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotides) i PCR-SSP (engl. Polymerase Chain
Reaction - Sequence Specific Primers). Metoda PCR-SSO manje je specifična i koristi se za
postupke tipizacije tkiva na tzv. niskoj ili srednjoj rezoluciji. Temelji se na klasičnom
umnožavanju specifičnog dijela DNA pomoću biotinom obilježenih početnica. Umnožena DNA
se zatim hibridizira upotrebom mikrosfera na koje su vezane DNA probe specifične za određene
oligonukleotidne sljedove. DNA probe označene su fluorokromom streptavidin-fikoeritrin (engl.
Streptavidin-Phycoerythrin - SAPE). Kromogena interakcija boje SAPE i biotina događa se
samo u slučaju specifičnog vezanja određene DNA probe za komplementaran slijed nukleotida
na amplifikonima što se očitava kao pozitivna reakcija pomoću Luminex tehnologije (The
Luminex, LABScan™ 100). S obzirom da se svaka mikrosfera sa specifičnim DNA probama
može razlikovati od ostalih (zahvaljujući endogenim bojama), uređaj može s visokom točnošću
odrediti koja se DNA proba vezala odnosno o kojem se alelnom obliku gena HLA radi. Rezultati
ovog postupka analiziraju se u programu Quicktype For Lifecodes (Slika 13).
20
Slika 13. Rezultati analize postupka hibridizacije DNA (metoda PCR-SSO). A) Proba CON je
kontrolna i mora biti pozitivna za sve uzorke. B) Mikrosfera 06 pokazuje pozitivnu reakciju na
uzorku C1. C) Na uzorku C1 mikrosfera 01 negativna.
Sljedeća metoda određivanja alela HLA znatno je osjetljivija i koristi se za postupke
tipizacije tkiva na visokoj rezoluciji. Radi se o metodi PCR-SSP koja se temelji na umnožavanju
specifičnog slijeda DNA upotrebom početnica specifičnih za jedan ili više alela HLA. Početnice
se vežu samo za one sljedove DNA kojima su u potpunosti komplementarne, stoga nastali
amplifikoni predstavljaju specifično umnožene alele pojedinog lokusa HLA. Nakon PCR
reakcije, uzorci umnožene DNA nanose se na agarozni gel u kombinaciji s bojom te se
primjenjuje tehnika elektroforetskog razdvajanja DNA na temelju veličine njezinih fragmenata
(Slika 14).
21
Slika 14. Prikaz rezultata tipizacije HLA metodom PCR-SSP. Uzorci 1, 3, 5, 7 i 8 predstavljaju
pozitivne reakcije sa specifično umnoženim PCR produktom dok su reakcije 2, 4 i 6 negativne
(vidljiva je samo kontrolna DNA).
3.4. Statistička analiza rezultata
Učestalosti alela i haplotipova HLA među našim bolesnicima određene su metodom
izravnog brojanja. Razlike u raspodjeli alela i haplotipova HLA između naše skupine bolesnika i
zdrave populacije kao i razlike u raspodjeli alela i haplotipova HLA u odnosu na druge
populacije u Europi utvrđene su upotrebom χ2
testa. Razina statističke značajnosti, odnosno P
vrijednost ispravljena je za svaki lokus HLA s obzirom na broj uočenih alela pojedinog lokusa
HLA. Podaci o učestalosti haplotipova među bijelcima europskog porijekla utvrđeni su pomoću
programa HaploStats [21].
22
4.0. Rezultati
4.1. Učestalost alela HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1 među bolesnicima u programu
nesrodne TKMS
Učestalost alela lokusa HLA-A kod 150 bolesnika uključenih u istraživanje prikazana je
u Tablici 2. Ukupan broj otkrivenih alela HLA-A bio je 24. Najčešći aleli HLA-A kod
navedenih ispitanika bili su: A*02:01, A*01:01, A*24:02, A*03:01, A*11:01 i A*26:01. Devet
alela: A*02:05, A*03:02, A*24:03, A*24:07, A*29:01, A*30:01, A*30:04, A*66:01, A*69:01 i
A*80:01 pojavili su se samo jednom među našim bolesnicima.
Tablica 2. Učestalost alela HLA-A među bolesnicima u programu nesrodne TKMS (N=150)
n - broj uočenih alela HLA; % - učestalost alela
Alel HLA-A* n % Alel HLA-A* n %
01:01 41 0,1367 26:01 15 0,0500
02:01 83 0,2767 29:01 1 0,0033
02:02 2 0,0067 29:02 3 0,0100
02:05 1 0,0033 30:01 1 0,0033
03:01 37 0,1233 30:04 1 0,0033
03:02 1 0,0033 31:01 6 0,0200
11:01 15 0,0500 32:01 13 0,0433
23:01 9 0,0300 33:01 5 0,0167
24:02 38 0,1267 66:01 1 0,0033
24:03 1 0,0033 68:01 13 0,0433
24:07 1 0,0033 69:01 1 0,0033
25:01 10 0,0333 80:01 1 0,0033
23
Analiza raspodjele alela HLA-B unutar ispitivane skupine prikazana je u Tablici 3. S
obzirom da je gen HLA-B najpolimorfniji gen HLA, 35 otkrivenih alela je u skladu s
očekivanjima. Najčešći alel ovog lokusa bio je B*51:01 s učestalošću od 13,0%, a još su samo
dva alela (B*18:01 i B*08:01) bila zastupljena s učestalošću većom od 10,0%. Aleli HLA-B s
najmanjom zastupljenošću bili su: B*07:04, B*07:05, B*14:01, B*41:01, B*45:01, B*50:01 i
B*53:01.
Tablica 3. Učestalost alela HLA-B kod bolesnika u programu nesrodne TKMS (N=150)
n - broj uočenih alela; % - učestalost alela
Alel HLA-B* n % Alel HLA-B* n %
07:02 22 0,0733 40:02 6 0,0200
07:04 1 0,0033 41:01 1 0,0033
07:05 1 0,0033 41:02 4 0,0133
08:01 31 0,1033 44:02 12 0,0400
13:02 6 0,0200 44:03 6 0,0200
14:01 1 0,0033 44:05 3 0,0100
14:02 6 0,0200 44:27 5 0,0167
15:01 6 0,0200 45:01 1 0,0033
18:01 33 0,1100 49:01 8 0,0267
27:02 9 0,0300 50:01 1 0,0033
27:05 12 0,0400 51:01 39 0,1300
35:01 21 0,0700 52:01 8 0,0267
35:02 2 0,0067 53:01 1 0,0033
35:03 13 0,0433 55:01 3 0,0100
35:08 3 0,0100 56:01 3 0,0100
38:01 9 0,0300 57:01 10 0,0333
39:01 8 0,0267 58:01 3 0,0100
40:01 2 0,0067
24
U Tablici 4 prikazana je učestalost alela HLA-C među nesrodnim bolesnicima
uključenim u ovo istraživanje. Ukupno je pronađen 21 različiti alel HLA-C, od kojih je najveću
učestalost pokazao alel C*07:01 (20,3%), slijedio ga je alel C*04:01 (14,7%) te aleli C*02:02
(9,7%), C*12:03 (9,3%) i C*07:02 (8,0%). Najmanje zastupljeni aleli HLA-C bili su C*07:18,
C*16:02 i C*17:01 s učestalošću od svega 0,3%.
Tablica 4. Učestalost alela HLA-C među bolesnicima u programu nesrodne TKMS (N=150)
Alel HLA-C* n %
01:02 13 0,0433
02:02 29 0,0967
03:02 2 0,0067
03:03 7 0,0233
03:04 2 0,0067
04:01 44 0,1467
05:01 11 0,0367
06:02 20 0,0667
07:01 61 0,2033
07:02 24 0,0800
07:04 5 0,0167
07:18 1 0,0033
08:02 7 0,0233
12:02 9 0,0300
12:03 28 0,0933
14:02 13 0,0433
15:02 16 0,0533
16:01 2 0,0067
16:02 1 0,0033
17:01 1 0,0033
17:03 4 0,0133
n - broj uočenih alela; % - učestalost alela
25
Analiza raspodjele alela HLA-DRB1 unutar ispitivane skupine prikazana je u Tablici
5. U ovom je istraživanju utvrđeno 30 različitih alela HLA-DRB1. Tri alela: DRB1*03:01
(15,3%), DRB1*01:01 (11,7%) i DRB1*11:04 (10,7%) bila su najčešća, dok su preostali
otkriveni aleli DRB1 bili zastupljeni s učestalošću manjom od 10,0%. Najraznovrsniji gen DRB1
u ovom istraživanju bio je DRB1*04 sa sedam različitih alela (DRB1*04:01, DRB1*04:02,
DRB1*04:03, DRB1*04:04, DRB1*04:07, DRB1*04:08 i DRB1*04:15). Najmanje zastupljeni
aleli HLA-DRB1 bili su: DRB1*01:03, DRB1*04:03, DRB1*04:07, DRB1*04:15,
DRB1*11:02, DRB1*11:03, DRB1*11:15, DRB1*11:28 i DRB1*16:02.
Tablica 5. Učestalost alela HLA-DRB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS(N=150)
Alel HLA-DRB1* n % Alel HLA-DRB1* n %
01:01 35 0,1167 11:02 1 0,0033
01:02 2 0,0067 11:03 1 0,0033
01:03 1 0,0033 11:04 32 0,1067
03:01 46 0,1533 11:15 1 0,0033
04:01 5 0,0167 11:28 1 0,0033
04:02 3 0,0100 12:01 4 0,0133
04:03 3 0,0100 13:01 14 0,0467
04:04 5 0,0167 13:02 11 0,0367
04:07 1 0,0033 13:03 5 0,0167
04:08 2 0,0067 14:01 3 0,0100
04:15 1 0,0033 14:54 4 0,0133
07:01 29 0,0967 15:01 25 0,0833
08:01 4 0,0133 15:02 7 0,0233
10:01 4 0,0133 16:01 25 0,0833
11:01 24 0,0800 16:02 1 0,0033
n – broj uočenih alela; % - učestalost alela
26
Učestalost alela lokusa HLA-DQB1 kod 150 tipiziranih bolesnika uključenih u
istraživanje prikazane su u Tablici 6. Ukupno 16 različitih alela HLA-DQB1 lokusa otkriveno je
unutar ove skupine bolesnika. Najučestalijih 5 alela DQB1 bili su: DQB1*03:01 (23,3%),
DQB1*02:01 (15,3%), DQB1*05:01 (14,0%), DQB1*05:02 (9,0%) i DQB1*06:02 (8,3%).
Najmanje zastupljeni aleli bili su DQB1*03:04 i DQB1*03:19, s učestalošću od svega 0,3%, dok
je alel DQB1*06:09 bio prisutan dvaput.
Tablica 6. Učestalost alela HLA-DQB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS(N=150)
n – broj uočenih alela; % - učestalost alela
Alel HLA-DQB1* n %
02:01 46 0,1533
02:02 20 0,0667
03:01 70 0,2333
03:02 17 0,0567
03:03 10 0,0333
03:04 1 0,0033
03:19 1 0,0033
04:02 3 0,0100
05:01 42 0,1400
05:02 27 0,0900
05:03 7 0,0233
06:01 7 0,0233
06:02 25 0,0833
06:03 14 0,0467
06:04 8 0,0267
06:09 2 0,0067
27
4.2. Raspodjela haplotipova HLA-A-B-DRB1 kod bolesnika u programu nesrodne TKMS
U Tablici 7 prikazana je raspodjela 30 najčešćih haplotipova HLA-A-B-DRB1
uočenih unutar skupine bolesnika uključenih u program nesrodne TKMS. Ukupan broj utvrđenih
haplotipova HLA-A-B-DRB1 bio je 227, dakle 197 haplotipova HLA-A-B-DRB1 pojavilo se
samo jednom. Iz Tablice 7 vidljivo je da su samo četiri haplotipa HLA-A-B-DRB1 bila prisutna
više od pet puta. Najučestaliji haplotip bio je HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7,3%) kojeg
je imalo čak 22 bolesnika.
Tablica 7. Prikaz najučestalijih haplotipova HLA-A-B-DRB1 unutar skupine bolesnika u
programu TKMS (N=150)
HLA-A*-B*-DRB1* n % HLA-A*-B*-DRB1* n %
01:01-08:01-03:01 22 0,0733 02:01-35:01-13:01 2 0,0067
02:01-18:01-11:04 8 0,0267 02:01-41:02-13:03 2 0,0067
02:01-51:01-01:01 7 0,0233 02:01-44:02-15:01 2 0,0067
01:01-57:01-07:01 6 0,0200 02:01-44:03-07:01 2 0,0067
01:01-52:01-15:02 4 0,0133 02:01-44:27-16:01 2 0,0067
03:01-18:01-11:04 4 0,0133 02:01-51:01-11:01 2 0,0067
02:01-27:05-01:01 3 0,0100 03:01-07:02-11:01 2 0,0067
02:01-51:01-16:01 3 0,0100 03:01-07:02-13:02 2 0,0067
11:01-35:01-01:01 3 0,0100 03:01-07:02-15:01 2 0,0067
24:02-51:01-01:01 3 0,0100 03:01-35:01-11:04 2 0,0067
01:01-51:01-15:01 2 0,0067 03:01-51:01-01:01 2 0,0067
02:01-07:02-15:01 2 0,0067 24:02-07:02-15:01 2 0,0067
02:01-08:01-03:01 2 0,0067 24:02-57:01-07:01 2 0,0067
02:01-15:01-11:04 2 0,0067 26:01-13:02-07:01 2 0,0067
02:01-27:02-16:01 2 0,0067 68:01-58:01-13:02 2 0,0067
n – broj haplotipova; % - učestalost haplotipova
28
4.3. Raspodjela haplotipova HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 kod bolesnika u program nesrodne
TKMS
Tablica 8 prikazuje 10 HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 haplotipova uočenih dva ili više puta
među našim bolesnicima. Učestalost visoko očuvanog haplotipa HLA-A*01:01-B*08:01-
C*07:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01 ostala je nepromijenjena u usporedbi s Tablicom 7 gdje su
promatrani haplotipovi HLA-A-B-DRB1. Učestalost ostalih haplotipova HLA promijenila se
neznatno, što jasno govori o snažnoj neravnoteži udruživanja između pojedinih alela HLA zbog
koje se, čak i u slučaju proširenja promatranog haplotipa HLA s dva dodatna lokusa, učestalost
haplotipova HLA ne mijenja značajno.
Važno je spomenuti da su haplotipovi 150 bolesnika uključenih u ovo istraživanje
utvrđeni na temelju podataka o tipizaciji članova uže obitelji, primjenom Mendelovih zakona
nasljeđivanja odnosno segregacije (tzv. segregacijska analiza).
Tablica 8. Prikaz deset najučestalijih haplotipova HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 kod bolesnika
uključenih u program nesrodne TKMS
HLA-A*-B*-C*-DRB1*-DQB1* n %
01:01-08:01-07:01-03:01-02:01 22 0,0733
02:01-18:01-07:01-11:04-03:01 7 0,0233
02:01-51:01-14:02-01:01-05:01 5 0,0166
01:01-57:01-06:02-07:01-03:03 5 0,0166
01:01-52:01-12:02-15:02-06:01 4 0,0133
03:01-18:01-07:01-11:04-03:01 4 0,0133
11:01-35:01-04:01-01:01-05:01 3 0,0100
02:01-27:05-02:02-01:01-05:01 2 0,0066
02:01-51:01-14:02-16:01-05:02 2 0,0066
24:02-51:01-14:02-01:01-05:01 2 0,0066
n – broj uočenih haplotipova; % - učestalost haplotipova
29
Tablica 9 prikazuje haplotipove HLA unutar naše skupine bolesnika s neuobičajenim
kombinacijama alela HLA-B-C, odnosno HLA-DRB1-DQB1. Kod 15 bolesnika (10%) uočena je
neuobičajena kombinacija alela na lokusima HLA-B i -C, od toga kombinacija B*35:03-C*12:03
kod čak tri bolesnika. Neuobičajene kombinacije alela DRB1 i DQB1 uočili smo u haplotipu kod
četiri bolesnika (2,7%)
Tablica 9. Prikaz neuobičajenih kombinacija alela HLA-B-C i HLA-DRB1-DQB1 kod
bolesnika u programu nesrodne TKMS
Haplotip
HLA-A* HLA-B* HLA-C* HLA-DRB1* HLA-DQB1*
02:01 15:01 02:02 07:01 02:02
01:01 18:01 07:18 03:01 02:01
02:01 18:01 03:02 11:04 03:01
24:02 35:01 14:02 03:01 02:01
11:01 35:03 12:03 04:08 03:04
24:02 35:03 12:03 07:01 03:03
26:01 35:03 12:03 07:01 02:02
26:01 35:08 12:03 04:04 03:01
23:01 44:02 04:01 07:01 02:02
24:02 44:02 04:01 13:01 06:03
02:02 49:01 04:01 03:01 02:01
02:01 51:01 06:02 11:01 03:01
03:01 51:01 12:02 01:01 05:01
03:01 51:01 16:01 11:02 03:19
31:01 51:01 05:01 13:01 06:03
29:01 07:05 15:02 11:04 02:02
03:01 39:01 12:03 12:01 02:02
24:02 49:01 07:01 13:02 06:02
02:01 44:05 02:02 15:01 05:02
neuobičajene kombinacije alela HLA-B-C
neuobičajene kombinacije alela HLA-DRB1-DQB1
30
4.4. Broj mogućih nesrodnih darivatelja u nacionalnom i svjetskom registru za bolesnike u
programu nesrodne TKMS
U Tablici 10 prikazane su tipizacije HLA-A, -B, -DRB1 bolesnika u programu nesrodne
TKMS za koje je pronađeno pet ili više mogućih darivatelja u CBMDR-u. Pri tome se radi o
darivateljima koji su s bolesnikom HLA podudarni 6/6 i to na niskoj rezoluciji.
Tablica 10. Bolesnici koji su u hrvatskom registru imali pet ili više mogućih darivatelja
(HLA podudarnost 6/6).
n – broj mogućih darivatelja u hrvatskom registru
Bolesnik
Tipizacija
n HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1*
B50 01:01 01:01 08:01 08:01 03:01 03:01 107
B1 01:01 02:01 08:01 18:01 03:01 11:01 74
B2 11:01 01:01 35:01 08:01 01:01 03:01 47
B3 01:01 23:01 08:01 44:03 03:01 07:01 31
B4 01:01 24:02 08:01 55:01 03:01 10:01 10
B5 02:01 03:01 18:01 51:01 11:04 11:28 8
B6 25:01 02:01 18:01 44:27 16:01 15:01 8
B7 01:01 26:01 08:01 51:01 03:01 11:04 7
B8 01:01 24:02 08:01 51:01 03:01 13:01 6
B9 02:01 03:01 51:01 07:02 11:01 13:02 6
B10 02:01 03:01 35:01 51:01 08:01 01:01 5
B11 25:01 02:01 18:01 35:03 15:01 11:04 5
B12 01:01 25:01 08:01 40:02 03:01 11:01 5
B13 01:01 11:01 08:01 27:05 03:01 01:01 5
B14 01:01 02:01 08:01 39:01 03:01 12:01 5
B15 02:01 68:01 27:05 39:01 01:01 16:01 5
B16 24:07 03:01 35:01 18:01 01:01 11:04 5
31
Najveći broj HLA podudarnih nesrodnih darivatelja pronađeno je za one bolesnike koji su bili
homozigoti ili su barem na jednom kromosomu 6 imali visoko očuvani haplotip HLA-A*01:01-
B*08:01-DRB1*03:01.
Iz rezultata prikazanih u Tablici 11 vidljivo je da su za 13 bolesnika pronađena 2-4 moguća
darivatelja s HLA podudarnošću 6/6 (niska rezolucija) u hrvatskom registru.
Tablica 11. Bolesnici koji su u hrvatskom registru imali 2-4 moguća darivatelja
(HLA podudarnost 6/6).
n – broj mogućih darivatelja u hrvatskom registru
Bolesnik
Tipizacija
n HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1* n
B17 03:01 02:01 07:02 52:01 13:02 15:02 4
B18 32:01 03:01 07:02 51:01 15:01 01:01 3
B19 24:02 23:01 35:02 49:01 11:01 04:15 3
B20 01:01 02:01 52:01 27:02 15:02 16:01 3
B21 02:01 01:01 44:27 57:01 16:01 07:01 3
B22 03:01 02:01 18:01 07:02 01:01 14:54 2
B23 01:01 02:01 52:01 18:01 15:02 11:04 2
B24 03:01 24:02 35:01 51:01 11:04 01:01 2
B25 01:01 26:01 49:01 38:01 04:04 13:01 2
B26 32:01 03:01 07:02 35:01 04:01 16:01 2
B27 29:02 02:01 44:03 18:01 07:01 11:04 2
B28 25:01 26:01 18:01 38:01 14:01 04:04 2
B29 11:01 24:02 35:01 27:02 01:01 16:01 2
32
Za ukupno 20 bolesnika pronađen je samo jedan mogući darivatelj HLA podudarnosti 6/6 (niska
rezolucija) u hrvatskom registru što je vidljivo iz Tablice 12.
Tablica 12. Bolesnici koji su u hrvatskom registru imali jednog mogućeg darivatelja
(HLA podudarnost 6/6)
n – broj mogućih darivatelja u hrvatskom registru
Bolesnik
Tipizacija
N HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1* n
B30 02:01 32:01 51:01 35:01 01:01 16:01 1
B31 02:01 24:02 51:01 57:01 16:01 07:01 1
B32 01:01 26:01 08:01 57:01 03:01 11:01 1
B33 33:01 24:02 14:02 44:05 01:02 11:04 1
B34 02:01 11:01 35:01 35:03 13:02 01:03 1
B35 23:01 24:02 44:02 07:02 07:01 15:01 1
B36 01:01 11:01 57:01 35:01 07:01 16:01 1
B37 02:01 26:01 07:02 38:01 04:02 14:54 1
B38 11:01 02:01 18:01 51:01 11:04 13:01 1
B39 02:01 03:01 44:03 39:01 07:01 12:01 1
B40 02:01 26:01 35:08 38:01 16:01 04:02 1
B41 03:01 02:01 07:02 15:01 01:01 07:01 1
B42 02:01 26:01 27:02 38:01 07:01 04:01 1
B43 24:02 23:01 44:02 55:01 13:01 07:01 1
B44 24:02 02:01 40:01 44:03 15:01 07:01 1
B45 01:01 24:02 57:01 51:01 07:01 11:01 1
B46 02:01 03:01 44:05 18:01 15:01 11:04 1
B47 02:01 68:01 07:02 27:02 15:01 16:01 1
B48 01:01 24:02 57:01 35:03 07:01 07:01 1
B49 33:01 24:02 14:02 40:02 01:01 11:01 1
33
Na temelju podataka prikazanih u Tablicama 10, 11 i 12 vidljivo je da je 50 bolesnika
imalo mogućeg darivatelja s HLA podudarnošću 6/6 (niska rezolucija) u CBMDR-u. Preostalih
100 bolesnika nije imalo niti jednog mogućeg darivatelja u našem registru i za njih je trebalo
tražiti darivatelja u BMDW-u.
S obzirom da BMDW obuhvaća podatke velikog broja registara dobrovoljnih darivatelja,
a koji su tipizirani na različitoj rezoluciji, napravili smo dvije različite analize. Naime, pojedini
registri tipiziraju svoje darivatelje na niskoj rezoluciji za lokuse HLA-A, -B i -DRB1, dok drugi
registri tipizaciju svojih darivatelja rade na srednjoj i visokoj rezoluciji za 4 ili 5 lokusa (HLA-A,
-B, -C, -DRB1 i -DQB1). S druge strane, postoji i određeni broj darivatelja tipiziranih serološkim
metodama. Rezultati pretraživanja BMDW-a za naše bolesnike prikazani su u Tablici 13. Za
ukupno 18 bolesnika pronađeno je deset ili više mogućih darivatelja (HLA podudarnost 10/10) u
BMDW-u.
34
Tablica 13. Prikaz bolesnika s deset ili više mogućih darivatelja u svjetskom registru
(HLA podudarnost 10/10).
Bolesnik
Tipizacija n HLA-A* HLA-B* HLA-C* HLA-DRB1* HLA-DQB1*
B50 01:01 01:01 08:01 08:01 07:01 07:01 03:01 03:01 02:01 02:01 1161
B3 01:01 23:01 08:01 44:03 07:01 04:01 03:01 07:01 02:01 02:02 356
B2 11:01 01:01 35:01 08:01 04:01 07:01 01:01 03:01 05:01 02:01 237
B51 01:01 02:01 08:01 52:01 07:01 12:02 03:01 15:02 02:01 06:01 93
B1 01:01 02:01 08:01 18:01 07:01 07:01 03:01 11:01 02:01 03:01 51
B52 02:01 03:01 07:02 44:02 07:02 05:01 07:01 04:01 02:02 03:01 40
B27 29:02 02:01 44:03 18:01 16:01 07:01 07:01 11:04 02:02 03:01 34
B53 01:01 02:01 08:01 14:01 07:01 08:02 03:01 07:01 02:01 02:02 33
B54 01:01 02:01 08:01 51:01 07:01 01:02 03:01 11:01 02:01 03:01 22
B10 02:01 03:01 35:01 51:01 04:01 14:02 08:01 01:01 04:02 05:01 20
B13 01:01 11:01 08:01 27:05 07:01 02:02 03:01 01:01 02:01 05:01 14
B55 03:01 02:01 07:02 38:01 07:02 12:03 15:01 11:04 06:02 03:01 13
B56 24:02 02:01 51:01 07:02 14:02 07:02 01:01 15:01 05:01 06:02 13
B57 01:01 24:02 57:01 51:01 06:02 15:02 07:01 11:01 03:03 03:01 12
B23 01:01 02:01 52:01 18:01 12:02 07:01 15:02 11:04 06:01 03:01 12
B12 01:01 25:01 08:01 40:02 07:01 02:02 03:01 11:01 02:01 03:01 12
B58 24:02 01:01 18:01 57:01 07:01 06:02 11:04 07:01 03:01 03:03 11
B8 01:01 24:02 08:01 51:01 07:01 14:02 03:01 13:01 02:01 06:03 10
n – broj mogućih darivatelja u svjetskom registru
35
Usporedba broja nesrodnih darivatelja podudarnih s bolesnikom na 3 lokusa HLA (HLA
podudarnost 6/6) u CBMDR-a i BMDW-a prikazana je u Tablici 14. Najveći broj darivatelja
pronađenih u oba registra imaju oni bolesnici kod kojih je utvrđeno prisustvo haplotipa: HLA-
A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01.
Tablica 14. Usporedba broja darivatelja u CBMDR-u HLA podudarnosti 6/6 i broja
mogućih darivatelja u BMDW-u
n1 – broj darivatelja u hrvatskom registru; n
2 – broj mogućih darivatelja u svjetskom registru
Bolesnik Tipizacija
n1
n2 HLA-A* HLA-B* HLA-C*
B50 01:01 02:01 08:01 18:01 03:01 11:01 107 46369
B1 01:01 02:01 08:01 18:01 03:01 11:01 74 3505
B2 11:01 01:01 35:01 08:01 01:01 03:01 47 9439
B3 01:01 23:01 08:01 44:03 03:01 07:01 31 11021
B4 01:01 24:02 08:01 55:01 03:01 10:01 10 26
B5 02:01 03:01 18:01 51:01 11:04 11:28 8 198
B6 25:01 02:01 18:01 44:27 16:01 15:01 8 390
B7 01:01 26:01 08:01 51:01 03:01 11:04 7 210
B8 01:01 24:02 08:01 51:01 03:01 13:01 6 515
B9 02:01 03:01 51:01 07:02 11:01 13:02 6 241
B10 02:01 03:01 35:01 51:01 08:01 01:01 5 771
B11 25:01 02:01 18:01 35:03 15:01 11:04 5 124
B12 01:01 25:01 08:01 40:02 03:01 11:01 5 141
B13 01:01 11:01 08:01 27:05 03:01 01:01 5 956
B14 01:01 02:01 08:01 39:01 03:01 12:01 5 290
B15 02:01 68:01 27:05 39:01 01:01 16:01 5 25
B16 24:07 03:01 35:01 18:01 01:01 11:04 5 574
36
5.0. Rasprava
Alogenična TKMS je metoda liječenja mnogih malignih bolesti i genetskih poremećaja
krvotvornog sustava. Ukoliko unutar obitelji nema HLA podudarnog darivatelja, a procijenjeno
je da bolesnik zadovoljava sve uvjete za primjenom ove terapijske metode, pristupa se potrazi za
fenotipski HLA podudarnim nesrodnim darivateljem. Kao što je u radu navedeno, približno 2/3
bolesnika unutar obitelji nema HLA podudarnog darivatelja što jasno pokazuje kolika je važnost
nesrodne TKMS. Upravo činjenica da se u tolikom postotku slučajeva pristupa potrazi za
nesrodnim darivateljem ukazuje na veliku potrebu za stvaranjem i razvojem nacionalnih registara
dobrovoljnih darivatelja KMS te njihovim uključivanjem u BMDW [11]. Pronalazak HLA
podudarnog darivatelja za 5 lokusa HLA (HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DQB1) znatno otežava
činjenica da se radi o najpolimorfnijim genima kod čovjeka.
Osim uključivanja što većeg broja dobrovoljnih darivatelja u nacionalni i svjetski
registar, pronalasku HLA podudarnog nesrodnog darivatelja pridonose i analize raspodjele alela
i haplotipova HLA unutar pojedine populacije [11]. Cilj ovog rada bio je analizirati upravo
raspodjelu alela i haplotipova HLA kod skupine od 150 bolesnika uključenih u program
nesrodne TKMS u Hrvatskoj te odrediti koji su to neuobičajeni aleli ili haplotipovi HLA koji
otežavaju pronalazak HLA podudarnog nesrodnog darivatelja.
Raspodjela alela HLA-A među bolesnicima nije pokazala statistički značajna odstupanja
od raspodjele u zdravoj populaciji, odnosno bila je u skladu s istraživanjem provedenim 2014. na
uzorku od 4000 dobrovoljnih darivatelja iz CBMDR-a [12]. Međutim, među našim bolesnicima
jedan bolesnik imao je alel A*29:01 koji nije uočen među dobrovoljnim darivateljima u
prethodnom istraživanju [12]. Riječ je o alelu koji je rijedak među bijelcima i češće se pojavljuje
u pojedinim populacijama u Aziji i Africi [13]. Na lokusu HLA-B kod naših bolesnika nije
otkriven niti jedan novi alel u odnosu na istraživanje iz 2014. godine [12]. S druge strane, na
lokusu HLA-DRB1 među našom skupinom bolesnika uočena su dva alela koja nisu bili
otkrivena među dobrovoljnim darivateljima u već spomenutom istraživanju [12]. Naime, jedan je
bolesnik imao alel HLA-DRB1*11:15, a drugi alel HLA-DRB1*11:28. Trenutačno nema velikog
broja podataka o učestalosti spomenutih alela u svijetu, ali je svakako poznato (prema
rezultatima brojnih populacijskih istraživanja) da su aleli DRB1*11:15 i DRB1*11:28 relativno
rijetki, kako u hrvatskoj populaciji tako i u ostalim populacijama u Europi.
37
Usporedba učestalosti alela HLA među našim ispitanicima s rezultatima istraživanja
provedenima proteklih godina u Europi pokazala je statistički značajna odstupanja za alele:
B*27:02, B*40:02 i DRB1*11:04 koji su učestaliji u našoj populaciji (bolesničkoj i zdravoj),
nego u pojedinim populacijama na sjeveru i zapadu Europe [12, 14, 15, 22]. Naime, alel B*27:05
je puno češći, u usporedbi s alelom B*27:02, u populacijama središnje i zapadne Europe. S druge
strane, u hrvatskoj populaciji razlika u učestalosti između dva spomenuta alela znatno je manje
izražena. To je potvrđeno i ovim istraživanjem. Kod 12 od 21 (57,1%) HLA B*27 pozitivnog
bolesnika uočen je alel 27:05, dok je kod preostalih devet bolesnika (42,9%) uočen alel 27:02.
Slični su rezultati dobiveni i istraživanjem provedenim 2014. godine na 4000 dobrovoljnih
darivatelja [12]. Učestalost alela B*27:02 (3%) u skladu je s njegovom učestalošću kod
populacija na području jugoistočne Europe [12].
Nadalje, ovim je istraživanjem potvrđena znatno veća učestalost alela B*40:02 (2%) u
odnosu na alel B*40:01 (0,7%) među našim bolesnicima što je u skladu s učestalošću tog alela
među zdravim osobama. Taj rezultat statistički značajno odstupa od rezultata drugih
populacijskih istraživanja gdje je uočena veća učestalost alela B*40:01 u odnosu na alel B*40:02
kod mnogih europskih populacija (Austrijanci, Belgijci, Britanci, Česi, Nijemci, Poljaci,
Rumunji, Talijani) [14, 15].
Usporedba alela DRB1*11:01 i DRB1*11:04 pokazala je da su oba prisutna među našim
ispitanicima sa sličnom učestalošću (Tablica 5). Takav rezultat u skladu je s prethodnim
istraživanjem provedenim među dobrovoljnim darivateljima u Hrvatskoj [12]. Statistički
značajna razlika uočena je usporedbom učestalosti alela DRB1*11:04 među našim ispitanicima s
rezultatima istraživanja provedenim među populacijama središnje i sjeverne Europe (Austrijanci,
Belgijanci, Česi, Nijemci, Nizozemci, Poljaci) te podataka iz AFND (engl. Allele Frequency Net
Database) koji jasno pokazuju da je u spomenutim populacijama češći alel DRB1*11:01.
Analizom rezultata o učestalosti haplotipova HLA-A-B-DRB1 u ispitivanoj skupini
uočeno je da su dva najučestalija haplotipa HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 i A*02:01-
B*18:01-DRB1*11:04 što je u skladu s rezultatima ostalih istraživanja gdje su dva navedena
haplotipa također najčešća među zdravim ispitanicima u hrvatskoj populaciji [12]. Haplotip
HLA-A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 jedan je od najčešćih haplotipova u svim europskim
populacijama (do sada referiranim), dok učestalost haplotipa HLA-A*02:01-B*18:01-
DRB1*11:04 pokazuje regionalne razlike. Naime, puno je češći na jugu u odnosu na sjever
38
Europe. Pretpostavka je da se alel DRB1*11:04 (a time i navedeni haplotip) širio iz Male Azije
prema Europi, iz čega proizlaze i opisane regionalne razlike. Najučestaliji haplotip HLA-A-B-C-
DRB1-DQB1 među našim ispitanicima je A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-
DQB1*02:01, prisutan kod 22 bolesnika (7,3%) Riječ je o visoko očuvanom haplotipu.
Kod 19 bolesnika uočene su neuobičajene kombinacije alela HLA-B-C, odnosno HLA-
DRB1-DQB1. Od toga je kod 15 bolesnika uočena neuobičajena kombinacija alela HLA-B-C, a
kod četiri bolesnika neuobičajena kombinacija alela HLA-DRB1-DQB1. Neuobičajena
kombinacija skupine alela B*35 (B*35:03 i B*35:08) s alelom C*12:03 uočena je kod četiri
bolesnika što je iznenađujući rezultat s obzirom da su aleli skupine B*35 u jakoj neravnoteži
udruživanja s alelom C*04:01.
Alel B*51:01, za razliku od alela skupine B*35, ne pokazuje tako snažnu neravnotežu
udruživanja niti s jednim alelom na lokusu HLA-C. U našoj populaciji najčešće dolazi u
kombinaciji s alelima: *C-01:02, C*02:02, C*14:02, C*15:02, C*16:02 od kojih najviše s alelom
C*14:02 i C*15:02. Iz tog su razloga haplotipovi s alelom B*51:01 (Tablica 9) neuobičajeni i
predstavljaju problem u pronalaženju 10/10 HLA podudarnog nesrodnog darivatelja. Rezultati
ovog istraživanja u skladu s istraživanjem provedenim među švicarskim bolesnicima u kojem su
autori došli do sličnih zaključaka [16].
Haplotip B*44:02-C*04:01, uočen kod dva bolesnika, također predstavlja rizičan
čimbenik u pronalaženju HLA podudarnog darivatelja jer alel B*44:02 najčešće dolazi u
kombinaciji s alelom C*05:01 (>70% slučajeva) dok se alel C*04:01 pojavljuje češće u
kombinaciji s alelom B*44:03 [17].
Analiza broja darivatelja s obzirom na genotip HLA pokazala je da je najveći broj
darivatelja imao bolesnik „B50” koji je bio homozigot za visoko očuvani haplotip: HLA-
A*01:01-B*08:01-C*07:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01. To je bilo i za očekivati s obzirom na
rasprostranjenost tog haplotipa u svijetu. Potrebno je istaknuti da za 75 bolesnika, u trenutku
pretraživanja BMDW-a, nije bilo niti jednog darivatelja koji je bio HLA podudaran s bolesnikom
za alele lokusa HLA-A, -B i –DRB1 na visokoj rezoluciji. Međutim, unutar ove skupine
bolesnika, za njih 69 postojala je mogućnost da će pronaći darivatelja podudarnog za alele HLA-
A, -B i -DRB1. Za 6 bolesnika (Tablica 15), u trenutku pretraživanja CBMDR-a i BMDW-a,
nije postojala mogućnost da će pronaći HLA podudarnog darivatelja 6/6, a time ni 10/10 (visoka
rezolucija). Riječ je o bolesnicima koji imaju ili neki rijetki alel (npr. bolesnik B62 ima rijetki
39
alel na lokusu HLA-A - alel A*69:01; bolesnik B60 alel A*30:04; bolesnik B64 alel A*80:01) ili
imaju neuobičajene haplotipove HLA-A-B-DRB1 (preostala trojica bolesnika).
Tablica 15. Prikaz HLA tipizacije bolesnika kojima nije pronađen niti jedan mogući
darivatelj u svjetskom registru (HLA podudarnost 6/6).
Bolesnik Tipizacija
HLA-A* HLA-B* HLA-DRB1*
B59 25:01 02:01 18:01 49:01 11:01 12:01
B60 30:04 30:01 13:02 08:01 07:01 07:01
B61 26:01 31:01 07:02 51:01 13:01 13:01
B62 26:01 69:01 35:08 51:01 04:04 04:07
B63 31:01 24:02 51:01 50:01 04:08 03:01
B64 01:01 80:01 18:01 58:01 03:01 03:01
40
6.0. Zaključak
1. Raspodjela alela na lokusima HLA-A, -B, -C, -DRB1 i -DQB1 unutar ispitivane skupine
bolesnika u programu TKMS s nesrodnog darivatelja u Hrvatskoj nije pokazala statistički
značajne razlike u usporedbi s učestalošću tih alela među zdravim ispitanicimna.
2. Najčešći aleli među našim ispitanicima bili su: HLA-A*02:01 (27,7%), B*51:01 (13,0%),
C*07:01 (20,3%), DRB1*03:01 (15,3%) i DQB1*03:01 (23,3%).
3. Otkriveno je 227 različitih haplotipova HLA-A-B-DRB1 među našim ispitanicima, od
čega se 197 haplotipova HLA pojavilo samo jednom. Najzastupljeniji je bio: HLA-
A*01:01-B*08:01-DRB1*03:01 (7,3%).
4. Najučestaliji haplotip koji je obuhvatio 5 lokusa HLA bio je: HLA-A*01:01-B*08:01-
C*07:01-DRB1*03:01-DQB1*02:01 (7,3%) što je u skladu s podacima za kontrolnu
populaciju.
5. U istraživanoj skupini bolesnika, njih 19 (12,7%) imalo je neuobičajenu kombinaciju
alela u haplotipu HLA, od toga je 15 bolesnika imalo neuobičajenu kombinaciju alela
HLA-B-C, a 4 bolesnika neuobičajenu kombinaciju alela HLA-DRB1-DQB1.
6. Za ukupno 50 bolesnika pronađen je barem jedan HLA podudarni nesrodni darivatelj
(6/6, niska rezolucija) u CBMDR-u.
7. Za polovicu naših bolesnika, njih ukupno 75, pronađen je barem jedan HLA podudarni
nesrodni darivatelj u BMDW-u, dok za 6 bolesnika nije pronađen niti jedan darivatelj
koji bi s bolesnikom bio HLA podudaran 10/10.
8. Rijetki aleli (A*29:01, B*80:01, C*07:18, DRB1*04:15, DRB1*11:15 i DRB1*11:28)
kao i neuobičajene kombinacije alela HLA-B-C, odnosno HLA-DRB1-DQB1 pokazali su
se kao ograničavajući čimbenici u pronalasku HLA podudarnog nesrodnog darivatelja.
41
7.0. Literatura
[1] Mehra N. K. (2010): The HLA Complex in Biology and Medicine: A Resource Book.
Jaypee Brothers Medical Publishers Ltd., New Delhi.
[2] Andreis I., Batinić D., Čulo F., Grčević D., Lukinović-Škudar V., Marušić M., Taradi M.,
Višnjić D. (2009): Imunologija. Medicinska naklada, Zagreb.
[3] Kindt T. J., Osborne B. A., Goldsby R. A. (2006): Kuby Immunology. Freeman, W. H. &
Company, New York.
[4] Undlien D. E., Lie B. A., Thorsby E. 2001. HLA complex genes in type 1 diabetes and other
autoimmune diseases.Which genes are involved? Trends in Gentics 17, 93-100.
[5] Williams T. M. 2001. Human leukocyte antigen gene polymorphism and the
histocompatibility laboratory. The Journal of Molecular Diagnostics 3, 98-104.
[6] Badrinath S., Huyton T., Blasczyk R., Bade-Doeding C. (2014): HLA Class I Polymorphism
and Tapasin Dependency. U: Xi Y. (ur.) HLA and Associated Important Diseases. London,
InTech, 41-60.
[7] Grubić Z. 2012. Tipizacija HLA u procjeni kompatibilnog darivatelja. Bilten KROHEMA 4,
42-44.
[8] Nunes J. M., Buhler S., Roessli D., Sanchez-Mazas A. 2014. The HLA-net GENE[RATE]
pipeline for effective HLA data analysis and its application to 145 population samples from
Europe and neighbouring areas. Tissue Antigens 83, 307-323.
42
[9] Serventi-Seiwerth R., Mikulić M., Mrsić M., Grubić Z., Bojanić I., Štingl K., Labar B. 2011.
Transplantacija alogenih krvotvornih matičnih stanica od HLA podudarnog nesrodnog
darivatelja. Medicina Fluminensis 47, 381-388.
[10] Mikulić M., Grubić Z. 2012. Postupak pronalaženja nesrodnog darivatelja krvotvornih
matičnih stanica. Bilten KROHEMA 4, 39-41.
[11] Gourraud P. A., Balère M. L., Faucher C., Loiseau P., Dormoy A., Marry E., Garnier F.
2014. HLA phenotypes of candidates for HSCT: comparing transplanted versus non-
transplanted candidates, resulting in the predictive estimation of the probability to find a
10/10 HLA matched donor. Tissue Antigens 83, 17-26.
[12] Grubic Z., Burek Kamenaric M., Mikulic M., Stingl Jankovic K., Maskalan M., Zunec R.
2014. HLA-A, HLA-B and HLA-DRB1 allele and haplotype diversity among volunteer
bone marrow donors from Croatia. International Journal of Immunogenetics. 41, 211-221.
[13] Brézin A. P., Monnet D., Cohen J. H.M., Levinson R. D. 2012. HLA-A29 and Birdshot
Chorioretinopathy. Ocular Immunology and Inflammation 19, 397-400.
[14] Pingel J., Solloch U.V., Hofmann J.A., Lange V., Ehninger G., Schmidt A.H. 2012. High-
resolution HLA haplotype frequencies of stem cell donors in Germany with foreign
parentage: how can they be used to improve unrelated donor searches? Human Immunology
74, 330-340
43
[15] Testi M., Andreani M., Locatelli F., Arcese W., Troiano M., Battarra M., Gaziev J.,
Lucarelli G. 2014. Influence of HLA characteristics of Italian patients on donor search
outcome in unrelated hematopoietic stem cell transplantation. Tissue Antigens 84, 198-205.
[16] Bettens F., Nicoloso de Faveri G., Tiercy J.M. 2009. HLA-B51 and haplotypic diversity of
B-Cw associations: implications for matching in unrelated hematopoietic stem cell
transplantation. Tissue Antigens 73, 316-325.
[17] Cao K., Hollenbach J., Shi X., Shi W., Chopek M., Fernandez-Vina M.A. 2001.
Analysis of the frequencies of HLA-A, B, and C alleles and haplotypes in the five major
ethnic groups of the United States reveals high levels of diversity in these loci and
contrasting distribution patterns in these population. Human Immunology 62, 1009-1030.
[18] http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html
[19] http://www.pypop.org/popdata/index.html
[20] http://www.bmdw.org/index.php?id=97
[21] http://www.haplostats.org/haplostats?execution=e1s1
[22] http://www.allelefrequencies.net/
Životopis
Rođen sam 22. svibnja 1990. u Slavonskom Brodu. Osnovnu školu Ivan Goran Kovačić u
Slavonskom Brodu završio sam 2005. godine. Iste godine upisao sam srednju školu,
Gimanziju Matija Mesić u Slavonskom Brodu, koju sam završio 2009. godine.
Preddiplomski studij Znanosti o okolišu na Prirodoslovno-matematičkom fakultetu,
Sveučilišta u Zagrebu upisao sam 2009., a 2012. stekao sam zvanje prvostupnika struke
Znanosti o okolišu (univ. bacc. oecol.), obranivši Seminarski rad pod nazivom “Bakterije kao
indikatori kvalitete vode”. Iste sam godine upisao diplomski studij Eksperimentalne biologije
(modul: Fiziologija i imunobiologija). Diplomirao sam 6. veljače 2015. godine obranivši
diplomski rad: “Raznovrsnost alela HLA među bolesnicima u programu transplantacije
krvotvornih matičnih stanica”, pod mentorstvom prof. dr. sc. Zorane Grubić.